JPH08505048A

JPH08505048A - 殺生物性のキチン結合性蛋白質

Info

Publication number: JPH08505048A
Application number: JP51181194A
Authority: JP
Inventors: ブロエカエルト，ヴィレム，フランス; カムエ，ブルーノ・フィリッペ・アンゲロ; オズボーン，ルパート・ウィリアム; リーズ，サラ・ブロンウェン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1992-11-12
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 1996-06-04
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: EP0672146A1; EP0672146B1; AU5340694A; DE69333781T2; BR9307429A; AU677251B2; CA2147122A1; ATE291623T1; WO1994011511A1; JP3594595B2; DE69333781D1

Abstract

(57)【要約】種子から単離しうる殺生物性蛋白質が解明された。これらの蛋白質はキチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを含むアミノ酸配列を有するが、病原性真菌に対して実質的に、より良好な活性、より高い、酸性アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の比率、および／または分節菌体分枝を増大させる抗真菌活性を示す。トウガラシ属、コバンソウ属および近縁種から単離される抗微生物性蛋白質が提供される。これらの蛋白質は広範な抗真菌活性を示し、かつグラム陽性細菌に対して有効である。これらの蛋白質をコードするＤＮＡを単離し、ベクターに取り込ませることができる。植物をこのＤＮＡで形質転換することができる。これらの蛋白質は、抗真菌薬または抗微生物として農業または薬剤に使用しうる。該蛋白質を発現するトランスジェニック植物は向上した病害抵抗性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】殺生物性のキチン結合性蛋白質本発明は、殺生物性（ｂｉｏｃｉｄａｌ）蛋白質、それらの製造および使用のための方法、ならびにそれらをコードするＤＮA配列に関するものである。特に本発明は、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種子から単離しうる蛋白質、およびコバンソウ属（Ｂｒｉｚａ）の種子から単離しうる蛋白質を含む、抗微生物性蛋白質類に関するものである。これに関して、抗微生物性蛋白質とは下記のうち少なくとも１つの活性をもつ蛋白質として定義される：抗真菌活性（抗酵母活性を含む）；抗菌活性。活性には、たとえば部分的阻害または死滅などの一定範囲の拮抗作用が含まれる。それらの蛋白質はオリゴマーペプチドサブユニットであってもよく、または単一ペプチドサブユニットであってもよい。トウガラシ属は５０の種を含み、世界中で栽培されている多数の重要な野菜の種を含む（たとえばグリーンおよびレッドペッパー、チリ、パプリカならびにカエンネ（ｃａｙｅｎｎｅ）ペッパー）。これらの広く栽培されている例のほかに、トウガラシ属には食用ではないが色彩豊かなそれらの果実のために栽培されている多数の種も含まれる。コバンソウ属は多数の観賞用の草を含み、イネ科に属する。この属は、高温牧草地で見られる草の種、たとえばライグラス（ｒｙｅｇｒａｓｓ）に近縁である。植物は潜在的な侵入体と戦うために広範な一連の抗真菌活性化合物を産生するが、抗真菌活性をもつ蛋白質がこれらの防御の重要な部分を構成することがこの１０年間で明らかになった。幾つかの類の蛋白質が報告されており、それにはチオニン類、β−１，３−グルカナーゼ類、リボソーム不活性化蛋白質およびキチナーゼ類が含まれる。この最後の群の酵素は、以下においてキチン結合性植物蛋白質と呼ばれる、より広い類に属する。基本的なキチナーゼはマメ類から（ボラー（Ｂｏｌｌｅｒ）ら，１９８３，Ｐｌａｎｔａ，１５７：２２−３１）、コムギから（モラノ（Ｍｏｌａｎｏ）ら、１９７９，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５４：４９０１−４９０７）、タバコから（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）ら，１９８７，ＰｒｏＮａｔＡｃａＳｃｉＵＳＡ，８４：８９−９３）および他の植物から単離されている。他のキチン結合性植物蛋白質は特定の触媒活性をもたず、従って単にそれらのレクチン活性について記載されているにすぎない。これらには、コムギから（ライスおよびエツラー（Ｒｉｃｅ，Ｅｔｚｌｅｒ），１９７４，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍ，５９：４１４−４１９）、オオムギから（ポーマン（Ｐｅｕｍａｎ）ら，１９８２，ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２０３：２３９−１４３）、イネから（ツダ（Ｔｓｕｄａ），１９７９，ＪＢｉｏｃｈｅｍ，８６：１４５１−１４６１）、およびイラクサ類（ｓｔｉｎｇｉｎｇｎｅｔｔｌｅ）から（ポーマン（Ｐｅｕｍａｎ）ら，１９８３，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１７７：９９−１０３）のキチン結合性レクチン類、ならびにゴムノキのラテックスからのヘベイン（ｈｅｖｅｉｎ）と呼ばれる小型の蛋白質（ファン・パリス（ＶａｎＰａｒｉｊｓ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８３：２５８−２６４）が含まれる。このように（本明細書に定める）キチン結合性植物蛋白質は、キチナーゼ、キチン結合性レクチン類およびヘベインからなる蛋白質群である。これらの蛋白質はすべて、システイン／グリシンに富む保存ドメインを含む（総説についてはレイケルおよびブレケルト（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ），１９９１，Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ベルマ（ＶｅｒｍａＤＰ）（編者），テルフォード・プレスを参照されたい）。この共通領域がキチン結合活性をもたらすと思われる。このドメインは４０−４３アミノ酸の長さであり、２回（イラクサレクチン）もしくは４回（コムギ、オオムギおよびイネレクチン）反復されるか、または無関係なドメインに融合している（基本的キチナーゼおよびブロヘベイン）。ヘベイン自体は４３アミノ酸の長さであり、本質的にこの保存ドメインそのものからなる（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９０，ＰｒｏＮａｔＡｃａＳｃｉＵＳＡ，８７：７６３３−７６３７）。ヘベインをコードするｃＤＮＡクローン（ＨＥＶＩ）が単離された（レイケルおよびブレケルト（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ），米国特許第５１８７２６２号明細書、１９９３年２月１６日発行）。図５には下記のキチン結合性植物蛋白質中に見られるシステイン／グリシンに富む共通ドメインを示す：タバコキチナーゼ、マメキチナーゼ、ヘベイン、コムギレクチシ、イラクサレクチン。配列の一致および保存変化を囲んだ（保存変化はアミノ酸相同群ＦＷＹ、ＭＩＬＶ、ＲＫＨ、ＥＤ、ＮＱ、ＳＴおよびＰＡＧ内での置換であると考えられる；一致を最大にした場合に生じるギャップをダッシュで示す）。９アミノ酸残基を含む中央領域は、そのドメインの特に良好に保存された部分であり、下記の配列をもつ：このコア領域の周りにおいてもシステイン／グリシンに富むドメインの中央システインモチーフは絶対的に保存されており、下記の配列をもつ：システイン−（４アミノ酸）−システイン−システイン−（５アミノ酸）− システイン−（６アミノ酸）−システインキチン結合性植物蛋白質は、キチンを含む特定の生物（菌類または昆虫）の生育に影響を及ぼすことが見出された。しかしそれらの蛋白質の特異性には相異がある。たとえばコムギ／オオムギ／イネ−型のレクチンはゾウムシに対しては毒性であるが、インビトロで菌類に対しては不活性である（マードック（Ｍｕｒｄｏｃｋ）ら，１９９０，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，２９：８５−８９）。これに対しヘベインおよびキチナーゼ類はインビトロで特定の病原性菌類の増殖に対して阻害性であることが認められた（ファン・パリス（ＶａｎＰａｒｉｊｓ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８３：２５８−２６４；ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９８８，ＰｈｙｓｉｏｌＭｏｌＰｌａｎｔＰａｔｈ，３３：３１９−３３１）。ＨＥＶ１蛋白質は菌類の増殖を阻害するために使用しうる（レイケルおよびブレケルト，米国特許第５１８７２６２号明細書、１９９３年２月１６日発行）。イラクサレクチンはインビトロでヘベインより２−５倍高い水準の抗真菌活性を生じることも示された（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１１００−１１０２）。これらの蛋白質が植物において抵抗性を作り出すために有用であるという可能性が述べられている（たとえばパイオニア・ハイブレッドの欧州特許出願第５０２７１８号明細書）。