CN114807159B - 一种与耐旱性相关的c-糖基黄酮代谢基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明发现基因HORVU2Hr1G001460可显著改变青稞中C‑糖基黄酮代谢，进一步改变的C‑糖基黄酮的积累，从而提高青稞的抗旱能力。将基因HORVU2Hr1G001460转入烟草植株过表达后，烟草中的10种C‑糖基黄酮积累量也相应增加，因此，基因HORVU2Hr1G001460在抗旱植物中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种与耐旱性相关的C-糖基黄酮代谢基因及其用途。
背景技术
植物抗旱性（Plant drought resistance）是指陆生植物对干旱环境的适应或抗御能力，由于陆生植物经常受到干旱威胁，在长期适应进化中形成各种抗旱机能。在形态方面，一般陆生植物叶表面有角质层，栅栏细胞排列紧密，有的叶片有绒毛，有的干旱时落叶将叶片卷成筒状。在生理方面可自行开合气孔控制蒸腾。在生化方面，主动提高体内糖分和氨基酸含量以增强吸水能力，主动抑制分解酶活性以保持在干旱下的代谢平衡等。
植物抗旱性可通过诱导而增强，不同青稞之间也存在固有的抗旱性差异。青稞是青藏高原的主要粮食作物，长期干旱等恶劣环境导致青稞产量和品质下降，这也使青稞成为研究植物抗旱机理的重要资源。但目前还没有针对抗旱青稞，研究其具备的抗旱基因及其在其他植物中抗旱的应用研究，以提高农作物的抗旱能力。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示
本发明还提供一种重组载体， 它包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述重组载体是重组pCAMBIA-supper1300载体。
本发明还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。
进一步地，所述重组菌为重组农杆菌，优选为重组农杆菌GV3101。
本发明还提供了一种蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
一种前述的基因、重组载体、重组菌、蛋白在提高植物耐旱性中的用途。
进一步地，所述植物包括青稞、烟草。
本发明最后提供了一种抗旱植物的制备方法：取前述的基因、重组载体、重组菌或蛋白，转入植物中，即可。
进一步地，所述植物包括青稞、烟草。
本发明发现了一种新的基因HORVU2Hr1G001460，其可显著改变青稞中C-糖基黄酮代谢，进一步改变C-糖基黄酮的积累，从而提高青稞的抗旱能力。将基因HORVU2Hr1G001460转入烟草植株过表达后，烟草中的10种C-糖基黄酮积累量也相应增加，因此，基因HORVU2Hr1G001460在抗旱植物中具有重要意义，具备实际生产推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 与对照组相比，烟草瞬时超表达HORVU2Hr1G001460基因使得10中C-糖基黄酮含量有不同程度的增加，其中5种达到显著性差异
图2.抗旱型青稞和旱敏感型青稞中HORVU2Hr1G001460基因表达的差异。
具体实施方式
实施例1基因HORVU2Hr1G001460的代谢物含量及抗旱性的研究
1、方法
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
一、HORVU2Hr1G001460基因及其编码蛋白的发现
从培养8天的青稞叶片中发现一个新基因，如序列表的SEQ ID NO.1所示，命名为HORVU2Hr1G001460基因,将其编码的蛋白命名HORVU2Hr1G001460蛋白，其蛋白序列如序列表的SEQ ID NO.2所示；
HORVU2Hr1G001460基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：
ATGGACGGCGTTGCCACCGCGGCGGCCGGGACGGCTCCCGAGAACCAGAAGCCACGGGTGGTGCTGTACCCGTCGCCGGGGATGGGGCACCTGGTGTCCATGATCGAGCTGGGCAAGCTCTTCGCGGCGCGGGGGCTGGCCGTCACCATCCTCATCGTCGAGCTGCCCTTCGTCGACACCGCCGCGCGGGGCCCCTTCCTGGCCGCCGTCACCGCCGCCAACCCCTCCGTCACCTTCCACTGCCTCCCTCGGGTCCATTTCCCGCCCCTCGCCTCCCCGCACCCCGAGGCCGTCACCTACGAGGTCGCCCGCCTCTCCAACCCGCACCTCCGCGACTTCCTCCTCGCCCCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCGTCCTCGTCGTCGACTTCTTCTGCAGCGTGGCGCTCGACCTCGCCGCGGAGCTCGGGGTTCCCGGGTACTGCTTCTTCACGTCCGCCGCCGAGGCCCTGGCGTCCTTCCTCTACCTGCCGGTCCTGCACGCGCAGACCGCCGCCAGCTTCCGAGAGATGGGCGAGCAGCTGGTCCGCGTGCCCGGCATCGCGCCGTTCCCGGCCACGCACGCGATCAAGCCGCTCCAGGACCGCGACGACGCGGCGTACCGGGGTTTCTTGCAGGTGTCCCCCGACCTCTGCCGCTCGCAGGGCATCATCGTCAACACGTTCCGGTCCCTGGAGCCGCGCGCCGTCGAGGCCATCGTGGCCGGGCTGTGCACCCCGCCCGGCCTCCCGACGCCGCCGGTGCACTGCATCGGGCCGCTGATAAAGTCGGCGGAGGTGGGCGGGGAGTGCCTGGGGTGGCTGGACGCGCAGCCGGAGGGCAGCGTGGTGTTCCTCTGCTTCGGCAGCCTGGGCGTGTTCAGCGCGGCGCAGATCAGGGAGATCGCCGTCGGGCTGGAGGCGAGCGGCAACCGGTTCCTGTGGGTGGTCCGTAGCCCGCCGAACGAGGACCCGGCGAGGAGGTTCGAGGAGCCGCCGGAGCCCGACCTGGACGCCCTCCTCCCTCCGGGCTTCCTCGCCCGGACCCAAGAGAGAGGGCTGGTGGTGAAGACGTGGGCGCCGCAGCGCGACGTGCTGGCGCACGGCGCGGTGGGCGGGTTCGTGACGCACTGCGGGTGGAACTCGGTGCTGGAGGCGGTGATGGCCGGCGTGCCGATGCTGGCGTGGCCGCTGTACGCGGAGCAGCGGCTCAACCGGGTGTTCCTGGAGAAGGAGCTGGGGCTGGCCGCGGCCGTGGACGGATACGACCACGACAAGGAGCTGGTGGAGGCCGGCGAGGTGGAGAAGAAGGTGCGGTGGCTGATGGAGTCGGACGGCGGGAGCGTGCTCCGGGAGCGCACGCTGGACGCCATGCGGAGGGCCAAGGAGGCGCTGGCCGAGGGCGGCGAGTCGGACGTGACGCTCACCAAGCTCGTGGAGGGATGGACCGGACCGGACTAG
目的蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO.2）如下：
MDGVATAAAGTAPENQKPRVVLYPSPGMGHLVSMIELGKLFAARGLAVTILIVELPFVDTAARGPFLAAVTAANPSVTFHCLPRVHFPPLASPHPEAVTYEVARLSNPHLRDFLLAPPAPAPAVLVVDFFCSVALDLAAELGVPGYCFFTSAAEALASFLYLPVLHAQTAASFREMGEQLVRVPGIAPFPATHAIKPLQDRDDAAYRGFLQVSPDLCRSQGIIVNTFRSLEPRAVEAIVAGLCTPPGLPTPPVHCIGPLIKSAEVGGECLGWLDAQPEGSVVFLCFGSLGVFSAAQIREIAVGLEASGNRFLWVVRSPPNEDPARRFEEPPEPDLDALLPPGFLARTQERGLVVKTWAPQRDVLAHGAVGGFVTHCGWNSVLEAVMAGVPMLAWPLYAEQRLNRVFLEKELGLAAAVDGYDHDKELVEAGEVEKKVRWLMESDGGSVLRERTLDAMRRAKEALAEGGESDVTLTKLVEGWTGPD
二、HORVU2Hr1G001460基因的获得
供试材料为：青稞的叶片
提取供试材料的总RNA并反转录得到cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。
三、重组质粒的构建
采用In-Fusion（无缝克隆）技术将序列表的SEQ ID NO.1所示的双链DNA分子插入到载体pCAMBIA-supper1300载体上，使用限制性内切酶XbaI对载体进行单酶切，构建CaMV35S启动子过表达HORVU2Hr1G001460基因的载体，得到重组质粒35S:HORVU2Hr1G001460。
四、制备转基因烟草
（1）将重组质粒35S:HORVU2Hr1G001460导入根癌农杆菌GV3101（上海唯地生物技术有限公司），得到重组农杆菌。
（2）采用步骤（1）得到的重组农杆菌对六叶期的烟草进行注射，具体步骤如下：
a. 将含有目的载体的农杆菌单克隆接种于3mL含有50μg/mL 卡那霉素和50μg/mL利福平的LB培养基中，在28°C，200rpm的条件下培养过夜。
b. 取出1mL菌液转入10mL含有50μg/mL 卡那霉素，50μg/mL利福平，30μM 乙酰丁香酮（AS）的LB培养基中，在28°C，200rpm的条件下培养至OD600为0.5-1.0。
c. 收集菌体，重悬于等体积含有10mM MgCl2和150 μM AS的10 mM 2-(N-吗啡啉)-乙磺酸（MES）缓冲液（pH 5.6）中，室温黑暗条件孵育1-3h。
d. 用1 mL针管吸取菌液，注射到烟草叶片背面。注射完毕后，烟草先放置在黑暗条件下培养24 h，再转移到正常光照条件下培养48h，即可取样。检测转空载以及含有目的基因表达载体的叶片中代谢物含量的变化。
2、结果
本发明试验中过表达HORVU2Hr1G001460基因的烟叶中，10种C-糖基黄酮积累量增加，其中5种存在显著差异（图1）。植物代谢相关领域研究表明：在自然条件下，植物为了更好地适应环境，获得更大的生存机会，其体内的亲脂性小分子会发生糖基化。黄酮类化合物是一种在植物体内广泛存在的多酚类化合物，具有抗氧化和清除自由基的活性，黄酮类化合物的糖基化是植物在异常环境中储存生物活性物质的重要机制。 此外，基于代谢组学与转录学研究苦荞抗旱分子机制的研究表明：其幼苗抗旱主要代谢通路包括黄酮和黄酮醇生物合成 [基于代谢组学与转录学研究苦荞抗旱分子机制，欧阳建勇，2020]。基于此，本发明中HORVU2Hr1G001460基因能使植物中多个黄酮糖苷积累显著增加，表明其可以提高植物的耐旱性能。
