DE69333781T2

DE69333781T2 - Biozide chitin bindende proteine

Info

Publication number: DE69333781T2
Application number: DE1993633781
Authority: DE
Inventors: Willem Frans Broekaert; Bruno Philippe Angelo Cammue; Rupert William Osborn; Sarah Bronwen Rees
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1992-11-12
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2013-10-23
Also published as: WO1994011511A1; AU5340694A; EP0672146A1; AU677251B2; JP3594595B2; EP0672146B1; BR9307429A; JPH08505048A; ATE291623T1; CA2147122A1; DE69333781D1

Description

Diese Erfindung betrifft biozide Proteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung und sie codierende DNA-Sequenzen. Insbesondere betrifft sie eine Klasse von antimikrobiellen Proteinen, die ein Protein, das aus Samen von Capsicum isoliert werden kann, und ein Protein einschließen, das aus Samen von Briza isoliert werden kann.
In diesem Zusammenhang werden antimikrobielle Proteine als Proteine definiert, die wenigstens eine der folgenden Aktivitäten besitzen: Antipilzaktivität (welche Antihefeaktivität einschließen kann); antibakterielle Aktivität. Aktivität schließt eine Reihe von antagonistischen Wirkungen ein, wie eine partielle Inhibierung oder Tod. Solche Proteine können oligomer sein oder können einzelne Peptiduntereinheiten sein.
Die Gattung Capsicum umfaßt fünfzig Arten und schließt viele wichtige Pflanzenarten ein, die in der Welt angebaut werden (z.B. grüner Paprika und Spanischer Pfeffer, Chili, Paprika und Cayennepfeffer). Ebenso wie diese weithin kultivierten Beispiele schließt Capsicum ebenfalls eine Anzahl von Arten ein, die wegen ihrer farbenprächtigen, aber nicht eßbaren Früchte angebaut werden.
Die Gattung Briza umfaßt viele Ziergräser und gehört zur Familie der Gramineae. Die Gattung ist eng verwandt mit Grasarten, die in hochwertigen gemäßigten Weideflächen gefunden werden, wie Lolch.
Pflanzen erzeugen ein weites Feld von Antipilzverbindungen, um potentielle Eindringliche zu bekämpfen, und in den letzten zehn Jahren wurde es ersichtlich, daß Proteine mit Antipilzaktivität einen wichtigen Teil dieser Verteidigungen bilden. Verschiedene Klassen von Proteinen wurden beschrieben, einschließlich Thioninen, beta-1,3-Glucanasen, Ribosom-inaktivierenden Proteinen und Chitinasen. Diese letzte Gruppe von Enzymen fällt in eine breitere Klasse, die nachfolgend als die Chitin-bindenden Pflanzenproteine bezeichnet wird. Basische Chitinasen wurden aus Bohne (Boller et al., 1983, Planta, 157: 22–31), Weizen (Molano et al., 1979, J. Biol. Chem., 254: 4901–4907), Tabak (Shinshi et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 89–93) und anderen Pflanzen isoliert. Die anderen bekannten Chitin-bindenden Pflanzenproteine besitzen keine definierte katalytische Aktivität und wur den deshalb allein nach ihrer Lectinaktivität beschrieben. Diese schließen Chitin-bindende Lectine aus Weizen (Rice und Etzler, 1974, Biochem. Biophys. Res. Comm., 59: 414–419), Gerste (Peumans et al., 1982, Biochem. J., 203: 239–143), Reis (Tsuda, 1979, J. Biochem., 86: 1451–1461) und Brennessel (Peumans et al., 1983, FEBS Lett., 177: 99–103) plus ein kleines Protein aus dem Latex des Gummibaums, das Hevein genannt wird (Van Parijs et al., 1991, Planta, 183: 258–264), ein.
Somit sind die Chitin-bindenden Pflanzenproteine (wie hier definiert) eine Proteingruppe, die aus Chitinasen, Chitin-bindenden Lectinen und Hevein besteht. All diese Proteine enthalten eine konservierte Cystein/Glycin-reiche Domäne (für eine Übersicht siehe Raikhel und Broekaert, 1991, "Control of plant gene expression", D. P. Verma (Hrsg.), Telford Press). Diese gemeinsame Region kann die Chitin-bindende Aktivität verleihen. Die Domäne hat eine Länge von 40–43 Aminosäuren und ist entweder zweimal wiederholt (Nessel-Lectin), vierfach (in Weizen-, Gerste- und Reis-Lectinen) oder an eine Domäne ohne Bezug fusioniert (in basischen Chitinasen und Prohevein). Hevein selbst hat eine Länge von 43 Aminosäuren und umfaßt im wesentlichen gerade diese konservierte Domäne (Broekaert et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 7633–7637). Ein cDNA-Klon (HEV1), der Hevein codiert, wurde isoliert (Raikhel und Broekaert, US-PS 5,187,262, veröffentlicht am 16. Februar 1993). 5 zeigt die gemeinsame Cystein/Glycin-reiche Domäne, die in den folgenden Chitin-bindenden Pflanzenproteinen gefunden wird: Tabak-Chitinase, Bohnen-Chitinase, Hevein, Weizen-Lectin, Nessel-Lectin. Sequenzidentitäten und konservierte Veränderungen sind umrahmt (konservierte Veränderungen werden als Substitutionen innerhalb der Aminosäure-Homologiegruppen FWY, MILV, RKH, ED, NQ, ST und PAG betrachtet; Lücken, die für eine maximale Angleichung eingeführt sind, werden durch Bindestriche dargestellt). Die zentrale Region aus neun Aminosäureresten ist ein besonders gut konserviertes Merkmal der Domäne und hat die Sequenz:
Um diese Kernregion herum ist das zentrale Cysteinmotiv der Cystein/Glycin-reichen Domäne ebenfalls absolut konserviert und hat die Sequenz:
Cystein-(vier Aminosäuren)-Cystein-Cystein-(fünf Aminosäuren)-Cystein(sechs Aminosäuren)-Cystein.
Es wurde festgestellt, daß die Chitin-bindenden Pflanzenproteine das Wachstum bestimmter Organismen beeinflussen, die Chitin enthalten (Pilze oder Insekten). Jedoch gibt es Unterschiede in der Spezifität der Proteine. Zum Beispiel sind die Lectine vom Weizen/Gerste/Reis-Typ toxisch für Rüsselkäfer, aber sind inaktiv gegenüber Pilzen in vitro (Murdock et al., 1990, Phytochem., 29: 85–89). Andererseits wurde festgestellt, daß Hevein und die Chitinasen inhibitorisch für das Wachstum bestimmter pathogener Pilze in vitro sind (Van Parijs et al., 1991, Planta, 183, 258–264; Broekaert et al., 1988, Physiol. Mol. Plant Path., 33: 319–331). Das HEV1-Protein kann verwendet werden, um das Wachstum von Pilzen zu inhibieren (Raikhel und Broekaert, US-PS 5,187,262, veröffentlicht am 16. Februar 1993). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß Nessel-Lectin Antipilzaktivität in vitro ausübt und mit einem Ausmaß von 2- bis 5-fach größer als Hevein (Broekaert et al., 1989, Science, 245: 1100–1102). Die potentielle Brauchbarkeit dieser Proteine zur Konstruktion von Resistenz in Pflanzen wurde beschrieben (z.B. Pioneer Hi-Bred: EP-A-502 718).
