JP2000245483A - アサガオ（ＰｈａｒｂｉｔｉｓｎｉｌＬ．）種子由来の抗菌性ペプチドを発現するトランスジェニック植物体 - Google Patents
アサガオ（ＰｈａｒｂｉｔｉｓｎｉｌＬ．）種子由来の抗菌性ペプチドを発現するトランスジェニック植物体Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】本発明はアサガオ（Pharbitis nil L.)種
子由来の抗菌性ペプチドを発現するトランスジェニック
植物体、前記ペプチドをコードするcDNA、前記cDNAを含
む組み換え植物体発現ベクター及びそれを用いた抗真菌
耐性を有するトランスジェニック植物体の製造方法に関
する。本発明の抗菌性ペプチドPn-AMPは多様な真菌に対
して優れた抗菌活性を有しているため、前記ペプチドを
発現するトランスジェニック植物体は多様な病因菌の感
染に対して強い耐性を有することができる。
子由来の抗菌性ペプチドを発現するトランスジェニック
植物体、前記ペプチドをコードするcDNA、前記cDNAを含
む組み換え植物体発現ベクター及びそれを用いた抗真菌
耐性を有するトランスジェニック植物体の製造方法に関
する。本発明の抗菌性ペプチドPn-AMPは多様な真菌に対
して優れた抗菌活性を有しているため、前記ペプチドを
発現するトランスジェニック植物体は多様な病因菌の感
染に対して強い耐性を有することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアサガオ(Pharbitis
nil L.)種子由来の抗菌及び抗真菌性ペプチドを発現す
るトランスジェニック植物体に関する。より具体的に
は、本発明はアサガオ種子由来の抗菌性ペプチドをコー
ドするcDNA、前記ペプチドの組み換え植物体発現ベクタ
ー、及び病原性微生物に対する耐性を有するトランスジ
ェニック植物体に関する。
nil L.)種子由来の抗菌及び抗真菌性ペプチドを発現す
るトランスジェニック植物体に関する。より具体的に
は、本発明はアサガオ種子由来の抗菌性ペプチドをコー
ドするcDNA、前記ペプチドの組み換え植物体発現ベクタ
ー、及び病原性微生物に対する耐性を有するトランスジ
ェニック植物体に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物は病因菌の侵入から避けることがで
きる運動性を有していないので、直接又は間接的な対応
によりそれ自身を保護しなければならないのである。こ
のような観点から、農業において病因性真菌(fungal pa
thogen)の防除は重要な課題となり、農作物を栽培する
際に、真菌が起因になって発生する病を防ぐための努力
が続いてきた。主に、真菌防除のための従来の研究は、
衛生学的又は化学的分野に集まっており、効果的殺真菌
剤(fungicide)の開発につれ、ある程度、真菌感染によ
る損害が低減してきた。しかしながら、ボトリティス・
シネリア(Botrytiscinerea)、フサリウム・オキシスポ
ラム(Fusarium oxysporum)、フィトフトラ・パラシティ
カ(Phytophthora parasitica)、アルテナリア・アルテ
リザタ(Alternaria alterizata）等のような多様の真菌
類に対しては、それに抵抗性を有する農作物を開発する
ための育種研究や遺伝子工学研究で多大な成果を納め得
なかった。
きる運動性を有していないので、直接又は間接的な対応
によりそれ自身を保護しなければならないのである。こ
のような観点から、農業において病因性真菌(fungal pa
thogen)の防除は重要な課題となり、農作物を栽培する
際に、真菌が起因になって発生する病を防ぐための努力
が続いてきた。主に、真菌防除のための従来の研究は、
衛生学的又は化学的分野に集まっており、効果的殺真菌
剤(fungicide)の開発につれ、ある程度、真菌感染によ
る損害が低減してきた。しかしながら、ボトリティス・
シネリア(Botrytiscinerea)、フサリウム・オキシスポ
ラム(Fusarium oxysporum)、フィトフトラ・パラシティ
カ(Phytophthora parasitica)、アルテナリア・アルテ
リザタ(Alternaria alterizata）等のような多様の真菌
類に対しては、それに抵抗性を有する農作物を開発する
ための育種研究や遺伝子工学研究で多大な成果を納め得
なかった。
【０００３】最近、当該分野において病因-関連（Ｐ
Ｒ）タンパク質(pathogenesis-relatedprotein)やフィ
トアレキシン(phytoalexin)等のような相異なる分子量
群に属する抗菌剤からなる植物体の動的防御体系(dynam
ic defense system)の研究が行われてきている。植物
は、病原菌から自分自身を保護するための高等動物に見
られる免疫系を有しておらず、主としてシステイン及び
グリシンに富む種々の小さい抗菌性タンパク質等の抗菌
剤によって、病原菌の侵入から自分自身を保護してい
る。
Ｒ）タンパク質(pathogenesis-relatedprotein)やフィ
トアレキシン(phytoalexin)等のような相異なる分子量
群に属する抗菌剤からなる植物体の動的防御体系(dynam
ic defense system)の研究が行われてきている。植物
は、病原菌から自分自身を保護するための高等動物に見
られる免疫系を有しておらず、主としてシステイン及び
グリシンに富む種々の小さい抗菌性タンパク質等の抗菌
剤によって、病原菌の侵入から自分自身を保護してい
る。
【０００４】このような抗菌性タンパク質の中で、ヘベ
イン(hevein)領域を有したキチン結合タンパク質は相互
類似な配列を共有し、多様な抗菌活性、特に抗真菌活性
を表すと知られている。例えば、キチン結合タンパク質
の中に、キチナーゼ(参照：Schumbaum, A.ら, Nature,
324:365-367, 1986)、小麦胚芽の凝集素(wheat germagg
lutinin, WGA,参照：Andersen, N. H.ら, Biochem., 3
2:1407-1422, 1993)、バーウィン(barwin,参照：Hejgaa
rd, J.ら, FEBS Lett., 307：389-392, 1992)、植物ディ
フェンシン(plantdefensin, 参照：Terras, F. R. G.
ら, Plant Cell,7:573-588, 1995)、レクチン(参照：Pe
umans, W. J.ら, Plant Physiol., 109:347-352, 199
5)、ミラビリス・ジャラパ(Mirabilis jalapa)とアマラ
ンサス・コダタス(Amaranthus caudatus)由来の抗菌ペ
プチド(参照：Broekaert, W. F.ら,Biochemistry, 31:4
308-4314, 1992; Cammue, B. P. A.ら, J. Biol. Che
m., 267:2228-2233, 1992)等が挙げられる。
イン(hevein)領域を有したキチン結合タンパク質は相互
類似な配列を共有し、多様な抗菌活性、特に抗真菌活性
を表すと知られている。例えば、キチン結合タンパク質
の中に、キチナーゼ(参照：Schumbaum, A.ら, Nature,
324:365-367, 1986)、小麦胚芽の凝集素(wheat germagg
lutinin, WGA,参照：Andersen, N. H.ら, Biochem., 3
2:1407-1422, 1993)、バーウィン(barwin,参照：Hejgaa
rd, J.ら, FEBS Lett., 307：389-392, 1992)、植物ディ
フェンシン(plantdefensin, 参照：Terras, F. R. G.
ら, Plant Cell,7:573-588, 1995)、レクチン(参照：Pe
umans, W. J.ら, Plant Physiol., 109:347-352, 199
5)、ミラビリス・ジャラパ(Mirabilis jalapa)とアマラ
ンサス・コダタス(Amaranthus caudatus)由来の抗菌ペ
プチド(参照：Broekaert, W. F.ら,Biochemistry, 31:4
308-4314, 1992; Cammue, B. P. A.ら, J. Biol. Che
m., 267:2228-2233, 1992)等が挙げられる。
【０００５】キチン結合タンパク質が分子レベルでどう
いう機構を通じて抗真菌活性及び／又は抗細菌活性を表
わすかは今まで明らかになっていない。Van Parijsらは
ヘベイン及びユリティカ・ディオイカ凝集素(Uritica dio
ica agglutinin, UDA)の抗真菌活性は、そのタンパク質
分子の大きさと関連があると報告している(参照：VanPa
rijsら, Planta, 183:258-264, 1991)。すなわち、それ
らのタンパク質の大きさがかなり小さいため、真菌の細
胞壁を通過して原形質膜に至ることができ、そこで真菌
細胞壁の形態形成に影響を及ぼすと予測した。さらに、
強塩基性で、システインに富む小さい抗菌性タンパク質
であるチオニン(thionin)の場合は、原形質膜に穴を作
って、膜を破壊し、その結果、微生物体が死んでしまう
と推測されている(参照：Florak, D. E. A.及びStiekem
a, W. J., Plant Mol. Biol.,26:25-37, 1994)。
いう機構を通じて抗真菌活性及び／又は抗細菌活性を表
わすかは今まで明らかになっていない。Van Parijsらは
ヘベイン及びユリティカ・ディオイカ凝集素(Uritica dio
ica agglutinin, UDA)の抗真菌活性は、そのタンパク質
分子の大きさと関連があると報告している(参照：VanPa
rijsら, Planta, 183:258-264, 1991)。すなわち、それ
らのタンパク質の大きさがかなり小さいため、真菌の細
胞壁を通過して原形質膜に至ることができ、そこで真菌
細胞壁の形態形成に影響を及ぼすと予測した。さらに、
強塩基性で、システインに富む小さい抗菌性タンパク質
であるチオニン(thionin)の場合は、原形質膜に穴を作
って、膜を破壊し、その結果、微生物体が死んでしまう
と推測されている(参照：Florak, D. E. A.及びStiekem
a, W. J., Plant Mol. Biol.,26:25-37, 1994)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】抗真菌性タンパク質を
コードする遺伝子を農作物に導入することにより、真菌
性病原体の感染を部分的に抑えることができるが、トラ
ンスジェニック植物体の防御機構が種−特異的な病原体
認識に基づくものであること、トランスジェニック植物
体の発現タンパク質が熱変性のために充分な生物活性を
表さないこと、植物体から発生する予想できない副作用
の恐れもあること等から、満足すべきものでないことが
判明した。したがって、種々の細菌及び真菌に対して広
範囲の抗菌活性を表すと共に、安定で副作用のない、植
物体の抗菌性を効果的に増加させることができる技術の
開発が求められてきた。
コードする遺伝子を農作物に導入することにより、真菌
性病原体の感染を部分的に抑えることができるが、トラ
ンスジェニック植物体の防御機構が種−特異的な病原体
認識に基づくものであること、トランスジェニック植物
体の発現タンパク質が熱変性のために充分な生物活性を
表さないこと、植物体から発生する予想できない副作用
の恐れもあること等から、満足すべきものでないことが
判明した。したがって、種々の細菌及び真菌に対して広
範囲の抗菌活性を表すと共に、安定で副作用のない、植
物体の抗菌性を効果的に増加させることができる技術の
開発が求められてきた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この故、本発明者らは植
物体に効果的な抗菌活性を与えることができ、熱に安定
で、副作用のない抗菌ペプチドを分離するために鋭意研
究努力した結果、成熟したアサガオ(Pharbitis nil L.)