本発明者らは、先に、ヒユ（ハゲイトウ）属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）から単離された広域スペクトル抗真菌活性をもつ２種類の蛋白質（Ａｃ−ＡＭＰ類）を報告した（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４；国際特許出願公開ＷＯ９２／２１６９９号明細書）。これは本質的に、キチン結合性レクチン類において同定されたシステイン／グリシンドメインからなる。本発明によれば、キチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを含むアミノ酸配列を有し、かつ下記のうち１または２以上の特性を備えた抗微生物性蛋白質が提供される：キチン結合性植物蛋白質より実質的に良好な、植物病原性真菌に対抗する活性；キチン結合性植物蛋白質より高い、酸性アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の比率；植物病原性真菌に対する分節菌体分枝（ｈｙｐｈａｌｂｒａｎｃｈｉｎｇ）を生じる活性。特にトウガラシ属の種の種子から単離しうる蛋白質、およびコバンソウ属の種の種子から単離しうる蛋白質が提供される。それらの抗微生物性蛋白質は、近縁種および非近縁種（カタポジウム属（Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ）、バプティシア属（Ｂａｐｔｉｓｉａ）、ミクロセンシス属（Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓ）、ヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）を含む）の種子からも単離することができ、またはいずれか適切な方法で合成することができる。本発明者らは、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ）の種子から新規な抗微生物性蛋白質（以下、Ｃａ−ＡＭＰ１（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ１）と呼ぶ）を精製した。この蛋白質はキチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを共有するが、ヘベインまたはイラクサレクチンより少なくとも１桁高い、極めて有効かつ広域スペクトルの抗真菌活性を保有するので新規である。このように、これらの蛋白質配列の保存性（たとえばＣａ−ＡＭＰ１に関するアミノ酸配列はヘベインと６５％等しい）にもかかわらず、このトウガラシ蛋白質はその抗真菌活性の効力およびスペクトルにおいて著しく改良されている。実際に、Ｃａ−ＡＭＰ１とヘベインはサイズおよびアミノ酸配列において極めて類似するが、それらの活性の水準およびスペクトルにおいて著しく異なることは注目すべきである。また本発明者らは、コバンソウ（Ｂｒｉｚａｍａｘｉｍａ）の種子から新規な抗微生物性蛋白質（以下、Ｂｍ−ＡＭＰ１（Ｂｒｉｚａｍａｘｉｍａａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ１）と呼ぶ）を精製した。この蛋白質はキチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを共有するが、極めて有効かつ広域スペクトルの抗真菌活性を保有するので新規である。このように、これらの蛋白質配列の保存性にもかかわらず、このコバンソウ蛋白質はその抗真菌活性の効力およびスペクトルにおいて著しく向上している。Ｂｍ− ＡＭＰ１に関するアミノ酸配列はＣａ−ＡＭＰ１と４５％等しいが、ヘベインとはわずか３５％等しい。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１の抗真菌活性は、前記のヒユ蛋白質（Ａｃ−ＡＭＰ）（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４：国際特許出願公開ＷＯ９２／２１６９９号明細書）のものに類似する：これらの蛋白質はすべて実質的にヘベインまたはイラクサレクチンより塩基性が高く、これが活性の相異に関与している可能性がある。本発明者らは、全体的に塩基性のプロフィルを保有することが抗真菌性蛋白質の有効性に寄与することを見出した。たとえばオシロイバナ属（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）およびダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）から単離された異なる類の抗真菌性蛋白質の場合、より活性の高いものは常に、より塩基性の相同体である（テラス（Ｔｅｒｒａｓ）ら、１９９２，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２６７：１５３０１−１５３０９；カミュ（Ｃａｍｍｕｅ）ら、１９９２，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２６７：２２２８−２２３３）。トウガラシ（Ｃａ−ＡＭＰ１）蛋白質の配列はヘベインのものに極めて類似するが、塩基性アミノ酸：酸性アミノ酸の比率はＣａ−ＡＭＰ１については４：１であり、ヘベインについては４：５である（すなわちはるかに低い）。塩基性アミノ酸：酸性アミノ酸の比率はＢｍ−ＡＭＰ１については３：１である。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１の塩基性が効力の向上に関与している可能性がある。従って部位特異的突然変異を利用して特定のキチン結合性植物蛋白質（たとえばヘベイン）の塩基性を高めると、特にその置換がトウガラシ（Ｃａ−ＡＭＰ１）蛋白質において塩基性アミノ酸がある位置でなされた場合（たとえばヘベインの位置２８のアスパラギン酸の交換）、またはコバンソウ（Ｂｍ−ＡＭＰ１）蛋白質において塩基性アミノ酸がある位置でなされた場合、抗真閑活性が高まると思われる。従って特定のキチン結合性植物蛋白質の構造を調整することによって、新規な、より有効な本発明の抗微生物性蛋白質を作り出すことが可能である。多数の異なる植物種をスクリーニングした際に、本発明の蛋白質類が植物の種子にかなり共通であることが明らかになった。蛋白質の抗真菌活性をそれらが生じる予想外の形態学的作用、すなわち部分的に阻害された発芽中の真菌胞子において著しい分節菌体分枝が起こることに基づいて識別することが可能である。これはフサリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）を用いた場合に特に顕著である。本発明者らは、ヒユ蛋白質（Ａｃ−ＡＭＰ１）が真菌分節菌体に対して同様な作用を生じることを今回見出した。この阻害の性質は、それがアッセイに用いるカチオンの濃度に対して極めて感受性であるという事実をも特色とする。トウガラシ蛋白質（Ｃａ−ＡＭＰ１）とヒユ蛋白質（Ａｃ−ＡＭＰ類）の類似性にもかかわらず、それらの一次構造および三次構造には顕著な相異がある。図５は、Ｃａ−ＡＭＰ１の配列が少なくとも４２のアミノ酸残基を含むことを示す。しかしＡｃ−ＡＭＰ２はこれより短い蛋白質である：すなわち全Ａｃ−ＡＭＰ２配列はわずか３０のアミノ酸残基を含むにすぎない。さらにＣａ−ＡＭＰ１の残りの配列は、Ａｃ−ＡＭＰ２蛋白質に見られない２個の付加的なシステイン残基を含む。システインは蛋白質内の内部結合に関与するので、Ｃａ−ＡＭＰ１とＡｃ−ＡＭＰ２の三次構造が異なることはあり得る。Ｂｍ−ＡＭＰ１は、そのアミノ酸の総数およびそのシステイン残基の数においてＣａ−ＡＭＰ１に類似する。Ｂｍ−ＡＭＰ１とＣａ−ＡＭＰ１が二次および三次の双方の水準でかなりの相同性を共有することはあり得る。Ｃａ−ＡＭＰ１と同様にＢｍ−ＡＭＰ１が、一部はＢｍ−ＡＭＰ１中に見られる２個の付加的なシステイン残基のためその三次構造においてＡｃ−ＡＭＰ２と異なることもあり得る。本発明はさらに、本発明の蛋白質をコードする組換えＤＮＡ配列、および該配列を含むベクターを提供する。該ＤＮＡを生物系にクローニングまたは形質転換して、コードされた該蛋白質を発現させることができる。さらに、本発明による抗微生物性蛋白質をコードする組換えＤＮＡで形質転換された植物が提供される。さらに、真菌または細菌を本発明による蛋白質に暴露することにより、真菌または細菌と対抗する方法も提供される。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１は広範な抗真菌活性を示し、かつグラム陽性細菌に対しても有効である。それぞれの蛋白質は殺真閑薬または抗生物質として、農業用または薬剤用に有用である。抗微生物性蛋白質への植物病原体の暴露は、植物に、または植物が生育する土壌に付与された前記の蛋白質を微生物内で発現させることにより達成しうる。またそれらの蛋白質は、標準的な農業技術（たとえば噴霧）により該蛋白質を植物の部分に付与することによって、真菌性または細菌性病害と対抗するために使用しうる。またそれらの蛋白質は、植物の生育中に、または収穫後の作物の保護のために、植物体内で発現させることにより真菌性または細菌性病害と対抗するために使用しうる。またそれらの蛋白質は、哺乳動物感染症を治療するための殺真菌薬として使用しうる。本発明の抗微生物性蛋白質は、適宜な種子から単離精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工的に合成するか、または組換えＤＮＡの発現により適切な微生物内で産生させることができる。それらの蛋白質をトランスジェニック植物内で発現させることもできる。