KR100328507B1

KR100328507B1 - 나팔꽃 종자로부터 유래된 항균성 펩타이드의 ｃＤＮＡ를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터

Info

Publication number: KR100328507B1
Application number: KR1019990006622A
Authority: KR
Inventors: 구자춘; 조무제; 송필순; 정창호
Original assignee: 박찬구; 금호석유화학 주식회사
Priority date: 1999-02-27
Filing date: 1999-02-27
Publication date: 2002-03-16
Also published as: KR20000056880A; JP2000245483A

Abstract

본 발명은 다양한 세균 및 진균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내어, 식물체에 진균 감염에 대한 내성을 부여할 수 있는, 나팔꽃(Pharbitis nil L.) 종자에서 유래한 항균성 펩타이드와 이를 코딩하는 cDNA, 전기 cDNA를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터 및 이를 이용한 항진균 내성을 가지는 형질전이 식물체(transgenic plant)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 항균성 펩타이드 Pn-AMP는 다양한 진균에 대하여 우수한 항균 활성을 가지므로, 본 발명의 항진균 내성을 가지는 형질전이 식물체(transgenic plant)의 제조방법에 따라 전기 Pn-AMP를 코딩하는 유전자를 원하는 식물세포에 도입함으로써, 진균감염에 대하여 내성을 가지는 전이 식물체를 용이하게 제조할 수 있을 것이다.

Description

나팔꽃 종자로부터 유래된 항균성 펩타이드의 ｃＤＮＡ를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터{Recombinant Plant Expression Vector Comprising cDNA Encoding Antimicrobial Peptide Derived from Seed of Pharbitis nil L.}

본 발명은 나팔꽃(Pharbitis nil L.) 종자로부터 유래된 항균성 펩타이드의 cDNA를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터 및 이를 이용한 항진균 내성을 가지는 형질전이 식물체(transgenic plant)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 다양한 세균 및 진균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내어, 식물체에진균 감염에 대한 내성을 부여할 수 있는, 나팔꽃 종자에서 유래한 항균성 펩타이드와 이를 코딩하는 cDNA, 전기 cDNA를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터 및 이를 이용한 항진균 내성을 가지는 형질전이 식물체(transgenic plant)의 제조방법에 관한 것이다.

농업에 있어서 병인성 진균(fungal pathogen)의 방제는 중요한 과제로, 농작물의 재배시에 진균으로 인하여 발생되는 병을 막으려는 노력이 계속되어 왔다. 진균을 방제하기 위한 종래의 연구는 주로 위생학적 또는 화학적인 분야에 집중되었으며, 효과적인 살진균제(fungicide)의 개발에 따라 어느 정도 진균 감염의 감소도 이루어졌다. 그러나, 보트리티스 시너리아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피토프토라 파라시티카(Phytophthora parasitica) 및 알터나리아 알터리자타(Alternaria alterizata) 등과 같은 다양한 진균류에 대해 저항성을 가지는 농작물을 개발하기 위한 육종 연구나 유전공학 연구는 큰 성과를 거두지 못하였다.

최근에는, 병인-연관 단백질(pathogenesis-related protein, PR protein)이나 피토알렉신(phytoalexin) 등과 같이 서로 다른 분자량군에 속하는 항균 인자(antimicrobial agent)로 구성되는 식물체의 동적 방어체계(dynamic defense system)가 주목을 받고 있다. 식물은 고등동물과는 달리 병원균으로부터 자신을 보호할 수 있는 별도의 면역체계를 가지고 있지 않으며, 주로 시스테인(cysteine)과 글리신(glycine)이 풍부한 다양한 작은 항균성 단백질을 발현함으로써 병원균의 침입으로부터 자신을 보호한다. 이러한 항균성 단백질 중에서 히베인(hevein) 도메인을 가진 키틴 결합 단백질(chitin-binding protein)들은 서로 유사한 서열을 공유하며, 다양한 정도의 항균 활성(antimicrobial activity), 특히 항진균 활성(antifungal activity)을 나타낸다고 알려져 있다. 키틴 결합 단백질의 예를 들면, 키틴분해효소(chitinase, 참조: Schlumbaum, A. et al., Nature, 324:365-367, 1986), 밀 배아 응집소(wheat germ agglutinin, WGA, 참조: Andersen, N.H. et al., Biochem., 32:1407-1422, 1993), 바윈(barwin, 참조: Hejgaard, J. et al., FEEB Lett., 307-389-392, 1992), 식물 디펜신(plant defensin, 참조: Terras, F.R.G. et al., Plant Cell, 7:573-588, 1995), 렉틴(lectin, 참조: Peumans, W.J. et al., Plant Physiol., 109:347-352, 1995) 미라빌리스 자파라(Mirabilis japala)와 아마란터스 코다터스(Amaranthus caudatus)에서 유래한 항균 펩타이드(참조: Broekaert, W.F. et al., Biochemistry, 31:4308-4314, 1992; Cammue, B.P.A. et al., J. Biol. Chem., 267:2228-2233, 1992) 등이 발견되었으나, 현재까지는 상술한 단백질이 분자적인 수준에서 어떤 기작을 통해 항진균 활성 및/또는 항세균 활성을 나타내는지는 밝혀지지 않았다. 반 파리즈(Van Parijs) 등은 히베인과 유리티카 디오이카 응집소(Uritica dioicaagglutinin, UDA) 단백질의 항진균 활성은 전기 단백질의 크기와 관련이 있다고 보고하였는데(참조: Van Parijs et al., Planta, 183:258-264, 1991), 즉, 이들 단백질은 크기가 상당히 작아 진균의 세포벽을 뚫고 들어가 원형질막(plasma membrane)에 도달할 수 있으며, 그 곳에서 진균 세포벽의 형태 형성에 영향을 줄것으로 예상하였다. 또한, 시스테인이 풍부하며 작은 크기의 항균성 단백질인 티오닌(thionin)의 경우,진균의 원형질막에 구멍을 생성시켜 막을 파괴하고, 그 결과 미생물체가 사멸에 이르는 것으로 추측되고 있다(참조: Florak, D.E.A., and Stiekema, W.J., Plant Mol. Biol., 26:25-37, 1994).

