KR20050027837A - 식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 - Google Patents

식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 Download PDF

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KR20050027837A
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Abstract

본 발명은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 (erythropoietin, EPO)를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 식물체 및 상기 식물체를 이용한 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 대량으로 저비용으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 인간 적혈구 생성 촉진인자와 동일한 생물학적 특성 및 기능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 인간 적혈구 생성 촉진인자는 빈혈, 류마티스 관절염 및 후천성 면역 결핍증 등의 치료제로 유용하다.

Description

식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자{Recombinant Human Erythropoietin Expressed in Plants}
본 발명은 식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 (erythropoietin, EPO)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 식물체 및 상기 식물체를 이용한 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법에 관한 것이다.
식물 유전공학은 짧은 역사에도 불구하고 눈부신 발전을 하여 동식물 및 미생물 유래의 유용 유전자를 식물에 도입하여 새로운 형질을 갖는 형질전환 식물체의 개발이 가능하게 되었다. 지금까지 시도된 유전자 조작에 의한 식물체 개발은 내병성, 내충성, 제초제 내성 유전자 등의 도입에 의한 작물의 생산성 증가 등의 농업적 응용에 집중되었고, 이들은 식물 유전공학의 1세대를 형성하였다.
그러나 최근 들어 식물을 단순히 식량자원의 소재로 보는 농업적 응용보다는 식물이 가지는 다양한 산업 소재로서의 기능과 고등생물로서 지니는 장점 등을 이용하여 고부가가치의 유용한 재조합 단백질의 생산을 위한 생산 시스템으로서의 개발에 관심이 집중되어 있다. 즉, 식물 자체를 목적으로 하는 것이 아니라 식물을 도구로 이용하여, 도입된 유전자가 단순히 발현되는 것으로 끝나는 투입 (input) 개념보다는 도입된 유전자로부터 유래하는 새로운 물질이나 기능을 이용하려는 생산 (output)의 개념으로 이용하고자 하였으며, 이것이 곧 2세대 식물 유전공학의 기본 개념이다.
식물은 의료용 및 산업용 단백질의 대량생산 시스템으로 특히 매력적인데, 그 이유는 기존에 확립되어 있는 전통적인 농업기반을 이용하여 쉽게 수확하고 가공할 수 있으므로 원하는 생물자원 (biomass)의 대량확보가 가능하기 때문이다. 또한 단백질 발현 시스템으로 주로 이용되었던 세균과 달리 식물체는 포유동물 단백질의 활성에 필수적인 후-해독 수식 과정이 수행되는 진핵생물 단백질 합성 경로를 갖고 있다 (Cabanes-Macheteau et al., Glycobiolgy 9:365-372(1999)).
한편, 당단백질인 EPO는 적혈구 세포 형성에 관여하는 중요한 호르몬으로 이것은 성숙한 적혈구 세포로 분화하는 곳이나 골수에서 적아구계 (erythroblast) 전구세포의 분화 및 증식을 촉진시킨다. EPO는 166개의 아미노산으로 구성되어 있으며 3개의 N-결합 당쇄와 O-결합 당쇄를 포함하는데, 이들 당쇄 전체의 분자량은 EPO 당단백 호르몬 분자량의 40%에 해당하며 EPO의 생체내 활성에 필수적이다. EPO는 신장에서 생성되는데, 이 생성은 저산소공급 (저산소증), 혈액손실, 주위의 산소력을 감소시키거나 조직으로 산소의 공급을 감소시키는 반응에 따라 조절된다.
적혈구는 인체 내 모든 조직에 산소를 공급하는 역할을 하는 혈액 세포로서 산소 공급의 정도에 따라 그 양이 조절되는데 이를 조절하는 것이 EPO 이다. 즉, 체내에 산소공급이 저하되면 콩팥에 존재하는 특정 세포가 이를 감지하여 EPO의 농도를 증가시킴으로서 혈액 내 적혈구의 양이 많아지고 이에 따라 산소공급도 증가하게 된다.