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列は、それらがキチン結合性植物蛋白質と同類であることを示す。特にＣａ−ＡＭＰ１とヘベインはアミノ酸配列およびサイズが極めて類似する。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１は本質的にそれぞれ共通のシステイン／グリシンドメインからなる。一次構造の知見から、前記の抗微生物性蛋白質またはその一部を標準的なペプチド合成装置による化学合成により調製することができる。それにより、抗微生物性蛋白質をコードするＤＮＡ構造体を調製することもできる。ＤＮＡ配列は既知のアミノ酸配列から推定するか、または植物由来のＤＮＡライブラリーからその配列を単離することができる。オリゴヌクレオチドプローブを既知のアミノ酸配列から誘導し、それらを用いて、前記蛋白質の一部または全部をコードするｃＤＮＡクローンにつきｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。これらの同じオリゴヌクレオチドプローブまたはｃＤＮＡクローンを用いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、実際の抗微生物性蛋白質遺伝子（１または２以上）を単離することができる。それらのゲノムクローンには、植物ゲノム内で作動する制御配列が含まれる。こうして抗微生物性（または他の）蛋白質の発現を駆動するために使用しうるプロモーター配列を単離することもできる。これらのプロモーターは、特に環境条件（たとえば真菌性病原体の存在）に応答するものであってもよく、それらを用いていずれかの標的遺伝子の発現を駆動させることもできる。次いで本発明の抗微生物性蛋白質をコードするＤＮＡ（それはｃＤＮＡクローン、ゲノムＤＮＡクローン、または標準的な核酸合成装置を用いて調製されたＤＮＡのいずれであってもよい）を、蛋白質または蛋白質の一部を発現しうる生物系内へクローニングすることができる。ＤＮＡを構成性または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。誘導性の系の例には、病原体による誘導発現および化学物質による誘導が含まれる。こうして本発明蛋白質を適切な微生物または培養細胞内で産生させ、使用のために抽出および単離することができる。適切な微生物には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）および酵母が含まれる。適切な細胞には、培養された昆虫細胞および培養された哺乳動物細胞が含まれる。遺伝子材料をウイルスまたはバクテリオファージ内へクローニングすることもできる。前記ＤＮＡを既知の方法でいずれかの植物種内へ形質転換し、これにより抗微生物性蛋白質をその植物内で発現させることもできる。本発明によれば植物細胞を、本発明による構造体を用いて多様な既知の方法で形質転換することができる（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｇｕｎ）など）。形質転換された細胞は、適切な場合には次いで新規な核物質がゲノム内に安定に取り込まれた全植物を再生しうる。この方法で、形質転換された単子葉植物および双子葉植物の両方を得ることができが、通常は後者の方が再生しやすい。調製しうる遺伝子修飾された植物の例には、家畜用穀物（ｆｉｅｌｄｃｒｏｐ）、穀類（ｃｅｒｅａｌ）、果実および野菜、たとえば下記のものが含まれるカノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、バレイショ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ。本発明は図面を参照することによってさらに理解しうる：図１は、Ｃａ−ＡＭＰ１の精製に関するカチオン交換クロマトグラム、およびこれと共に抗真菌活性のグラフを示す。図２は、精製されたＣａ−ＡＭＰ１のＨＰＬＣプロフィルを示す。図３は、Ｃａ−ＡＭＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図４は、Ｃａ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列を示す。図５は、Ｂｍ−ＡＭＰ１、Ｃａ−ＡＭＰ１、Ａｃ−ＡＭＰ２、および多数のキチン結合性レクチンのアミノ酸配列の一致を示す。図６は、蛋白質Ｃａ−ＡＭＰ１に関して可能性のある推定ＤＮＡ配列の１つを示す。図７は、Ｃａ−ＡＭＰ１、およびヒユ蛋白質Ａｃ−ＡＭＰ１と共にインキュベートされた、部分的に阻害されたフザリウム・カルモラム胞子を示す。図８は、キチンを用いたＣａ−ＡＭＰ１のアフィニティークロマトグラフィー処理の種々の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図９は、Ｂｍ−ＡＭＰ１の精製に関するカチオン交換クロマトグラム、およびこれと共に抗真菌活性のグラフを示す。図１０は、精製されたＢｍ−ＡＭＰ１のＨＰＬＣプロフィルを示す。図１１は、Ｂｍ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列を示す。図１２は、Ｂｍ−ＡＭＰ１に関して可能性のある推定ＤＮＡ配列の１つを示す。以下の実施例は本発明を説明するものである。実施例１抗真菌活性および抗菌活性のアッセイ抗真菌活性は先に報告された顕微分光分析により測定された（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ)，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５−６０）。試験はルーティンに２０μｌの（フィルター滅菌した）被験溶液および８０μｌの真菌胞子（２×１０⁴胞子／ｍｌ）を用いて、半濃度バレイショデキストロースブロス（培地Ａ）、またはそれぞれ最終濃度１ｍＭおよび５０ｍＭとなるように添加されたＣａＣｌ₂およびＫＣｌを含有する半濃度バレイショデキストロースブロス（培地Ｂ）中で実施された。特に指示しない限り試験生物はフザリウム・カルモラム（菌株ＩＭＩ１８０４２０）であり、インキュベーションは２５℃で４８時間行われた。増殖阻止率％は、５９５ｎｍにおける対照微生物培養物の補正済み吸光度に対する、対照微生物培養物の補正済み吸光度から試験微生物培養物の補正済み吸光度を差し引いたものの比率の、１００倍と定義される。補正済み吸光度値は、４８時間後に測定された５９５ｎｍにおける吸光度から３０分後に測定された５９５ｎｍにおける吸光度を差し引いたものに等しい。抗菌活性は下記に従って顕微分光分析により測定された。細菌懸濁液はソフト栄養寒天（トリプトン、１０ｇ／ｌ；シープラーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）（ＦＭＣ），５ｇ／ｌ）に接種することにより調製された。細菌懸濁液（１０⁵コロニー形成単位／ｍｌ）のアリコート（８０μｌ）を、平底９６ウェルミクロプレート内のフィルター滅菌試料（２０μｌ）に添加した。５９５ｎｍにおける培養物の吸光度を、２８℃でのインキュベーションの３０分後および２４時間後に、ミクロプレート読み取り装置により測定した。増殖阻止率％は抗真菌活性アッセイにつき前記に述べたように計算された。実施例２トウガラシまたはコバンソウの種子からの塩基性蛋白質の抽出１ｋｇのトウガラシまたはコバンソウの種子（チルターン・シーズから、英国カンブリア）をコーヒーミルで粉砕し、得られた粉を４℃で２時間、１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭベンズアミジンを含有する氷冷された抽出用緩衝液２リットルで抽出した。得られたホモジネートをガーゼで絞り、遠心分離（７，０００×ｇで３０分間）により澄明化した。固体硫酸アンモニアを上清に添加して、７５％相対飽和度となし、４℃で一夜放置することにより沈殿を生成させた。７，０００× ｇで３０分間の遠心分離後に、沈殿を最小容量の蒸留水に再溶解し、ベンゾイル化セルロースチューブ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を用いて蒸留水に対して徹底的に透析した。透析後に、１０倍濃度の緩衝液を添加することにより溶液を５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）に調整し、５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）中で平衡化したＱ−セファロース高速流（Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ）（ファルマシア、スウェーデン国ウプサラ）カラム（１２×５ｃｍ）に導通した。カラムを通過した蛋白質画分を酢酸でｐＨ６に調整した。この物質は前記種子の塩基性（ｐＩ＞９）蛋白質画分である。これらの画分をさらに実施例３の記載に従って精製した。実施例３トウガラシまたはコバンソウの種子からの抗微生物性蛋白質の精製トウガラシまたはコバンソウの抗微生物性蛋白質の単離に用いた出発原料は、実施例２に従って成熟種子から抽出された塩基性蛋白質画分であった。これらの蛋白質をこの抽出物のカチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。約５００ｍｌの塩基性蛋白質画分を５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）に調整し、５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）中で平衡化したＳ−セファロース高性能（Ｑ −ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）（ファルマシア）カラム（１０×１．