DE69434071T2

DE69434071T2 - Antimikrobielle proteine

Info

Publication number: DE69434071T2
Application number: DE1994634071
Authority: DE
Inventors: Willem Frans Broekaert; Bruno Philippe Angelo Cammue; Rupert William Osborn; Sarah Bronwen Bracknell REES
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1993-12-24
Filing date: 1994-12-19
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2014-12-20
Also published as: EP0736096A1; ES2225835T3; DE69434071D1; CN1080303C; WO1995018229A1; CA2177854A1; CN1139454A; AU1276395A; DK0736096T3; JP3631492B2; JPH09507388A; US5919918A; AU696550B2; BR9408415A; EP0736096B1; ATE279519T1; GB9326424D0; US5750504A

Description

Diese Erfindung betrifft antimikrobielle Proteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung und sie codierende DNA-Sequenzen. Insbesondere betrifft sie antimikrobielle Proteine, die aus Samen von Heuchera isoliert werden können.
In diesem Zusammenhang werden antimikrobielle Proteine als Proteine definiert, die wenigstens eine der folgenden Aktivitäten besitzen: Antipilzaktivität (die Antihefeaktivität einschließen kann), antibakterielle Aktivität. Aktivität schließt eine Reihe von antagonistischen Wirkungen ein, wie partielle Inhibierung oder Tod. Solche Proteine können oligomer sein oder einzelne Peptiduntereinheiten sein.
Die Gattung Heuchera ist Teil der Pflanzenfamilie Saxifragaceae. Die Saxifragaceae ist eine weit verbreitete Familie, die hauptsächlich mehrjährige Kräuter und Sträucher umfaßt, die die Johannisbeere und Stachelbeere sowie viele populäre Gartenblumen enthält.
Pflanzen erzeugen ein weites Feld von Antipilzverbindungen zur Bekämpfung von potentiellen Eindringlichen, und über die letzten zehn Jahre wurde es deutlich, daß Proteine mit Antipilzaktivität einen wichtigen Teil dieser Verteidigungen bilden. Verschiedene Klassen solcher Proteine wurden beschrieben, einschließlich von Thioninen, Beta-1,3-Glucanasen, Ribosominaktivierenden Proteinen, Zeamatinen, Chitin-bindenden Lectinen und Chitinasen. Diese Proteine haben eine beträchtliche Aufmerksamkeit erlangt, da sie potentiell als biologische Bekämpfungsmittel verwendet werden könnten.
Die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/GB92/01570 (veröffentlicht am 18. März 1993 unter der Veröffentlichungsnummer WO93/05153) beschreibt eine Proteinklasse, die Antipilzproteine (AFPs) und antimikrobielle Proteine (AMPs) umfaßt. Die Klasse schließt die folgenden Proteine ein: Rs-AFP1 und Rs-AFP2, die aus Raphanus sativus isoliert werden können (Terras FRG et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:15301-13309), Bn-AFP1 und Bn-AFP2, die aus Brassica napus isoliert werden können, Br-AFPl und Br-AFP2, die aus Brassica rapa isoliert werden können, Sa-AFP1 und Sa-AFP2, die aus Sinapis alba isoliert werden können, At-AFP1, das aus Arabidopsis thaliana isoliert werden kann, Dm-AMP1 und Dm-AMP2, die aus Dahlia merckii isoliert werden können, Cb-AMP1 und Cb-AMP2, die aus Cnicus benedictus isoliert werden können, Lc-AFP, das aus Lathyrus cicera isoliert werden kann, Ct-AMP1 und Ct-AMP2, die aus Clitoria ternatea isoliert werden können.
Diese Proteinklasse wird nachfolgend als die "Proteine vom Rs-AFP-Typ" bezeichnet werden. Diese und andere aus Pflanzen stammende antimikrobielle Proteine sind nützlich als Fungizide oder Antibiotika, insbesondere für landwirtschaftliche Zwecke. Die Proteine können auf oder um eine Pflanze herum ausgebracht werden oder können innerhalb einer Pflanze exprimiert werden.
Wir haben jetzt ein neues wirksames antimikrobielles Protein gereinigt.
Wir haben ein neues antimikrobielles Protein aus Samen von Heuchera sanguinea gereinigt, nachfolgend Hs-AFP1 genannt (Heuchera sanguinea – Antipilzprotein 1). Hs-AFP1 ist ein 5 kDa-Polypeptid; solche Polypeptide können als Dimere assoziiert sein. Hs-AFP1 zeigt ein breites Spektrum von Antipilzaktivität.