EPO는 정상인의 경우 혈액 1 ㎖ 당 약 15 내지 30 mU 또는 0.01 mM 수준으로 유지되는데, 재생 불량성 빈혈 환자에서는 정상인보다 EPO의 농도가 높아 이들의 혈액이나 뇨를 EPO 생산에 이용하였다 (Espada et al., Biochem. Med. 3:475, 1970). 그러나 이러한 방법으로는 EPO의 원료 수급이 어려워 사람의 EPO 유전자를 클로닝하여 동물 세포 또는 곤충세포에서 발현시키는 방법들이 개발되었다 (대한민국 특허공고 제 89-1011호, 제 93-5917호 및 제 10-369788호; 대한민국 특허출원 제 93-16865호). 또한 대장균에서 제조하는 방법도 개발되었다 (대한민국 특허출원 제 97-1911호). 대량생산을 위해 대장균을 이용하는 경우, 발현된 EPO는 당화된 형태로 3차 구조를 연구하기에는 적합하지 않다는 단점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 식물체에 성공적으로 도입하고, 이로부터 기능성의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 수득할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 식물발현용 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 것으로서, 아미노산 치환 없이 식물체내에서의 발현을 최적화하기 위하여 변형된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 디자인은 다음과 같은 기준에 의해 실시된다: (ⅰ) GC 함량을 50% 이상으로 하고, (ⅱ) 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하며, (ⅲ) 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이러한 식물-적합 서열은 유전자의 해독율 (translation rate)을 증가시킬 수 있다 (Kusnadi et al., Biotechnol. Prog. 14:149-155(1998)). 또한, 도입 유전자의 배열이 숙주 식물체에서 인트론으로 인식됨으로 인해 식물체 핵 내에서 절단되어 원하는 단백질의 생산에 실패할 가능성을 배제하기 위하여, 도입되는 외래 유전자 내의 인트론 유사 서열이 제거된다.
본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 식물발현용 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 유전자가 도입된 식물체의 제조는 크게 두 방식에 의해 달성된다: 일시적 형질감염 식물체 (transient transfected plant) 및 형질전환 식물체 (transgenic plant).
본 명세서에서 용어 "일시적 형질감염 식물체"는 외래 유전자가 도입된 식물체로서 도입된 외래 유전자가 다음 세대로 전달되지 않는 것을 의미한다. 일시적 형질감염 식물체에서 외래 유전자는 일반적으로 숙주 세포의 염색체와 별개로 존재하게 된다. 반대로, 용어 "형질전환 식물체"는 다음 세대로 전달되는 외래 유전자를 갖는 식물체를 의미한다. 형질전환 식물체에서 외래 유전자는 일반적으로 숙주 세포의 염색체에 통합 (integration)되어 숙주 세포의 유전 내용물 (genetic repertoire)이 되며, 다음 세대에 안정적으로 전달된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물체의 식물세포로 도입되는 단계; 및 (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물세포로 도입되는 단계; (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계; 및 (c) 유전자가 도입된 식물세포를 포함하는 식물체로부터 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 일시적 형질감염은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (Rainer Fisher et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 30:113-116(1999)). 식물에서의 일시적 유전자 발현은 안정된 발현을 하는 형질전환체에 비하여 신속하고 단백질 발현 결과를 빠른 시일 내에 확인할 수 있기 때문에, 안정된 형질전환 식물체를 사용한 대규모 생산에 앞서 식물체에서 수득한 목적 단백질의 정상적 기능 여부를 확인하는데 적합하다.
이에 본 발명자들은 생물학적 활성을 가지는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 효율적인 대량 생산을 위하여, 식물체에서 일시적 유전자 발현 방법을 사용하여 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 발현하고 분리 및 정제하였다.
일시적 유전자 발현 방법은 대량 생산을 위해 식물 형질전환체를 제조하기 전에 목적 유전자의 기능성과 안정적 발현성을 검사하는데 적합한 접근방법으로서, 시간과 비용을 절약할 수 있는 이점이 있다. 특히, 안정적 형질전환에 의해 제조된 식물 형질전환체의 경우, 외래 유전자가 삽입된 위치에 따라 영향을 받는 염색체 위치효과 (chromosomal positional effect)를 나타내는 데, 일시적 형질감염은 이러한 효과를 배제할 수 있어 외래 유전자의 효과적 발현과 분리에 매우 적합하다.