상술한 항균성 단백질을 코딩하는 유전자를 농작물에 도입시키면 진균성 병원체의 감염을 부분적으로 억제할 수 있었으나, 다양한 진균 감염에 대하여 저항성을 나타내지 못할 뿐만 아니라, 어떤 경우에는 전이 식물체(transgenic plant)의 방어기작이 병원체 인식(pathogen recognition)에 있어서 종-특이적인 특성을 나타내어 사용에 적당하지 못하였다. 또한, 항균성 단백질의 열에 의한 변성 때문에 충분한 활성을 나타내지 못하는 경우도 있었으며, 전이 식물체에서 발생하는 원하지 않는 부작용도 우려되었다.

따라서, 다양한 세균 및 진균에 대하여 넓은 범위의 항균 활성을 나타내며, 동시에 안정하고 부작용이 적어 식물체의 진균 감염에 대한 저항성을 효과적으로 증가시킬 수 있는 기술을 개발하여야 할 필요성이 있어왔다.

이에, 본 발명자들은 유전공학적 기법에 의해 식물체에 효과적인 항균활성을 부여할 수 있는 기술을 확립하고자 예의 연구노력한 결과, 나팔꽃의 성숙 종자로부터 강력한 항균 활성을 가지는 Pn-AMP1 및 Pn-AMP2 펩타이드를 분리정제하고, 나팔꽃 종자의 cDNA 라이브러리로부터 전기 펩타이드들을 코딩하는 cDNA를 각각 분리하여, 이를 식물체 발현벡터에 클로닝하였다. 이어서, 전기 발현벡터로 형질전환된아그로박테리움을 매개로 전기 항균성 펩타이드를 발현하는 전이체 식물을 제조하여, 전기 전이체 식물이 광범위한 항진균 활성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 나팔꽃 종자로부터 유래된 항균성 펩타이드 Pn-AMP1 및 Pn-AMP2를 각각 코딩하는 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 전기 cDNA를 포함하는 식물체 발현벡터들을 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환되어 전이식물체를 제조하는 목적으로 사용할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 네번째 목적은 전기 항균성 펩타이드를 발현하여 항진균 내성을 가지는 전이식물세포 및 전이식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯번째 목적은 전기 재조합 미생물을 매개로 식물세포를 형질전이시켜 전기 식물세포가 전기 항균성 펩타이드를 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 항진균 내성을 가지는 전이식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 성숙 Pn-AMP1의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 성숙 Pn-AMP2의 아미노산 서열(서열번호 2)을 다른 키틴-결합 단백질들의 아미노산 서열과 상호 비교한 그림이다.

도 2는 Pn-AMP2 cDNA를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터 pLES9806의 유전자 지도이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 나팔꽃 유래 항균성 펩타이드 Pn-AMP는 나팔꽃의 성숙 종자로부터분리 정제되었으며, 다음과 같은 아미노산 서열을 가진다:

QQCG-x-QA-y-GRLCGNGLCCSQWGYCGSTAAYCGAGCQSQCK-z

상기에서,

x는 S 또는 R이고;

y는 R 또는 S이며; 및,

z는 S 또는 없다.

상기에서, 총 41개의 아미노산으로 구성되고, 5번째, 8번째 및 41번째 아미노산으로 각각 세린, 아르기닌 및 세린을 가지는 펩타이드를 'Pn-AMP1'이라 명명하였으며, 총 40개의 아미노산으로 구성되고, 5번째 및 8번째 아미노산으로 각각 아르기닌 및 세린을 가지는 펩타이드를 'Pn-AMP2'라 명명하였다.

Pn-AMP는 키틴 결합 능력을 가지고 있는 분자량 약 4kDa의 염기성 펩타이드로, 종래의 키틴-결합 단백질들과 본 발명의 Pn-AMP 간의 아미노산 서열상동성을 분석한 결과, Pn-AMP는 일반적인 키틴-결합 단백질에서 발견되는 시스테인과 글리신이 풍부한 키틴-결합 영역을 포함하고 있는 신규한 단백질임이 확인되었다. Pn-AMP의 아미노산 서열은 고무유액 히베인과 가장 유사하여 66%의 서열상동성을 보였으며, 서열의 차이는 키틴-결합 영역내의 가변지역에 한정되어 있었다. Pn-AMP와 다른 키틴-결합 단백질들간에는 시스테인 잔기들이 잘 보존되어 있었다. Pn-AMP는세포벽의 키틴 포함 여부에 상관없이 식물 감염성 진균을 포함한 다양한 진균종에 대하여 우수한 항균활성을 나타내었으며, 일부 세균에 대해서도 항균활성을 보였으나, 곤충 또는 동물세포에 대해서는 세포독성을 나타내지 않았다.