の種子より強力な抗菌活性を有するPn-AMP1及びPn-AMP2
ペプチドを分離精製し、アサガオ種子のcDNAライブラリ
ーにより前記ペプチドらをコードするcDNAを各々分離し
て、それを植物体の発現ベクター中にクローニングを行
った。次に、アグロバクテリウムを媒介にし、前記抗菌
性ペプチドを発現する植物体を製造し、前記植物体が広
範囲の抗病因菌活性を示すことを見出し、本発明を完成
するに至った。
物体に効果的な抗菌活性を与えることができ、熱に安定
で、副作用のない抗菌ペプチドを分離するために鋭意研
究努力した結果、成熟したアサガオ(Pharbitis nil L.)
の種子より強力な抗菌活性を有するPn-AMP1及びPn-AMP2
ペプチドを分離精製し、アサガオ種子のcDNAライブラリ
ーにより前記ペプチドらをコードするcDNAを各々分離し
て、それを植物体の発現ベクター中にクローニングを行
った。次に、アグロバクテリウムを媒介にし、前記抗菌
性ペプチドを発現する植物体を製造し、前記植物体が広
範囲の抗病因菌活性を示すことを見出し、本発明を完成
するに至った。
【０００８】従って、本発明の一番目の目的は、成熟ア
サガオ種子由来の新規な抗菌性ペプチドをコードするcD
NAを提供することにある。本発明の二番目の目的は、前
記cDNAを含む植物体の発現ベクターを提供することにあ
る。本発明の三番目の目的は、前記発現ベクターで形質
転換されて、トランスジェニック植物体を製造するため
に使用可能な組み換え微生物を提供することにある。本
発明の四番目の目的は、前記抗菌性ペプチドを発現する
トランスジェニック植物体を提供することにある。本発
明の五番目の目的は、抗病因菌耐性を有するトランスジ
ェニック植物体の製造方法を提供することにある。
サガオ種子由来の新規な抗菌性ペプチドをコードするcD
NAを提供することにある。本発明の二番目の目的は、前
記cDNAを含む植物体の発現ベクターを提供することにあ
る。本発明の三番目の目的は、前記発現ベクターで形質
転換されて、トランスジェニック植物体を製造するため
に使用可能な組み換え微生物を提供することにある。本
発明の四番目の目的は、前記抗菌性ペプチドを発現する
トランスジェニック植物体を提供することにある。本発
明の五番目の目的は、抗病因菌耐性を有するトランスジ
ェニック植物体の製造方法を提供することにある。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明をより具体的に説明
する。本発明のアサガオ成熟種子由来の抗菌性ペプチド
（以下Pn-AMPという）は成熟したアサガオ種子より分離
精製されて下記アミノ酸配列： QQCG-x-QA-y-GRLCGNGLCCSQWGYCGSTAAYCGAGCQSQCK-z （式中、xはS又はRを示し、yはR又はSを示し、及びzはS
又はないことを示す）を有し、Pn-AMP1及びPn-AMP2が含
まれる。上記で、「Pn-AMP1」（アミノ酸配列を配列番
号１に示す）は、４１個のアミノ酸からなり、第５位、
第８位及び第４１位のアミノ酸として各々セリン、アル
ギニン及びセリンを有するペプチドを意味し、又、「Pn
-AMP2」（アミノ酸配列を配列番号２に示す）は、４０
個のアミノ酸からなり、第５位及び第８位のアミノ酸と
して各々アルギニン及びセリンを有するペプチドを意味
する。
する。本発明のアサガオ成熟種子由来の抗菌性ペプチド
（以下Pn-AMPという）は成熟したアサガオ種子より分離
精製されて下記アミノ酸配列： QQCG-x-QA-y-GRLCGNGLCCSQWGYCGSTAAYCGAGCQSQCK-z （式中、xはS又はRを示し、yはR又はSを示し、及びzはS
又はないことを示す）を有し、Pn-AMP1及びPn-AMP2が含
まれる。上記で、「Pn-AMP1」（アミノ酸配列を配列番
号１に示す）は、４１個のアミノ酸からなり、第５位、
第８位及び第４１位のアミノ酸として各々セリン、アル
ギニン及びセリンを有するペプチドを意味し、又、「Pn
-AMP2」（アミノ酸配列を配列番号２に示す）は、４０
個のアミノ酸からなり、第５位及び第８位のアミノ酸と
して各々アルギニン及びセリンを有するペプチドを意味
する。
【００１０】Pn-AMPはキチン結合能を有する分子量約４
ｋDaの塩基性ペプチドである。本発明のPn-AMPのアミノ
酸配列を分析した結果、Pn-AMPは他のキチン-結合タン
パク質の配列に相同性を有するシステインとグリシンに
富むキチン結合ドメインを含んでいる新規のタンパク質
であることが確認された。特に、Pn-AMP1及びPn-AMP2の
アミノ酸配列はゴムラテックスであるヘベインと66%の
配列相同性を示し、配列の違いはキチン-結合ドメイン
内の可変領域に多く位置していた。Pn-AMPと他のキチン
-結合タンパク質において、システイン残基はよく保存
されていた。Pn-AMPは、真菌細胞壁がキチンを包含する
か否かに関わらず、広範な真菌種に対して優れた抗菌活
性を示しており、一部の細菌に対しても抗菌活性を示す
が、昆虫細胞または哺乳動物細胞に対しては細胞毒性を
表さなかった。
ｋDaの塩基性ペプチドである。本発明のPn-AMPのアミノ
酸配列を分析した結果、Pn-AMPは他のキチン-結合タン
パク質の配列に相同性を有するシステインとグリシンに
富むキチン結合ドメインを含んでいる新規のタンパク質
であることが確認された。特に、Pn-AMP1及びPn-AMP2の
アミノ酸配列はゴムラテックスであるヘベインと66%の
配列相同性を示し、配列の違いはキチン-結合ドメイン
内の可変領域に多く位置していた。Pn-AMPと他のキチン
-結合タンパク質において、システイン残基はよく保存
されていた。Pn-AMPは、真菌細胞壁がキチンを包含する
か否かに関わらず、広範な真菌種に対して優れた抗菌活
性を示しており、一部の細菌に対しても抗菌活性を示す
が、昆虫細胞または哺乳動物細胞に対しては細胞毒性を
表さなかった。
【００１１】前記Pn-AMPをコードするcDNAを単離するた
めに、成熟したアサガオ種子のcDNAライブラリーをスク
リーニングしたところ、それぞれ約609bp、605bpのPn-A
MP1及びPn-AMP2 cDNA（配列番号４及び６）が選択され
た。Pn-AMP1 cDNAクローンは、5'UTR(ヌクレオチド1〜4
6）、Pn-AMP１ cDNA(ヌクレオチド47〜325、配列番号
５）、及び3’UTR(ヌクレオチド326〜609）からなり、
前記Pn-AMP1 cDNAはアミノ末端シグナルペプチド領域
(ヌクレオチド47〜121）、Pn-AMP1(ヌクレオチド122〜2
44）及びカルボキシ末端領域(ヌクレオチド245〜325）
からなっていることが確認された。一方、Pn-AMP2 cDNA
クローンは、5’UTR(ヌクレオチド1〜21）、Pn-AMP2 cD
NA(ヌクレオチド22〜297、配列番号７）、及び3’UTR
(ヌクレオチド298〜605）からなり、前記Pn-AMP2 cDNA
はアミノ末端シグナルペプチド領域(ヌクレオチド22〜9
6）、Pn-AMP2(ヌクレオチド97〜216）及びカルボキシ末
端領域(ヌクレオチド217〜297）からなっていることが
確認された。このような結果から、本発明のPn-AMP1及
びPn-AMP2はまず各々92個のアミノ酸（配列番号８）及
び91個のアミノ酸（配列番号９）からなる前駆体の形態
で発現し、転写後修飾を経て、抗菌活性を表す成熟した
ペプチドに転換されることを示唆する。
めに、成熟したアサガオ種子のcDNAライブラリーをスク
リーニングしたところ、それぞれ約609bp、605bpのPn-A
MP1及びPn-AMP2 cDNA（配列番号４及び６）が選択され
た。Pn-AMP1 cDNAクローンは、5'UTR(ヌクレオチド1〜4
6）、Pn-AMP１ cDNA(ヌクレオチド47〜325、配列番号
５）、及び3’UTR(ヌクレオチド326〜609）からなり、
前記Pn-AMP1 cDNAはアミノ末端シグナルペプチド領域
(ヌクレオチド47〜121）、Pn-AMP1(ヌクレオチド122〜2
44）及びカルボキシ末端領域(ヌクレオチド245〜325）
からなっていることが確認された。一方、Pn-AMP2 cDNA
クローンは、5’UTR(ヌクレオチド1〜21）、Pn-AMP2 cD
NA(ヌクレオチド22〜297、配列番号７）、及び3’UTR
(ヌクレオチド298〜605）からなり、前記Pn-AMP2 cDNA
はアミノ末端シグナルペプチド領域(ヌクレオチド22〜9
6）、Pn-AMP2(ヌクレオチド97〜216）及びカルボキシ末
端領域(ヌクレオチド217〜297）からなっていることが
確認された。このような結果から、本発明のPn-AMP1及
びPn-AMP2はまず各々92個のアミノ酸（配列番号８）及
び91個のアミノ酸（配列番号９）からなる前駆体の形態
で発現し、転写後修飾を経て、抗菌活性を表す成熟した
ペプチドに転換されることを示唆する。
【００１２】また、本発明は真菌抵抗性の転移体植物を
製造するに使用できるPn-AMP cDNAを含む植物体発現ベ
クター及びこれで形質転換されたトランスジェニック植
物体を提供する。本発明の好ましい実施態様によると、
Pn-AMP2のヌクレオチド1から340までに当たる配列を含
むcDNA断片をバイナリーベクターであるpGA643にクロー
ニングし、発現ベクターであるpLES9806を製造したとこ
ろ、Pn-AMP2はCaMV 35Sプロモーターの調節下で発現し
た。次に、前記組み換え発現ベクターのpLES9806でアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tum
efaciens)LBA4404を形質転換させ、トランスジェニック
植物体の製造時、媒介体として使用できる形質転換体を
得た後、この形質転換体を「アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスLBA4404/pLES9806」と命名して、それを国
際寄託機関である韓国科学技術研究所（KIST）付設の生
命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行（KCTC、大韓民国大
田広域市儒成区魚恩洞52所在）に寄託番号「KCTC 0548B
P」として1998年11月18日付けで寄託した。該微生物を
媒介として使用してトランスジェニック植物体を作成し
た。
製造するに使用できるPn-AMP cDNAを含む植物体発現ベ
クター及びこれで形質転換されたトランスジェニック植
物体を提供する。本発明の好ましい実施態様によると、
Pn-AMP2のヌクレオチド1から340までに当たる配列を含
むcDNA断片をバイナリーベクターであるpGA643にクロー
ニングし、発現ベクターであるpLES9806を製造したとこ
ろ、Pn-AMP2はCaMV 35Sプロモーターの調節下で発現し
た。次に、前記組み換え発現ベクターのpLES9806でアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tum
efaciens)LBA4404を形質転換させ、トランスジェニック
植物体の製造時、媒介体として使用できる形質転換体を