일시적 형질감염에서 외래 유전자를 식물세포로 전달하는 방법은 대표적으로 세 종류가 있다: 내이키드 (naked) DNA를 입자에 코팅하여 도입하는 입자총 (particle bombardment) 방법 (Christou, P., Trends Plant Sci. 1:423-431(1996)), 진공 침투 (vacuum infiltration) 등에 의하여 발현 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움을 식물조직으로 도입하는 아그로인필트래이션법 (agroinfiltration) (Kapila et al., Plant Sci., 122:101-108(1996)), 및 변형된 식물 바이러스 벡터를 이용하는 바이러스벡터법 (viral vectors) (Scholthof, H. et al., Annu. Rev. Phytopathol. 34:299-323(1996)).
이들 세 가지 방법의 형질전환 효율은 각각 다양하여, 입자총에 의한 DNA 도입의 경우에는 일반적으로 소수의 세포들에만 유전자가 도입되며 전사를 위하여 DNA가 세포의 핵 내에 도달해야만 기능을 하게 된다. 이 방법은 안정적 형질전환에 앞서서 재조합 단백질의 안정성 검사에 사용할 수 있지만 재조합 단백질의 대량 발현을 위해서는 부적당하다.
아그로인필트래이션법은 입자총 보다 많은 세포들에 유전자가 도입될 수 있는데, 목적 유전자를 포함하는 T-DNA가 몇 가지 세균 단백질들의 도움으로 능동적으로 핵 내에 도입된다. 이 방법 또한 도입된 T-DNA가 숙주세포의 염색체로 통합되어 지속적으로 발현되는 것이 아니고, 핵 내에 독립적으로 존재하여 목적 유전자의 일시적 발현을 나타내는 것으로 단백질 안정성과 기능의 특성을 조사하기에 충분한 양의 단백질을 신속하게 확보하기에 적당하다.
그리고 바이러스벡터를 이용한 방법은 바이러스 식물 병원성 유전자 (viral plant pathogene)의 지놈에 외래 유전자를 도입하여 강한 프로모터의 조절을 받도록 하는 것으로서, 외래 유전자를 포함한 재조합 바이러스 벡터를 식물에 감염시키면 도입된 외래 유전자는 식물 바이러스 복제 과정 중에 고효율로 함께 증폭된 후 발현이 이루어져 외래 단백질을 생산하게 된다. 그러나 바이러스 벡터를 사용할 경우에는 생산할 단백질의 크기가 30 kDa 이하로 제한되어 있어 도입할 유전자의 크기가 커서는 사용하기가 어렵다는 단점이 있다.
따라서, 본 발명에서는 아그로인필트래이션법이 가장 바람직하다. 아그로인필트래이션법은 일반적으로 잎을 가지고 실시된다.
아그로필트레이션에 본 발명이 실시되는 경우, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용한다.
아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 식물체의 잎의 조직에 침투시키는 단계: 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 침투된 잎에서 단백질의 발현을 확인하는 단계.
상기한 구체적인 일 실시예에서, 적합한 잎은 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 꽃대가 오르기 전에 생성된 잎이고, 가장 바람직하게는 너무 어리거나 성숙하지 않은 잎이다. 잎이 어릴수록 발현량이 많으나 조직이 황화되거나 죽기 쉬우며, 성숙한 잎은 조직이 팽창되어 있어 균의 주입은 쉬우나 발현량이 감소된다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다.
식물 세포로의 유전자 도입은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320 및 pHS737과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., "Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); R. K. Jain, et al., Biochem. Soc. Trans. 28:958-961(2000)).
아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 잎에 있는 식물세포로의 유전자 도입은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자 도입 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물을 잎의 조직에 침투 (infiltration)시키는 과정을 포함한다.