Erfindungsgemäß wird ein Antipilzprotein mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ 2D NO: 1 gezeigt oder eine Aminosäuresequenz bereitgestellt, die im wesentlichen homolog zu SEQ ID NO: 1 mit wenigstens 60 % Sequenzidentität zur gesamten, in SEQ 2D NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist, mit der Maßgabe, daß ein solches Protein Antipilzaktivität aufweist.
Ein erfindungsgemäßes Antipilzprotein kann aus Samen von Heuchera isoliert werden und kann ebenfalls aus den Samen von sowohl verwandten als auch nicht verwandten Arten isoliert werden oder kann durch jedes geeignete Verfahren hergestellt oder synthetisiert werden.
Das Antipilzprotein kann aus Pflanzenmaterial extrahiert und gereinigt werden, aus seiner bekannten Aminosäuresequenz durch chemische Synthese unter Verwendung einer Standard-Peptidsynthesevorrichtung hergestellt werden oder innerhalb eines geeigneten Organismus (z.B. ein Mikroorganismus oder eine Pflanze) durch Expression von rekombinanter DNA hergestellt werden. Das Antipilzprotein ist nützlich als Fungizid und kann für landwirtschaftliche oder pharmazeutische Anwendungen eingesetzt werden.
Die Aminosäuresequenzierung von Hs-AFP1 zeigt, daß es homolog zu den Proteinen vom Rs-AFP-Typ ist (internationale Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO93/05153). Die Aminosäuresequenz von Hs-AFP1 ist als SEQ ID NO: 1 gezeigt.
5 zeigt die Sequenzangleichung von Hs-AFP1 (SEQ 2D NO: 1) mit den Antipilz/antimikrobiellen Proteinen vom Rs-AFP-Typ Rs-AFP1 (SEQ ID NO: 3), Rs-AFP2 (SEQ 2D NO: 4), Dm-AMP1 (SEQ ID NO: 5), Cb-AMP1 (SEQ ID NO: 6), Ct-AMP1 (SEQ ID NO: 7) und Lc-AFP (SEQ ID NO: 8), wie beschrieben in der internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO93/05153. Ein Teil der Sequenzen der Proteine Siα2 aus Sorghum (SEQ ID NO: 9) und gl-P aus Triticum (SEQ ID NO: 10) plus die vorhergesagten Genprodukte von pSAS10 (Vigna) (SEQ ID NO: 11), pI230 (Pisum) (SEQ ID NO: 12) und p322 (Solanum) (SEQ ID NO: 13) sind ebenfalls gezeigt (nachfolgend erörtert). Gedankenstriche wurden in die Sequenzen eingeführt, um eine optimale Angleichung zu ergeben.
Die Proteine vom Rs-AFP-Typ teilen ein gemeinsames Strukturmotiv, das ebenfalls innerhalb der Sequenz von Hs-AFP1 gefunden wird. Die Sequenzangleichung von Hs-AFP1 mit den Proteinen vom Rs-AFP-Typ zeigt, daß sie ein Consensus-Cystein-Glycin-Motiv teilen, das in 3 gezeigt ist. Es ist aus 3 ersichtlich, daß die Anzahl der Aminosäurereste zwischen den konservierten Cysteinen und Glycinen geringfügig in den verschiedenen gezeigten Sequenzen und Teilsequenzen variiert: Gedankenstriche wurden in die Sequenzen eingeführt, um eine optimale Angleichung zu ergeben. Mit einer Restenumerierung relativ zur Sequenz von Hs-AFP1 haben alle acht Cysteinreste konservierte Positionen in den Restenummern 6, 17, 23, 27, 39, 48, 50 und 54, und es gibt zwei konservierte Glycine in den Positionsnummern 15 und 37. Zusätzlich gibt es einen konservierten aromatischen Rest in Position 13 und einen konservierten Glutamatrest in Position 31.
Die Hs-AFP1-Sequenz zeigt 48 % Sequenzidentität mit Rs-AFP1. Trotz der Ähnlichkeiten zwischen dem Heuchera-Protein (Hs-AFP1) und den Proteinen vom Rs-AFP-Typ gibt es Unterschiede im gesamten Aminosäuregehalt und in der Aminosäuresequenz.