Wir haben zuvor zwei aus Amaranthus isolierte Proteine (die Ac-AMPs) mit einem breiten Spektrum an Antipilzaktivität beschrieben (Broekaert et al., 1992, Biochemistry, 31: 4308–4314; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO92/21699), die im wesentlichen die in Chitin-bindenden Lectinen identifizierte Cystein/Glycin-Domäne umfassen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein antimikrobielles Protein mit einer Aminosäuresequenz, die die gemeinsame Cystein/Glycin-Domäne von Chitin-bindenden Pflanzenproteinen enthält und eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist:
eine wesentlich bessere Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze als diejenige der Chitin-bindenden Pflanzenproteine;
ein höheres Verhältnis von basischen Aminosäuren zu sauren Aminosäuren als die Chitin-bindenden Pflanzenproteine;
Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze, die zu Hyphenverzweigung führt.
Insbesondere wird ein antimikrobielles Protein bereitgestellt, daß die in 4 oder 11 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt. Diese Proteine können aus Samen von Capsicum-Arten oder Briza-Arten isoliert werden. Solche antimikrobiellen Proteine können ebenfalls aus den Samen von verwandten und nichtverwandten Arten isoliert werden (einschließlich Catapodium, Baptisia, Microsensis, Delphinium) oder können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt oder synthetisiert werden.
Wir haben ein neues antimikrobielles Protein aus Samen von Capsicum annuum gereinigt, nachfolgend Ca-AMP1 genannt (Capsicum anuum antimikrobielles Protein 1). Das Protein teilt die gemeinsame Cystein/Glycin-Domäne von Chitin-bindenden Pflanzenproteinen, aber ist einzigartig, da es eine sehr wirksame und breitbandige Antipilzaktivität besitzt, die wenigstens eine Größenordnung höher als Hevein oder Nessel-Lectin ist. So ist das Capsicum-Protein trotz der konservierten Natur dieser Proteinsequenzen (z.B. ist die Aminosäuresequenz für Ca-AMP1 zu 65% identisch mit Hevein) deutlich verbessert in der Wirksamkeit und im Spektrum seiner Antipilzaktivität. Tatsächlich ist es bemerkenswert, daß Ca-AMP1 und Hevein eine so ähnliche Größe und Aminosäuresequenz aufweisen, aber sich so drastisch in ihrer Stärke und Spektrum von Aktivität unterscheiden.
Wir haben ebenfalls ein neues antimikrobielles Protein aus Samen von Briza maxima gereinigt, nachfolgend als Bm-AMP1 bezeichnet (Briza maxima antimikrobielles Protein 1). Das Protein teilt die gemeinsame Cystein/Glycin-Domäne von Chitin-bindenden Pflanzenproteinen, aber ist einzigartig, da es eine sehr wirksame und breitbandige Antipilzaktivität besitzt. So ist das Briza-Protein trotz der konservierten Natur dieser Proteinsequenzen deutlich verbessert in der Wirksamkeit und im Spektrum seiner Antipilzaktivität. Die Aminosäuresequenz für Bm-AMP1 ist zu 45% identisch mit Ca-AMP1, aber nur zu 35% mit Hevein.
Die Antipilzaktivität von Ca-AMP1 und von Bm-AMP1 ist ähnlich derjenigen der oben erörterten Amaranthus-(Ac-AMP)-Proteine (Broekaert et al., 1992, Biochemistry, 31: 4308–4314); internationale Patentveröffentlichung Nr. WO92/21699): all diese Proteine sind wesentlich basischer als Hevein oder das Nessel-Lectin, was die Aktivitätsdifferenz erklären kann.
Wir haben festgestellt, daß der Besitz eines basischen Gesamtprofils zur Wirksamkeit eines Antipilzproteins beiträgt. Zum Beispiel ist es bei unterschiedlichen Klassen von Antipilzproteinen, die aus Mirabilis und Raphanus isoliert werden, immer das basischere Homolog, das das aktivste ist (Terras et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 15301–15309; Cammue et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 2228–2233). Obwohl die Sequenz des Capsicum-(Ca-AMP1)-Proteins sehr ähnliche derjenigen von Hevein ist, beträgt das Verhältnis von basischen zu sauren Aminosäuren 4:1 für Ca-AMP1, aber 4:5 (d.h. viel geringer) für Hevein. Das Verhältnis von basischen zu sauren Aminosäuren beträgt 3:1 für Bm-AMP1. Es kann sein, daß die basische Natur von Ca-AMP1 und von Bm-AMP1 ihre verbesserte Wirksamkeit begründet. Es ist deshalb wahrscheinlich, daß eine Erhöhung der basischen Natur bestimmter Chitin-bindender Pflanzenproteine (wie Hevein) unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese jede Antipilzaktivität potenzieren würde, insbesondere falls Substitutionen an Positionen vorgenommen würden, an denen es basische Aminosäuren im Capsicum-(Ca-AMP1)-Protein gibt (wie ein Austausch der Asparaginsäure in Position 28 in Hevein), oder in Positionen, in denen es basische Aminosäuren im Briza-(Bm-AMP1)-Protein gibt. Durch Anpassen der Struktur bestimmter Chitin-bindender Pflanzenproteine ist es deshalb möglich, neue, wirksamere antimikrobielle Proteine der Erfindung zu schaffen.
Während des Durchmusterungsverlaufs vieler unterschiedlicher Pflanzenarten wurde es ersichtlich, daß die Proteinklasse der Erfindung relativ üblich in Pflanzensamen ist. Es ist möglich, die Antipilzaktivität der Proteine auf Basis der unerwarteten morphologischen Wirkung zu unterscheiden, die sie erzeugen: eine schwere Verzweigung von Hyphen tritt in partiell inhibierten keimenden Pilzsporen auf. Dies ist besonders ersichtlich, wenn Fusarium culmorum verwendet wird. Wir haben jetzt festgestellt, daß das Amaranthus-Protein (Ac-AMP1) eine ähnliche Wirkung auf Pilzhyphen verursacht. Die Natur der Inhibierung kann ebenfalls durch die Tatsache gekennzeichnet werden, daß sie sehr empfindlich für die Konzentrationen von im Test verwendeten Kationen ist.
Trotz der Ähnlichkeiten zwischen dem Capsicum-Protein (Ca-AMP1) und den Amaranthus-Proteinen (Ac-AMPs) gibt es merkliche Unterschiede in ihren Primär- und Tertiärstrukturen. 5 zeigt, daß die Sequenz von Ca-AMP1 wenigstens 42 Aminosäurereste enthält. Jedoch ist Ac-AMP2 ein kürzeres Peptid: die volle Ac-AMP2-Sequenz enthält nur 30 Aminosäurereste. Außerdem enthält die zusätzliche Sequenz von Ca-AMP1 zwei zusätzliche Cysteinreste, die nicht im Ac-AMP2-Protein gefunden werden. Da Cysteine an internen Bindungen innerhalb von Proteinen beteiligt sind, ist es wahrscheinlich, daß die Tertiärstrukturen von Ca-AMP1 und Ac-AMP2 verschieden sind.
Bm-AMP1 ähnelt Ca-AMP1 in Bezug auf seine Gesamtanzahl von Aminosäuren und seine Anzahl von Cysteinresten. Es ist wahrscheinlich, daß Bm-AMP1 und Ca-AMP1 eine beträchtliche Homologie sowohl auf der Sekundär- als auch auf der Tertiärebene teilen. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, daß sich Bm-AMP1, wie Ca-AMP1, von Ac-AMP2 in seiner Tertiärstruktur unterscheidet, zum Teil aufgrund der zwei zusätzlichen Cysteinreste, die in Bm-AMP1 gefunden werden.
Die Erfindung stellt ferner eine rekombinante DNA-Sequenz bereit, die für ein Protein der Erfindung codiert, und einen Vektor, der die Sequenz enthält. Die DNA kann in ein biologisches System kloniert oder transformiert werden, das die Expression des codierten Proteins erlaubt.