得た後、この形質転換体を「アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンスLBA4404/pLES9806」と命名して、それを国
際寄託機関である韓国科学技術研究所（KIST）付設の生
命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行（KCTC、大韓民国大
田広域市儒成区魚恩洞52所在）に寄託番号「KCTC 0548B
P」として1998年11月18日付けで寄託した。該微生物を
媒介として使用してトランスジェニック植物体を作成し
た。
【００１３】また、本発明のPn-AMPペプチドを発現する
抗真菌耐性を有するトランスジェニック植物体の例とし
て、前記アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA440
4/pLES9806（KCTC 0548BP）を媒介体として用い、リー
フディスク形質転換法でタバコ葉の細胞にPn-AMP2 cDNA
を導入し、培養することによりPn-AMP2を発現するトラ
ンスジェニックタバコを製造した。前記形質転換された
タバコの細胞を「ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tab
acum)cv. Xanthi-nc/pLES9806」と命名して、国際寄託
機関である韓国科学技術研究所（KIST）付設の生命工学
研究所（KRIBB）遺伝子銀行（KCTC、大韓民国大田広域
市儒成区魚恩洞52所在）に寄託番号「KCTC054９BP」と
して1998年11月18日付けで寄託した。
抗真菌耐性を有するトランスジェニック植物体の例とし
て、前記アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA440
4/pLES9806（KCTC 0548BP）を媒介体として用い、リー
フディスク形質転換法でタバコ葉の細胞にPn-AMP2 cDNA
を導入し、培養することによりPn-AMP2を発現するトラ
ンスジェニックタバコを製造した。前記形質転換された
タバコの細胞を「ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tab
acum)cv. Xanthi-nc/pLES9806」と命名して、国際寄託
機関である韓国科学技術研究所（KIST）付設の生命工学
研究所（KRIBB）遺伝子銀行（KCTC、大韓民国大田広域
市儒成区魚恩洞52所在）に寄託番号「KCTC054９BP」と
して1998年11月18日付けで寄託した。
【００１４】トランスジェニック植物体の真菌感染に対
する抵抗性の程度で導入されたPn-AMP発現の効果を測定
するために、前記トランスジェニックタバコをフィトフ
トラ・パラシチカpv.ニコチアナで感染して培養した結
果、感染７日後、野生型のタバコでは疾患症状が見られ
始めたが、トランスジェニックタバコの場合には感染に
よる疾患症状を全然示さず、健康であった。野生型植物
体の葉では真菌の菌糸体が広がっていたが、トランスジ
ェニック植物体の葉ではそのような菌糸体の成長は観察
されなかった。本発明により、Pn-AMPをコードする遺伝
子を目的とする植物体に導入することにより、真菌感染
に対する抵抗性を高めることができる。従って、本発明
の組み換え発現ベクター及びこれによって形質転換され
た微生物を、農作物の真菌による病気の抑制に使用する
ことができることが示唆される。
する抵抗性の程度で導入されたPn-AMP発現の効果を測定
するために、前記トランスジェニックタバコをフィトフ
トラ・パラシチカpv.ニコチアナで感染して培養した結
果、感染７日後、野生型のタバコでは疾患症状が見られ
始めたが、トランスジェニックタバコの場合には感染に
よる疾患症状を全然示さず、健康であった。野生型植物
体の葉では真菌の菌糸体が広がっていたが、トランスジ
ェニック植物体の葉ではそのような菌糸体の成長は観察
されなかった。本発明により、Pn-AMPをコードする遺伝
子を目的とする植物体に導入することにより、真菌感染
に対する抵抗性を高めることができる。従って、本発明
の組み換え発現ベクター及びこれによって形質転換され
た微生物を、農作物の真菌による病気の抑制に使用する
ことができることが示唆される。
【００１５】
【実施例】以下、実施例によって本発明をより具体的に
説明するが、これらの実施例は専ら本発明をより具体的
に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら
の実施例により限らないことは当業者には理解されよ
う。
説明するが、これらの実施例は専ら本発明をより具体的
に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら
の実施例により限らないことは当業者には理解されよ
う。
【００１６】実施例１：成熟アサガオ種子からの抗菌性
ペプチドの単離実施例1-1 ：抗菌性ペプチドの単離及び精製 アサガオ(Pharbitis nil L.)の乾燥した成熟種子50gを
微細な粉末になるように粉砕し、10mM NaH2PO4、15mM N
a2HPO4、100mM KCl、1mM EDTA、及び1mM チオ尿素を含
む抽出用緩衝液（pH6.0)500mlの中に懸濁した。前記懸
濁液を4℃で3時間攪拌した後、30分間32,000xgで遠心分
離して、上清液を回収した。この上清液に固形硫酸アン
モニウムを30%相対飽和(relative saturation)濃度とな
るように加えた。次に、32,000xgの条件で30分間遠心分
離し、沈澱物を除去した後、上清液を再び硫酸アンモニ
ウムで70%相対飽和に調整し、それを32,000xgの条件で3
0分間再遠心分離して沈澱物を得た。前記沈澱物を180ml
の脱イオン水に再溶解し、含まれている分子量の大きい
タンパク質を変性させるために80℃で15分間熱処理し
た。熱によって変性したタンパク質は32,000xgの条件で
30分間遠心分離して除去した。得られた上清液は脱イオ
ン水で十分透析した後、溶液を25mM NaClを含む10mMリ
ン酸緩衝液(pH6.0)に加え、同じ緩衝液で平衡化したCM5
2-セルロースカチオン交換カラムに注入し、数回洗浄し
た後、520mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH6.0)でカ
ラムに吸着したタンパク質を溶出し、各画分の抗菌活性
を調べた。CM-セルロースカラムの活性を示す画分を合
わせ、10mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したODS-A12
0逆相C18オープンカラム(open column, 0.5cmx25cm, YM
C-ゲル, Japan)に注入し、水で数回洗浄した後、0%から
80%までのアセトニトリルの直線濃度勾配の条件で溶出
させた。各画分の抗菌活性を調べて、活性画分を合わ
せ、真空濃縮器で乾燥した。乾燥した試料を0.05% トリ
フルオロ酢酸に溶解した後、ギルソン(Gilson)HPLCシス
テムに連結したODS-120Tカラム(0.5cmx25cm, Toso, Tok
yo, Japan)の逆相HPLCにかけた。0〜60%の直線勾配の溶
液B(0.05%(v/v)TFA/アセトニトリル)を含む溶液A(0.05%
TFA/水)を使用して、1ml/分の流速条件でタンパク質を
６０分以内で溶出させた。その結果、溶出曲線上で２つ
のピークがほとんど同時点に表れ、対応する２個の画分
をそれぞれ集めて、前記と同様な条件で再び逆相HPLCを
行い、更に精製した。その結果、２つのピークが正確に
区分され、各ピークに含まれる単一のポリペプチドは分
子量が約４kDaで、多様な真菌に対して優れた抗菌活性
を示したため、各々のペプチドをそれぞれ「Pn-AMP1」
及び「Pn-AMP2」と命名した。
ペプチドの単離実施例1-1 ：抗菌性ペプチドの単離及び精製 アサガオ(Pharbitis nil L.)の乾燥した成熟種子50gを
微細な粉末になるように粉砕し、10mM NaH2PO4、15mM N
a2HPO4、100mM KCl、1mM EDTA、及び1mM チオ尿素を含
む抽出用緩衝液（pH6.0)500mlの中に懸濁した。前記懸
濁液を4℃で3時間攪拌した後、30分間32,000xgで遠心分
離して、上清液を回収した。この上清液に固形硫酸アン
モニウムを30%相対飽和(relative saturation)濃度とな
るように加えた。次に、32,000xgの条件で30分間遠心分
離し、沈澱物を除去した後、上清液を再び硫酸アンモニ
ウムで70%相対飽和に調整し、それを32,000xgの条件で3
0分間再遠心分離して沈澱物を得た。前記沈澱物を180ml
の脱イオン水に再溶解し、含まれている分子量の大きい
タンパク質を変性させるために80℃で15分間熱処理し
た。熱によって変性したタンパク質は32,000xgの条件で
30分間遠心分離して除去した。得られた上清液は脱イオ
ン水で十分透析した後、溶液を25mM NaClを含む10mMリ
ン酸緩衝液(pH6.0)に加え、同じ緩衝液で平衡化したCM5
2-セルロースカチオン交換カラムに注入し、数回洗浄し
た後、520mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH6.0)でカ
ラムに吸着したタンパク質を溶出し、各画分の抗菌活性
を調べた。CM-セルロースカラムの活性を示す画分を合
わせ、10mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したODS-A12
0逆相C18オープンカラム(open column, 0.5cmx25cm, YM
C-ゲル, Japan)に注入し、水で数回洗浄した後、0%から
80%までのアセトニトリルの直線濃度勾配の条件で溶出
させた。各画分の抗菌活性を調べて、活性画分を合わ
せ、真空濃縮器で乾燥した。乾燥した試料を0.05% トリ
フルオロ酢酸に溶解した後、ギルソン(Gilson)HPLCシス
テムに連結したODS-120Tカラム(0.5cmx25cm, Toso, Tok
yo, Japan)の逆相HPLCにかけた。0〜60%の直線勾配の溶
液B(0.05%(v/v)TFA/アセトニトリル)を含む溶液A(0.05%
TFA/水)を使用して、1ml/分の流速条件でタンパク質を
６０分以内で溶出させた。その結果、溶出曲線上で２つ
のピークがほとんど同時点に表れ、対応する２個の画分
をそれぞれ集めて、前記と同様な条件で再び逆相HPLCを
行い、更に精製した。その結果、２つのピークが正確に
区分され、各ピークに含まれる単一のポリペプチドは分
子量が約４kDaで、多様な真菌に対して優れた抗菌活性
を示したため、各々のペプチドをそれぞれ「Pn-AMP1」
及び「Pn-AMP2」と命名した。
【００１７】実施例1-2: アミノ酸配列分析及びキチン-
結合ドメインの特性付け 前記実施例1-1で精製したPn-AMP1とPn-AMP2のアミノ酸
配列を決定するために、各々のペプチドを還元させ、S-
カルボキシメチル化してトリプシンで分解し、配列決定
に適したペプチド断片を得た(参照：Creighton, J. E.