전기 Pn-AMP를 코딩하는 cDNA를 나팔꽃 성숙종자의 cDNA 라이브러리로부터 선별하였는 바, Pn-AMP1 cDNA를 포함하는 유전자 절편은 609bp의 크기를 가지며, 5'UTR(뉴클레오티드 1 내지 46), Pn-AMP1 cDNA(뉴클레오티드 47 내지 325), 및 3'UTR(뉴클레오티드 326 내지 609)로 구성되며, 특히 전기 Pn-AMP1 cDNA는 아미노 말단 신호펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 47 내지 121), Pn-AMP1 코딩영역(뉴클레오티드 122 내지 244) 및 카르복시 말단 펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 245 내지 325)으로 구성되어 있는 것으로 확인되었다. 한편, Pn-AMP2 cDNA를 포함하는 유전자 절편은 605bp의 크기를 가지며, 5'UTR(뉴클레오티드 1 내지 21), Pn-AMP2 cDNA(뉴클레오티드 22 내지 297), 및 3'UTR(뉴클레오티드 298 내지 605)로 구성되며, 특히 전기 Pn-AMP2 cDNA는 아미노 말단 신호펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 22 내지 96), Pn-AMP1 코딩영역(뉴클레오티드 97 내지 216) 및 카르복시 말단 펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 217 내지 297)으로 구성되어 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 발명의 Pn-AMP 1및 Pn-AMP2가 일단 각각 92개 아미노산과 91개 아미노산으로 구성되는 전구체 형태로 발현된 다음, 전사 후 변형과정을 거쳐 항균 활성을 나타내는 성숙 펩티드로 전환됨을 제시하였다.

본 발명은 또한, 진균 저항성 전이체 식물을 제조하는데 사용될 수 있는 Pn-AMP cDNA를 포함하는 식물체 발현벡터 및 이로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.본 발명의 바람직한 일실시예로서 Pn-AMP2 전구체 단백질의 전체 코딩 영역을 포함하는 뉴클레오티드 1 내지 340에 해당하는 340bp 크기의 cDNA 절편을 바이너리(binary) 벡터인 pGA643의 XbaII/ClaI 부위에 클로닝하여, 재조합 식물체 발현벡터인 pLES9806를 제조하였는 바, Pn-AMP2는 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 CaMV 35S 프로모터의 조절하에서 발현된다. 이어서, 전기 재조합 발현벡터 pLES9806로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 형질전환시켜, 항진균 내성을 가지는 전이식물체의 제조시 매개체로서 사용될 수 있는 형질전환체를 수득한 다음, 전기 형질전환체를 '아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404/pLES9806'이라 명명하고, 이를 1998년 11월 18일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 1 소재)에 기탁번호 'KCTC 0548BP'로 기탁하였다.

이어서, 본 발명의 Pn-AMP 펩타이드를 발현하는 항진균 내성을 가진 형질전이 식물체의 일례로서, 전기 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404/pLES9806를 이용하여, 리프 디스크 형질전환법(leaf disc transformation)으로 담배잎 세포에 Pn-AMP2 cDNA를 도입시키고, 이를 식물 성체의 생장을 유도하는 조건하에서 배양하여, Pn-AMP2를 발현하는 형질전이(tranasgenic) 담배를 제조하였다. 한편, 전기 형질전환된 담배 세포를 'Nicotiana tabacumcv. Xanthi-nc/pLES9806'이라 명명하였으며, 1998년 11월 18일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국대전광역시 유성구 어은동 1 소재)에 기탁번호 'KCTC 0549BP'로 기탁하였다.

전이 식물체의 진균 감염에 대한 저항성의 정도로써 도입된 Pn-AMP 유전자의 효능을 측정하고자, 전기 형질전이 담배를 피토프토라 파리시티카(Phytophthora parasiticapv. nicotianae)로 감염시키고 배양한 결과, 감염 7일후 형질전이 되지 않은 대조군 담배는 질병 증세를 나타내면서 완전히 사멸하였으나, 전이체 담배의 경우에는 피토프토라 파라시티카 감염에 의한 질병의 증세가 전혀 나타나지 않았으며, 담배잎에서도 균사의 성장이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 Pn-AMP를 코딩하는 유전자를 일반적인 전이식물체 제조방법에 따라 목적하는 식물세포에 도입함으로써, 농작물을 비롯한 각종 식물체의 항진균 내성을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 제시하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 나팔꽃 종자로부터 분리된 항균성 펩타이드