Insbesondere kann der Vektor zur Transformation einer Pflanze verwendet werden und so eine Pflanze erzeugen, die mit rekombinanter DNA transformiert ist, die ein erfindungsgemäßes antimikrobielles Protein codiert.
Es wird ebenfalls ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen oder Bakterien bereitgestellt, wobei sie mit dem erfindungsgemäßen Protein in Kontakt gebracht werden.
Ca-AMP1 und Bm-AMP1 zeigen einen breiten Bereich von Antipilzaktivität und sind ebenfalls wirksam gegen Gram-positive Bakterien. Jedes Protein ist nützlich als Fungizid oder Antibiotikum, für landwirtschaftliche oder pharmazeutische Anwendungen. Der Kontakt eines Pflanzenpathogens mit einem antimikrobiellen Protein kann durch Expression des Proteins innerhalb eines Mikroorganismus erreicht werden, der auf eine Pflanze oder auf den Boden, in dem eine Pflanze wächst, ausgebracht wird. Die Proteine können ebenfalls zur Bekämpfung von pilzlichen oder bakteriellen Krankheiten durch Ausbringung des Proteins auf Pflanzenteile unter Verwendung von standardmäßigen landwirtschaftlichen Techniken (z.B. Sprühen) verwendet werden. Die Proteine können ebenfalls zur Bekämpfung von pilzlicher oder bakterieller Krankheit durch Expression innerhalb von Pflanzenkörpern verwendet werden, entweder während der Lebensdauer der Pflanze oder für einen Nachernte-Pflanzenschutz. Das Protein kann ebenfalls als Fungizid zur Behandlung von Säugetierinfektionen verwendet werden.
Das antimikrobielle Protein kann aus geeigneten Samen isoliert und gereinigt werden, künstlich aus seiner bekannten Aminosäuresequenz synthetisiert werden oder innerhalb eines geeigneten Mikroorganismus durch Expression von rekombinanter DNA erzeugt werden. Die Proteine können ebenfalls innerhalb einer transgenen Pflanze exprimiert werden.
Aminosäuresequenzierung von Ca-AMP1 und von Bm-AMP1 zeigt, daß sie homolog mit Chitin-bindenden Pflanzenproteinen sind. Insbesondere sind Ca-AMP1 und Hevein sehr ähnlich in der Aminosäuresequenz und Größe. Ca-AMP1 und Bm-AMP1 umfassen jeweils im wesentlichen die gemeinsame Cystein/Glycin-Domäne.
Das Wissen um die Primärstruktur ermöglicht die Herstellung des antimikrobiellen Proteins oder von Teilen davon durch chemische Synthese unter Verwendung eines standardmäßigen Peptid-Syntheseautomaten. Es ermöglicht ebenfalls die Herstellung von DNA-Konstrukten, die das antimikrobielle Protein codieren. Die DNA-Sequenz kann aus der bekannten Aminosäuresequenz vorhergesagt werden, oder die Sequenz kann aus DNA-Bibliotheken, die aus Pflanzen stammen, isoliert werden.
Oligonukleotidsonden können aus der bekannten Aminosäuresequenz abgeleitet und zur Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek auf cDNA-Klone verwendet werden, die einen Teil oder das gesamte Protein codieren. Die gleichen Oligonukleotidsonden oder cDNA-Klone können zur Isolierung des (der) tatsächlichen antimikrobiellen Proteingens(gene) durch Durchmusterung genomischer DNA-Bibliotheken verwendet werden. Solche genomischen Klone können Kontrollsequenzen einschließen, die im Pflanzengenom arbeiten. Daher ist es ebenfalls möglich, Promotorsequenzen zu isolieren, die zum Antreiben der Expression der antimikrobiellen (oder anderen) Proteine verwendet werden können. Diese Promotoren können besonders ansprechend auf Umweltbedingungen sein (wie die Gegenwart eines pilzlichen Pathogens) und können zum Antreiben der Expression jedes Zielgens verwendet werden.
DNA, die das antimikrobielle Protein codiert (die ein cDNA-Klon, ein genomischer DNA-Klon oder DNA sein kann, die unter Verwendung eines standardmäßigen Nukleinsäure-Syntheseautomaten hergestellt wurde), kann dann in ein biologisches System kloniert werden, das die Expression des Proteins oder eines Teils des Proteins erlaubt. Die DNA kann unter die Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors gestellt werden. Beispiele für induzierbare Systeme schließen die Pathogen-induzierte Expression und chemische Induktion ein. Daher kann das Protein in einem geeigneten Mikroorganismus oder einer kultivierten Zelle hergestellt, extrahiert und zur Verwendung isoliert werden. Geeignete Mikroorganismen schließen Escherichia coli, Pseudomonas und Hefe ein. Geeignete Zellen schließen kultivierte Insektenzellen und kultivierte Säugetierzellen ein. Das genetische Material kann ebenfalls in ein Virus oder einen Bakteriophagen kloniert werden. Die DNA kann ebenfalls durch bekannte Verfahren in jede Pflanzenart transformiert werden, so daß das antimikrobielle Protein innerhalb der Pflanze exprimiert wird.
Erfindungsgemäße Pflanzenzellen können mit Konstrukten der Erfindung gemäß einer Vielzahl bekannter Verfahren transformiert werden (Agrobacterium-Ti-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilbeschuß etc.). Die transformierten Zellen können dann in geeigneten Fällen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, in denen das neue Kernmaterial stabil in das Genom eingefügt ist. Sowohl transformierte einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden, obwohl letztere gewöhnlich leichter zu regenerieren sind.
Beispiele für genetisch modifizierte Pflanzen, die hergestellt werden können, schließen Feldfrüchte, Getreide, Obst und Gemüse ein, wie z.B. Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle, Soja, Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen, Melonen, Kartoffeln, Karotte, Salat, Kohl, Zwiebel.
Die Erfindung kann weiter unter Bezugnahme auf die Zeichnungen verstanden werden, in denen gilt:
1 zeigt das Kationenaustauscherchromatogramm für die Reinigung von Ca-AMP1 und das verbundene Diagramm der Antipilzaktivität.
2 zeigt das HPLC-Profil von gereinigtem Ca-AMP1.
3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Ca-AMP1.
4 zeigt die Aminosäuresequenz von Ca-AMP1.
5 zeigt die Angleichung der Aminosäuresequenz von Bm-AMP1, Ca-AMP1, Ac-AMP2 und eine Anzahl Chitin-bindender Lectine.
6 zeigt eine mögliche vorhergesagte DNA-Sequenz für das Protein Ca-AMP1.
7 zeigt partiell inhibierte Fusarium culmorum-Sporen, die mit Ca-AMP1 und dem Amaranthus-Protein Ac-AMP1 inkubiert wurden.
8 zeigt die SDS-PAGE-Analyse unterschiedlicher Fraktionen nach Affinitätschromatografie von Ca-AMP1 mit Chitin.
9 zeigt das Kationenaustauscherchromatogramm für die Reinigung von Bm-AMP1 und das verbundene Diagramm der Antipilzaktivität.
10 zeigt das HPLC-Profil von gereinigtem Bm-AMP1.
11 zeigt die Aminosäuresequenz von Bm-AMP1.
12 zeigt eine mögliche vorhergesagte DNA-Sequenz für Bm-AMP1.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Antipilz- und antibakterielle Aktivitätstests
Die Antipilzaktivität wurde durch Mikrospektrofotometrie wie zuvor beschrieben gemessen (Broekaert, 1990, FEMS Microbiol. Lett., 69: 55–60). Routinemäßig wurden Untersuchungen mit 20 μl einer (filtersterilisierten) Testlösung und 80 μl einer Suspension von Pilzsporen (2 × 10⁴ Sporen/ml) in entweder halbkonzentrierter Kartoffeldextrosebouillon (Medium A) oder halbkonzentrierter Kartoffeldextrosebouillon mit auf Endkonzentrationen von 1 mM und 50 mM hinzugegebenem CaCl₂ bzw. KCl (Medium B) durchgeführt.