In Protein Structure, a practical approach, Creigh
ton, T.E.編, pp155-167, IRL Press,Oxford, 1989)。
精製した抗菌ペプチド（100-500pmol）を、８Ｍ尿素を
含む0.4ＭNH4HCO3 50mlに溶解し、５mlの４５mM DTTを
直ちに添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。
冷却後、５mlの１００mMヨウ化アセトアミド溶液を添加
し、反応混合液を室温で15分間インキュベートした。次
に、混合液を水で3倍に希釈し、逆相HPLCカラム（Chemo
cosorb 5-ODS-H, 2.1mm×100mm）上に直接注入した。ペ
プチド断片は0-60％（v/v）直線勾配のアセトニトリル
を使用し、流速0.2分/mlで分離した。精製した各々のペ
プチド断片をABI 473A Protein Sequencer(Applied Bio
systems Inc., U.S.A.)を用いてアミノ酸配列を分析し
た。その結果、成熟Pn-AMP1及びPn-AMP2は各々４１個及
び４０個のアミノ酸からなり、第５位、第８位及び第４
１位のアミノ酸を除く残りの部分では二つのペプチドが
同一アミノ酸配列を共有していることが確認された。す
なわち、Pn-AMP1(配列番号1)は、第５位のアミノ酸がセ
リン、第８位のアミノ酸がアルギニンであり、第４１位
のアミノ酸としてセリンを有する４１個のアミノ酸から
なるペプチドであり、Pn-AMP2(配列番号2）は、第５位
のアミノ酸がアルギニン、第８位のアミノ酸がセリンで
ある、４０個のアミノ酸からなるペプチドである（図
1）。したがって、前記Pn-AMP1とPn-AMP2はいわゆる異
性体（isomer）の関係であると推測され、Pn-AMP1とPn-
AMP2を総称して「Pn-AMP」と称することにした。
結合ドメインの特性付け 前記実施例1-1で精製したPn-AMP1とPn-AMP2のアミノ酸
配列を決定するために、各々のペプチドを還元させ、S-
カルボキシメチル化してトリプシンで分解し、配列決定
に適したペプチド断片を得た(参照：Creighton, J. E.
In Protein Structure, a practical approach, Creigh
ton, T.E.編, pp155-167, IRL Press,Oxford, 1989)。
精製した抗菌ペプチド（100-500pmol）を、８Ｍ尿素を
含む0.4ＭNH4HCO3 50mlに溶解し、５mlの４５mM DTTを
直ちに添加し、５０℃で１５分間インキュベートした。
冷却後、５mlの１００mMヨウ化アセトアミド溶液を添加
し、反応混合液を室温で15分間インキュベートした。次
に、混合液を水で3倍に希釈し、逆相HPLCカラム（Chemo
cosorb 5-ODS-H, 2.1mm×100mm）上に直接注入した。ペ
プチド断片は0-60％（v/v）直線勾配のアセトニトリル
を使用し、流速0.2分/mlで分離した。精製した各々のペ
プチド断片をABI 473A Protein Sequencer(Applied Bio
systems Inc., U.S.A.)を用いてアミノ酸配列を分析し
た。その結果、成熟Pn-AMP1及びPn-AMP2は各々４１個及
び４０個のアミノ酸からなり、第５位、第８位及び第４
１位のアミノ酸を除く残りの部分では二つのペプチドが
同一アミノ酸配列を共有していることが確認された。す
なわち、Pn-AMP1(配列番号1)は、第５位のアミノ酸がセ
リン、第８位のアミノ酸がアルギニンであり、第４１位
のアミノ酸としてセリンを有する４１個のアミノ酸から
なるペプチドであり、Pn-AMP2(配列番号2）は、第５位
のアミノ酸がアルギニン、第８位のアミノ酸がセリンで
ある、４０個のアミノ酸からなるペプチドである（図
1）。したがって、前記Pn-AMP1とPn-AMP2はいわゆる異
性体（isomer）の関係であると推測され、Pn-AMP1とPn-
AMP2を総称して「Pn-AMP」と称することにした。
【００１８】一方、従来のキチン-結合タンパク質と本
発明のPn-AMPとの配列相同性を分析した結果、Pn-AMP1
及びPn-AMP2はキチン-結合タンパク質のアミノ酸と相同
性を有するシステインとグリシンに富むキチン結合ドメ
インを含む新規のタンパク質であることが確認された
（図1）。図１で、陰影をつけたボックス内の配列はタ
ンパク質間の同一アミノ酸の部分を示し、点は最適な整
列のために導入した空白を示す。また、ヘベインはゴム
ラテックス (rubber latex)ヘベイン、CBP20はタバコの
抗真菌タンパク質、大麦CHIは大麦のキチナーゼ、米CHI
は米のクラス1キチナーゼ、UDAはユリチカ・ディオイカ
凝集素(Uritica dioica agglutinin)、WGA3は小麦の胚
芽凝集素3であるイソレクチン、及びAc-AMP2はアマラン
サス・コダタス(Amaranthus caudatus)由来の抗真菌ペ
プチドを各々示す。右側の数は各々のタンパク質中のア
ミノ酸番号を示す。図1に示すように、Pn-AMP1及びPn-A
MP2のアミノ酸の配列はラバーラテックスヘベインと一
番類似で、66%の配列相同性を示し、特にシステイン残
基はPn-AMP1及びPn-AMP2から他のキチン結合タンパク質
でよく保存されている。配列の違いはキチン結合ドメイ
ン内の可変領域にしばしば見られる。しかしながら、こ
のような高い配列相同性にも関わらず、成熟Pn-AMP1及
びPn-AMP2(pI=8.6)はヘベイン(pI=4.6)に比べて強塩基
性を示し、この高pI値はPn-AMP内の4個のアルギニン残
基の存在のためである。一方、Pn-AMP1とPn-AMP2におけ
るキチン結合能をキチンカラムを用いて測定した結果、
両ペプチドがキチンに対して強い親和性を有しているこ
とが確認された。
発明のPn-AMPとの配列相同性を分析した結果、Pn-AMP1
及びPn-AMP2はキチン-結合タンパク質のアミノ酸と相同
性を有するシステインとグリシンに富むキチン結合ドメ
インを含む新規のタンパク質であることが確認された
（図1）。図１で、陰影をつけたボックス内の配列はタ
ンパク質間の同一アミノ酸の部分を示し、点は最適な整
列のために導入した空白を示す。また、ヘベインはゴム
ラテックス (rubber latex)ヘベイン、CBP20はタバコの
抗真菌タンパク質、大麦CHIは大麦のキチナーゼ、米CHI
は米のクラス1キチナーゼ、UDAはユリチカ・ディオイカ
凝集素(Uritica dioica agglutinin)、WGA3は小麦の胚
芽凝集素3であるイソレクチン、及びAc-AMP2はアマラン
サス・コダタス(Amaranthus caudatus)由来の抗真菌ペ
プチドを各々示す。右側の数は各々のタンパク質中のア
ミノ酸番号を示す。図1に示すように、Pn-AMP1及びPn-A
MP2のアミノ酸の配列はラバーラテックスヘベインと一
番類似で、66%の配列相同性を示し、特にシステイン残
基はPn-AMP1及びPn-AMP2から他のキチン結合タンパク質
でよく保存されている。配列の違いはキチン結合ドメイ
ン内の可変領域にしばしば見られる。しかしながら、こ
のような高い配列相同性にも関わらず、成熟Pn-AMP1及
びPn-AMP2(pI=8.6)はヘベイン(pI=4.6)に比べて強塩基
性を示し、この高pI値はPn-AMP内の4個のアルギニン残
基の存在のためである。一方、Pn-AMP1とPn-AMP2におけ
るキチン結合能をキチンカラムを用いて測定した結果、
両ペプチドがキチンに対して強い親和性を有しているこ
とが確認された。
【００１９】実施例1-3： Pn-AMPの抗菌活性測定 本発明で分離精製した抗菌性ペプチドの抗菌活性は、Br
oekaertらの方法によって、顕微分光光度法(microspect
rophotometry)で測定した（参照：Broekaert,W. F.ら,
Biochemistry, 31:4308-4314, 1992)。試験菌は、細胞
壁にキチンのない真菌類を含んだ全8種の植物感染性の
真菌である、即ち、ボトリティス・シネリア(Botrytis c
inerea)、コレトトリカム・ランジナリウム(Colletotri
chum langenarium)、リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctoni
a solani)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxy
sporum)、フィトフトラ・パラシチカ(Phytophthora par
asitica)、フィトフトラ・カプシシ(Phytophthora caps
ici)、ピチウム・spp.(Pythium spp.)、及びスクレロチ
ニア・スクレロチオラム(Sclerotinia sclerotiorum)と
ともに、酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ(Sac
charomyces cerevisiae)を用いた。全真菌をポテト・デ
キストロース寒天培地またはV8寒天培地を用いて25℃で
培養し、カビ胞子または菌糸をDuvickらの方法(参照：D
uvick, J.P.ら, J. Biol. Chem., 267:18814-18820, 19
92)やSingletonらの標準方法(参照：Singleton, L. L.
ら, In Methods for Research on Soil-borne Phytopat
hogenic Fungi, APS Press, Minnesota, 1992)によって
収集した。次に、多様な濃度の成熟Pn-AMP1及びPn-AMP2
溶液20μlを、1ml当たり104個のカビ胞子、100個のカビ
菌糸片、または105個の酵母を含む増殖培地（半強度（h
alf-strength）ポテト・デキストロースブロス）80μl
と96ウェルのマイクロプレートの各ウェル中で混合し
た。ここで、対照群にはペプチド溶液の代わりに殺菌し
た蒸留水を加えた。25℃で48時間培養した後、595nmで
の吸光度を測定することにより成長阻害率を求めて、用
量−応答曲線（ペプチドの濃度に対する成長阻害率の曲
線）から50%成長阻害に必要なペプチドの濃度(IC50)を
算出した。その結果、Pn-AMP1及びPn-AMP2は広範囲の植
物感染性のカビと酵母に対して強力な抗菌活性を表し、
真菌に対するIC50は0.6-75μg/mlであって、この値はア
マランツ(amaranth)キチン-結合タンパク質であるAc-AM
PのIC50と同様であった(参照：Broekaert, W. F.ら,Bio
chemistry, 31:4308-4314, 1992)。更に、Pn-AMP1及びP
n-AMP2はキチンを含んでいる真菌のみでなく、細胞壁に
キチンを含んでいない真菌類である卵菌類(Oomycetes)
まで広範囲の阻害効果を有し、Pn-AMPのキチン結合能が
真菌の成長阻害に必須でないことを示した。
oekaertらの方法によって、顕微分光光度法(microspect
rophotometry)で測定した（参照：Broekaert,W. F.ら,
Biochemistry, 31:4308-4314, 1992)。試験菌は、細胞
壁にキチンのない真菌類を含んだ全8種の植物感染性の
真菌である、即ち、ボトリティス・シネリア(Botrytis c
inerea)、コレトトリカム・ランジナリウム(Colletotri
chum langenarium)、リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctoni
a solani)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxy
sporum)、フィトフトラ・パラシチカ(Phytophthora par
asitica)、フィトフトラ・カプシシ(Phytophthora caps
ici)、ピチウム・spp.(Pythium spp.)、及びスクレロチ
ニア・スクレロチオラム(Sclerotinia sclerotiorum)と
ともに、酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ(Sac
charomyces cerevisiae)を用いた。全真菌をポテト・デ
キストロース寒天培地またはV8寒天培地を用いて25℃で
培養し、カビ胞子または菌糸をDuvickらの方法(参照：D
uvick, J.P.ら, J. Biol. Chem., 267:18814-18820, 19
92)やSingletonらの標準方法(参照：Singleton, L. L.