실시예 1-1: 항균성 펩타이드의 분리 및 정제

나팔꽃(Pharbitis nil L.)으로부터 수득한 후 건조된 성숙 종자 509g을 분쇄기로 고운 분말이 되도록 분쇄하고, 10mM 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 15mM 인산수소나트륨(Na2HPO4), 100mM 염화칼륨(KCl), 1mM EDTA 및 1mM 티오우레아(thiourea)가 포함된 추출용 완충용액(extraction buffer) 500ml에 넣어 현탁시켰다. 전기 현탁액을 4℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 30분간 32,000xg로 원심분리시키고, 이로부터 회수된 상층액에 고형 황산암모늄을 30% 상대포화(relative saturation) 농도에 이르도록 첨가하였다. 이어서, 전기 시료를 32,000xg의 조건으로 30분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 회수하여 다시 황산암모늄으로 70% 상대포화시키고, 이를 32,000xg의 조건으로 30분 동안 재원심분리하여 침전물을 수득하였다. 그런 다음, 전기 침전물을 180ml 증류수로 용해시키고, 전기 용액에 포함되어 있는 단백질을 불활성화시키기 위하여 80℃에서 15분간 열처리하였으며, 열에 의해 불활성화된 단백질은 32,000xg의 조건으로 30분동안 원심분리하여 제거하였다. 이로부터 수득한 상층액을 증류수에 대하여 투석한 후, 25mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)에 가하였다. 전기 용액을 동일한 완충용액으로 평형화시킨 CM 52-셀룰로오스 컬럼에 주입하고, 동일한 완충용액으로 수차례 세척한 다음, 520mM 염화나트륨이 포함된 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)으로 컬럼에 흡착된 단백질을 용출하였다. 후술하는 실시예 1-2의 방법에 따라 각 분획의 항균 활성을 조사하여, 활성분획만을 모아 ODS-A120 개방컬럼(open column, 1cmx15cm, C18, YMC-젤, Japan)에 주입하고, 증류수로 수차례 세척한 후, 0% 내지 80% 아세토니트릴 농도구배 조건으로 단백질을 용출하였다. 다시 각 분획의 항균 활성을 조사하여, 활성분획만을 모아 진공 농축기로 건조시키고, 건조된 시료를 0.05%의 TFA(trifluoroacetic acid)에 용해시킨 다음, 길슨(Gilson) HPLC 시스템에 연결된 ODS-120T 역상 HPLC 컬럼(0.5cm x 25cm, Toso, Tokyo, Japan)에 주입하였다. 0 내지 60%(v/v) 용액 B(0.05%(v/v) TFA/아세토니트릴)를 포함하는 용액 A(0.05% TFA/증류수)를 이용하여 1㎖/분의 유속조건으로 단백질을 용출한 결과, 거의 비슷한 시간대에 용출곡선 상에 두 개의 피크가 나타나, 두 분획을 수집하여 다시 전기와 동일한 조건으로 역상 HPLC를 수행하였다. 그 결과 두 개의 피크가 뚜렷이 구분되었으며, 각 피크에 해당하는 펩타이드 모두 다양한 진균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내었는 바, 각 펩타이드를 'Pn-AMP1' 및 'Pn-AMP2'라고 명명하였다. 전기 Pn-AMP1 및 Pn-AMP2 펩타이드를 18% SDS-PAGE로 분석한 결과, 각 펩타이드의 분자량은 약 4kDa으로 확인되었다.

실시예 1-2: 아미노산 서열분석 및 키틴-결합 분석

전기 실시예 1-1에서 수득한 Pn-AMP1과 Pn-AMP2의 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 각 펩타이드를 환원시키고 S-카르복실메틸화하여, 트립신으로 절단하였다(참조: Creighton, J.E. 1989. In Protein Structure, a practical approach. Creighton, T.E. eds., Pp155-167, IRL Press, Oxyford). 이로부터 생성된 각 펩타이드 절편을 ABI 473A Protein Sequencer(Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 아미노산 서열을 결정하였다. 그 결과, Pn-AMP1과 Pn-AMP2는 각각 41개와 40개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 5번째, 8번째 및 41번째 아미노산을 제외한 나머지 부분에서는 두 가지 펩티드가 동일한 아미노산 서열을 공유하고 있음을 확인하였다. 즉, Pn-AMP1(서열번호 1)은 5번째 아미노산이 세린, 8번째 아미노산이 아르기닌이고, 41번째 아미노산으로 세린을 가지고 있는 데 반하여, Pn-AMP2(서열번호 2)는 5번째 아미노산이 아르기닌, 8번째 아미노산이 세린이고, 41번째 아미노산이 결여되어 있다(참조: 도 1). 따라서, 전기 Pn-AMP1과 Pn-AMP2는 일종의 이소머(isomer) 관계에 있는 것으로 추측되며, Pn-AMP1과 Pn-AMP2를 총칭하여 'Pn-AMP'라 하기로 하였다.