Die Antipilzaktivität von Hs-AFP1 verursacht eine schwere Verzweigung (Überverzweigung) von Pilzfäden aus bestimmten Arten. Diese morphologische Wirkung ist ähnlich derjenigen, die durch Rs-AFP1 oder Rs-AFP2 erzeugt wird.
Hs-AFP1 und die Proteine vom Rs-AFP-Typ sind partiell homolog mit den vorhergesagten Proteinprodukten aus den Fusarium-induzierten Genen pI39 und pI230 in der Erbse (Pisum sativum – ein Mitglied der Familie Fabaceae), wie von Chiang und Hadwiger beschrieben (1991, Mol. Plant Microbe Interact, 4:324-331). Diese Homologie wird mit dem vorhergesagten Proteinprodukt des pSAS10-Gens aus der Augenbohne (Vigna unguiculata – eine andere Fabaceae) geteilt, wie von Ishibashi et al. beschrieben (1990, Plant Mol. Biol., 15:59-64). Die Proteine sind ebenfalls teilweise homolog mit dem vorhergesagten Proteinprodukt von Gen p322 in der Kartoffel (Solanum tuberosum – ein Mitglied der Familie Solanaceae), wie von Stiekema et al. beschrieben (1988, Plant Mol. Biol., 11:255-269). Kürzlich wurde ein Protein, dessen aminoterminale Aminosäuresequenz fast identisch mit dem reifen Protein ist, das durch p322 codiert wird, aus Kartoffelknollen gereinigt, und es wurde gezeigt, daß es antimikrobielle Aktivität besitzt (Moreno et al., 1994, Eur. J. Biochem., 233:135-139). Nichts ist über die biologischen Eigenschaften des Proteins bekannt, das durch die Gene pI39, pI230, pSAS10 oder p322 codiert werden, da nur die cDNA untersucht wurde. Jedoch werden die pI39- und pI230-Gene nach Kontakt der Pflanze mit einer Krankheit oder einer anderen Belastung eingeschaltet. Es wurde vorgeschlagen, daß das pSAS10-Gen ein an der Keimung beteiligtes Protein codiert.
Die Sequenzen von Hs-AFP1 und Proteinen vom Rs-AFP-Typ zeigen einen geringeren Grad von partieller Homologie mit den Sequenzen einer Gruppe von kleinen α-Amylasen-Inhibitoren, die in den folgenden Mitgliedern der Gramineae gefunden werden: Hirse (Bloch und Richardson, 1991, FEBS Lett., 279:101-104), Weizen (Colitta et al., 1990, FEBS Lett., 270:191-194) und Gerste (Mendez et al., 1990, Eur. J. Biochem., 194:533-539). Solche Proteine, einschließlich Siα2 aus Hirse und g-1-Purothionin (g-1P) aus Weizen sind dafür bekannt, Insekten-α-Amylase zu hemmen, und können toxisch für Insektenlarven sein, obwohl dies nie gezeigt wurde. Es ist nicht bekannt, ob diese α-Amylase-Inhibitoren eine Antipilz- oder andere antimikrobielle Aktivität zeigen: keine anderen Daten über ihre biologische Aktivität wurden berichtet.
Das Wissen über seine Primärstruktur ermöglicht die Herstellung des antimikrobiellen Proteins oder von Teilen davon durch chemische Synthese unter Verwendung einer Standard-Peptidsynthesevorrichtung. Es ermöglicht ebenfalls die Herstellung von DNA-Konstrukten, die das antimikrobielle Protein codieren.
Die Erfindung stellt ferner eine DNA-Sequenz bereit, die ein erfindungsgemäßes Antipilzprotein codiert. Die DNA-Sequenz kann eine cDNA-Sequenz oder eine genomische Sequenz sein und kann aus einem cDNA-Klon, einem genomischen DNA-Klon oder aus DNA stammen, die unter Verwendung einer Standard-Nukleinsäuresynthesevorrichtung hergestellt wurde.