ら, In Methods for Research on Soil-borne Phytopat
hogenic Fungi, APS Press, Minnesota, 1992)によって
収集した。次に、多様な濃度の成熟Pn-AMP1及びPn-AMP2
溶液20μlを、1ml当たり104個のカビ胞子、100個のカビ
菌糸片、または105個の酵母を含む増殖培地（半強度（h
alf-strength）ポテト・デキストロースブロス）80μl
と96ウェルのマイクロプレートの各ウェル中で混合し
た。ここで、対照群にはペプチド溶液の代わりに殺菌し
た蒸留水を加えた。25℃で48時間培養した後、595nmで
の吸光度を測定することにより成長阻害率を求めて、用
量−応答曲線（ペプチドの濃度に対する成長阻害率の曲
線）から50%成長阻害に必要なペプチドの濃度(IC50)を
算出した。その結果、Pn-AMP1及びPn-AMP2は広範囲の植
物感染性のカビと酵母に対して強力な抗菌活性を表し、
真菌に対するIC50は0.6-75μg/mlであって、この値はア
マランツ(amaranth)キチン-結合タンパク質であるAc-AM
PのIC50と同様であった(参照：Broekaert, W. F.ら,Bio
chemistry, 31:4308-4314, 1992)。更に、Pn-AMP1及びP
n-AMP2はキチンを含んでいる真菌のみでなく、細胞壁に
キチンを含んでいない真菌類である卵菌類(Oomycetes)
まで広範囲の阻害効果を有し、Pn-AMPのキチン結合能が
真菌の成長阻害に必須でないことを示した。
【００２０】一方、チオニン(参照：Teras, F. R. G.
ら, Plant Physiol. 103:1311-1319,1993)、Ac-AMP及び
植物ディフェンシン等の、いくつかの塩基性を示す抗菌
性ペプチドは陽イオン、特にCaCl2により強力に阻害さ
れることが報告されている(参照：Osborn, R. W.ら, FE
BS Lett. 368:257-262, 1995)。Pn-AMP1及びPn-AMP2に
対するCaCl2の拮抗効果(antagonistic effect)を調べる
ために、5mMのCaCl2の存在下でペプチドのIC50を決定し
たところ、IC50値が47倍〜250倍程上昇することが確認
された。
ら, Plant Physiol. 103:1311-1319,1993)、Ac-AMP及び
植物ディフェンシン等の、いくつかの塩基性を示す抗菌
性ペプチドは陽イオン、特にCaCl2により強力に阻害さ
れることが報告されている(参照：Osborn, R. W.ら, FE
BS Lett. 368:257-262, 1995)。Pn-AMP1及びPn-AMP2に
対するCaCl2の拮抗効果(antagonistic effect)を調べる
ために、5mMのCaCl2の存在下でペプチドのIC50を決定し
たところ、IC50値が47倍〜250倍程上昇することが確認
された。
【００２１】Pn-AMPがグラム陰性細菌(大腸菌、アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス)とグラム陽性細菌(バ
シルス・サブチリス（Bacillus subtilis）)に対しても
成長阻害効果を示すか否かを検査するために、これらを
Pn-AMP1及びPn-AMP2の存在下で培養した。多様な濃度の
成熟Pn-AMP1及びPn-AMP2溶液20μlを、1ml当たり105個
の細菌を含むLB培地80μlと96ウェルマイクロプレート
の各ウェル中で混合した。次にPn-AMPの抗菌活性をIC50
で測定した結果、200μg/mlまでの濃度においてもグラ
ム陰性細菌の生存には何の影響も及ぼさなかった。一
方、グラム陽性細菌であるバシルスサブチリスに対し
て、Pn-AMP1の場合には38μg/mlのIC50値で、Pn-AMP2の
場合には20μg/mlのIC50値であった。5mMのCaCl2の存在
下では、Pn-AMP1及びPn-AMP2とも、200μg/mlの濃度で
成長阻害は観察されなかった。
バクテリウム・ツメファシエンス)とグラム陽性細菌(バ
シルス・サブチリス（Bacillus subtilis）)に対しても
成長阻害効果を示すか否かを検査するために、これらを
Pn-AMP1及びPn-AMP2の存在下で培養した。多様な濃度の
成熟Pn-AMP1及びPn-AMP2溶液20μlを、1ml当たり105個
の細菌を含むLB培地80μlと96ウェルマイクロプレート
の各ウェル中で混合した。次にPn-AMPの抗菌活性をIC50
で測定した結果、200μg/mlまでの濃度においてもグラ
ム陰性細菌の生存には何の影響も及ぼさなかった。一
方、グラム陽性細菌であるバシルスサブチリスに対し
て、Pn-AMP1の場合には38μg/mlのIC50値で、Pn-AMP2の
場合には20μg/mlのIC50値であった。5mMのCaCl2の存在
下では、Pn-AMP1及びPn-AMP2とも、200μg/mlの濃度で
成長阻害は観察されなかった。
【００２２】実施例1-4: Pn-AMPの細胞毒性分析 本発明のPn-AMPの細胞毒性を調べるために、サル腎臓の
細胞系であるMA104細胞株及び昆虫細胞系であるSf9(ス
ポドプテラ・フランジペルダ（Spodoptera frungiperd
a）9)細胞株を用いて、Broekaertの方法(Broekaert, W.
F.ら, Biochemistry, 31:4308-4314, 1992参照)に従っ
て、細胞の生存能試験を行った：１× 10 6個のSf9細胞
とMA104細胞を各々グレース培地(Grace's media, Life
Technologies, Inc., U.S.A.)、DMEM培地(Dulbecco's m
odified Eagle medium, Life Technologies, Inc., U.
S.A)で培養した。次に、Pn-AMP1及びPn-AMP2の存在下で
24時間更に培養し、トリパンブルー(trypanblue)で染色
し、細胞の生存能を顕微鏡でアッセイした。その結果、
Pn-AMP1及びPn-AMP2は、動物細胞（MA104）及び昆虫細
胞（Sf9）の生存には何の影響も及ばないことが確認さ
れた。
細胞系であるMA104細胞株及び昆虫細胞系であるSf9(ス
ポドプテラ・フランジペルダ（Spodoptera frungiperd
a）9)細胞株を用いて、Broekaertの方法(Broekaert, W.
F.ら, Biochemistry, 31:4308-4314, 1992参照)に従っ
て、細胞の生存能試験を行った：１× 10 6個のSf9細胞
とMA104細胞を各々グレース培地(Grace's media, Life
Technologies, Inc., U.S.A.)、DMEM培地(Dulbecco's m
odified Eagle medium, Life Technologies, Inc., U.
S.A)で培養した。次に、Pn-AMP1及びPn-AMP2の存在下で
24時間更に培養し、トリパンブルー(trypanblue)で染色
し、細胞の生存能を顕微鏡でアッセイした。その結果、
Pn-AMP1及びPn-AMP2は、動物細胞（MA104）及び昆虫細
胞（Sf9）の生存には何の影響も及ばないことが確認さ
れた。
【００２３】実施例2: Pn-AMP cDNAのクローニング実施例2-1 ：アサガオ種子ｍRNA由来cDNAライブラリーの
製造 Pn-AMPをコードするcDNAをクローニングするため、まず
アサガオ種子ｍRNA由来のcDNAライブラリーを製造し
た：開花後、40日経ったアサガオより成熟した種子2gを
取って、Maniatisらの標準的な方法によって全RNA及び
ポリ(A)+ RNAを抽出した。次に、λZAPII cDNA合成キッ
ト(Stratagene, U.S.A.)を用いて、製造社の指示によっ
て前記ポリ(A)+ RNA 5μｇから二本鎖（ds）のcDNAを合
成した。dscDNA 500ngをpBluescriptII(SK-)プラスミド
(Stratagene, U.S.A.200ng)のEcoRI/XhoI部位にライゲ
ートし、プラスミドベースのcDNAライブラリーを製造し
た。前記cDNAライブラリーのプラスミドを大腸菌XL1-bl
ue(Stratagene, U.S.A.)にエレクトロポレーション法で
導入し、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培養
した結果、およそ104個の形質転換体が形成された。
製造 Pn-AMPをコードするcDNAをクローニングするため、まず
アサガオ種子ｍRNA由来のcDNAライブラリーを製造し
た：開花後、40日経ったアサガオより成熟した種子2gを
取って、Maniatisらの標準的な方法によって全RNA及び
ポリ(A)+ RNAを抽出した。次に、λZAPII cDNA合成キッ
ト(Stratagene, U.S.A.)を用いて、製造社の指示によっ
て前記ポリ(A)+ RNA 5μｇから二本鎖（ds）のcDNAを合
成した。dscDNA 500ngをpBluescriptII(SK-)プラスミド
(Stratagene, U.S.A.200ng)のEcoRI/XhoI部位にライゲ
ートし、プラスミドベースのcDNAライブラリーを製造し
た。前記cDNAライブラリーのプラスミドを大腸菌XL1-bl
ue(Stratagene, U.S.A.)にエレクトロポレーション法で
導入し、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培養
した結果、およそ104個の形質転換体が形成された。
【００２４】実施例2-2： Pn-AMP cDNAを含むクローン
の選別 cDNAライブラリーのスクリーニングのためのDNAプロー
ブは、前記実施例2-1で製造したds cDNAを鋳型として用
い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)より得た。その際、プ
ライマーとしては、Pn-AMP1及びPn-AMP2に発見されるキ
チン結合ドメインのアミノ酸配列(CCSQWGYC)より類推し
て合成した、下記の塩基配列を有するCG1プライマー： 5'-TG(C/T)TG(C/T)(A/T)(C/G)NCA(A/G)TGGGGNTA(C/T)TG
(C/T)GG-3'(配列番号3) とオリゴ(dT)プライマーを用いた。
の選別 cDNAライブラリーのスクリーニングのためのDNAプロー
ブは、前記実施例2-1で製造したds cDNAを鋳型として用
い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)より得た。その際、プ
ライマーとしては、Pn-AMP1及びPn-AMP2に発見されるキ
チン結合ドメインのアミノ酸配列(CCSQWGYC)より類推し
て合成した、下記の塩基配列を有するCG1プライマー： 5'-TG(C/T)TG(C/T)(A/T)(C/G)NCA(A/G)TGGGGNTA(C/T)TG
(C/T)GG-3'(配列番号3) とオリゴ(dT)プライマーを用いた。
【００２５】PCRは、50ngのds cDNA、100ngのCG1プライ
マー、20ngのオリゴ(dT)プライマー、Taqポリメラーゼ
（Promega）及び１０×Taqポリメラーゼ緩衝液（Promeg
a）を含み、最終容積は50μlで実施した。増幅プログラ
ムは、94℃で2分間の初期活性化段階の後、94℃で30
秒、50℃で30秒、72℃で1分とする反応を40サイクル繰
り返し、最後に72℃で10分間の伸長段階とした。反応が
完了した後、およそ500bpの大きさの増幅PCR産物を１％
アガロースゲルで精製し、ランダムープライミングラベ
リングキット（Random-Priming Labeling Kit： Amersh
am, U.S.A.)を用いてα-32P[dCTP]で標識した。
マー、20ngのオリゴ(dT)プライマー、Taqポリメラーゼ
（Promega）及び１０×Taqポリメラーゼ緩衝液（Promeg
a）を含み、最終容積は50μlで実施した。増幅プログラ
ムは、94℃で2分間の初期活性化段階の後、94℃で30
秒、50℃で30秒、72℃で1分とする反応を40サイクル繰
り返し、最後に72℃で10分間の伸長段階とした。反応が
完了した後、およそ500bpの大きさの増幅PCR産物を１％
アガロースゲルで精製し、ランダムープライミングラベ
リングキット（Random-Priming Labeling Kit： Amersh
am, U.S.A.)を用いてα-32P[dCTP]で標識した。
【００２６】実施例2-3： Pn-AMP1のcDNAクローンの単
離 実施例2-1で得た約104個のcDNA含有プラスミドで形質転
換された大腸菌コロニーに対して実施例2-2で製造した