한편, 종래의 키틴-결합 단백질들과 본 발명의 Pn-AMP 간의 서열상동성을 분석한 결과, 도 1에서 보듯이, Pn-AMP는 일반적인 키틴-결합 단백질에서 발견되는 시스테인과 글리신이 풍부한 키틴-결합 영역을 포함하고 있는 신규한 단백질임이 확인되었다. 도 1에서, 박스 내의 서열은 단백질 간의 동일한 아미노산 부분을 나타내고; 점은 배열을 위해 도입한 공백을 나타내며; Hevein은 고무유액 히베인(rubber latex hevein); CBP20은 담배 항진균 단백질; Barley CHI는 보리 키틴분해효소(barley chitinase); Rice CHI는 벼의 클래스 1 키틴분해효소(rice class I chitinase); UDA는 유리티카 디오이카 응집소(Uritica dioicaagglutinin); WGA3는 밀 배아 응집소 3 이소렉틴(isolectin); 및, Ac-AMP2는 애머랜터스 코다터스(Amaranthus caudatus) 유래 항진균 펩타이드를 각각 나타내며, 오른편의 숫자는 각 단백질의 아미노산 번호를 나타낸다. 도 1로부터 알 수 있듯이, Pn-AMP의 아미노산 서열은 고무유액 히베인과 가장 유사하여 66%의 서열상동성을보였으며, 서열의 차이는 키틴-결합 영역내의 가변지역에 집중되어 있다. 그러나, 이러한 높은 서열상동성에도 불구하고, Pn-AMP(pI=8.6)는 히베인(pI=4.6)에 비하여 강염기성을 띤다. 또한, Pn-AMP와 다른 키틴-결합 단백질들간에는 시스테인 잔기들이 잘 보존되어 있다. 한편, Pn-AMP1과 Pn-AMP2의 키틴에 대한 결합정도를 키틴 컬럼을 사용해서 측정한 결과, 두 펩타이드 모두 키틴에 강한 친화력을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 1-3: Pn-AMP의 항균 활성 측정

본 발명에서 분리 정제한 항균성 펩타이드의 항균 활성은 브로캘트(Broekaert) 등의 방법에 따라 현미분광광도법(microspectrophotometry)으로 측정한 바(참조: Broekaert, W.F., et al., Biochemistry, 31:4308-4314, 1992), 시험균으로는 세포벽에 키틴이 없는 곰팡이를 포함한 총 8가지의 식물감염성 진균 즉, 보트리티스 시너리아(Botrytis cinerea), 콜렉토트리컴 랑지나리움(Colletotrichum lamgenarium), 리조토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 피토프토라 파라시티카(Phytophthora parasitica), 피토프토라 캅시시(Phytophthora capsici), 피시움(Pythium spp.) 및 스레로티니아 스레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum)과, 효모인 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였다. 모든 균을 PDB 배지(potato dextrose broth medium) 또는 V8 아가 배지를 사용하여25℃에서 배양하고, 곰팡이 포자 또는 균사를 두빅(Duvick) 등의 방법(참조: Duvick, J.P., et al., J. Biol. Chem., 267:18814-18820, 1992)과 싱글톤(Singleton) 등의 표준방법(참조: Singleton, L.L., et al., In Methods for Research on Soil-borne Phytopathogenic Fungi, APS Press, Minnesota, 1992)에 따라 수집하였다. 이어서, 1㎖당 104 개의 곰팡이 포자나 100개의 곰팡이 균사조각, 또는 105 개의 효모를 포함하는 PDB(patato dextrose broth) 배지 80㎕가 들어있는 96웰 플레이트에 다양한 농도의 펩타이드 용액 20㎕를 가하고 잘 혼합하였다. 이때, 대조군에는 펩타이드 용액 대신 살균한 증류수를 가하였다. 25℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 595nm에서 흡광도를 측정함으로써 성장저해율을 산술하였으며, 펩타이드 농도에 따른 성장저해율 곡선으로부터 50% 성장저해에 필요한 펩타이드의 농도(IC50)를 결정하였다. 그 결과, Pn-AMP는 넓은 범위의 곰팡이와 효모에 대하여 강력한 항균 활성을 나타내어, 진균에 대한 Pn-AMP의 IC50는 0.6 내지 75㎍/㎖이었으며, 이 값은 종래의 키틴 결합 단백질인 애머랜스(amaranth) Ac-AMP의 동일 균에 대한 IC50와 비슷하였다(참조: Broekaert, W.F., et al., Biochemistry, 31:4308-4314, 1992). 또한, Pn-AMP1 및 Pn-AMP2는 키틴을 포함하고 있는 진균뿐만 아니라, 세포벽에 키틴을 포함하고 있지 않은 진균인 난균류(Oomycetes)에까지 광범위한 저해효과를 나타내어, Pn-AMP의 키틴에 대한 친화력이 진균의 성장 저해에 필수적이지는 않음을 시사하였다.

한편, 티오닌(참조: Terras, F.R.G. et al. Plant Physiol. 103:1311-1319, 1993), Ac-AMP 및 식물 디펜신스(defensins, 참조: Osborn, R.W. et. al. 1995.FEBS Lett. 368:257-262) 등 몇 가지 염기성을 띠는 항균성 펩타이드들은 양이온, 특히 CaCl2에 의해서 강력하게 저해되는 것으로 보고되었는 바, Pn-AMP1 및 Pn-AMP2에 대한 CaCl2의 길항효과(antagonistic effect)를 보기 위하여, 전기와 동일한 방법으로 각종 균을 배양하면서 성장 배지에 5mM의 CaCl2를 첨가한 결과, CaCl2가 존재할 때 Pn-AMP의 IC50 값이 47배 내지 250배 증가함을 확인하였다.