상기 침투 과정은 진공을 이용한 방법 또는 주사기를 이용한 방법으로 실시될 수 있다. 진공을 이용하는 경우의 구체적인 일 실시예는 다음과 같다. 식물체 잎을 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 놓고, 짧은 시간 동안 진공을 적용한다. 이어 진공을 빠르게 해제하고, 잎을 멸균수로 소독한 다음, 습한 종이 위에 잎의 윗 부분이 아래로 향하도록 놓는다. 그런 다음, 상기 잎을 약 22℃에서 약 16 시간의 광조건 하에서 보관한다. 그리고 나서, 약 2-3 시간 후, 발현된 목적 단백질의 확인한다.
한편, 주사기를 이용하는 경우에의 구체적인 일 실시예는 다음과 같다. 식물체 잎의 뒷면에 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물을 주사기를 이용하여 주입하고, 이 식물체를 약 3-5일 동안 배양한 다음, 발현된 목적 단백질을 확인한다.
아그로박테리움 튜머페이션스 배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 침투를 돕기 위한 것이다.
본 발명에 따라 유전자 도입된 식물체는 당업계에 공지된 방법에 의해 목적 단백질의 발현을 확인된다. 예를 들어, 유전자 도입된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 식물 세포에 존재하는 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 유전자 도입 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)). 한편, 유전자 도입 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 유전자가 있는 경우에는 유전자가 도입된 잎 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 유전자 도입 여부를 용이하게 확인할 수 있다 (Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep., 5:387(1987)).
본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.
본 발명의 유전자 도입 식물체, 즉 일시적 형질감염 식물체의 조직 (예: 잎)으로부터 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻은 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질의 N-말단에 6 x His이 있는 경우에는, Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질을 신속하고 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 일시적 형질감염 식물체를 이용함으로써 단기간에 저렴한 비용으로 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 천연 (natural-occurring) 인간 적혈구 생성 촉진인자와 동일한 생물학적 특성 및 기능을 나타낸다.
재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 유전자가 도입된 식물체를 제조하기 위한 다른 접근 방법은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정적으로 발현하는 형질전환 식물체를 이용하는 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체로부터 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982) 및 Saul, M. et al., Plant Molecular Biology Manual, Vol. A1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)), 입자총 방법 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990) 및 Christou, P., Trends Plant Sci. 1:423-431(1996)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개 형질전환이 가장 바람직하다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일반적으로 잎 디스크, 그리고 다른 조직 (자엽 및 배축)을 가지고 실시된다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.
형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (Bhojwani, S.S. et al., Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Elsevier Science, New York, (1983); 및 Lindsey, K., Ed., Plant Tissue Culture Manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, (1991)). 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).
한편, 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물체 (예: 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 특정 식물체의 형질전환을 위한 가장 효율적인 방법을 구축하였다. 이러한 방법은 PCT/KR02/01461, PCT/KR02/01462 및 PCT/KR02/01463에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.
본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.
아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (ⅰ) 서열목록 제 1 서열에 기재된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻는 단계; 및 (c') 상기 재분화 신초를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.
상기한 구체적인 일 실시예에서, 형질전환에 적합한 익스플랜트는 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 자엽 및 배축이고, 가장 바람직하게는 자엽이다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다. 식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).
보다 바람직하게는, pBin19, pRD400 및 pRD320과 같은 바이너리 벡터 시스템 이 이용된다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986)). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물 내로 감염된다.
아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 최종적으로, 발근 배지에서 재분화된 신초의 발근에 의해 형질전환 식물이 생산된다.
본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)).
형질전환체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 형질전환 식물체의 다양한 기관 (예: 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 종자 등)으로부터 유래된 조직으로부터 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻는 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.