32Pで標識されたPCR産物を用いて、インジツコロニーハ
イブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。
2回のスクリーニングの結果、50個の陽性コロニーが単
離された。前記陽性コロニーよりプラスミドDNAを各々
抽出し、タクダイプライマーサイクルシークエンシング
キット（Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit； Perk
in-Elmer, U.S.A.)を用いて、ABI373A 自動DNAシーケン
サー(Applied Biosystems Inc., U.S.A.)でds cDNAの塩
基配列を分析した。全50個のクローン中35個のクローン
は、5'及び3'末端部分の長さが若干違うことを除いては
同一の塩基配列を示した。その中で一番長いcDNAクロー
ンの長さは、609bp（配列番号４）であるが、DNASISプ
ログラムで塩基配列を分析した結果、5'UTR（ヌクレオ
チド１〜46)、Pn-AMP1 cDNA(ヌクレオチド47〜325;配列
番号5）、及び3'UTR（ヌクレオチド326〜609)からな
り、Pn-AMP1 cDNAはアミノ酸末端のシグナルペプチド領
域(ヌクレオチド47〜121)、Pn-AMP1(ヌクレオチド122〜
244)、及びカルボキシ末端領域(ヌクレオチド245〜325)
からなっていることが確認された。
離 実施例2-1で得た約104個のcDNA含有プラスミドで形質転
換された大腸菌コロニーに対して実施例2-2で製造した
32Pで標識されたPCR産物を用いて、インジツコロニーハ
イブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。
2回のスクリーニングの結果、50個の陽性コロニーが単
離された。前記陽性コロニーよりプラスミドDNAを各々
抽出し、タクダイプライマーサイクルシークエンシング
キット（Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit； Perk
in-Elmer, U.S.A.)を用いて、ABI373A 自動DNAシーケン
サー(Applied Biosystems Inc., U.S.A.)でds cDNAの塩
基配列を分析した。全50個のクローン中35個のクローン
は、5'及び3'末端部分の長さが若干違うことを除いては
同一の塩基配列を示した。その中で一番長いcDNAクロー
ンの長さは、609bp（配列番号４）であるが、DNASISプ
ログラムで塩基配列を分析した結果、5'UTR（ヌクレオ
チド１〜46)、Pn-AMP1 cDNA(ヌクレオチド47〜325;配列
番号5）、及び3'UTR（ヌクレオチド326〜609)からな
り、Pn-AMP1 cDNAはアミノ酸末端のシグナルペプチド領
域(ヌクレオチド47〜121)、Pn-AMP1(ヌクレオチド122〜
244)、及びカルボキシ末端領域(ヌクレオチド245〜325)
からなっていることが確認された。
【００２７】実施例2-4：Pn-AMP2のcDNAクローンの単離 実施例2-3で調製した50個のクローン中前記35個のクロ
ーンを除いた15個のクローンには、5'及び3'末端部分の
長さが若干違うことを除いては、同一の塩基配列を示し
た。その中で一番長いcDNAクローンの長さは605bp(配列
番号6)であるが、DNASISプログラムで塩基配列を分析し
た結果、5'UTR(ヌクレオチド1〜21)、Pn-AMP2 cDNA(配
列番号7;ヌクレオチド22〜297)、及び3'UTR(ヌクレオチ
ド298〜605)からなり、Pn-AMP2 cDNAはアミノ末端のシ
グナルペプチド領域(ヌクレオチド22〜96)、Pn-AMP2(ヌ
クレオチド97〜216)、及びカルボキシ末端領域(ヌクレ
オチド217〜297)からなっていることが確認された。こ
のような結果から、本発明のPn-AMP1及びPn-AMP2が各々
92個のアミノ酸(配列番号8)と91個のアミノ酸(配列番号
9)からなる前駆体の形態で発現された後、転写後修飾に
よって抗菌活性を示す成熟ペプチドとして得られること
が示唆された。
ーンを除いた15個のクローンには、5'及び3'末端部分の
長さが若干違うことを除いては、同一の塩基配列を示し
た。その中で一番長いcDNAクローンの長さは605bp(配列
番号6)であるが、DNASISプログラムで塩基配列を分析し
た結果、5'UTR(ヌクレオチド1〜21)、Pn-AMP2 cDNA(配
列番号7;ヌクレオチド22〜297)、及び3'UTR(ヌクレオチ
ド298〜605)からなり、Pn-AMP2 cDNAはアミノ末端のシ
グナルペプチド領域(ヌクレオチド22〜96)、Pn-AMP2(ヌ
クレオチド97〜216)、及びカルボキシ末端領域(ヌクレ
オチド217〜297)からなっていることが確認された。こ
のような結果から、本発明のPn-AMP1及びPn-AMP2が各々
92個のアミノ酸(配列番号8)と91個のアミノ酸(配列番号
9)からなる前駆体の形態で発現された後、転写後修飾に
よって抗菌活性を示す成熟ペプチドとして得られること
が示唆された。
【００２８】実施例3： Pn-AMP2発現ベクターの構築及
び形質転換体の製造 Pn-AMP2発現ベクターを製造するために、Pn-AMP2 cDNA
を含有するpBluescriptIISK(-)ベクターをXbaII/ClaIで
完全に切断し、全コード領域を含むヌクレオチド1〜340
に当たる340bpのDNA断片を0.8%アガロースゲルで回収し
た。前記340bpDNA断片をバイナリーベクターであるpGA6
43のXbaII/ClaI部位にライゲートし、植物体発現ベクタ
ーであるpLES9806を製造した（参照：図２）。図２で、
nptIIは、ノパリン(nopaline)合成酵素のプロモーター
及びターミネーター、及びネオマイシンホスホトランス
フェラーゼIIのコード領域を含むカナマイシン抵抗性を
表すキメラ遺伝子を表し、CaMV 35Sはカリフラワーモザ
イクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターを示す。
び形質転換体の製造 Pn-AMP2発現ベクターを製造するために、Pn-AMP2 cDNA
を含有するpBluescriptIISK(-)ベクターをXbaII/ClaIで
完全に切断し、全コード領域を含むヌクレオチド1〜340
に当たる340bpのDNA断片を0.8%アガロースゲルで回収し
た。前記340bpDNA断片をバイナリーベクターであるpGA6
43のXbaII/ClaI部位にライゲートし、植物体発現ベクタ
ーであるpLES9806を製造した（参照：図２）。図２で、
nptIIは、ノパリン(nopaline)合成酵素のプロモーター
及びターミネーター、及びネオマイシンホスホトランス
フェラーゼIIのコード領域を含むカナマイシン抵抗性を
表すキメラ遺伝子を表し、CaMV 35Sはカリフラワーモザ
イクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターを示す。
【００２９】次に、pLES9806でアグロバクテリウム・ツ
メファシエンスLBA4404をエレクトロポレーションによ
って形質転換した後、10μg/mlのカナマイシン及び5μg
/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレートの選択培
地に塗抹し、28℃で2日間培養して形質転換体を選別し
た。選別された形質転換体を「アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスLBA4404/pLES9806」と命名して、これを
1998年11月18日に国際寄託機関である韓国科学技術研究
所（KIST）付設の生命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行
（KCTC、大韓民国大田広域市儒成区魚恩洞52所在）に寄
託番号「KCTC 0548BP」として寄託した。
メファシエンスLBA4404をエレクトロポレーションによ
って形質転換した後、10μg/mlのカナマイシン及び5μg
/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレートの選択培
地に塗抹し、28℃で2日間培養して形質転換体を選別し
た。選別された形質転換体を「アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスLBA4404/pLES9806」と命名して、これを
1998年11月18日に国際寄託機関である韓国科学技術研究
所（KIST）付設の生命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行
（KCTC、大韓民国大田広域市儒成区魚恩洞52所在）に寄
託番号「KCTC 0548BP」として寄託した。
【００３０】実施例4: トランスジェニックタバコの製
造 アグロバクテリウムが媒介するリーフディスク形質転換
法(Agrobacterium-mediated leaf disc transformatio
n)を用いて、Pn-AMP2を発現するトランスジェニックタ
バコを製造した(参照：Horsch, R.ら, 1984, Science,
233:496-498):タバコ(Nicotiana tabacum cv. Xanthi-n
c)のリーフディスクに実施例3で得たアグロバクテリウム
・ツメファシエンスLBA4404/pLES9806(KCTC 0548BP)を
接種して2日間培養し、次いで選択培地(0.5mg/l牛血清
アルブミン、ムラシゲスクーグ（Murashige-Skoog）
塩、3%シュクロース、100mg/l カナマイシン、250mg/l
シュードペン及び0.8%アガロースを含む)に移してカル
スの成長を誘導した。前記カルスを培養して一ヶ月経っ
た後、再生した苗条をバーミキュライト、パーライト及
びピートモスが同比率で混合された苗床に移し、25℃の
培養器で昼長さ(day-length)16時間の条件で培養して成
長させた。得られたタバコ細胞を「Nicotiana tabacum
cv. Xanthi-nc/pLES9806」と命名して、1998年11月18日
に国際寄託機関である韓国科学技術研究所（KIST）付設
の生命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行（KCTC、大韓民
国大田広域市儒成区魚恩洞52所在）に寄託番号「KCTC 0
549BP」として寄託した。
造 アグロバクテリウムが媒介するリーフディスク形質転換
法(Agrobacterium-mediated leaf disc transformatio
n)を用いて、Pn-AMP2を発現するトランスジェニックタ
バコを製造した(参照：Horsch, R.ら, 1984, Science,
233:496-498):タバコ(Nicotiana tabacum cv. Xanthi-n
c)のリーフディスクに実施例3で得たアグロバクテリウム
・ツメファシエンスLBA4404/pLES9806(KCTC 0548BP)を
接種して2日間培養し、次いで選択培地(0.5mg/l牛血清
アルブミン、ムラシゲスクーグ（Murashige-Skoog）
塩、3%シュクロース、100mg/l カナマイシン、250mg/l
シュードペン及び0.8%アガロースを含む)に移してカル
スの成長を誘導した。前記カルスを培養して一ヶ月経っ
た後、再生した苗条をバーミキュライト、パーライト及
びピートモスが同比率で混合された苗床に移し、25℃の
培養器で昼長さ(day-length)16時間の条件で培養して成
長させた。得られたタバコ細胞を「Nicotiana tabacum
cv. Xanthi-nc/pLES9806」と命名して、1998年11月18日
に国際寄託機関である韓国科学技術研究所（KIST）付設
の生命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行（KCTC、大韓民
国大田広域市儒成区魚恩洞52所在）に寄託番号「KCTC 0
549BP」として寄託した。
【００３１】実施例5：トランスジェニックタバコでのP
n-AMP2の発現及び抗真菌耐性調査実施例5-1 ：免疫ブロット分析 実施例4で製造されたトランスジェニックタバコ(KCTC 0
549BP)の葉を粉砕し、抽出用緩衝液(50mM リン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH6.0、0.1mM PMSF含有)に投入した。抽出
物を12,000xgの条件で30分間遠心分離し、上清液を80℃