另外，发明人还检测了抗旱青稞与干旱敏感性青稞，两者的HORVU2Hr1G001460基因表达有显著差异（图2）。
由此可见，编码C-糖基黄酮（CGT）的HORVU2Hr1G001460基因是植物抗旱相关C-糖基黄酮代谢的关键结构基因，其为植物提供耐旱性的C-糖基黄酮的积累。因此，该基因在抗旱植物中具有重要意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 西藏自治区农牧科学院农业研究所
<120> 一种与耐旱性相关的C-糖基黄酮代谢基因及其用途
<130> GY462-2021P0114332CC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacggcg ttgccaccgc ggcggccggg acggctcccg agaaccagaa gccacgggtg 60
gtgctgtacc cgtcgccggg gatggggcac ctggtgtcca tgatcgagct gggcaagctc 120
ttcgcggcgc gggggctggc cgtcaccatc ctcatcgtcg agctgccctt cgtcgacacc 180
gccgcgcggg gccccttcct ggccgccgtc accgccgcca acccctccgt caccttccac 240
tgcctccctc gggtccattt cccgcccctc gcctccccgc accccgaggc cgtcacctac 300
gaggtcgccc gcctctccaa cccgcacctc cgcgacttcc tcctcgcccc tccggctccg 360
gctccggccg tcctcgtcgt cgacttcttc tgcagcgtgg cgctcgacct cgccgcggag 420
ctcggggttc ccgggtactg cttcttcacg tccgccgccg aggccctggc gtccttcctc 480
tacctgccgg tcctgcacgc gcagaccgcc gccagcttcc gagagatggg cgagcagctg 540
gtccgcgtgc ccggcatcgc gccgttcccg gccacgcacg cgatcaagcc gctccaggac 600
cgcgacgacg cggcgtaccg gggtttcttg caggtgtccc ccgacctctg ccgctcgcag 660
ggcatcatcg tcaacacgtt ccggtccctg gagccgcgcg ccgtcgaggc catcgtggcc 720
gggctgtgca ccccgcccgg cctcccgacg ccgccggtgc actgcatcgg gccgctgata 780
aagtcggcgg aggtgggcgg ggagtgcctg gggtggctgg acgcgcagcc ggagggcagc 840
gtggtgttcc tctgcttcgg cagcctgggc gtgttcagcg cggcgcagat cagggagatc 900
gccgtcgggc tggaggcgag cggcaaccgg ttcctgtggg tggtccgtag cccgccgaac 960
gaggacccgg cgaggaggtt cgaggagccg ccggagcccg acctggacgc cctcctccct 1020
ccgggcttcc tcgcccggac ccaagagaga gggctggtgg tgaagacgtg ggcgccgcag 1080
cgcgacgtgc tggcgcacgg cgcggtgggc gggttcgtga cgcactgcgg gtggaactcg 1140
gtgctggagg cggtgatggc cggcgtgccg atgctggcgt ggccgctgta cgcggagcag 1200
cggctcaacc gggtgttcct ggagaaggag ctggggctgg ccgcggccgt ggacggatac 1260
gaccacgaca aggagctggt ggaggccggc gaggtggaga agaaggtgcg gtggctgatg 1320
gagtcggacg gcgggagcgt gctccgggag cgcacgctgg acgccatgcg gagggccaag 1380
gaggcgctgg ccgagggcgg cgagtcggac gtgacgctca ccaagctcgt ggagggatgg 1440
accggaccgg actag 1455
<210> 2
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asp Gly Val Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Pro Glu Asn Gln
1 5 10 15
Lys Pro Arg Val Val Leu Tyr Pro Ser Pro Gly Met Gly His Leu Val
20 25 30