６ｃｍ）に付与した。カラムを３．０ｍｌ／分で、５０−７５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ６．０）の直線濃度勾配を用いて３２５分間にわたって溶離した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸光度のオンライン測定により蛋白質につき監視し（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図１および９の下側パネルに示す）、１０ｍｌの画分で採集した。それぞれ画分からの試料を実施例１の記載に従って抗真菌活性につきアッセイした（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図１および９の上側パネルに示す）。クロマトグラフィー処理後に、トウガラシ抽出物は２２０ｍＭＮＨ₄Ａｃ付近で溶出する幅広い活性ピークを与えた。コバンソウ抽出物は２５０ｍＭＮＨ₄ Ａｃ付近で溶出する幅広い活性ピークを与えた。抗真菌活性を示すこれらの画分をプールし、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。そのピークの約３ｍｇ量を、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したＰＥＰ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂ ／Ｃ₁₈、ファルマシア）カラム（２５×０．４ｃｍ）に装填した。カラムを１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡから１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡまでの直線濃度勾配を用いて１００分間にわたって溶離した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸光度のオンライン測定により蛋白質につき監視した（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図２および１０の下側パネルに示す）。１ｍｌの画分を採集し、真空乾燥し、１ｍｌの蒸留水に再溶解し、そのうち１０ μｌを抗真菌アッセイに用いた（トウガラシまたはコバンソウについての結果を、それぞれ図２および１０の上側パネルに示す）。上分に分離した単一の活性ピークを、それぞれＣａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１と呼んだ。実施例４精製した抗微生物性蛋白質Ｃａ−ＡＭＰ１の分子構造精製した抗微生物性蛋白質の分子構造をさらに分析した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を市販のプレキャストゲル（高密度ファストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌＨｉｇｈＤｅｎｓｉｔｙ）、ファルマシアから）上で、ファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）ファルマシア）電気泳動装置を用いて実施した。試料用緩衝液は２００ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ブロモフェノールブルー、および特に指示しない限り１％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール（ＤＴＥ）を含有していた。電気泳動後に蛋白質を１２．５％グルタルアルデヒド中で固定し、ホイケスホーベンおよびデルニック（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ，Ｄｅｒｎｉｃｋ）（１９８５，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，６，１０３−１１２）に従って銀染色した。比較のために分子量マーカー（ファルマシア）を走行させた（図３、列Ｍ）：１７ｋＤａ、１４．５ｋＤａ、８ｋＤａ、６ｋＤａ、２．５ｋＤａ。Ｃａ−ＡＭＰ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｃａ−ＡＭＰ１はβ−メルカプトエタノールで還元したのち、見掛け分子量４−５ｋＤａの単一バンドとして走行する（図３、列２および４）。未還元Ｃａ−ＡＭＰ１は１４ｋＤａの単一バンドとして走行する（図３、列１および３）。これらの結果は、天然Ｃａ− ＡＭＰ１はオリゴマー（恐らく二量体）蛋白質であることを示す。実施例５Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列フルマー（Ｆｕｌｌｍｅｒ）（１９８４，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１４２，３３６−３４１）の方法を用いるＳ−ピリジルエチル化によりシステイン残基を修飾した。Ｐｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈）（ファルマシア）カラム（２５×０．４ｃｍ）上でのＨＰＬＣにより試薬を除去した。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルまでの直線濃度勾配を用いて溶離することにより、Ｓ−ピリジルエチル化蛋白質を採集した。得られた蛋白質画分を、１２０Ａアナライザー（アプライド・バイオシステムズ）によるフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体のオンライン検出を伴う４７７Ａ蛋白質シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）により、アミノ酸配列分析した。Ｃａ−ＡＭＰ１の配列を決定する最初の試みにより、この蛋白質はＮ−末端ブロックされていることが示された。次いでＳ−ピリジルエチル化蛋白質を供給業者（ベーリンガー・マンハイム、ＦＲＧ）の指示に従ってピログルタメートアミノペプチダーゼで脱ブロックした。この反応は部分的に成功して、最初の１６アミノ酸に関する配列が求められたにすぎない。Ｃ−末端に関する配列を求めるために、Ｃａ−ＡＭＰ１をトリプシンで消化し、得られた３つのフラグメントを配列決定した。１つはブロックされていることが認められ、これはＮ−末端である。他の２つのペプチドの配列決定により、それらをＮ−末端に関する配列と整列させることができ（図４）、かつその完全配列はキチン結合性植物蛋白質中に見られたシステイン／グリシンに富むドメインと相同性であることが示された（図５）。Ｃａ−ＡＭＰ１に関するこの配列が不完全であって、Ｃ−末端にさらにアミノ酸があるという可能性はある。このペプチドがＮ−末端ブロックされており、これをアミノペプチダーゼで除去しうるという所見は、Ｎ−末端アミノ酸がグルタミンであることを示唆する。Ｂｍ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列を図１１に示す。配列中の２つの位置において２アミノ酸の選択の可能性がある。位置９においてアミノ酸はアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）であり、位置２３においてアミノ酸はセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）である。精製された蛋白質画分Ｂｍ−ＡＭＰ１は、これら２位置において前記アミノ酸のいずれかの組み合わせをもつ異なる配列のペプチドの混合物である可能性がある。図５は、タバコキチナーゼ（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）ら，１９８７，ＰｒｏＮａｔＡｃａＳｃｉＵＳＡ，８４：８９−９３）、マメキチナーゼ（ブログリー（Ｂｒｏｇｌｉｅ）ら，１９８６，ＰｒｏＮａｔＡｃａＳｃｉＵＳＡ，８３：６８２０−６８２４）、ヘベイン（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９０，ＰｒｏＮａｔＡｃａＳｃｉＵＳＡ，８７：７６３３ −７６３７）、コムギレクチン（レイケルおよびニルキンス（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎｉｌｋｉｎｓ），１９８７，ＰｒｏＮａｔＡｃａＳｃｉＵＳＡ，８４：６７４５−６７４９）、イラクサレクチン（チャポー（Ｃｈａｐｏｔ）ら，１９８６，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９５：２３１−２３４）、Ａｃ−ＡＭＰ２（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４；国際特許出願公開ＷＯ９２／２１６９９号明細書）からのＮ−末端アミノ酸配列、ならびにＣａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１に関する配列の一致を示す。配列の一致および保存変化を囲んだ。保存変化はアミノ酸相同群ＦＷＹ、ＭＩＬＶ、ＲＫＨ、ＥＤ、ＮＱ、ＳＴおよびＰＡＧ内での置換であると考えられる。一致を最大にした場合に生じるギャップをダッシュで示す。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１に関するアミノ酸配列は、キチン結合性植物蛋白質中のシステイン／グリシンに富むドメインに対して著しい類似性を示す。特にＣａ−ＡＭＰ１はヘベインに６５％等しい。