Pn-AMP가 그람 음성 세균(E. coli,Agrobacterium tumefaciens)과 그람 양성 세균(Bacillus subtilis)에 대해서도 성장저해 효과를 보이는지 검사해보기 위해서, 1ml 당 105 개의 세균을 포함하는 LB 아가 배지 80㎕가 들어있는 96웰 플레이트에 다양한 농도의 펩타이드 용액 20㎕를 가하고 잘 혼합하였다. 이어서, 전기와 동일한 방법으로 Pn-AMP의 항균활성을 조사한 결과, Pn-AMP1 및 Pn-AMP2 모두 200㎍/㎖의 농도에서도 그람 음성세균의 생존에는 아무런 영향을 미치지 않았다. 하지만, 그람 양성세균인 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에 대하여 Pn-AMP1의 경우에는 38㎍/㎖의 IC50 값으로, Pn-AMP2의 경우에는 20㎍/㎖의 IC50 값으로 성장을 저해하였으며, 배지에 5mM의 CaCl2를 첨가시에는 Pn-AMP1 및 Pn-AMP2 모두 250㎍/㎖의 농도에서 바실러스 서브틸리스의 성장을 저해하였다.

실시예 1-4: Pn-AMP의 세포독성 분석

본 발명의 Pn-AMP의 세포독성을 조사하기 위하여, 원숭이 간 세포주인 MA104 세포주와 곤충세포주인 Sf9(Spodoptera Frungiperda 9) 세포주를 이용하여, 브로캘트의 방법(참조: Broekaert, W.F., et al., Biochemistry, 31:4308-4314, 1992)에 따라 세포의 생육성 시험을 수행하였다: Sf9 세포는 그레이스 배지(Grace's media, Life Technologies, Inc., U.S.A.)에서, MA104 세포는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, Life Technologies, Inc., U.S.A)에서, 각각 배양한 다음, Pn-AMP를 첨가하여 24시간 동안 더 배양하고, 트립판 블루(trypan blue)로 염색하여, 염색된 세포의 수를 현미경으로 관찰하며 계수하였다. 그 결과, Pn-AMP는 동물세포 및 곤충세포의 생존에는 아무런 영향을 미치지 못하는 것이 확인되었다.

실시예 2: Pn-AMP cDNA의 클로닝

실시예 2-1: 나팔꽃 종자 cDNA 라이브러리의 제조

Pn-AMP를 코딩하는 cDNA를 클로닝하고자, 먼저 나팔꽃 종자 cDNA 라이브러리를 제조하였다: 개화 후 40일이 경과한 나팔꽃으로부터 성숙 종자 2g을 수득하여, 전제 RNA를 추출한 다음, 이로부터 폴리(A)+ RNA만을 분리하였다. 이어서, λZAPII cDNA 합성 킷트(Stratagene, U.S.A.)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 전기 폴리(A)+ RNA로부터 이중가닥의 cDNA를 합성하고, 이를 pBluescriptII (SK-) 플라스미드(Stratagene, U.S.A.)의 EcoRI/XhoI 부위에 클로닝하여, 나팔꽃 종자 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 전기 cDNA 라이브러리의 플라스미드로 대장균 XL1-blue(Stratagene, U.S.A.)를 전기충격법(electrop oration)으로 형질전환시키고,100㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트에서 배양한 결과, 평균 104개의 콜로니가 형성되었다.

실시예 2-2: Pn-AMP cDNA를 포함하는 클론의 선별

나팔꽃 종자 cDNA 라이브러리로부터 Pn-AMP cDNA를 포함하는 클론을 선별하는데 사용할 프로브는, 전기 실시예 2-1에서 제조한 바 있는, 나팔꽃의 성숙 종자에서 추출한 mRNA로부터 합성된 이중가닥 cDNA를 주형으로 사용하는 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)으로부터 수득하였다. 이때, 프라이머로는 Pn-AMP1 및 Pn-AMP2에서 발견되는 키틴-결합 영역의 아미노산 서열(CCSQWGYC)로부터 유추하여 합성된, 다음과 같은 염기서열을 가지는 CG1 프라이머와 올리고(dT) 프라이머를 사용하였다:

CG1 프라이머:

5'-TG(C/T)TG(C/T)(A/T)(C/G)NCA(A/G)TGGGGNTA(C/T)TG(C/T)GG-3'(서열번호 3)

전기 PCR 반응액은 50ng의 이중가닥 cDNA, 100ng의 CG1 프라이머, 20ng의 올리고(dT) 프라이머, Taq DNA 중합효소 및 반응 완충용액을 포함하며, 총 반응 부피는 50㎕로 조정하였다. 전기 반응액을 94℃에서 2분동안 열처리한 다음, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 구성되는 반응주기를 40회 반복수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 최종반응시켰다. 반응이 완료된 다음, 증폭산물을 1% 아가로오스 젤로 분리하여, 500bp 크기의 DNA 절편을 젤로부터 정제하고, Random-Priming Labeling Kit(Amersham, U. S. A.)를 사용하여 α-32P[dCTP]로 표지하였다.