Wenn nichts anderes angegeben ist, war der Testorganismus Fusarium culmorum (Stamm IMI 180420), und die Inkubation erfolgte bei 25°C für 48 Stunden. Die prozentuale Wachstumshemmung wird als das 100-fache des Verhältnisses der korrigierten Extinktion der Kontrollmikrokultur abzüglich der korrigierten Extinktion der Testmikrokultur gegenüber der korrigierten Extinktion bei 595 nm der Kontrollmikrokultur definiert. Die korrigierten Extinktionswerte sind gleich der Extinktion bei 595 nm der Kultur, gemessen nach 48 Stunden, abzüglich der Extinktion bei 595 nm, gemessen nach 30 min.
Die antibakterielle Aktivität wurde mikrospektrofotometrisch wie folgt gemessen. Eine bakterielle Suspension wurde durch Impfen von weicher Nährmittelagarose (Trypton, 10 g/l; Seaplaque-Agarose (FMC), 5 g/l) hergestellt. Teilmengen (80 μl) der bakteriellen Suspension (10⁵ Kolonie-bildende Einheiten pro ml) wurden zu filtersterilisierten Proben (20 μl) in flachbödigen Mikroplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Extinktion bei 595 nm der Kultur wurde mit Hilfe eines Mikroplattenlesers nach 30 Minuten und 24 Stunden Inkubation bei 28°C gemessen. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde wie oben für den Antipilzaktivitätstest beschrieben berechnet.
Beispiel 2
Extraktion von basischen Proteinen aus Capsicum annuum- oder Briza maxima-Samen
1 kg Capsicum annuum- oder Briza maxima-Samen (von Chiltern Seeds, Cumbria, UK) wurde in einer Kaffeemühle gemahlen, und das resultierende Mehl wurde für 2 Stunden bei 4°C mit 2 l eines eiskalten Extraktionspuffers extrahiert, der 10 mM NaH₂PO₄, 15 mM Na₂HPO₄, 100 mM KCl, 2 mM EDTA und 1 mM Benzamidin enthielt. Das resultierende Homogenat wurde durch Seihtuch gedrückt und durch Zentrifugieren geklärt (30 min mit 7.000 × g). Festes Ammoniumsulfat wurde zum Überstand hinzugegeben, um eine 75%ige relative Sättigung zu erhalten, und man ließ die Ausfällung durch Stehen über Nacht bei 4°C bilden. Im Anschluß an Zentrifugieren mit 7.000 × g für 30 Minuten wurde die Ausfällung erneut in einem minimalen Volumen von destilliertem Wasser gelöst und umfassend gegen destilliertes Wasser unter Verwendung von benzoylierten Celluloseschläuchen (Sigma, St. Lous, MO) dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung durch Zugabe des 10-fach konzentrierten Puffers auf 50 mM NH₄Ac (pH 9) eingestellt und über eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden; 12 × 5 cm) geleitet, die in 50 mM NH₄Ac (pH 9) äquilibriert worden war. Die Proteinfraktion, die durch die Säule gelangte, wurde mit Essigsäure auf pH 6 eingestellt.
Dieses Material stellt die basische (pI > 9) Proteinfraktion der Samen dar. Die Fraktionen wurden weiter wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt.
Beispiel 3
Reinigung von antimikrobiellem Protein aus Capsicum annuum- oder Briza maxima-Samen
Das Ausgangsmaterial zur Isolierung des antimikrobiellen C. annuum- oder B. maxima-Proteins war die basische Proteinfraktion, die aus den reifen Samen wie in Beispiel 2 extrahiert worden war. Die Proteine wurden weiter durch Kationenaustauscherchromatografie dieses Extrakts gereinigt.
Ca. 500 ml der basischen Proteinfraktion wurden auf eine S-Sepharose High Performance-Säule (Pharmacia; 10 × 1,6 cm) aufgetragen, die in 50 mM NH₄Ac, pH 6,0 äquilibriert worden war. Die Säule wurden mit 3,0 ml/min mit einem linearen Gradienten von 50–750 mM NH₄Ac, pH 6,0 über 325 Minuten eluiert. Das Eluat wurde auf Protein durch aktuelle Messung der Extinktion bei 280 nm überwacht (Ergebnisse für Capsicum und für Briza in den unteren Feldern der 1 bzw. 9 gezeigt) und in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Proben aus jeder Fraktion wurden auf Antipilzaktivität wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht (Ergebnisse für Capsicum und für Briza in den oberen Feldern der 1 bzw. 9 gezeigt).
Im Anschluß an Chromatografie lieferte der Capsicum-Extrakt einen breiten Aktivitätspeak, der bei ca. 220 mM NH₄Ac eluierte. Der Briza-Extrakt lieferte einen breiten Aktivitätspeak, der bei ca. 250 mM NH₄Ac eluierte. Die Antipilzaktivität aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und weiter durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Ca. 3 mg-Mengen des Peaks wurden auf eine PEP-S-Säule (poröse Kieselerde C₂/C₁₈, Pharmacia; 25 × 0,4 cm) aufgetragen, die mit 0,1%TFA (Trifluoressigsäure) äquili briert worden war. Die Säule wurde mit 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0,1%TFA zu 100% Acetonitril/0,1% TFA über 100 Minuten entwickelt. Das Eluat wurde auf Protein durch aktuelle Messung der Extinktion bei 280 nm überwacht (Ergebnisse für Capsicum und für Briza in den unteren Feldern der 2 bzw. 10 gezeigt). 1 ml-Fraktionen wurden aufgefangen, vakuumgetrocknet und erneut in 1 ml destilliertem Wasser gelöst, von dem 10 μl in einem Antipilztest verwendet wurden (Ergebnisse für Capsicum und für Briza in den oberen Feldern der 2 bzw. 10 gezeigt). Die einzelnen, gut aufgelösten Aktivitätspeaks wurden als Ca-AMP1 bzw. Bm-AMP1 bezeichnet.
Beispiel 4
Molekulare Struktur das gereinigten antimikrobiellen Proteins Ca-AMP1
Die molekulare Struktur des gereinigten antimikrobiellen Proteins wurde weiter analysiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde an vorgegossenen gewerblichen Gelen (PhastGel High Density von Pharmacia) unter Verwendung einer PhastSystem-Elektrophoresevorrichtung (Pharmacia) durchgeführt. Der Probenpuffer enthielt 200 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1% (G/V) SDS, mM EDTA, 0,005% Bromphenolblau und, wenn nichts anders angegeben, 1% (G/V) Dithioerythrit (DTE). Proteine wurden nach Elektrophorese in 12,5% Glutaraldehyd fixiert und gemäß Heukeshoven und Dernick silberangefärbt (1985, Electrophoresis, 6, 103–112). Molekulargewichtsmarker (Pharmacia) wurden zum Vergleich laufengelassen (Bahn M, 3): 17 kDA, 14,5 kDA, 8 kDA, 6 kDA, 2,5 kDA.
Ca-AMP1 wurde durch SDS-PAGE analysiert. Nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol läuft Ca-AMP1 als eine einzelne Bande mit einer scheinbaren molekularen Masse von 4 bis 5 kDA (3, Bahn 2 und 4). Unreduziertes Ca-AMP1 wandert als eine einzelne Bande mit 14 kDA (3, Bahn 1 und 3). Diese Ergebnisse zeigen, daß das native Ca-AMP1 ein oligomeres Protein ist, wahrscheinlich ein Dimer.