본 발명의 방법에 따르면, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 대량으로 저비용으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 천연 (natural-occurring) 인간 적혈구 생성 촉진인자와 동일한 생물학적 특성 및 기능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 빈혈, 류마티스 관절염 및 후천성 면역 결핍증 등의 치료제로 유용하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질의 신규 유전자의 합성
천연의 인간 적혈구 생성 촉진인자 유전자와 동일하게 167개의 아미노산 (참조: 서열목록 제 2 서열)을 암호화하면서도, 기존의 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과는 다르게, 식물체가 선호하는 최적의 뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 신규 유전자의 디자인 기준은, 첫째, GC 함량을 50% 이상으로 하고, 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하였으며, 그리고 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이렇게 디자인된 뉴클레오타이드 서열은 Plant Biotechnology Institute (이하 "PBI"로 표시), National Research Centre (SK, 캐나다)에서 화학적으로 합성하였다. 합성된 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질을 코딩하는 DNA는 서열목록 제 1 서열에 기재되어 있다.
실시예 2: 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질 유전자의 식물 발현용 벡터의 제작
재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 합성 유전자는 501 bp로 구성되어 있으며, 5'-말단에 XbaI과 3'-말단에 BamHI의 인식부위를 가질 수 있도록 합성되어 있다.
식물 발현용 바이너리 벡터인 pHS737 (PBI, National Research Centre, 캐나다)을 제한효소 XbaI과 BamHI 효소로 함께 처리하여 절단한 후 분리·정제하였다. 상기 501 bp 합성 유전자와 절단된 pHS737 벡터를 혼합하고, 이 혼합물에 라이게이션 완충액 (KOSCO, 대한민국) 및 T4 리가아제 (KOSCO, 대한민국)를 첨가한 후 1시간 이상 16℃에서 반응 시켰다. 그런 다음, 반응물을 CaCl2로 처리된 컴피턴트 세포 E. coli strain DH5α(Promega, 미합중국)에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신 (100 mg/㎖)이 포함된 LB 배지에서 항생제 저항성 균주를 선별하였다.
선발된 클론으로부터 알칼리 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였고, 정방향 프라이머 5'-AAT CTA GAA ATG GCT ACT AT-3'과 역방향 프라이머 5'-AAG GAT CCC CGA GCT TGA GA-3'를 사용해서 중합효소연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. PCR 증폭에서 이용된 효소는 Taq 중합효소 (솔젠트, 대한민국)이고, 온도 조건은 다음과 같이 세팅하였다: 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 하였다.
이어, 증폭 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 분석하여 목적하는 인서트 서열이 플라스미드에 있음을 확인하였다.
실시예 3: 식물체로의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 유전자 도입
실시예 3-1: 아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101 배양액의 제조
실시예 2에서 제작한 재조합 pHS737/EPO 벡터를 접합 (conjugation)에 의하여 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90) (Plant-cell-rep., 15(11):799-803(1996))에 도입하였다. 재조합 pHS737/EPO 벡터를 가진 대장균 S17-1과 아그로박테리움 튜머페인션스 GV3101 (Mp90)를 각각 액체 LB배지에서 대수기까지 배양하였다. 이들 각각의 세포들을 에펜도르프 튜브에 1:1로 함께 혼합한 다음 30초간 원심분리하여 세포들을 농축시킨 후 28℃에서 1-2일 동안 정치배양을 하였다. 시간이 경과한 세포들이 든 에펜도르프 튜브는 살살 흔들어 주어 농축된 세포를 부유화시킨 다음, 50 mg/L 카나마이신 및 30 mg/L 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 다음, 28℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 선별하였다 (Alt-Morbe et al., J. Bacteriol. 178:4248-4257(1996)). 상기 벡터가 도입된 균주를 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/EPO로 명명하였다.
pHS737/EPO를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/EPO 를 액체 LB 배지에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양하여 종균 (seed culture)으로 사용하였다. 충분히 배양된 종균을 액체 LB 배지에 최종 배양 볼륨의 1/50과 항생제 (50mg/L Kanamycin)를 넣고 600 nm에서 흡광도 1.5 에 도달할 때까지 약 18시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 상온에서 3500 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 균체를 10 mM MgCl2 용액 (BA 0.2 ppm, 아세토시린곤 150 μM 함유)에 현탁한 후 3시간 이상 상온에서 적응시킨 후 식물체의 감염에 사용하였다.