Die DNA-Sequenz kann aus der bekannten Aminosäuresequenz vorhergesagt werden, und DNA, die das Protein codiert, kann unter Verwendung einer Stan dard-Nukleinsäuresynthesevorrichtung hergestellt werden. Alternativ kann die DNA-Sequenz aus DNA-Bibliotheken, die aus Pflanzen stammen, isoliert werden. Geeignete Oligonukleotidsonden können aus der bekannten Aminosäuresequenz abgeleitet und zur Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek auf cDNA-Klone verwendet werden, die einen Teil oder das gesamte Protein codieren. Diese gleichen Oligonukleotidsonden oder cDNA-Klone können zur Isolierung des tatsächlichen antimikrobiellen Proteingens(gene) durch Durchmusterung genomischer DNA-Bibliotheken verwendet werden. Solche genomischen Klone können Kontrollsequenzen einschließen, die im Pflanzengenom arbeiten. Daher ist es ebenfalls möglich, Promotorsequenzen zu isolieren, die zum Antreiben der Expression der antimikrobiellen (oder anderen) Proteine verwendet werden können. Diese Promotoren können insbesondere auf Umweltbedingungen (wie die Gegenwart eines pilzlichen Pathogens) reagieren und können zum Antreiben der Expression eines beliebigen Zielgens verwendet werden.
Die DNA-Sequenz, die das Antipilzprotein codiert, kann in ein DNA-Konstrukt oder einen Vektor in Kombination mit geeigneten regulatorischen Sequenzen (Promotor, Terminator, etc.) eingefügt werden. Die DNA-Sequenz kann unter die Kontrolle eines konstitutiven oder eines induzierbaren Promotors gestellt werden (z.B. stimuliert durch Umweltbedingungen, Gegenwart eines Pathogens, Gegenwart einer Chemikalie). Ein solches DNA-Konstrukt kann kloniert oder in ein biologisches System transformiert werden, das die Expression des codierten Proteins oder eines aktiven Teils des Proteins erlaubt. Geeignete biologische Systeme schließen Mikroorganismen (z.B., Bakterien, wie Escherichia coli, Pseudomonas, und Endophyten, wie Clavibacter xyli Unterart cynodontis (Cxc); Hefe; Viren; Bakteriophagen; etc.), kultivierte Zellen (wie Insektenzellen, Säugetierzellen) und Pflanzen ein. In einigen Fällen kann das exprimierte Protein anschließend extrahiert und zur Verwendung isoliert werden.
Ein erfindungsgemäßes Antipilzprotein (wie Hs-AFP1) ist nützlich als Fungizid. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzen-pathogenen Pilzen bereit, wobei sie mit einem erfindungsgemäßen Antipilzprotein in Kontakt gebracht werden.
Für pharmazeutische Anwendungen kann das Antipilzprotein als Fungizid verwendet werden, um Säugetierinfektionen zu behandeln (z.B. zur Bekämpfung von Hefen, wie Candida). Die Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die das Antipilzprotein der Erfindung umfaßt. Die Erfindung stellt ferner das Antipilzprotein der Erfindung zur Verwendung als Pharmazeutikum bereit.
Ein erfindungsgemäßes Antipilzprotein kann ebenfalls als Konservierungsmittel verwendet werden (z.B. als Lebensmitteladditiv).
Für landwirtschaftliche Anwendungen kann das Antipilzprotein zur Verbesserung der Krankheitsresistenz oder Krankheitstoleranz von Kulturpflanzen entweder während des Lebens der Pflanze oder für den Nachernte-Kulturpflanzenschutz verwendet werden. Pathogene, die mit den Proteinen in Kontakt gebracht werden, werden gehemmt. Das Antipilzprotein kann ein Pathogen ausrotten, das schon auf der Pflanze etabliert ist, oder kann die Pflanze vor einem zukünftigen Pathogenangriff schützen. Die ausrottende Wirkung des Proteins ist besonders vorteilhaft.