Beispiel 5
Aminosäuresequenzierung von Ca-AMP1 und Bm-AMP1
Cysteinreste wurden durch S-Pyridylethylierung unter Verwendung des Verfahrens von Fullmer modifiziert (1984, Anal. Biochem., 142, 336–341). Die Reagenzien wurden durch HPLC an einer Pep-S-Säule (poröse Kieselerde C₂/C₁₈, Pharmacia; 25 × 0,4 cm) entfernt. Die S-pyridylethylierten Proteine wurden durch Eluieren der Säule mit einem linearen Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) zu 0,1% TFA enthaltendem Acetonitril zurückgewonnen. Die resultierenden Proteinfraktionen wurden der Aminosäuresequenz analyse in einem 477A Protein Sequencer (Applied Biosystems) mit einer aktuellen Detektion von Phenylthiohydantoin-Aminosäurederivaten in einem 120A Analyser (Applied Biosystems) unterworfen.
Anfängliche Versuche zur Sequenzierung von Ca-AMP1 zeigten, daß das Protein N-terminal geblockt war. Anschließend wurde das S-pyridylethylierte Protein mit Pyroglutamataminopeptidase gemäß den Herstelleranweisungen entblockt (Boehringer Mannheim, DE). Die Reaktion war nur teilweise erfolgreich und lieferte eine Sequenz für die ersten 16 Aminosäuren.
Zum Erhalt der Sequenz für den C-Terminus wurde Ca-AMP1 mit Trypsin verdaut, und drei der resultierenden Fragmente wurden sequenziert. Es wurde festgestellt, daß eines geblockt war und den N-Terminus darstellt. Die Sequenzierung der anderen zwei Peptide zeigte, daß sie mit der Sequenz für den N-Terminus angeglichen werden konnten (4), und daß die vollständige Sequenz homolog zur Cystein/Glycin-reichen Domäne war, die in Chitin-bindenden Pflanzen-Lectinen gefunden wird (5). Es ist möglich, daß die Sequenz für Ca-AMP1 unvollständig ist, und daß es mehr Aminosäuren am C-Terminus gibt. Der Befund, daß das Peptid N-terminal geblockt war und daß dies mit Aminopeptidase entfernt werden konnte, legt nahe, daß die N-terminale Aminosäure ein Glutamin sein kann.
Die Aminosäuresequenz von Bm-AMP1 ist in 11 gezeigt. An zwei Positionen in der Sequenz gibt es eine Wahl von zwei Aminosäuren. In Position 9 ist die Aminosäure entweder Arginin (R) oder Histidin (H), und in Position 23 ist die Aminosäure entweder Serin (S) oder Asparagin (N). Die gereinigte Proteinfraktion Bm-AMP1 kann eine Mischung von Peptiden mit Sequenzen sein, die an diesen zwei Positionen mit jeder Kombination der angegebenen Aminosäuren variieren.
5 zeigt die Angleichung von N-terminalen Aminosäuresequenzen aus Tabak-Chitinase (Shinshi et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 89–93), Bohnen-Chitinase (Broglie et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 6820–6824), Hevein (Broekaert et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 7633–7637), Weizen-Lectin (Raikhel und Nilkins, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 6745–6749), Nessel-Lectin (Chapot et al., 1986, FEBS Lett., 195: 231–234), Ac-AMP2 (Broekaert et al., 1992, Biochemistry, 31: 4308–4314; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO92/21699) und die Sequenzen für Ca-AMP1 und Bm-AMP1. Sequenzidentitäten und konservierte Veränderungen sind umrahmt. Konservierte Veränderungen werden als Substitutionen innerhalb der Aminosäure-Homologiegruppen FWY, MILV, RKH, ED, NQ, ST und PAG betrachtet. Zur maximalen Angleichung eingeführte Lücken sind durch Bindestriche dargestellt.
Die Aminosäuresequenz für Ca-AMP1 und für Bm-AMP1 zeigt eine verblüffende Ähnlichkeit mit der Cystein/Glycin-reichen Domäne in Chitin-bindenden Pflanzenproteinen. Insbesondere ist Ca-AMP1 zu 65% identisch mit Hevein. Bm-AMP1 ist zu 35% mit Hevein und zu 45% mit Ca-AMP1 identisch. Wie die Amaranthus-Proteine sind Ca-AMP1 und Bm-AMP1 wesentlich basischer als Hevein.
Sowohl Ca-AMP1 als auch Hevein haben vier basische Aminosäuren, aber Ca-AMP1 hat nur eine saure Aminosäure im Vergleich zu fünf in Hevein. Falls die basische Gesamtnatur dieser Proteine wichtig für ihre Aktivität ist, dann würde man erwarten, daß Substitutionen der Asparaginsäure in Position 28 in Hevein gegen das in dieser Position in Ca-AMP1 gefundene Arginin die spezifische Aktivität von Hevein erhöhen würden. Tatsächlich scheint es relativ bemerkenswert, daß Ca-AMP1 und Hevein eine so ähnliche Größe und Aminosäuresequenz aufweisen, aber sich so drastisch in ihrer Stärke und in ihrem Spektrum der Aktivität unterscheiden.
Bm-AMP1 enthält sechs basische Aminosäuren und nur zwei saure Aminosäuren, wohingegen Hevein vier basische Aminosäuren, aber fünf saure Aminosäuren aufweist. Das basische Gesamtprofil von Bm-AMP1 kann deshalb mit der erhöhten Antipilzaktivität dieses Proteins im Vergleich zu Hevein und anderen Chitin-bindenden Pflanzenproteinen in Verbindung stehen.
6 und 12 zeigen eine der möglichen DNA-Sequenzen des Gens, das für Ca-AMP1 bzw. Bm-AMP1 codiert. Diese Gensequenz wurde aus der bekannten Aminosäuresequenz unter Verwendung von Kodonen vorhergesagt, die üblicherweise in zweikeimblättrigen Pflanzen auftreten. Die tatsächliche Gensequenz innerhalb von Capsicum oder Briza kann sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden.
Beispiel 6
Stabilität der Antipilzaktivität des Proteins
Untersuchungen auf Antipilzaktivität wurden mit 20 μl-Proben, fünffach verdünnt mit Wachstumsmedium, das Fusarium culmorum-Sporen enthielt, gemäß dem in Beispiel 1 angegebenen Testverfahren durchgeführt. Unbehandelte Kontrollproben bestanden aus den Testproteinen mit 500 μg/ml in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7). Hitzestabilitätsuntersuchungen wurden durch Erwärmen von Teilmengen der Testproteine für 10 Minuten auf unterschiedliche Temperaturen von bis zu 100°C durchgeführt. Die Reduktion von Disulfidbrücken erfolge durch Zugabe von Dithiothreit mit 30 mM und Tris-HCl (pH 8,6) mit 300 mM. Die Reagenzien wurden durch Umkehrphasen-Chromatografie entfernt. Für Verdauungen wurden unterschiedliche Proteasen mit 200 μg/ml hinzugegeben und bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. Die Kontrollbehandlung, die nur die Reagenzien enthielt, erwies sich als negativ für die Antipilzaktivität nach dem Umkehrphasen-Chromatografieschritt.
Die Antipilzaktivität des gereinigten Ca-AMP1-Proteins und des Bm-AMP1-Proteins war resistent gegen Wärmebehandlung bei bis zu 80°C für 10 Minuten. Reduktion der Disulfidbindungen durch Dithiothreit hob jedoch die Antipilzaktivität vollständig auf. Diese Disulfidbindungen sind wesentlich für die biologische Aktivität.