실시예 3-2: 식물세포의 준비 및 아그로인필트래이션 (agroinfiltration)
먼저 소독한 담배 (Nicotina bentamiana)의 종자를 파종하여 3 주 이상 배양한 후 온실에서 순화시켰다. 순화된 식물체의 잎사귀에 GM-CSF 유전자를 가진 pHS737 벡터 (pHS737/hGM-CSF)를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90)를 실시예 3-1에서 제시된 방법으로 감염용 배양액을 제조한 후 액을 바늘을 제거한 1 ㎖ 주사기 ((주) 녹십자, 대한민국)에 삽입 후 이를 잎의 뒷면에 고르게 퍼질때까지 주입하였다. 잎 전체에 균을 주입하면 잎이 무거워 식물체 자체가 쓰러지거나 엽병이 부러지는 경우가 발생할 수 있어 주의하여 주입하였다. 아그로박테리움이 주입된 식물체는 10분에서 1시간이 경과하면 원래의 상태를 회복하게 된다. 아그로박테리움이 주입된 식물체는 배양 3일이 경과한 후 5일 이내에 수확하여 실시예 4의 방법을 이용하여 분석하였다.
실시예 4: 유전자 도입 식물체에서 도입 유전자 발현 확인을 위한 표지인자 분석
상기 실시예 3에서 확보한 식물체의 유전자 발현 확인은 다음과 같이 실시하였다: 베타-글루쿠로니다아제 (β- glucuronidase, GUS) 리포터 유전자의 발현을 확인하기 위해 잎을 채취한 다음, GUS 분석 용액 (X-gluc (5-Bromo-4-Chloro- 3-Indole-β-D-Glucuronic Acid), 1 mg/㎖) 200 ㎕를 잎이 든 용기에 넣고 진공기 (vacuum)를 이용하여 완전히 젖을 때까지 진공을 유지한다. 그 후 발색되는 양상을 육안으로 관찰하여 유전자의 도입 및 발현을 확인하였다.
유전자가 도입된 잎의 세포들은 리포터 유전자인 베타-글루쿠로니다아제 (β-glucuronidase, GUS)가 발현되면 효소인 베타-글루쿠로니다아제가 생성되며 여기에 X-gluc용액을 첨가하면 베타-글루쿠로니다아제가 X-gluc를 분해하면서 색소가 생성되어 세포들이 파란색을 나타낸다. 본 발명에서 유전자가 도입된 잎은 리포터 유전자인 베타-글루쿠로니다아제가 발현되어 파란색을 나타내어 유전자의 도입 및 발현을 확인하였다.
실시예 5: 유전자 도입 식물체에서 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질의 분리 및 정제
적당량의 액체질소가 들어있는 막자사발에 유전자가 도입된 담배의 잎 1 g을 잘라서 넣고 식물조직을 분쇄하였다. 식물 생중량 0.5 g 당 단백질 분해효소 억제제-함유 추출완충액 (250 mM 수크로스, 1 M Hepes, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT) 2 ㎖ 를 첨가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 12,000 rpm, 4 ℃에서 30분 이상 원심분리한 후 상등액을 취하여 새 튜브로 옮겼다. 이 용해된 세포용액을 니켈 수지가 함유된 프로본드 (Probond) 컬럼 (Quiagen GmbH, 독일)에 첨가하여 실온에서 10분간 약하게 흔들어주면서 세포용액내의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질이 니켈 수지에 잘 흡착되도록 하였다.
재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질이 흡착된 수지를 동량의 pH 7.8 흡착 완충용액 (20 mM 소듐 포스페이트 및 500 mM 소듐 클로라이드)으로 2회 세척하여 수지에 흡착된 식물세포 유래 단백질을 제거하였다. 이와 같이 세척된 수지에 동량의 pH 6.0 세척 완충용액 (20 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드)을 첨가하여 실온에서 약하게 흔들어주어 수지를 재차 세척하고, 다시 동량의 pH 4.0 용출 완충용액 (20 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드)을 첨가하여 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질을 용출시켰다.