Ｂｍ−ＡＭＰ１はヘベインに３５％、Ｃａ−ＡＭＰ１に４５％等しい。ヒユ蛋白質類と同様に、Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１はヘベインより実質的に塩基性が高い。Ｃａ−ＡＭＰ１およびヘベインは両方とも４個の塩基性アミノ酸を含むが、Ｃａ−ＡＭＰ１はヘベインの５個に対し１個の酸性アミノ酸を含むにすぎない。それらの活性にとってこれらの蛋白質の全体としての塩基性が重要であれば、ヘベインの位置２８のアスパラギン酸を、Ｃａ−ＡＭＰ１のこの位置に見られるアルギニンに交換すると、ヘベインの比活性が高まると期待される。事実、Ｃａ−ＡＭＰ１とヘベインはサイズおよびアミノ酸配列において極めて類似するが、それらの活性の水準およびスペクトルは著しく異なるというのは、極めて注目に値すると思われる。Ｂｍ−ＡＭＰ１は、６個の塩基性アミノ酸およびわずか２個の酸性アミノ酸を含み、これに対しヘベインは４個の塩基性アミノ酸を含むが、５個の酸性アミノ酸を含む。従ってＢｍ−ＡＭＰ１の全体として塩基性のプロフィルが、ヘベインおよび他のキチン結合性植物蛋白質と比較してこの蛋白質の抗真菌活性が向上していることに関係すると思われる。図６および１２は、それぞれＣａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１をコードする遺伝子の可能なＤＮＡ配列の１つを示す。この遺伝子配列は、分かったアミノ酸配列から、双子葉植物に一般的に生じるコドンを用いて推定された。トウガラシおよびコバンソウの実際の遺伝子配列は、遺伝子コドンの縮重のため、異なる可能性がある。実施例６本発明蛋白質の抗真菌活性の安定性抗真閑活性に関する試験は、実施例１に挙げたアッセイ法に従って、フザリウム・カルモラム胞子を含有する増殖培地で５倍希釈された２０μｌの試料を用いて行われた。未処理対照試料は、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中の被験蛋白質５００μｇ／ｍｌからなっていた。熱安定性試験は、アリコートの被験蛋白質を１００℃までの種々の温度で１０分間加熱することにより行われた。ジスルフィド橋の還元は、３０ｍＭのジチオトレイトールおよび３００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加することにより行われた。逆相クロマトグラフィーにより試薬を除去した。消化のために種々のプロテアーゼを２００μｇ／ｍｌで添加し、３７℃で３時間インキュベートした。試薬のみを含有する対照処理は、逆相クロマトグラフィー段階後に抗真菌活性につき陰性であることが証明された。精製されたＣａ−ＡＭＰ１蛋白質およびＢｍ−ＡＭＰ１蛋白質の抗真菌活性は、最高８０℃で１０分間の熱処理に対して抵抗性であった。しかしジチオトレイトールによるジスルフィド結合の還元は、抗真菌活性を完全に失わせた。これらのジスルフィド結合は生物学的活性にとって必須なのである。プロテイナーセＫまたはプロナーゼＥによるＣａ−ＡＭＰ１の処理は抗真菌活性を少なくとも１０倍低下させたのに対し、トリプシンはこの活性をわずか２倍低下させ、キモトリブシンは活性に対して影響を及ぼさなかった。実施例７本発明蛋白質の抗真菌効力（Ａ）Ｃａ−ＡＭＰ１精製された蛋白質の抗真菌効力を、実施例１に記載したアッセイ法を用いて種々の植物病原性真菌につき評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収集、ならびに閑糸体フラグメントの調製は、先に報告されたものに従って行われた（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５−６０）。下記の真菌株を用いた：アルテルナリア・ブラシオコラ（Ａｌｒｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃｏｌａ）ＭＵＣＬ２０２９７、アスコシタ・ピシ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａｐｉｓｉ）ＭＵＣＬ３０１６４、ボツリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）ＭＵＣＬ３０１５８、セルコスポラ・べチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔｉｃｏｌａ）Ｋ８９７、コレトリカム・リンデムチアナム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）ＭＵＣＬ９５７７、フザリウム・カルモラムＩＭＩ１８０４２０、フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｐｉｓｉ）ＩＭＩ２３６４４１、フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）ＭＵＣＬ９０９、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）コレクション・ファン・エッテン１６０−２−２、ペニシリウム・ジギテイタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｉｇｉｔａｔｕｍ）（Ｋ０８７９）、フォマ・ベタ（Ｐｈｏｍａｂｅｔａｅ）ＭＵＣＬ９９１６、ピレノフォラ・トリティシーレペンチス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ）ＭＵＣＬ３０２１７、ピリキュラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅ）ＭＵＣＬ３０１６６、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＣＢＳ２０７−８４、セプトリア・トリティシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａｔｒｉｔｉｃｉ）（Ｋ１０９７Ｄ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ）（Ｋ１１２７）、ベルティシリウム・アルボーアトラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）（Ｋ０９３７）、ベルティシリウム・ダーリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）ＭＵＣＬ１９２１０。リゾクトニア・ソラニについては菌糸体フラグメントを接種物として用い、これに対し他のすべての真菌は胞子として接種された。増殖培地Ａまたは培地Ｂを用いて、抗真菌性蛋白質の系列希釈液を真菌に付与した。増殖阻止率％を顕微分光分析法により測定した。４８時間のインキュベーション後に５０％の増殖阻市に要する濃度（ＩＣ₅₀値）を用量−反応曲線から計算した。結果を表１にまとめる。一連の真菌につき培地Ａにおいてアッセイしたところ、ＩＣ₅₀値は１μｇ／ｍｌから５００μｇ／ｍｌ以上にまで変動した。しかし１８株中１２株の病原性真閑についてはＩＣ₅₀値は５０μｇ／ｍｌ未満であり、１０株の真菌についてはＩＣ₅₀値は１０μｇ／ｍｌ未満であった。これらの結果は、Ｃａ−ＡＭＰ１が有効かつ広域スペクトルの真菌増殖阻害物質であることを示す。しかしＣａ−ＡＭＰ１の活性はアッセイに採用されるイオン条件に対して著しく感受性であり、その活性は高い塩類（培地１３）においては本質的に失われる。Ｃａ−ＡＭＰ１を用いて得られた抗真菌活性の水準は、先にヒユの種子から単離された２種類のペプチド（Ａｃ−ＡＭＰ類）（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４）のものに匹敵する。キチン結合性植物蛋白質、たとえばヘベインまたはイラクサレクチンと比較して、Ｃａ−ＡＭＰ１ははるかに高い比活性をもつ。先に本発明者らは、イラクサレクチンが１００μｇ／ｍｌ未満の濃度で試験した７株中３株の真菌のみを阻害し、２０μｇ／ｍｌ未満では阻害しないことを示した（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４）。またヘベインはイラクサレクチンよりはるかに活性が低いとすら報告されている（ファン・パリス（ＶａｎＰａｒｉｊｓ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８３：２５８−２６４）。従ってアミノ酸配列の類似性にもかかわらず、Ｃａ−ＡＭＰ１はヒユ蛋白質と同様に、キチン結合性植物蛋白質とは別個に分類しうる。Ｃａ−ＡＭＰ１およびヒユ蛋白質は、部分的に阻害された真菌胞子において同じ形態学的変化をもたらす。これは、アッセイにフザリウム・カルモラム胞子をＩＣ₅₀値より２−４倍低い蛋白質濃度において使用した場合、容易に見ることができる。光学顕微鏡下で観察すると、これらの蛋白質は発芽中の分節菌体を著しく分枝させる（図７）。図７Ａは２４℃で８時間発芽させた対照胞子を示す；図７Ｂおよび７Ｃは、それぞれＣａ−ＡＭＰ１およびＡｃ−ＡＭＰ１により部分的に阻害された胞子を示す。ヘベインは濃厚な分節閑体および芽を発現させることが報告されている（ファン・パリス（ＶａｎＰａｒｉｊｓ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８３：２５８−２６４）。（Ｂ）Ｂｍ−ＡＭＰ１精製された蛋白質の抗真菌効力を、実施例１に記載したアッセイ法を用いて種々の植物病原性真菌につき評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収集、ならびに菌糸体フラグメントの調製は、先に報告されたものに従って行われた（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５−６０）。