Behandlung von Ca-AMP1 mir Proteinase K oder Pronase E reduzierte die Antipilzaktivität zumindest 10-fach, wohingegen Trypsin die Aktivität nur 2-fach reduzierte und Chymotrypsin keine Wirkung auf die Aktivität hatte.
Beispiel 7
Antipilzwirkung der Proteine
(A) Ca-AMP1
Die Antipilzwirkung des gereinigten Proteins wurde an unterschiedlichen pflanzenpathogenen Pilzen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests bewertet. Das Kultivieren von Pilzen, das Sammeln und die Ernte von Pilzsporen und die Zubereitung von Myzelfragmenten erfolgten wie zuvor beschrieben (Broekaert et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett., 69: 55–60). Die folgenden Pilzstämme wurden verwendet: Alternaria brassicola MUCL 20297, Ascochyta pisi MUCL 30164, Botrytis cinerea MUCL 30158, Cercospora beticola Stamm K897, Colletotrichum lindemuthianum MUCL 9577, Fusarium culmorum IMI 180420, Fusarium oxysporum f.sp. pisi IMI 236441, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici MUCL 909, Nectria haematococca Sammlung Van Etten 160-2-2, Penicillium digitatum (K0879), Phoma betae MUCL 9916, Pyrenophora tritici-repentis MUCL 30217, Pyricularia oryzae MUCL 30166, Rhizoctonia solani CBS 207-87, Septoria tritici (K1097D), Trichoderma viride (K1127), Verticillium albo-atrum (K0937), Verticillium dahliae MUCL 19210.
Für R. solani wurden Myzelfragmente als Inoculum verwendet, wohingegen alle anderen Pilze als Sporen übergeimpft wurden.
Reihenverdünnungen der Antipilzproteine wurden auf die Pilze unter Verwendung von entweder Wachstumsmedium A oder B aufgebracht. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde durch Mikrospektrofotometrie gemessen. Die zur 50%igen Wachstumshemmung nach 48 h Inkubation erforderliche Konzentration (IC₅₀-Wert) wurde aus Dosis-Reaktions-Kurven berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1
Untersucht für eine Reihe von Pilzen in Medium A variierten die IC₅₀-Werte von 1 μg/ml bis über 500 μg/ml. Jedoch war der IC₅₀-Wert für 12 der 18 pathogenen Pilze unterhalb 50 μg/ml, und für 10 der Pilze war der IC₅₀-Wert unterhalb 10 μg/ml. Die Ergebnisse zeigen, daß Ca-AMP1 ein wirksamer und breitbandiger Inhibitor des Pilzwachstums ist.
Die Aktivität von Ca-AMP1 ist jedoch sehr empfindlich gegenüber den ionischen Bedingungen, die im Test verwendet werden, und seine Aktivität wird bei hoher Salzkonzentration im wesentlichen aufgehoben (Medium B).
Der Grad der mit Ca-AMP1 erhaltenen Antipilzaktivität ist vergleichbar mit demjenigen der zwei Peptide (Ac-AMPs), die zuvor aus Amaranthus-Samen isoliert wurden (Broekaert et al., 1992, Biochemistry, 31: 4308–4314). Relativ zu Chitin-bindenden Pflanzenproteinen, wie Hevein oder Nessel-Lectin, hat Ca-AMP1 eine viel höhere spezifische Aktivität. Zuvor haben wir gezeigt, daß Nessel-Lectin nur 3 von 7 untersuchten Pilzen bei Konzentrationen von unterhalb 100 μg/ml und keinen bei unterhalb 20 μg/ml hemmt (Broekaert et al., 1992, Biochemistry, 31: 4308–4314). In ähnlicher Weise wird berichtet, daß Hevein viel weniger aktiv als sogar Nessel-Lectin ist (Van Parijs et al., 1991, Planta, 183: 258–264). Trotz der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz kann Ca-AMP1 deshalb, ebenso wie die Amaranthus-Proteine, separat von den Chitin-bindenden Pflanzenproteinen klassifiziert werden.
Ca-AMP1 und die Amaranthus-Proteine führen zu den gleichen morphologischen Veränderungen in partiell gehemmten Pilzsporen. Dies wird leicht visualisiert, wenn Fusarium culmorum-Sporen im Test und bei Konzentrationen der Proteine verwendet werden, die 2–4-fach unterhalb des IC₅₀-Werts sind. Unter einem Lichtmikroskop betrachtet verursachen die Proteine eine schwere Verzweigung der entstehenden Hyphenspitzen (7). 7A zeigt Kontrollsporen, die für 8 Stunden bei 24°C keimten; 7B und 7C zeigen Sporen, die teilweise durch Ca-AMP1 bzw. Ac-AMP1 gehemmt wurden. Es wurde berichtet, daß Hevein die Entwicklung von dicken Hyphen und Knospen verursacht (Van Parijs et al., 1991, Planta, 183: 258–264).
(B) Bm-AMP1
Die Antipilzwirkung des gereinigten Proteins wurde an unterschiedlichen pflanzenpathogenen Pilzen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests bewertet. Das Kultivieren von Pilzen, das Auffangen und die Ernte von Pilzsporen und die Zubereitung von Myzelfragmenten erfolgten wie zuvor beschrieben (Broekaert et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett., 69: 55–60). Die folgenden Pilzstämme wurden verwendet: Alternaria longipes Stamm CBS 620.83, Botrytis cinerea MUCL 30158, Caldosporium sphaerospermum Stamm KO791, Fusarium culmorum IMI 180420, Penicillium digitatum Stamm K0879, Septoria tritici (K1097D), Trichoderma viride (K1127), Verticillium dahliae MUCL 19210.
Alle Pilze wurden als Sporen übergeimpft.
Reihenverdünnungen der Antipilzproteine wurden auf die Pilze unter Verwendung von entweder Wachstumsmedium A oder B ausgebracht. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde durch Mikrospektrofotometrie gemessen. Die zur 50%igen Wachstumshemmung nach 48 h Inkubation erforderliche Konzentration (IC₅₀-Wert) wurde aus den Dosis-Reaktions-Kurven berechnet.
Die Ergebnisse für Bm-AMP1 sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Tabelle 2
Bewertet für eine Reihe von Pilzen in Medium A variierten die IC₅₀-Werte von 1 μg/ml bis 150 μg/ml. Jedoch war der IC₅₀-Wert für sechs der acht pathogenen Pilze unterhalb von 10 μg/ml. Die Ergebnisse zeigen, daß Bm-AMP1 ein wirksamer und breitbandiger Inhibitor des Pilzwachstums ist.
Die Aktivität von Bm-AMP1 ist jedoch sehr empfindlich gegenüber den ionischen Bedingungen, die im Test verwendet werden, und seine Aktivität wird bei hoher Salzkonzentration im wesentlichen aufgehoben (Medium B).
Der Grad und das Spektrum der mit Bm-AMP1 erhaltenen Antipilzaktivität ist vergleichbar mit derjenigen von Ca-AMP1 und mit derjenigen der zwei Peptide (Ac-AMPs), die zuvor aus Amaranthus-Samen isoliert wurden. Relativ zu Chitin-bindenden Pflanzenproteinen, wie Hevein oder Nessel-Lectin, hat Bm-AMP1 eine viel höhere spezifische Aktivität. Zuvor haben wir gezeigt, daß Nessel-Lectin nur 3 von 7 bei Konzentrationen von unter 100 μg/ml getesteten Pilzen hemmt und keinen bei unterhalb von 20 μg/ml (Broekaert et al., 1992, Biochemistry, 31: 4308–4314). In ähnlicher Weise wurde berichtet, daß Hevein viel weniger aktiv als sogar Nessel-Lectin ist (Van Parijs et al., 1991, Planta, 183: 258–264). Trotz der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz kann Bm-AMP1 deshalb, ebenso wie Ca-AMP1 und die Amaranthus-Proteine, separat von den Chitin-bindenden Pflanzenproteinen klassifiziert werden.