で15分間インキュベートした。遠心分離で熱変性物を除
去し、濃縮過程を経て約12μgの可溶性タンパク質を
得、17% SDS-PAGEで展開した。エレクトロブロッティン
グによってニトロセルロース膜フィルター上にタンパク
質をトランスファーし、フィルターを６％（w/v）脱脂
乳含有TTBS（100mM Tris・HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.1
% Tween20）中でブロックした。次いでフィルターをウ
サギの抗Pn-AMP2抗体、及びホースラディッシュペルオ
キシダーゼ-結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンGを2次抗
体として用いて免疫ブロットを行った。ECL検出溶液(Am
ersham, USA)で発色反応させ、本発明のトランスジェニ
ックタバコでPn-AMP2タンパク質が発現することを確認
した。一方、ウサギの抗Pn-AMP2ポリクローナル抗体
は、フロイント完全アジュバント中のシリカマトリクス
に結合した1mgの精製Pn-AMP2をウサギに皮下注射で免疫
し、フロイント不完全アジュバント中の同一抗原１ｍｇ
でブースティング(boosting)注射を3週間毎に行って製
造した。
n-AMP2の発現及び抗真菌耐性調査実施例5-1 ：免疫ブロット分析 実施例4で製造されたトランスジェニックタバコ(KCTC 0
549BP)の葉を粉砕し、抽出用緩衝液(50mM リン酸ナトリ
ウム緩衝液、pH6.0、0.1mM PMSF含有)に投入した。抽出
物を12,000xgの条件で30分間遠心分離し、上清液を80℃
で15分間インキュベートした。遠心分離で熱変性物を除
去し、濃縮過程を経て約12μgの可溶性タンパク質を
得、17% SDS-PAGEで展開した。エレクトロブロッティン
グによってニトロセルロース膜フィルター上にタンパク
質をトランスファーし、フィルターを６％（w/v）脱脂
乳含有TTBS（100mM Tris・HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.1
% Tween20）中でブロックした。次いでフィルターをウ
サギの抗Pn-AMP2抗体、及びホースラディッシュペルオ
キシダーゼ-結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンGを2次抗
体として用いて免疫ブロットを行った。ECL検出溶液(Am
ersham, USA)で発色反応させ、本発明のトランスジェニ
ックタバコでPn-AMP2タンパク質が発現することを確認
した。一方、ウサギの抗Pn-AMP2ポリクローナル抗体
は、フロイント完全アジュバント中のシリカマトリクス
に結合した1mgの精製Pn-AMP2をウサギに皮下注射で免疫
し、フロイント不完全アジュバント中の同一抗原１ｍｇ
でブースティング(boosting)注射を3週間毎に行って製
造した。
【００３２】実施例5-2：トランスジェニックタバコの
真菌感染に対する耐性 実施例5-1で本発明のトランスジェニックタバコが抗菌
活性を有するPn-AMP2ペプチドを発現することが確認さ
れたため、次のような方法で前記トランスジェニックタ
バコの抗真菌性を調査した： 1L当たりに乾燥した正常
タバコ葉1gが入っているV8寒天培地にフィトフトラ・パ
ラシチカ(Phytophthora parasitica pv. Nicotianae my
celia)を接種し、25℃で光に露出させながら培養した。
真菌の菌糸体の菌叢が形成した後（２−４日）、前記菌
糸体を含む寒天ディスク(〜8mm2)を切り出し、トランス
ジェニック又は非トランスジェニックタバコ植物体を4
週間培養したMS寒天培地に移した。これらを25℃で昼長
さを16時間にして培養器で培養した。真菌感染は、接種
７日後に裸眼又は顕微鏡観察で菌糸体の増殖を分析し
た。野生型植物体では疾患症状が現われ、完全に死んで
しまったが、トランスジェニック植物体の場合は、フィ
トフトラパラシチカ感染による疾患症状を全然表さなか
った。対照群タバコと転移体タバコの葉を採取してアニ
リンブルーで染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果、真菌
感染野生型植物体の葉には真菌の菌糸が広範囲に広がっ
ていたが、接種を受けたトランスジェニック植物体の葉
では菌糸の成長が観察されず、胞子嚢内の自己蛍光物質
の存在による明るい蛍光を示した。
真菌感染に対する耐性 実施例5-1で本発明のトランスジェニックタバコが抗菌
活性を有するPn-AMP2ペプチドを発現することが確認さ
れたため、次のような方法で前記トランスジェニックタ
バコの抗真菌性を調査した： 1L当たりに乾燥した正常
タバコ葉1gが入っているV8寒天培地にフィトフトラ・パ
ラシチカ(Phytophthora parasitica pv. Nicotianae my
celia)を接種し、25℃で光に露出させながら培養した。
真菌の菌糸体の菌叢が形成した後（２−４日）、前記菌
糸体を含む寒天ディスク(〜8mm2)を切り出し、トランス
ジェニック又は非トランスジェニックタバコ植物体を4
週間培養したMS寒天培地に移した。これらを25℃で昼長
さを16時間にして培養器で培養した。真菌感染は、接種
７日後に裸眼又は顕微鏡観察で菌糸体の増殖を分析し
た。野生型植物体では疾患症状が現われ、完全に死んで
しまったが、トランスジェニック植物体の場合は、フィ
トフトラパラシチカ感染による疾患症状を全然表さなか
った。対照群タバコと転移体タバコの葉を採取してアニ
リンブルーで染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果、真菌
感染野生型植物体の葉には真菌の菌糸が広範囲に広がっ
ていたが、接種を受けたトランスジェニック植物体の葉
では菌糸の成長が観察されず、胞子嚢内の自己蛍光物質
の存在による明るい蛍光を示した。
【００３３】
【発明の効果】以上で詳細に説明したように、本発明は
アサガオ(Pharbitis nil L.)成熟種子由来の抗菌性ペプ
チドのcDNA、前記cDNAを含む組み換え植物体の発現ベク
ター、及びそれを用いた抗真菌耐性を有するトランスジ
ェニック植物体の製造方法を提供する。本発明の抗菌性
ペプチドPn-AMPは多様な植物病原体に対して優れた抗菌
活性を有しているため、前記ペプチドを発現するトラン
スジェニック植物体は多様な病因菌の感染に対して強い
耐性を有することができる。
アサガオ(Pharbitis nil L.)成熟種子由来の抗菌性ペプ
チドのcDNA、前記cDNAを含む組み換え植物体の発現ベク
ター、及びそれを用いた抗真菌耐性を有するトランスジ
ェニック植物体の製造方法を提供する。本発明の抗菌性
ペプチドPn-AMPは多様な植物病原体に対して優れた抗菌
活性を有しているため、前記ペプチドを発現するトラン
スジェニック植物体は多様な病因菌の感染に対して強い
耐性を有することができる。
【００３４】 SEQUENCE LISTING <110> Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. <120> Transgenic Plants Expressing Antimicrobial Peptides derived from Seed of Pharbitis nil L. <130> PA99-224 <150> KR99-6622 <151> 1999-02-27 <160> 9 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Pharbitis nil L. <400> 1 Gln Gln Cys Gly Ser Gln Ala Arg Gly Arg Leu Cys Gly Asn Gly Leu 1 5 10 15 Cys Cys Ser Gln Trp Gly Tyr Cys Gly Ser Thr Ala Ala Tyr Cys Gly 20 25 30 Ala Gly Cys Gln Ser Gln Cys Lys Ser 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Pharbitis nil L. <400> 2 Gln Gln Cys Gly Arg Gln Ala Ser Gly Arg Leu Cys Gly Asn Gly Leu 1 5 10 15 Cys Cys Ser Gln Trp Gly Tyr Cys Gly Ser Thr Ala Ala Tyr Cys Gly 20 25 30 Ala Gly Cys Gln Ser Gln Cys Lys 35 40 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer based on amino acid sequence in chitin-binding do main of Pn-AMP1 and Pn-AMP2 <400> 3 tgytgywsnc artggggnta ytgycg 26 <210> 4 <211> 609 <212> DNA <213> Pharbitis nil L. <400> 4 aaagaaagat caagaaacac ctactatact atacataaaa gagaaaatga aattctgtac 60 tatgtttctt gttgtcttgg ctttagccag cttgttgttg acaccatcaa caataatggc 120 acaacagtgt gggagtcaag cccgtgggcg tctgtgcggc aacggccttt gctgcagcca 180 gtggggctac tgtggctcca ctgcagccta ctgtggagct ggctgccaga gccaatgcaa 240 atctactgct gcttctgcca ccgacaccac caccactgca aaccaatcaa ccgctaagtc 300 ggatcccgcc ggcggtgcca actgatctca tcgatgatat gtacgttaga ccaccatgcg 360 ccgcacgccg atgtgccgta acctggccaa caaaaaataa aagatgtgtc gttgtttagt 420 ttaattctag ataggtaggg taggttatga aactaaagtg ggatggacat acatgtgatc 480 atctcacaaa tcaaatcttt ggatgctcct gcctactact ctatgtagtt tgtaatgtcc 540 gactactttg ttttaatttt gaataagatc gatgaggcgt gcatggttgc aaaaagctaa 600 gttccactt 609 <210> 5 <211> 279 <212> DNA <213> Pharbitis nil L. <400> 5 atgaaattct gtactatgtt tcttgttgtc ttggctttag ccagcttgtt gttgacacca 60 tcaacaataa tggcacaaca gtgtgggagt caagcccgtg ggcgtctgtg cggcaacggc 120 ctttgctgca gccagtgggg ctactgtggc tccactgcag cctactgtgg agctggctgc 180 cagagccaat gcaaatctac tgctgcttct gccaccgaca ccaccaccac tgcaaaccaa 240 tcaaccgcta agtcggatcc cgccggcggt gccaactga 279 <210> 6 <211> 605 <212> DNA <213> Pharbitis nil L. <400> 6 atatacacaa aagaattgaa aatgaaatac tgtactatgt ttattgttct cttgggttta 60 ggcagcttgt tgttgacacc aacaacaata atggcacaac agtgcgggag acaagccagt 120 gggcgtctgt gcggcaacgg cctttgctgc agccagtggg gctactgtgg ctccactgca 180 gcctactgtg gagctggttg ccagagccaa tgcaaatcta ctgctgcttc ttccaccacc 240 actaccactg caaaccaatc aaccgctaag tcggatcccg ccggcggtgc caactgatcg 300 atctcatcga taatgtatga ccacctccac catgcacgca cgcacgccga tatgccgtaa 360 