下記の真菌株を用いた：アルテルナリア・ロンギペス（Ａｌｒｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ）株ＣＢＳ６２０．８３、ボツリチス・シネレアＭＵＣＬ３０１５８、クラドスポリウム・スフェロスペルマム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）株Ｋ０７９１、フザリウム・カルモラムＩＭＩ１８０４２０、ペニシリウム・ジギテイタム株Ｋ０８７９、セプトリア・トリティシ（Ｋ１０９７Ｄ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｋ１１２７）、ベルティシリウム・ダーリアＭＵＣＬ１９２１０。すべての真菌を胞子として接種した。増殖培地Ａまたは培地Ｂを用いて、抗真菌性蛋白質の系列希釈液を真菌に付与した。増殖阻止率％を顕微分光分析法により測定した。４８時間のインキュベーション後に５０％の増殖阻止に要する濃度（ＩＣ₅₀値）を用量−反応曲線から計算した。Ｂｍ−ＡＭＰ１についての結果を表２にまとめる。一連の真菌につき培地Ａにおいてアッセイしたところ、ＩＣ₅₀値は１μｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌにまで変動した。しかし８株中６種の病原性真菌についてはＩＣ₅₀値は１０μｇ／ｍｌ未満であった。これらの結果は、Ｂｍ−ＡＭＰ１が有効かつ広域スペクトルの真菌増殖阻害物質であることを示す。しかしＢｍ−ＡＭＰ１の活性はアッセイに採用されるイオン条件に対して著しく感受性であり、その活性は高い塩類（培地Ｂ）においては本質的に失われる。Ｂｍ−ＡＭＰ１を用いて得られた抗真菌活性の水準は、Ｃａ−ＡＭＰ１のもの、および先にヒユの種子から単離された２種類のペプチドのもの（Ａｃ−ＡＭＰ類）に匹敵する。キチン結合性植物蛋白質、たとえばヘベインまたはイラクサレクチンと比較して、Ｂｍ−ＡＭＰ１ははるかに高い比活性をもつ。先に本発明者らは、イラクサレクチンが１００μｇ／ｍｌ未満の濃度で試験した７株中３株の真菌のみを阻害し、２０μｇ／ｍｌ未満では阻害しないことを示した（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４）。またヘベインはイラクサレクチンよりはるかに活性が低いとすら報告されている（ファン・パリス（ＶａｎＰａｒｉｊｓ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８３：２５８−２６４）。従ってアミノ酸配列の類似性にもかかわらず、Ｂｍ−ＡＭＰ１はＣａ−ＡＭＰ１およびヒユ蛋白質と同様に、キチン結合性植物蛋白質とは別個に分類しうる。実施例８Ｃａ−ＡＭＰ１のキチン結合活性Ｃａ−ＡＭＰ１とキチン結合性植物レクチンの配列の類似性により、Ｃａ−ＡＭＰ１もキチンに結合する可能性があることが示唆された。ミクロ−キチン−カラムにＣａ−ＡＭＰ１を装填し、カラムを５０ｍＭＮＨ₄ Ａｃ（ｐＨ７．０）で洗浄した。５０μｇのＣａ−ＡＭＰ１をカラム（０．５× １ｃｍ）に装填し、溶出液をカラムに３回再循環した。最終溶出液を採集した。カラムを１ｍｌの５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ７．０）で５回洗浄し、この画分を採集した。最後にカラムを１ｍｌの１００ｍＭ酢酸（ｐＨ２．８）で５回洗浄し、この酸洗浄画分を採集した。採集した画分を脱塩し、逆相クロマトグラフィーにより濃縮し、最後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のための試料用緩衝液５０μｌに溶解した。図８はこの分析の結果を示す。列Ｍは２９ｋＤａ、２０．１ｋＤａ、１３．２ｋＤａおよび５ｋＤａのサイズの分子量マーカーを示す。列１は、対照としての還元Ｃａ−ＡＭＰ１の走行である。列２は、反復５０ｍＭＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ７．０）洗浄により溶出した画分である。列３は酸洗浄画分、列４は初期貫流物である。大部分の蛋白質がカラムに結合し、低ｐＨの脱着用緩衝液中に溶出したことが分かる。これは、Ｃａ−ＡＭＰ１がキチンに対して親和性を示すことを示唆する。実施例９Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１の抗菌活性および抗酵母活性精製した蛋白質を下記の細菌：巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３６３２、大腸菌株ＨＢ１０１、およびシュートモナス・アエウロゲナーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｕｒｏｇｅｎａｓａ）ＮＣＩＢ８２９５の増殖に対して及ぼす影響につき評価し；またビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＪＲＹ１８８の増殖に及ぼす影響を評価した。バイオアッセイは実施例１の記載に従って実施された。結果を表３にまとめる。Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１は、それぞれ巨大菌およびビール酵母の増殖を強く阻害したが、試験した２種類のグラム陰性細菌に対してはほとんど、または全く影響を与えなかった。実施例１０Ｃａ−ＡＭＰ１およびＢｍ−ＡＭＰ１ｃＤＮＡの分子クローニング野生の植物から６つの異なる生育段階の種子を採集し、液体窒素中で凍結し、 −８０℃に保存する。粉砕したのち、６つの異なる生育段階の混合物１５ｇからデブリース（ＤｅＶｒｉｅｓ）ら（１９８８，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，Ｂ６，１−１３）の方法により全ＲＮＡを抽出する。ただし組織のｇ当たり、６ｍｌの１：２フェノール：ＲＮＡ抽出用緩衝液混合物、および２ｍｌのクロロホルムを用いる。シルフロー（Ｓｉｌｆｌｏｗ）ら（１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８，２７２５−２７３１）の記載に従って、オリゴ（ｄＴ）−セルロース上でのアフィニティークロマトグラフィーによりポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを精製する。ガブラーおよびホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｈｏｆｆｍａｎ）（１９８３，Ｇｅｎｅ２５，２６３−２６９）に従って１．５μｇのポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製し、ファルマシアのｃＤＮＡ合成キットを用いてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターにリゲートする。これらのｃＤＮＡを製造業者の指示に従ってラムダＺＡＰＩＩファージベクター（ステラタジーン）内へクローニングする。ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により下記に従って調製される。Ｃａ−ＡＭＰ１またはＢｍ−ＡＭＰ１のアミノ酸の走行に対応する２種類のディジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合成する：一方はセンス配向を有し、他方はアンチセンス配向を有する。両方のプライマーとも、それらの５′末端にＡＡＡＧＡＡＴＴＣ（すなわちＥｃｏＲＩ認識配列に続くＡＡＡ）配列をもつ。ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼを使用し、標準的条件下で（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎg，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・フルス）、アンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）としてのオリゴヌクレオチド、および標的ＤＮＡとしての２５ｎｇのｃＤＮＡを用いて実施される。温度プログラムには、９４℃で５分間の初期段階、３０サイクル（９４℃で１分間；４５℃で２分間；７２℃で３分間）、および７２℃で１０分間の初期段階が含まれる。ＰＣＲ増幅生成物を３％アガロース（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）、ＦＭＣ）ゲル上で精製する。ディジェネレートオリゴヌクレオチドを用いて、このＰＣＲ生成物を部分的に再増幅する。このＰＣＲ増幅生成物を再度３％アガロース（ヌシーブ、ＦＭＣ）ゲル上で精製し、同一条件下でのＰＣＲにより再増幅する。ただし反応混合物は１３０μＭのｄＴＴＰおよび７０μＭのジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを２００μＭのｄＴＴＰの代わりに含有する。ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅生成物を再度３％ヌシーブアカロースゲル上で精製する。約１０，０００プラーク形成単位のラムダＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリーを、ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅生成物により、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）、アメルシャム）を用いるｉｎｓｉｔｕプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。