Ser Met Ile Glu Leu Gly Lys Leu Phe Ala Ala Arg Gly Leu Ala Val
35 40 45
Thr Ile Leu Ile Val Glu Leu Pro Phe Val Asp Thr Ala Ala Arg Gly
50 55 60
Pro Phe Leu Ala Ala Val Thr Ala Ala Asn Pro Ser Val Thr Phe His
65 70 75 80
Cys Leu Pro Arg Val His Phe Pro Pro Leu Ala Ser Pro His Pro Glu
85 90 95
Ala Val Thr Tyr Glu Val Ala Arg Leu Ser Asn Pro His Leu Arg Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Val Leu Val Val Asp
115 120 125
Phe Phe Cys Ser Val Ala Leu Asp Leu Ala Ala Glu Leu Gly Val Pro
130 135 140
Gly Tyr Cys Phe Phe Thr Ser Ala Ala Glu Ala Leu Ala Ser Phe Leu
145 150 155 160
Tyr Leu Pro Val Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Ser Phe Arg Glu Met
165 170 175
Gly Glu Gln Leu Val Arg Val Pro Gly Ile Ala Pro Phe Pro Ala Thr
180 185 190
His Ala Ile Lys Pro Leu Gln Asp Arg Asp Asp Ala Ala Tyr Arg Gly
195 200 205
Phe Leu Gln Val Ser Pro Asp Leu Cys Arg Ser Gln Gly Ile Ile Val
210 215 220
Asn Thr Phe Arg Ser Leu Glu Pro Arg Ala Val Glu Ala Ile Val Ala
225 230 235 240
Gly Leu Cys Thr Pro Pro Gly Leu Pro Thr Pro Pro Val His Cys Ile
245 250 255
Gly Pro Leu Ile Lys Ser Ala Glu Val Gly Gly Glu Cys Leu Gly Trp
260 265 270
Leu Asp Ala Gln Pro Glu Gly Ser Val Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser
275 280 285
Leu Gly Val Phe Ser Ala Ala Gln Ile Arg Glu Ile Ala Val Gly Leu
290 295 300
Glu Ala Ser Gly Asn Arg Phe Leu Trp Val Val Arg Ser Pro Pro Asn
305 310 315 320
Glu Asp Pro Ala Arg Arg Phe Glu Glu Pro Pro Glu Pro Asp Leu Asp
325 330 335
Ala Leu Leu Pro Pro Gly Phe Leu Ala Arg Thr Gln Glu Arg Gly Leu
340 345 350
Val Val Lys Thr Trp Ala Pro Gln Arg Asp Val Leu Ala His Gly Ala
355 360 365
Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ala
370 375 380
Val Met Ala Gly Val Pro Met Leu Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln
385 390 395 400
Arg Leu Asn Arg Val Phe Leu Glu Lys Glu Leu Gly Leu Ala Ala Ala
405 410 415
Val Asp Gly Tyr Asp His Asp Lys Glu Leu Val Glu Ala Gly Glu Val
420 425 430
Glu Lys Lys Val Arg Trp Leu Met Glu Ser Asp Gly Gly Ser Val Leu
435 440 445
Arg Glu Arg Thr Leu Asp Ala Met Arg Arg Ala Lys Glu Ala Leu Ala
450 455 460
Glu Gly Gly Glu Ser Asp Val Thr Leu Thr Lys Leu Val Glu Gly Trp
465 470 475 480
Thr Gly Pro Asp
Claims (1)
1.一种基因在提高烟草中木犀草素-6-C-葡萄糖苷和木犀草素-8-C-葡萄糖苷积累中的用途，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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