실시예 2-3: Pn-AMP1 및 Pn-AMP2 cDNA 클론의 선별

전기 실시예 2-1에서 수득한 약 104 개의 형질전환된 대장균 콜로니에 대하여, 전기 실시예 2-2에서 제조한 32P로 표지된 500bp 프로브를 이용하여 인 시투 콜로니 하이브리다이제이션(in situ colony hybridization)을 2회 연속 수행하였다. 그 결과, 50개의 양성 클론이 선별되었다. 전기 양성 클론으로부터 플라스미드 DNA를 각각 추출하고, Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit(Perkin-Elmer, U.S.A.)를 이용하여, ABI 373A 자동 DNA 서열분석기(Applied Biosystems Inc., U.S.A.)로 전기 플라스미드들에 포함되어 있는 cDNA 절편의 염기서열을 분석하였다. 총 50개의 클론 중 35개 클론에 포함되어 있는 cDNA 절편들이 5' 및 3' 말단 부분의 길이가 약간씩 다른 점을 제외하고는, 동일한 염기서열을 나타내었다. 그 중 가장 길이가 긴 cDNA 절편의 길이는 609bp로(서열번호 4), DNASIS 프로그램으로 염기서열을 분석한 결과, 5'UTR(뉴클레오티드 1 내지 46), Pn-AMP1 cDNA(뉴클레오티드 47 내지 325; 서열번호 5), 및 3'UTR(뉴클레오티드 326 내지 609)로 구성되며, 특히 전기 Pn-AMP1 cDNA는 아미노 말단 신호펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 47 내지 121), Pn-AMP1 코딩영역(뉴클레오티드 122 내지 244) 및 카르복시 말단 펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 245 내지 325)으로 구성되어 있는 것으로 확인되었다.

한편, 50개의 클론 중 전기 35개 클론을 제외한 15개 클론에 포함되어 있는 cDNA 절편 역시 5' 및 3' 말단 부분의 길이가 약간씩 다른 점을 제외하고는, 동일한 염기서열을 나타내었다. 그 중 가장 길이가 긴 cDNA 절편의 길이는 605bp로(서열번호 6), DNASIS 프로그램으로 염기서열을 분석한 결과, 5'UTR(뉴클레오티드 1 내지 21), Pn-AMP2 cDNA(서열번호 7; 뉴클레오티드 22 내지 297), 및 3'UTR(뉴클레오티드 298 내지 605)로 구성되며, 특히 전기 Pn-AMP2 cDNA는 아미노 말단 신호펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 22 내지 96), Pn-AMP2 코딩영역(뉴클레오티드 97 내지 216) 및 카르복시 말단 펩티드 코딩영역(뉴클레오티드 217 내지 297)으로 구성되어 있는 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 본 발명의 Pn-AMP 1및 Pn-AMP2가 일단 각각 92개 아미노산(서열번호 8)과 91개 아미노산(서열번호 9)으로 구성되는 전구체 형태로 발현된 다음, 전사 후 변형과정을 거쳐 항균 활성을 나타내는 성숙 펩티드로 전환됨을 제시하였다.

실시예 3: Pn-AMP2 식물체 발현벡터 및 형질전환체의 제조

Pn-AMP2 식물체 발현벡터를 제조하고자, 전기 pBluescriptII SK(-) 벡터에 들어있는 605bp cDNA 전장을 XbaII/ClaI으로 완전히 절단하여, 0.8% 아가로오스 젤에서 전개하고, Pn-AMP2 전구체 단백질의 전체 코딩 영역을 포함하는 뉴클레오티드1 내지 340에 해당하는 340bp 크기의 절편을 젤로부터 분리 정제하였다. 전기 340bp cDNA 절편을 바이너리(binary) 벡터인 pGA643의 XbaII/ClaI 부위에 클로닝하여, 재조합 식물체 발현벡터인 pLES9806를 제조하였다(참조: 도 2). 도 2에서, npt Ⅱ는 카나마이신 저항성을 나타내는 키메릭 유전자로서 노파린(nopaline) 합성효소 유전자의 프로모터 및 전사종결자와 네오마이신 인산전이효소 Ⅱ 코딩서열을 포함하고, CaMV 35S는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV)의 35S 프로모터를 나타낸다.

이어서, 전기 재조합 발현벡터 pLES9806로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 일렉트로포레이션으로 형질전환시킨 다음, 10㎍/㎖의 카나마이신 및 5㎍/㎖의 테트라사이클린을 포함하는 LB 아가 플레이트 선택배지에 도말하고, 28℃에서 2일 동안 배양하여 형질전환체를 선택하였다. 선택된 형질전환체를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404/pLES9806'이라 명명하고, 이를 1998년 11월 18일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 1 소재)에 기탁번호 'KCTC 0548BP'로 기탁하였다.

실시예 4: 형질전이 담배의 제조

아그로박테리움이 매개하는 리프 디스크 형질전환법(agrobacterium-mediatedleaf disc transformation)으로 Pn-AMP2를 발현하는 형질전이(transgenic) 담배를 제조하였다(참조: Horsch, R. et al., 1984, Science, 233:496-498): 담배(Nicotiana tabacumcv. Xanthi-nc)의 리프 디스크에 전기 실시예 3에서 수득한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404/pLES9806(KCTC 0548BP)를 접종하고 2일 동안 배양하여, pLES9806 벡터에 포함되어 있는 Pn-AMP2 cDNA가 담배 세포의 염색체 내로 삽입되도록 한 다음, 이와 같이 형질전환된 담배 세포를 선택배지(0.5㎎/l 소 알부민, Murashige-Skoog 염, 3% 수크로오스, 100mg/l 카나마이신, 250mg/l 수도펜 및 0.8% 아가를 포함함)로 옮겨 칼루스(callus)의 생성을 유도하였다. 전기 칼루스를 배양한지 한달이 경과한 다음, 재생한 줄기를 질석(vermiculite), 펠라이트(perlite) 및 초탄(peat moss)이 동일비율로 혼합된 모판으로 옮기고, 25℃의 배양기에서 낮길이(day-length) 16시간인 조건으로 배양하여 형질전이 담배를 성장시켰다. 한편, 전기 형질전환된 담배 세포를 'Nicotiana tabacumcv. Xanthi-nc/pLES9806'이라 명명하고, 1998년 11월 18일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 1 소재)에 기탁번호 'KCTC 0549BP'로 기탁하였다.