Beispiel 8
Chitin-bindende Aktivität von Ca-AMP1
Die Sequenzähnlichkeit zwischen Ca-AMP1 und Chitin-bindenden Pflanzen-Lectinen legte nahe, daß Ca-AMP1 ebenfalls an Chitin binden könnte.
Mikro-Chitin-Säulen wurde mit Ca-AMP1 beladen und die Säulen mit 50 mM NH₄Ac (pH 7,0) gespült. 50 μg Ca-AMP1 wurde auf die Säule (0,5 × 1 cm) geladen und das Eluat dreimal über die Säule recycliert. Das fertige Eluat wurde aufgefangen. Die Säule wurde fünfmal mit 1 ml 50 mM NH₄Ac (pH 7,0) gespült und die Fraktion aufgefangen. Schließlich wurde die Säule mit 1 ml 100 mM Essigsäure (pH 2,8) gespült und diese saure Spülfraktion aufgefangen. Die aufgefangenen Fraktionen wurde entsalzt und durch Umkehrphasen-Chromatografie aufkonzentriert und schließlich in 50 μl Probepuffer zur SDS-PAGE-Analyse gelöst.
8 zeigt die Ergebnisse dieser Analyse. Bahn M zeigt Molekulargewichtsmarker mit einer Größe von 29 kDa, 20,1 kDa, 13,2 kDa und 5 kDa. Bahn 1 ist reduziertes Ca-AMP1, das man als Kontrolle laufen läßt. Bahn 2 ist die Fraktion, die mit wiederholten Spülungen mit 50 mM NH₄Ac (pH 7,0) eluiert wurde. Bahn 3 ist die saure Spülfraktion und Bahn 4 der anfängliche Durchfluß. Es ist ersichtlich, daß der Großteil des Proteins an die Säule bindet und im Desorptionspuffer mit geringem pH eluiert wird, was nahelegt, daß Ca-AMP1 Affinität zu Chitin aufweist.
Beispiel 9
Antibakterielle und Antihefe-Aktivität von Ca-AMP1 und von Bm-AMP1
Die gereinigten Proteine wurden auf ihre Wirkung auf das Wachstum der folgenden Bakterien bewertet: Bacillus megaterium ATCC 13632, Escherichia coli Stamm HB101 und Pseudomonas aeruginosa NCIB 8295; und auf ihre Wirkung auf das Wachstum von Saccharomyces cerevisiae JRY188. Bioassays wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Ca-AMP1 und Bm-AMP1 hemmten jeweils stark das Wachstum von B, megaterium und S. cerevisiae, aber hatten wenig oder keine Wirkung auf die zwei untersuchten Gram-negativen Bakterien.
Tabelle 3 Aktivität von Ca-AMP1 und Bm-AMP1 auf Bakterien und Hefe
Beispiel 10
Molekulare Klonierung von Ca-AMP1- und Bm-AMP1-cDNAa
Aus im Freien kultivierten Pflanzen werden Samen zu 6 unterschiedlichen Entwicklungsstadien gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert. Nach Pulverisierung wird vollständige RNA aus 15 g einer Mischung der 6 unterschiedlichen Entwicklungsstadien extrahiert, wobei das Verfahren von De Vries et al. verwendet wird (1988, Plant Molecular Biology Manual, B6, 1–13), mit der Ausnahme, daß 6 ml einer 1:2-Phenol-RNA-Extraktionspuffermischung und 2 ml Chloroform pro Gramm Gewebe verwendet werden. Poly(A)+-mRNA wird durch Affinitätschromatografie an Oligo(dT)-Cellulose wie von Siflow et al. beschrieben gereinigt (1979, Biochemistry, 18, 2725–2731). Doppelsträngige cDNAs werden auf 1,5 μg poly(A)+-RNA gemäß Gubler und Hoffman hergestellt (1983, Gene, 25, 263–269) und an EcoRI/NotI-Adaptoren unter Verwendung des cDNA Synthesis Kit von Pharmacia ligiert.
Die cDNAs werden in den lambda ZAPII-Phagenvektor (Stratagene) gemäß Herstelleranweisung kloniert. Eine DNA-Sonde zur Durchmusterung der cDNA-Bibliothek wird durch Polymerasekettenreaktion (PCR) wie folgt hergestellt. Zwei degenerierte Oligonukleotide werden synthetisiert, die einem Durchlauf von Aminosäuren von Ca-AMP1 oder Bm-AMP1 entsprechen: eines hat eine sense-Orientierung, und das andere hat eine antisense-Orientierung. Beide Primer weisen die AAAGAATTC-Sequenz (d.h. AAA gefolgt von der EcoRI-Erkennungssequenz) an ihren 5'-Enden auf. PCR wird mit der Taq-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press), wobei die Oligonukleotide als Amplimere und 25 ng cDNA als Ziel-DNA verwendet werden. Das Temperaturprogramm schließt einen Anfangsschritt auf 94°C für 5 min, 30 Zyklen (94°C für 1 min; 45°C für 2 min, 72°C für 3 min) und einen Endschritt auf 72°C für 10 min ein. Das PCR-Amplifikationsprodukt wird an einem 3%igen Agarosegel (NuSieve, FMC) gereinigt. Dieses PCR-Produkt wird partiell unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden erneut amplifiziert. Dieses PCR-Amplifikationsprodukt wird erneut an einem 3%igen Agarosegel (NuSieve, FMC) gereinigt und durch PCR erneut unter den gleichen Bedingungen amplifiziert, außer daß die Reaktionsmischung 130 μM dTTP und 70 μM Digoxigenin-11-dUTP anstelle von 200 μM dTTP enthält. Das Digoxigenin-markierte PCR-Produkt wird an einem 3%igen NuSieve Agarosegel gereinigt. Ca. 10.000 Plaque-bildende Einheiten der lambda ZAPII-cDNA-Bibliothek werden mit dem Digoxigenin-markierten PCR-Produkt durch in-situ-Plaque-Hybridisierung unter Verwendung von Nylon-Membranen (Hybond-N, Amersham) durchmustert. Membranen werden luftgetrocknet, und DNA wird mit den Membranen unter UV-Licht vernetzt (0,15 J/cm²). Die Hybridisierung wird für 16 h bei 64°C in 5 × SSC, 1% Blockierungsreagens (Boehringer Mannheim), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% Natriumdodecylsulfat, enthaltend 10 ng/ml von hitzedenaturierter Digoxigenin-markierter Sonde, durchgeführt. Nicht-spezifisch gebundene Sonde wird durch zweimaliges Spülen für 5 min in 2 × SSC/0,1% SDS bei 25°C und zweimaliges Spülen für 15 min in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 60°C entfernt. Die Detektion der Sonde erfolgt unter Verwendung von Anti-Digoxigenin-Antikörpern, die an alkalische Phosphatase gebunden sind (Boehringer Mannheim), und ihr Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Boehringer Mannheim) gemäß Herstelleranweisungen. Positive Plaques werden durch zwei zusätzliche Durchmusterungsrunden mit der gleichen Sonde unter den gleichen Bedingungen gereinigt. Inserte aus gereinigten Plaques werden in vivo in die pBluescript-Phagemid-Form mit Hilfe des Helferphagen R408 ausgeschnitten. Die Inserte aus unterschiedlichen positiven Klonen werden durch EcoRI-Verdau ausgeschnitten und ihre Größe durch Agarose-Gelelektrophorese verglichen. Einige der Klone werden einer Nukleotidsequenzanalyse unterworfen. Die Klone mit dem größten Insert können ein offenes Leseraster aufweisen, das Ca-AMP1 oder Bm-AMP1 entspricht, wie es durch Vergleich mit den experimentellen N-terminalen Aminosäuresequenzen bestimmt werden könnte. Die cDNA-Klone voller Länge können sich voneinander in der Länge ihrer untranslatierten Regionen des 5'- und 3'-Endes und der Polyadenylierungssignale unterscheiden.