유전자 도입 식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지고 있어 양이온을 띠는 니켈 수지에 결합되어 쉽게 분리된다. 이러한 과정을 거쳐 식물세포 단백질들이 모두 제거된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질만을 순수하게 정제하였다. 이와 같이 용출된 단백질을 센트리콘 (Amicon Co., U.S.A.)을 사용하여 농축하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동한 후 쿠마시블루로 염색한 결과 야생형 담배에서는 검출되지 않는 23.2 kD의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질이 세포 용출액에서 검출되었고, 특히 니켈 수지 칼럼으로 용출한 경우는 식물세포 단백질이 모두 제거된 순수한 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질이 검출됨을 확인하였다.
상기의 방법으로 정제된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질에 브래드포드 (Bradford) 방법에 의해 염색제 (Protein assay kit, Bio-Rad)를 넣고 UV-분광광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 BSA (Bovine Serum Albumin) 표준물질과 비교해서 단백질 정량을 실시하였다. 추출된 단백질은 양이 동일하도록 조정하여 각 시료를 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하였고, 이에 대해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 웨스턴 블럿 분석은 아래와 같은 방법으로 시행되었다. 상기 SDS-PAGE 겔에 있는 단백질을 Semi-Dry Transfer Units (Hoefer, 미합중국)를 이용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 겔에 있는 단백질 전부가 PVDF 막에 이동한 것을 확인한 다음 PVDF막을 건조시켰다. 이 PVDF막을 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 (Santacruz, 미합중국)가 첨가된 0.5% BSA/TBS (Tris-Buffered Saline) 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 TBS 용액으로 PVDF 막을 5분씩 세 번 세척하였다. 그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)와 1시간 동안 반응시킨 후 다시 TBS 용액으로 PVDF 막을 10분씩 세 번 세척하였다. 마지막으로 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)이 첨가된 왼충액에 PVDF 막을 넣고 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 그 결과를 판독하였다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과 상기 결과와 동일하게 23.2 kD의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질이 확인되었다.
실시예 6: 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질의 발현성 측정
아그로인필트래이션에 의해 도입된 유전자가 발현된 담배의 잎에서 분리·정제된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질의 기능을 확인하기 위하여, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질에 대한 항원-항체 반응을 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 측정하였다.
96-웰 마이크로타이터 플레이트에 정제된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질을 인산염 완충용액에 연속적으로 희석하여, 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항원을 웰에 고정시켰다. 단백질 항원이 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항원을 제거하고, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질 항원에 대한 단일클론항체 (Santacruz, 미합중국)를 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시켜 항원-항체반응을 유도하였다. 그런 다음 세척 완충용액으로 각각의 웰을 3회 세척한 후에 블롯킹 완충액을 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 상기와 동일하게 세척하였다. 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA)로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
세로축은 O.D. 405 nm에서의 흡광도 값을 나타낸 것이며, 가로은 상기 단백질에 대한 항체의 초기 역가를 1로 보았을 때 희석한 배수를 나타낸 것이다. 이를 야생형 식물체에서 분리한 단백질과 비교하여 도식화 한 것이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 유전자 도입 식물체에서 분리 정제한 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질의 항원성은 탁월하게 나타났으며, 이와 비교하여 야생형 식물체에서 분리한 단백질은 전혀 나타내지 않았다.
또한, ELISA 결과를 보여주는 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의해 형질전환 담배로부터 정제된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 천연의 인간 적혈구 생성 촉진인자에 대한 항체에 대하여 항원성을 나타내고 있음을 알 수 있고, 이에 천연의 인간 적혈구 생성 촉진인자와 유사한 생리학적 기능을 발휘할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 인간 적혈구 생성 촉진인자를 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체 및 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체를 제공한다. 한편, 본 발명은 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 대량으로 저비용으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 인간 적혈구 생성 촉진인자와 동일한 생물학적 특성 및 기능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자는 빈혈, 류마티스 관절염 및 후천성 면역 결핍증 등의 치료제로 유용하다.