cctgcaggct agcaaaaact aaaagatgtg tcgtcgttta ttttaattct agataggtag 420 gtaggttatg aaactaaagt gggatgaaca tccgtgtgat catctcacaa atcttagcta 480 ggatatgatg ctcctgccta ctactctatg tagtttgtaa tgtccgacta ctttatttta 540 attttgaata agatcaatgt ggcctgcatg gttgcaaaca ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaa 605 <210> 7 <211> 276 <212> DNA <213> Pharbitis nil L. <400> 7 atgaaatact gtactatgtt tattgttctc ttgggtttag gcagcttgtt gttgacacca 60 acaacaataa tggcacaaca gtgcgggaga caagccagtg ggcgtctgtg cggcaacggc 120 ctttgctgca gccagtgggg ctactgtggc tccactgcag cctactgtgg agctggttgc 180 cagagccaat gcaaatctac tgctgcttct tccaccacca ctaccactgc aaaccaatca 240 accgctaagt cggatcccgc cggcggtgcc aactga 276 <210> 8 <211> 92 <212> PRT <213> Pharbitis nil L. <400> 8 Met Lys Phe Cys Thr Met Phe Leu Val Val Leu Ala Leu Ala Ser Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Pro Ser Thr Ile Met Ala Gln Gln Cys Gly Ser Gln Ala 20 25 30 Arg Gly Arg Leu Cys Gly Asn Gly Leu Cys Cys Ser Gln Trp Gly Tyr 35 40 45 Cys Gly Ser Thr Ala Ala Tyr Cys Gly Ala Gly Cys Gln Ser Gln Cys 50 55 60 Lys Ser Thr Ala Ala Ser Ala Thr Asp Thr Thr Thr Thr Ala Asn Gln 65 70 75 80 Ser Thr Ala Lys Ser Asp Pro Ala Gly Gly Ala Asn 85 90 <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Pharbitis nil L. <400> 9 Met Lys Tyr Cys Thr Met Phe Ile Val Leu Leu Gly Leu Gly Ser Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Pro Thr Thr Ile Met Ala Gln Gln Cys Gly Arg Gln Ala 20 25 30 Ser Gly Arg Leu Cys Gly Asn Gly Leu Cys Cys Ser Gln Trp Gly Tyr 35 40 45 Cys Gly Ser Thr Ala Ala Tyr Cys Gly Ala Gly Cys Gln Ser Gln Cys 50 55 60 Lys Ser Thr Ala Ala Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Ala Asn Gln Ser 65 70 75 80 Thr Ala Lys Ser Asp Pro Ala Gly Gly Ala Asn 85 90
【００３５】
【００３６】
【配列番号３】 Pn-AMP1及びPn-AMP2のキチン結合ドメ
インのアミノ酸配列に基づいて合成したプライマー
インのアミノ酸配列に基づいて合成したプライマー
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】成熟Pn-AMP1のアミノ酸配列(配列番号１)及び
成熟Pn-AMP2のアミノ酸配列(配列番号２)を他のキチン
−結合タンパク質のアミノ酸配列と相互比較した図面で
ある。
成熟Pn-AMP2のアミノ酸配列(配列番号２)を他のキチン
−結合タンパク質のアミノ酸配列と相互比較した図面で
ある。
【図２】Pn-AMP2 cDNAを含む組み換え植物体発現ベクタ
ーpLES9806の遺伝子地図である。
ーpLES9806の遺伝子地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 宋 泌淳 大韓民国 光州広域市 月渓洞756−２ 新東亜アパート102−906 (72)発明者 鄭 昌昊 大韓民国 光州広域市 西区 花停洞 572番地 現代アパート100−1003
Claims (15)
- 【請求項１】 下記アミノ酸配列： QQCG-x-QA-y-GRLCGNGLCCSQWGYCGSTAAYCGAGCQSQCK-z （式中、ｘはＳ又はＲを示し、ｙはＲ又はＳを示し、及
びｚはＳ又はない）を有する抗菌性ペプチドをコードす
るcDNA。 - 【請求項２】 アサガオ(Pharbitis nil L.)由来の配列
番号８のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドPn-AMP1
の前駆体タンパク質をコードする配列番号５で表される
cDNA。 - 【請求項３】 アサガオ由来の配列番号９のアミノ酸配
列を有する抗菌性ペプチドPn-AMP2の前駆体タンパク質
をコードする配列番号７で表されるcDNA。 - 【請求項４】 請求項２のPn-AMP1 cDNAを含む植物体発
現ベクター。 - 【請求項５】 請求項３のPn-AMP2 cDNAを含み、図２の
遺伝子地図で表される植物体発現ベクターpLES9806。 - 【請求項６】 請求項５の植物体発現ベクターpLES9806
で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404/pLES9806(KCTC
0548BP)。 - 【請求項７】 Pn-AMP1をコードする遺伝子により形質
転換され、前記Pn-AMP1を発現するトランスジェニック
植物体又はその後代（progeny)。 - 【請求項８】 トランスジェニック植物体がタバコ又は
双子葉植物であることを特徴とする、請求項７に記載の
トランスジェニック植物体又はその後代。 - 【請求項９】 Pn-AMP2をコードする遺伝子により形質
転換され、前記Pn-AMP２を発現するトランスジェニック
植物体又はその後代。 - 【請求項１０】 トランスジェニック植物体がタバコ又
は双子葉植物であることを特徴とする、請求項９に記載
のトランスジェニック植物体又はその後代。 - 【請求項１１】 Pn-AMP2を発現する組み換えタバコの
細胞株ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）cv.
Xanthi-nc/pLES9806(KCTC 0549BP)。 - 【請求項１２】 Pn-AMPをコードする遺伝子を含む発現
ベクターで形質転換した組み換え微生物を媒介体にし、
植物細胞を形質転換し、前記植物細胞がPn-AMPを発現す
る段階；及び前記植物細胞を植物体の生長が誘導される
条件下で培養する段階を含む抗菌耐性を有するトランス
ジェニック植物体の製造方法。 - 【請求項１３】 組み換え微生物がアグロバクテリウム
・ツメファシエンスLBA4404(KCTC 0548BP)であることを
特徴とする、請求項１２に記載のトランスジェニック植
物体の製造方法。 - 【請求項１４】 植物体がタバコ又は双子葉植物である
ことを特徴とする、請求項１２に記載のトランスジェニ
ック植物体の製造方法。 - 【請求項１５】 培養は25℃の培養器で昼長さ(day-len
gth)16時間である条件でバーミキュライト、パーライト
及びピートモスが同比率で混合された苗床で行うことを
特徴とする、請求項１２に記載のトランスジェニック植
物体の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR99-6622 | 1999-02-27 | ||
| KR1019990006622A KR100328507B1 (ko) | 1999-02-27 | 1999-02-27 | 나팔꽃 종자로부터 유래된 항균성 펩타이드의 ｃＤＮＡ를 포함하는 재조합 식물체 발현벡터 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000245483A true JP2000245483A (ja) | 2000-09-12 |
Family
ID=19575245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11200954A Pending JP2000245483A (ja) | 1999-02-27 | 1999-07-14 | アサガオ（ＰｈａｒｂｉｔｉｓｎｉｌＬ．）種子由来の抗菌性ペプチドを発現するトランスジェニック植物体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000245483A (ja) |
| KR (1) | KR100328507B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002085080A (ja) * | 2000-09-19 | 2002-03-26 | Iwate Prefecture | わさびの新規な抗菌性タンパク質遺伝子 |
| WO2002068463A1 (fr) * | 2001-01-22 | 2002-09-06 | Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences | Nouveau peptide antibacterien naturel, sequence nucleotidique codant ce peptide et utilisation de celui-ci |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030042947A (ko) * | 2001-11-26 | 2003-06-02 | 대한민국 (경상대학교 총장) | 나팔꽃 씨에서 유래한 신규의 항균성 펩타이드, 이를코딩하는 ｃＤＮＡ 및 이를 도입한 병 저항성 형질전환식물체 |
-
1999
- 1999-02-27 KR KR1019990006622A patent/KR100328507B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-07-14 JP JP11200954A patent/JP2000245483A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002085080A (ja) * | 2000-09-19 | 2002-03-26 | Iwate Prefecture | わさびの新規な抗菌性タンパク質遺伝子 |
| WO2002068463A1 (fr) * | 2001-01-22 | 2002-09-06 | Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences | Nouveau peptide antibacterien naturel, sequence nucleotidique codant ce peptide et utilisation de celui-ci |
| US6887981B2 (en) | 2001-01-22 | 2005-05-03 | Shanghai Cas Shenglonda Biotech (Group) Co., Ltd. | Natural antibacterial peptide, the nucleotide sequence encoding it and the use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100328507B1 (ko) | 2002-03-16 |
| KR20000056880A (ko) | 2000-09-15 |
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