Zum Erhalt einer cDNA voller Länge kann ein anderer Ansatz verfolgt werden. PCR wird unter Standardbedingungen unter Verwendung eines antisense-Oligonukleotids in Kombination mit dem universellen M13-Primer einerseits und dem reversen M13-Primer andererseits durchgeführt. Die letzten Nukleotide des Oligonukleotids bilden die invertierte komplementäre Sequenz eines Teils der 3'-untranslierten Region, die unmittelbar den poly-A-Schwanz des cDNA-Klons mit weniger als voller Länge flankiert. Diese Sequenz wird zum 5'-Ende mit dem GAATTC-EcoRI-Erkennungsort verlängert, dem die Nukleotide 'ATA' vorangehen. Als eine Matrize werden entweder 2 μg von vollständiger cDNA oder 10⁵ rekombinante Phagen verwendet. In beiden Fällen werden 3 separate Reaktionen aufgestellt. Vor der Amplifikation werden die Phagen durch einen Anfangsschritt im PCR-Temperaturprogramm von 5 min auf 99°C zur Freisetzung der Phagen-DNA lysiert. Die Größe der Amplifikationsprodukte wird durch Elektrophorese an einem 3%igen Agarosegel (NuSieve, FMC) bestimmt. Produkte werden mit Größen erhalten, die Inserten unterschiedlicher Länge entsprechen, einschließlich eines cDNA-Klons voller Länge, falls ein solcher in der cDNA-Bibliothek vorhanden ist.
Beispiel 11
Konstruktion eines Expressionsvektors
Ein Expressionsvektor wird konstruiert, der die vollständige codierende Region der Ca-AMP1- oder Bm-AMP1-DNA enthält, flankiert an seinem 5'-Ende von dem starken konstitutiven Promotor der 35S-RNA des Blumenkohlmosaikvirus (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810–812), mit dem duplizierten Verstärkerelement, um eine hohe Transkriptionsaktivität zu erlauben (Kay et al., 1987, Science, 236, 1299–1302). Die codierende Region der Ca-AMP1/Bm-AMP1-DNA wird auf der Seite ihres 3'-Endes von der Polyadenylierungssequenz der 35S-RNA des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV35S) flankiert. Das Plasmidgerüst dieses Vektors ist das Phagemid pUC120 (Vieira und Messing, 1987, Methods Enzymol., 153, 3–11). Der Expressionsvektor wird wie folgt konstruiert. Ein cDNA-Klon, der aus der Ca-AMP1/Bm-AMP1-DNA besteht, wird in die BamHI/SalI-Orte von pEMBL18+ (Boehringer) kloniert. Das BamHI/SalI-Fragment wird in den Expressionsvektor pFAJ3002 subkloniert, der mit BamHI und SalI vorverdaut wurde. pFAJ3002 ist ein Derivat des Expressionsvektors pFF19 (Timmermans et al., 1990, J. Biotechnol., 14, 333–344), dessen besonderer EcoRI-Ort durch einen HindIII-Ort ersetzt ist.
Beispiel 12
Konstruktion eines Pflanzentransformationsvektors
Der Expressionsvektor aus Beispiel 11 wird mit HindIII verdaut, und das Fragment, das die Ca-AMP1/Bm-AMP1-DNA-Expressionskassette enthält, wird in den besonderen HindIII-Ort von pBin19Ri subkloniert. pBin19Ri ist eine modifizierte Version des Pflanzentransformationsvektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Research, 12, 8711–8721), worin die besonderen EcoRI- und HindIII-Orte vertauscht sind und die defekte nptII-Expressionskassette eingeführt ist (Yenofsky et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3435–3439).
Beispiel 13
Pflanzentransformation
Der unschädlich gemachte Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (pAL4404; Hoekema et al., 1983, Nature, 303, 179–180) wird mit dem in Beispiel 12 hergestellten Vektor unter Verwendung des Verfahrens von de Framond et al. transformiert (BioTechnology, 1, 262–269).
Eine Tabak-Transformation wird unter Verwendung von Blattscheiben aus Nicotiana tabacum Samsun auf Basis des Verfahrens von Horsch et al. (1985, Science, 227, 1229–1231) und durch Co-Kultivieren mit Agrobacterium-Stämmen, die pFRG8 enthalten, durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird unter Selektionsdruck von 100 μg/ml Kanamycin durchgeführt. Transgene Pflanzen (transformiert mit pFRG8) werden auf Medien regeneriert, die 100 μg/ml Kanamycin enthalten. Diese transgenen Pflanzen können auf Expression der neu eingeführten Gene unter Verwendung von standardmäßigen Western-Blotting-Techniken analysiert werden. Pflanzen, die die eingeführten Gene konstitutiv exprimieren können, können ausgewählt und selbstbestäubt werden, um Samen zu ergeben. F1-Keimlinge der transgenen Pflanzen können weiter analysiert werden.

Claims

Antimikrobielles Protein, das die in 4 oder 11 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.
Protein gemäß Anspruch 1, das ein Oligomer ist und wenigstens ein Polypeptid mit der in 4 oder 11 gezeigten Aminosäuresequenz umfaßt.
Protein gemäß Anspruch 1, worin das Protein aus der in 4 gezeigten Aminosäuresequenz besteht, die das reine Protein Ca-AMP1 ist.
Protein gemäß Anspruch 1, worin das Protein aus der in 11 gezeigten Aminosäuresequenz besteht, die das reine Protein Bm-AMP1 ist.
Protein gemäß Anspruch 1, das aus einem Pflanzensamen isoliert werden kann.
Protein gemäß Anspruch 5, das aus Samen isoliert werden kann, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Capsicum-Samen, Briza-Samen, Catapodium-Samen, Baptisia-Samen, Microsensis-Samen und Delphinium-Samen besteht.
Protein gemäß Anspruch 1, das synthetisch ist.
Protein gemäß Anspruch 1, das durch Expression von rekombinanter DNA erzeugt wird.
Zusammensetzung, die zur Ausbringung auf Pflanzenteile unter Verwendung von landwirtschaftlichen Standardtechniken geeignet ist und ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.
Rekombinante DNA-Sequenz, die ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 10, die cDNA ist.
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 10, die genomische DNA ist.
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 10, die aus einem pflanzlichen Genom isoliert ist.
Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 enthält.
Verfahren zur Bekämpfung von pilzlicher oder bakterieller Infektion in einer Pflanze, wobei das Verfahren das Ausbringen eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 auf die Pflanze umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 15, das den Kontakt mit einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 umfaßt.
Extraktionsverfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 aus organischem Material, das es enthält, wobei das Verfahren das Unterwerfen des organischen Materials der Mazeration und Lösungsmittelextraktion umfaßt.
Extraktionsverfahren gemäß Anspruch 17, worin das Protein anschließend durch Zentrifugieren, Chromatografie und Dialyse gereinigt wird.
Extraktionsverfahren gemäß Anspruch 17, worin das organische Material einen Samen umfaßt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Capsicum-Samen, Briza-Samen, Catapodium-Samen, Baptisia-Samen, Microsensis-Samen und Delphinium-Samen besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, welches die chemische Synthese des Proteins umfaßt.