膜を風乾し、ＤＮＡを紫外線（０．１５Ｊ．／ｃｍ²）下で膜に架橋させる。ハイブリダイゼーションは６４℃で１６時間、１０ｎｇ／ｍｌの熱変性ジゴキシゲニン標識プローブを含有する５×ＳＳＣ、１％ブロッキング試薬（ベーリンガー・マンハイム）、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム中において実施される。非特異的に結合したプローブは、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中２５℃において５分間で２回、０．１ ×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６０℃において１５分間で２回、すすぐことにより除去しうる。プローブの検出は、アルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー・マンハイム）およびその基質５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリルホスフェート（ベーリンガー・マンハイム）を用いて、製造業者の指示に従って行われる。陽性プラークを、同一プローブにより同一条件下でさらに２回のスクリーニング過程により精製する。精製プラークから挿入配列を切り取り、インビボでピーブルースクリプトファージミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｐｈａｇｅｍｉｄ）形中へヘルパーファージＲ４０８により挿入する。種々の陽性クローンからの挿入配列をＥｃｏＲＩ消化により切り取り、それらのサイズをアガロースゲル電気泳動により比較する。幾つかのクローンをヌクレオチド配列分析する。最大挿入配列を有するクローンがＣａ−ＡＭＰ１またはＢｍ−ＡＭＰ１に対応するオープンリーデグフレームを有する可能性があり、これは実験用Ｎ−末端アミノ酸配列との比較により判定しうる。全長ｃＤＮＡクローンはそれらの５′および３′末端非翻訳領域ならびにポリアデニル化シグナルにおいて互いに異なる可能性がある。全長ｃＤＮＡを得るために、他の方法をとることができる。ＰＣＲを標準的条件下で、一方ではＭ１３普遍プライマー、他方ではＭ１３逆プライマーと組み合わせたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて実施する。このオリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドが、全長未満（ｌｅｓｓ−ｔｈａｎ−ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ｃＤＮＡクローンのポリＡテイルを直接にフランキングする３′側非翻訳領域の一部の逆相補配列を形成する。この配列を５′末端方向へ、前方にヌクレオチド’ＡＴＡ’を含むＧＡＡＴＴＣＥｃｏＲＩ認識部位によって延長する。鋳型としては２μｇの全ｃＤＮＡまたは１０⁵の組換えファージを用いる。両方の場合とも、３回の別個の反応を設定する。増幅の前に、ＰＣＲ温度プログラムにおいて９９℃で５分間の初期段階によりファージを溶解して、ファージＤＮＡを放出させる。増幅生成物のサイズは３％アガロース（ヌシーブ、ＦＭＣ）ゲル上での電気泳動により決定される。異なる長さの挿入配列に対応するサイズの生成物が得られ、ｃＤＮＡライブラリー中に全長ｃＤＮＡが存在する場合にはこれらにそれが含まれる。実施例１１発現ベクターの構築発現ベクターを構築する：これは、その５′末端においてカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡの強力な構成性プロモーター（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１３，８１０−８１２）によりフランキングされ、高い転写活性を得るための重複エンハンサー要素（カイ（Ｋａｙ）ら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６，１２９９−１３０２）を備えた、Ｃａ−ＡＭＰ１またはＢｍ−ＡＭＰ１ＤＮＡの全コード領域を含む。Ｃａ−ＡＭＰ１／Ｂｍ−ＡＭＰ１ＤＮＡの全コード領域は、その３′末端側においてはカリフラワーモサイクウイルスの３５ＳＲＮＡのポリアデニル化配列（ＣａＭＶ３５５）によりフランキングされている。このベクターのプラスミド主鎖は、ファージミドｐＵＣ１２０（ビエイラおよびメッシング（Ｖｉｅｉｒａ，Ｍｅｓｓｉｎｇ），１９８７，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５３，３−１１）である。発現ベククーは下記により構築される。Ｃａ−ＡＭＰ１／Ｂｍ−ＡＭＰ１ＤＮＡから構成されるｃＤＮＡクローンを、ｐＥＭＢＬ１８＋（ベーリンガー）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位へクローニングする。このＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントを、予めＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した発現ベクターｐＦＡＪ３００２内へサブクローニングする。ｐＦＡＪ３００２は発現ベクターｐＦＦ１９（チンメルマンズ（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎｓ）ら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，３３３−３４４）の誘導体であって、そのユニークＥｃｏＲＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位で交換したものである。実施例１２植物形質転換ベクターの構築実施例１１で得た発現ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｃａ−ＡＭＰ１／Ｂｍ−ＡＭＰ１ＤＮＡ発現カセットを含むフラグメントをｐＢｉｎ１９ＲｉのユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位へサブクローニングする。ｐＢｉｎ１９Ｒｉは植物形質転換ベクターｐＢｉｎ１９（ベバン（Ｂｅｖａｎ），１９８４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２，８７１１−８７２１）の修飾形であって、ユニークＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位が交換され、欠陥ｎｔｐＩＩ発現カセット（イエノフスキー（Ｙｅｎｏｆｓｋｙ）ら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：３４３５−３４３９）が導入されたものである。実施例１３植物形質転換攻撃力を失わせた（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）株ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４）（ヘケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）ら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０３，１７９−１８０）を、実施例１２において調製したベクターによりデ・フラモンド（ｄｅＦｒａｍｏｎｄ）ら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１，２６２−２６９）の方法で形質転換する。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａｔａｂａｃｕｍ）サムサン（Ｓａｍｓｕｎ）の葉のディスクを用いて、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７，１２２９−１２３１）の方法、およびｐＦＲＧ８を含むアグロバクテリウム属菌株との同時培養に基づいて、タバコの形質転換を行う。同時培養は１００μｇ／ｍｌのカナマイシンの選択負荷のもとで実施される。これらのトランスジェニック植物（ｐＦＲＧ８で形質転換）を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地上で再生させる。これらのトランスジェニック植物を新たに導入された遺伝子の発現につき、標準的なウェスタンブロット法により分析することができる。導入された遺伝子の構成性発現が可能な植物を選択し、自家受粉させて種子を得ることができる。トランスジェニック植物のＦ１実生をさらに分析する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月２４日【補正内容】請求の範囲の全文を以下のとおり差し替える。請求の範囲１．実質的に図４または図１１に示されるアミノ酸配列を有する抗微生物性蛋白質。２．オリゴマーであり、かつ実質的に図４または図１１に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む、請求項１に記載の蛋白質。３．純粋な蛋白質Ｃａ−ＡＭＰ１である、請求項１に記載の蛋白質。４．純粋な蛋白質Ｂｍ−ＡＭＰ１である、請求項１に記載の蛋白質。５．植物の種子から単離しうる、請求項１に記載の蛋白質。６．トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種子、コバンソウ属（Ｂｒｉｚａ）の種子、カタポジウム属（Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ）の種子、バプティシア属（Ｂａｐｔｉｓｉａ）の種子、ミクロセンシス属（Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓ）の種子、ヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）の種子よりなる群から選ばれる種子から単離しうる、請求項５に記載の蛋白質。７．合成によるものである、請求項１に記載の蛋白質。８．組換えＤＮＡの発現により製造される、請求項１に記載の蛋白質。９．請求項１−８のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する組成物。１０．請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする、組換えＤＮＡ配列。１１．ｃＤＮＡである、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。１２．ゲノムＤＮＡである、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。１３．植物ゲノムから単離された、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。１４．プロモーター配列を含む、請求項１３に記載のＤＮＡ配列。１５．請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子から得られるプロモーター配列。１６．請求項１０に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。１７．コードされる蛋白質が発現する状態で請求項１０に記載の組換えＤＮＡを含む生物系。１８．微生物である、請求項１７に記載の生物系。１９．植物である、請求項１７に記載の生物系。２０．請求項１０に記載の組換えＤＮＡにより形質転換された植物。２１．組換えＤＮＡがＣａ-ＡＭＰ１をコードする、請求項２０に記載の植物。２２．組換えＤＮＡがＢｍ-ＡＭＰ１をコードする、請求項２０に記載の植物。２３．請求項２０−２２のいずれか１項に記載の植物の種子および子孫。２４．請求項１−８のいずれか１項に記載の蛋白質に暴露することを含む、真菌または細菌と対抗する方法。２５．請求項９に記載の組成物に暴露することを含む、請求項２４に記載の方法。２６．請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する有機材料から該蛋白質を得るための抽出方法であって、該有機材料をマセレーションおよび溶剤抽出することを含む方法。２７．蛋白質が次いで遠心分離、クロマトグラフィーおよび透析により精製される、請求項２６に記載の抽出方法。２８．有機材料がトウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種子、コバンソウ属（Ｂｒｉｚａ）の種子、カタポジウム属（Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ）の種子、バプティシア属（Ｂａｐｔｉｓｉａ）の種子、ミクロセンシス属（Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓ）の種子、ヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）の種子よりなる群から選ばれる種子を含む、請求項２６に記載の抽出方法。２９．有機材料が請求項１７に記載の生物系を含む、請求項２６に記載の抽出方法。３０．請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法であって、蛋白質の化学合成を含む方法。３１．請求項１−６のいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法であって、該蛋白質をコードする組換えＤＮＡ配列の発現を含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ０１Ｎ 63/00 Ａ 9155−4ＨＣ０７Ｋ 14/415 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者オズボーン，ルパート・ウィリアムイギリス国ミドルセックスティーダブリュー２６エスダブリュー，トゥイッケンハム，ウォーウィック・ロード 36 (72)発明者リーズ，サラ・ブロンウェンイギリス国バークシャーアールジー12 ３エックスエックス，ブラックネル，フォレスト・パーク，マイケルディバー・ウェイ 32

Claims

【特許請求の範囲】１．キチン結合性植物蛋白質の共通システイン／グリシンドメインを含むアミノ酸配列を有し、かつ下記よりなる群から選はれる特性のうち少なくとも１つを備えた抗微生物性蛋白質：（ａ）キチン結合性植物蛋白質より実質的に良好な、植物病原性真菌に対抗する活性；（ｂ）キチン結合性植物蛋白質より高い、酸性アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の比率；（ｃ）植物病原性真菌に対する分節菌体分枝を生じる活性。２．実質的に図４または図１１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗微生物性蛋白質。３．オリゴマーであり、かつ実質的に図４または図１１に示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む、請求項１に記載の蛋白質。４．純粋な蛋白質Ｃａ−ＡＭＰ１である、請求項１に記載の蛋白質。５．純粋な蛋白質Ｂｍ−ＡＭＰ１である、請求項１に記載の蛋白質。６．植物の種子から単離しうる、請求項１に記載の蛋白質。７．トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種子、コバンソウ属（Ｂｒｉｚａ）の種子、カタポジウム属（Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ）の種子、バプティシア属（Ｂａｐｔｉｓｉａ）の種子、ミクロセンシス属（Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓ）の種子、ヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）の種子よりなる群から選ばれる種子から単離しうる、請求項６に記載の蛋白質。８．合成によるものである、請求項１に記載の蛋白質。９．組換えＤＮＡの発現により製造される、請求項１に記載の蛋白質。１０．請求項１−９のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する組成物。１１．請求項１−７のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする、組換えＤＮＡ配列。１２．ｃＤＮＡである、請求項１１に記載のＤＮＡ配列。１３．ゲノム、ＤＮＡである、請求項１１に記載のＤＮＡ配列。１４．植物ゲノムから単離された、請求項１１に記載のＤＮＡ配列。１５．プロモーター配列を含む、請求項１４に記載のＤＮＡ配列。１６．請求項１−７のいずれか１項に記載の蛋白質をコードする遺伝子から得られるプロモーター配列。１７．請求項１１に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。１８．コードされる蛋白質が発現する状態で請求項１１に記載の組換えＤＮＡを含む生物系。１９．微生物である、請求項１８に記載の生物系。２０．植物である、請求項１８に記載の生物系。２１．請求項１１に記載の組換えＤＮＡにより形質転換された植物。２２．組換えＤＮＡがＣａ-ＡＭＰ１をコードする、請求項２１に記載の植物。２３．組換えＤＮＡがＢｍ-ＡＭＰ１をコードする、請求項２１に記載の植物。２４．請求項２１−２３のいずれか１項に記載の植物の種子および子孫。２５．請求項１−９のいずれか１項に記載の蛋白質に暴露することを含む、真菌または細菌と対抗する方法。２６．請求項１０に記載の組成物に暴露することを含む、請求項２５に記載の方法。２７．請求項１−７のいずれか１項に記載の蛋白質を含有する有機材料から該蛋白質を得るための抽出方法であって、該有機材料をマセレーションおよび溶剤抽出することを含む方法。２８．蛋白質が次いで遠心分離、クロマトグラフィーおよび透析により精製される、請求項２７に記載の抽出方法。２９．有機材料がトウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種子、コバンソウ属（Ｂｒｉｚａ）の種子、カタポジウム属（Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ）の種子、バプティシア属（Ｂａｐｔｉｓｉａ）の種子、ミクロセンシス属（Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓ）の種子、ヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）の種子よりなる群から選ばれる種子を含む、請求項２７に記載の抽出方法。３０．有機材料が請求項１８に記載の生物系を含む、請求項２７に記載の抽出方法。３１．請求項１−７のいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法であって、蛋白質の化学合成を含む方法。３２．請求項１−７のいずれか１項に記載の蛋白質を製造する方法であって、該蛋白質をコードする組換えＤＮA配列の発現を含む方法。