도 1은 유전자 도입 식물체, 즉 일시적 형질감염 (transient transfected) 식물체에서 발현된 인간 적혈구 생성 촉진인자 (erythropoietin, EPO) 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 야생종 담배의 단백질; 및 레인 2, 유전자 도입 식물체 내 발현된 인간 적혈구 생성 촉진인자.
도 2는 유전자 도입 식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 야생종 담배의 단백질; 및 레인 2, 유전자 도입 담배 내 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자.
도 3은 유전자 도입 식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 항원성을 보여주는 그래프. 세로축, 405 nm에서의 흡광도 값; 가로축, 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자에 대한 단일클론항체의 희석배수; 검정 마름모 E. coli에서 발현된 양성 대조군 (rh EPO); 검정 네모, 야생형 담배의 단백질; 검정 원, 유전자 도입 담배에서 분리 정제된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 단백질.
도 4는 유전자 도입 식물체에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 항원성을 나타내는 ELISA 플레이트 사진. 가로: (+), E. coli에서 발현된 양성 대조군; (-), 야생형 담배; 1-10, 유전자 도입 담배에서 발현된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자. 세로: 1-7, 항체 희석배수; (-) PBS 완충액.
<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Recombinant Human Erythropoietin Expressed in Plants <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the nucleotide sequence of hEPO <220> <221> CDS <222> (1)..(501) <400> 1 atg gcc cct ccc agg ctg atc tgt gat tca agg gtg ctt gag agg tat 48 Met Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr 1 5 10 15 ctt tta gag gca aag gag gcc gaa aac atc acc acc gga tgc gca gaa 96 Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu 20 25 30 cat tgc tca ctc aat gaa aat att aca gtg ccg gat aca aaa gtt aac 144 His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn 35 40 45 ttc tac gcc tgg aag cga atg gaa gtc gga caa cag gca gta gag gtt 192 Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val 50 55 60 tgg caa ggg ctg gct ctt ctt agc gag gcc gtt ctt aga ggc caa gct 240 Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala 65 70 75 80 ttg ctt gtg aat tcc tct caa cct tgg gag cca ttg cag ttg cac gtc 288 Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val 85 90 95 gac aaa gct gta tcc ggc ttg aga agc ctt aca act cta ctc cgt gca 336 Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala 100 105 110 ttg gga gca cag aag gaa gct att tcg cca cct gac gct gcg tct gcc 384 Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala 115 120 125 gct cca ctc cgg act ata act gct gat acc ttt cgt aaa ctc ttc aga 432 Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg 130 135 140 gtt tat agt aac ttt ttg cgc ggt aag cta aag tta tac act ggt gaa 480 Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu 145 150 155 160 gct tgt cgt acg ggt gac aga 501 Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 2 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr 1 5 10 15 Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu 20 25 30 His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn 35 40 45 Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val 50 55 60 Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala 65 70 75 80 Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val 85 90 95 Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala 100 105 110 Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala 115 120 125 Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu 145 150 155 160 Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims (9)

  1. 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자 (EPO)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  2. (ⅰ) 상기 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 식물발현용 벡터.
  3. 다음의 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체의 제조방법:
    (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물체의 식물세포로 도입되는 단계; 및
    (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계.
  4. 상기 제 3 항의 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 일시적으로 발현하는 일시적 형질감염 식물체.
  5. 다음의 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법:
    (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포로 도입되는 단계;
    (b) 상기 식물세포에 유전자 도입이 되었는 지 여부를 확인하는 단계; 및
    (c) 유전자가 도입된 식물세포를 포함하는 식물체로부터 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 수득하는 단계.
  6. 다음의 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법:
    (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계;
    (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
  7. 상기 제 6 항의 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 안정되게 발현하는 형질전환 식물체.
  8. 다음의 단계를 포함하는 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자의 제조방법:
    (a) 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터를 식물세포에 도입하는 단계;
    (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계;
    (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 형질전환 식물체로부터 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자를 수득하는 단계.
  9. 상기 제 5 항 또는 제 8 항의 방법에 의해 제조된 재조합 인간 적혈구 생성 촉진인자.
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