Kontakt eines Pflanzenpathogens mit einem Antipilzprotein kann auf verschiedenen Weisen erreicht werden, zum Beispiel:

(a) eine Zusammensetzung, die das isolierte Protein umfaßt, kann auf Pflanzenteile oder den umgebenden Boden unter Verwendung landwirtschaftlicher Standardtechniken (wie Sprühen) ausgebracht werden; das Protein kann auf Pflanzengewebe extrahiert oder chemisch synthetisiert oder aus genetisch zur Expression des Proteins modifizierten Mikroorganismen extrahiert worden sein;
(b) eine Zusammensetzung, die einen zur Expression des Antipilzproteins genetisch modifizierten Mikroorganismus umfaßt, kann auf eine Pflanze oder den Boden ausgebracht werden, in dem eine Pflanze wächst;
(c) ein zur Expression des Antipilzproteins genetisch modifizierter Endophyt kann in das Pflanzengewebe eingeführt werden (z.B. über ein Saatgutbehandlungsverfahren); [Ein Endophyt wird als ein Mikroorganismus mit der Fähigkeit zum Eingehen nicht-pathogener endosymbiontischer Beziehungen mit einem pflanzlichen Wirt definiert. Ein Verfahren des Endophyten-gesteigerten Schutzes von Pflanzen wurde in einer Reihe von Patentanmeldungen von Crop Genetics International Corporation beschrieben (z.B. die internationale Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO90/13224, das Europäische Patent Veröffentlichungsnummer EP-125468-B1, die internationale Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO91/10363, die internationale Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO87/03303). Der Endophyt kann zur Erzeugung landwirtschaftlicher Chemikalien genetisch modifiziert sein. Die internationale Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO94/16076 (ZENECA Limited) beschreibt die Verwendung von Endophyten, die zur Expression eines aus einer Pflanze stammenden antimikrobiellen Proteins genetisch modifiziert wurden.]
(d) DNA, die ein Antipilzprotein codiert, kann in das pflanzliche Genom eingeführt werden, so daß das Protein innerhalb des Pflanzenkörpers exprimiert wird (die DNA kann cDNA, genomische DNA oder DNA sein, die unter Verwendung einer Standard-Nukleinsäuresynthesevorrichtung hergestellt wurde).

Pflanzenzellen können mit rekombinanten DNA-Konstrukten gemäß einer Vielzahl bekannter Verfahren transformiert werden (Agrobacterium Ti-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilpistole, etc.). Die transformierten Zellen können dann in geeigneten Fällen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, in denen das neue Kernmaterial stabil im Genom eingebaut ist. Sowohl transformierte einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden, obwohl letztere gewöhnlich leichter zu regenerieren sind. Einige der Abkömmlinge dieser primären Transformanten werden die rekombinante DNA erben, die das Antipilzprotein(proteine) codiert.
Die Erfindung stellt ferner eine Pflanze mit verbesserter Resistenz gegen ein pilzliches Pathogen bereit, die rekombinante DNA enthält, die ein erfindungsgemäßes Antipilzprotein exprimiert. Eine solche Pflanze kann als ein Elter in Standard-Pflanzenzüchtungskreuzungen verwendet werden, um Hybride und Linien mit verbesserter Pilzresistenz zu entwickeln.
Rekombinante DNA ist heterologe DNA, die in die Pflanze oder ihre Vorfahren durch Transformation eingeführt wurde. Die rekombinante DNA codiert ein Antipilzprotein, das zur Übertragung auf einen Ort des Pathogenangriffs (wie die Blätter) exprimiert wird. Die DNA kann eine aktive Untereinheit eines Antipilzproteins codieren.
Ein Pathogen kann jeder Pilz sein, der auf, in oder nahe der Pflanze wächst. In diesem Zusammenhang wird verbesserte Resistenz als eine gesteigerte Toleranz gegenüber einem pilzlichen Pathogen im Vergleich zu einer Pflanze vom Wildtyp definiert. Die Resistenz kann von einer schwachen Erhöhung der Toleranz gegenüber den Wirkungen des Pathogens (wenn das Pathogen partiell gehemmt wird) bis zur völligen Resistenz variieren, so daß die Pflanze durch die Gegenwart des Pathogens unbeeinflußt ist (wenn das Pathogen ernsthaft gehemmt oder getötet wird). Sowohl ein erhöhter Grad von Resistenz gegen ein besonderes Pathogen als auch Resistenz gegen ein breiteres Spektrum von Pathogenen können eine Verbesserung der Resistenz darstellen. Transgene Pflanzen (oder daraus abstammende Pflanzen), die eine verbesserte Resistenz zeigen, werden im Anschluß an die Pflanzentransformation oder anschließende Kreuzung selektiert.
Wenn das Antipilzprotein innerhalb einer transgenen Pflanze oder ihren Abkömmlingen exprimiert wird, wird der Pilz mit dem Protein am Ort des Pathogenangriffs auf der Pflanze in Kontakt gebracht. Insbesondere durch Verwendung geeigneter regulatorischer Gensequenzen kann das Protein in vivo erzeugt werden, wenn und wo es am effektivsten sein wird. Zum Beispiel kann das Protein innerhalb von Teilen der Pflanze erzeugt werden, in denen es normalerweise nicht in Menge exprimiert wird, aber wo die Krankheitsresistenz wichtig ist (wie in den Blättern).