실시예 5: 형질전이 담배에서 Pn-AMP2의 발현 및 항-진균 내성 조사

실시예 5-1: 면역블랏 분석

전기 실시예 4에서 제조된 형질전이 담배에서의 Pn-AMP2 발현을 면역블랏 분석으로 확인하였다: 형질전이 담배(KCTC 0549BP)의 잎을 분쇄하고, 추출 완충용액(50mM 인산나트륨 완충용액, pH 6.0 및 0.1mM PMSF)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 전기 추출물을 12,000xg의 조건으로 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 80℃에서 15분간 방치하여 열변성시킨 다음, 원심분리로 침전물을 제거하고, 농축과정을 거쳐 약 12㎍의 용해성 단백질을 수득하였다. 전기 단백질을 17% SDS-PAGE로 전개한 다음, 토끼의 항-Pn-AMP2 항체를 1차 항체로 사용하고, HRP(horse radish peroxidase)-결합 염소 항-토끼 면역글로블린 G 항체를 2차 항체로 사용하여 면역블랏을 수행하였다. ECL 검출 용액(Amersham protein detection system, USA)으로 발색반응을 시켜, 본 발명의 형질전이 담배에서 Pn-AMP2 단백질이 발현됨을 확인하였다.

한편, 전술한 면역블랏 분석에 사용한 토끼의 항-Pn-AMP2 항체는, 프로인트의 컴플리트 아주반트(Freund's complete adjuvant)내의 실리카 매트릭스에 결합되어 있는 1㎎의 정제된 Pn-AMP2를 토끼에게 피하주사로 면역시키고, 동일한 항원으로 부스팅(boosting) 주사를 3주 간격으로 수행하여 제조하였다.

실시예 5-2: 형질전이 담배의 항-진균 내성 조사

전기 실시예 5-1에서 본 발명의 형질전이 담배가 항균 활성을 가지는 Pn-AMP2 펩티드를 발현하는 것으로 확인되었는 바, 다음과 같은 방법으로 전기 형질전이 담배의 항-진균 내성을 조사하였다: 1 리터당 건조된 정상 담배잎 1g이 첨가된 V8 아가에 피토프토라 파리시티카(Phytophthora parasiticapv. nicotianae) 균사체를 접종하여, 25℃에서 계속 빛을 쬐여 주며 2 내지 4주동안 배양하였다. 진균의 균사체 집락이 형성되면, 전기 균사체를 포함하는 아가 디스크(∼8mm2)를 떼어낸 다음, 멸균상태에서 4주 동안 배양한 전이되거나 또는 전이되지 않은 담배 식물체를 포함하는 MS 아가 배지로 옮겨, 담배 식물체가 피토프토라 파리시티카로 감염되도록 하였다. 감염된 담배 식물체는 25℃에서 낮 길이를 16시간으로 하여 배양기에서 배양하였다. 감염후 7일째, 대조군 담배는 질병 증세를 나타내면서 완전히 사멸하였으나, 전이체 담배의 경우에는 피토프토라 파라시티카 감염에 의한 질병의 증세가 전혀 나타나지 않았다. 대조군 담배와 전이체 담배의 잎을 채취하여 아닐린 블루로 염색하고 현광현미경으로 관찰한 결과, 대조군 담배의 잎에서는 피토프토라 파라시티카의 균사가 넓게 퍼져 있었으나, 형질전이된 담배의 잎에서는 균사의 성장이 관찰되지 않았으며, 형광물질이 포자낭 내에 침전되어 밝은 형광을 나타내었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 나팔꽃(Pharbitis nil L.) 종자로부터 유래된 항균성 펩타이드의 cDNA를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터 및 이를 이용한 항진균 내성을 가지는 형질전이 식물체(transgenic plant)의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 항균성 펩타이드 Pn-AMP는 다양한 진균에 대하여우수한 항균 활성을 가지므로, 본 발명의 항진균 내성을 가지는 형질전이 식물체(transgenic plant)의 제조방법에 따라 Pn-AMP를 코딩하는 유전자를 원하는 식물세포에 도입함으로써, 진균감염에 대하여 내성을 가지는 전이 식물체를 용이하게 제조할 수 있을 것이다.

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나팔꽃(Pharbitis nil L.) 종자로부터 유래된 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 항균성 펩타이드 Pn-AMP2의 전구체 단백질을 코딩하는 서열번호 7로 나타내어지는 cDNA를 포함하며, 다음과 같은 유전자 지도를 가지는 재조합 식물체 발현벡터 pLES9806:
제 5항의 식물체 발현벡터 pLES9806로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404(KCTC 0548BP).
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Pn-AMP2를 발현하는 재조합 담배 세포주Nicotiana tabacumcv.Xanthi-nc/pLES9806(KCTC 0549BP).
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