Beispiele für genetisch modifizierte Pflanzen, die hergestellt werden können, schließen Feldfrüchte, Getreide, Obst und Gemüse ein, wie z.B: Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle, Soja, Mais, Weizen, Gerste, Reis, Hirse, Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen, Melonen, Kartoffeln, Karotte, Salat, Kohl, Zwiebel.
Die Erfindung wird jetzt allein als Beispiel unter Verweis auf die Zeichnungen beschrieben, in denen gilt:
1 zeigt das Kationenaustauschchromatogramm zur Reinigung von Hs-AFP1 und das verbundene Diagramm der Pilzwachstumshemmung;
2 zeigt das Umkehrphasenchromatogramm für gereinigtes Hs-AFP1;
3 zeigt die Aminosäuresequenzangleichung von Hs-AFP1 und anderen Proteinen; und unter Bezugnahme auf das SEQUENZPROTOKOLL, worin gilt:

SEQ ID NO: 1 ist die Aminosäuresequenz von Hs-AFP1;
SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäuresequenz von Ah-AMP1;
SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäuresequenz von Rs-AFP1;
SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz von Rs-AFP2;
SEQ ID NO: 5 ist die Aminosäuresequenz von Dm-AMP1;
SEQ ID NO: 6 ist die Aminosäuresequenz von Cb-AMP1;
SEQ ID NO: 7 ist die Aminosäuresequenz von Ct-AMP1;
SEQ ID NO: 8 ist die Aminosäuresequenz von Lc-AFP;
SEQ 2D NO: 9 ist ein Teil der Aminosäuresequenz von Siα2;
SEQ ID NO: 10 ist ein Teil der Aminosäuresequenz von yl-P;
SEQ ID NO: 11 ist ein Teil der vorhergesagten Aminosäuresequenz des pSAS10- Genprodukts;
SEQ ID NO: 12 ist ein Teil der vorhergesagten Aminosäuresequenz des pI230- Genprodukts;
SEQ ID NO: 13 ist ein Teil der vorhergesagten Aminosäuresequenz des p322- Genprodukts.

Beispiel 1
Tests zur Antipilz- und antibakteriellen Aktivität
Die Antipilzaktivität wurde durch Mikrospektrophotometrie wie zuvor beschrieben gemessen (Broekaert, 1990, FEMS Microbiol. Lett., 69:55-60). Routinemäßig wurden die Untersuchungen mit 20 µl einer (filtersterilisierten) Testlösung und 80 µl einer Suspension von Pilzsporen (2 x 10⁴ Sporen/ml) in halbkonzentrierter Kartoffeldextrosebouillon (1/2 PDB) durchgeführt. Das synthetische Wachstumsmedium (SMF) bestand aus K₂HPO₄ (2,5 mM), MgSO₄ (50 µM), CaCl₂ (50 µM), FeSO₄ (5 µM), CoCl₂ (0,1 µM), CuSO₄ (0,1 µM), Na₂MoO₄ (2 µM), H₃BO₃ (0,5 µM), KI (0,1 µM), ZnSO₄ (0,5 µM), MnSO₄ (0,1 µM), Glucose (10 g/l), Asparagin (1 g/l), Methionin (20 mg/l), myo-Inosit (2 mg/l), Biotin (0,2 mg/l), Thiamin-HCl (1 mg/l) und Pyridoxin-HCl (0,2 mg/l). Kontrollmikrokulturen enthielten 20 µl steriles destilliertes Wasser und 80 µl der Pilzsporensuspension.
Wenn nichts anderes angegeben ist, war der Testorganismus Fusarium calmorum (Stamm IMI 180420), und die Inkubation erfolgte bei 25°C für 48 Stunden. Die prozentuale Wachstumsinhibierung wird als das 100-fache des Verhältnisses der korrigierten Extinktion der Kontrollmikrokultur abzüglich der korrigierten Extinktion der Testmikrokultur gegenüber der korrigierten Extinktion bei 595 nm der Kontrollmikrokultur definiert. Die korrigierten Extinktionswerte sind gleich der Extinktion bei 595 nm der Kultur, gemessen nach 48 Stunden, abzüglich der Extinktion bei 595 nm, gemessen nach 30 min.
Die antibakterielle Aktivität wurde mikrospektrophotometrisch wie folgt gemessen: Eine bakterielle Suspension wurde hergestellt durch Impfen von weicher Nährmittelagarose (Trypton, 10 g/l; Seaplaque-Agarose (FMC, 5 g/l). Teilmengen (80 µl) der bakteriellen Suspension (105 koloniebildende Einheiten pro ml) wurden zu filtersterilisierten Proben (20 µl) in flachbödigen Mikroplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Extinktion bei 595 nm der Kultur wurde mit Hilfe eines Mikroplattenlesers nach 30 Minuten und 24 Stunden Inkubation bei 28°C gemessen. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde wie oben für den Test der Antipilzaktivität beschrieben berechnet.
Beispiel 2
Reinigung von Antipilzproteinen aus Heuchera sanguinea-Samen
20 g H. sanguinea-Samen (erhalten von Okkerse, Mechelen, Belgien) wurden in einer Kaffeemühle gemahlen, und das resultierende Mehl wurde für 2 Stunden bei 4°C mit 100 ml eines eiskalten Extraktionspuffers extrahiert, der 10 mM NaH₂PO₄, 15 mM NaH₂PO₄, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mM Thioharnstoff und 1 mM PMSF enthielt. Das Homogenat wurde durch Seihtuch gedrückt und durch Zentrifugieren geklärt (30 min bei 7.000 x g). Der Überstand wurde umfassend gegen destilliertes Wasser unter Verwendung von benzoylierter Cellulose-Schlauchleitung (Sigma) mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 2.000 Da dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung auf 50 mM (NH₄)Ac (pH 9) durch Zugabe des zehnfach konzentrierten Puffers eingestellt und anschließend über eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden; 12 x 5 cm) im Gleichgewicht mit 50 mM NH₄NH₄Ac (pH 9) geleitet. Die durch die Säule gelangte Proteinfraktion wurde lyophilisiert und schließlich in 50 ml 20 mM NH₄NH₄Ac (Ammoniumacetat), pH 6 erneut gelöst.
Diese Fraktion wurde auf eine S-Sepharose High Performance-Säule (Pharmacia; 10 x 1,6 cm) aufgetragen, die zuvor mit 20 mM NH₄NH₄Ac-Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 120 ml von 20 zu 500 mM NH₄NH₄Ac (pH 6) eluiert. Das Eluat wurde auf Protein durch unmittelbare Messung der Extinktion bei 280 nm überwacht (Ergebnisse im unteren Diagramm der 1 gezeigt) und in 7,5 ml-Fraktionen aufgefangen.
Die Fraktionen wurden lyophilisiert und erneut in destilliertem Wasser aufgelöst. Von diesen Fraktionen wurden 5 µl in den in Beispiel 1 beschriebenen mikrospektrophotometrischen Tests der Antipilzaktivität unter Verwendung des mit 1 mM CaCl₂ und 50 mM KCl ergänzten synthetischen Wachstumsmediums getestet (Ergebnisse als Histogramme im oberen Diagramm von 1 gezeigt). Die gesamte Antipilzaktivität war im Hauptpeak enthalten, der bei etwa 300 mM NH₄NH₄Ac eluierte (angegeben durch eine Pfeilspitze in 1).
Die Fraktion, die die höchste Antipilzaktivität zeigte, wurde weiter durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt. Diese Fraktion wurde auf eine Pep-S-Säule (poröse Kieselerde C₂/C₁₈, Pharmacia; 25 x 0,93 cm) im Gleichgewicht mit 10 % Acetonitril, das 0,1 % TFA enthielt, geladen. Die Säule wurde mit 4 ml/min mit einem linearen Gradienten von 200 ml von 10 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) zu 95 % Acetonitril/0,1 % TFA eluiert. Das Eluat wurde auf Protein durch unmittelbare Messung der Extinktion bei 280 nm überwacht. Zwei ml-Fraktionen des Eluats wurden aufgefangen, vakuumgetrocknet und schließlich in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst, von dem 10 µl in einem mikrospektrophotometrischen Test der Antipilzaktivität unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen synthetischen Wachstumsmediums, ergänzt mit 1 mM CaCl₂ und 50 mM KCl, verwendet wurden.
2 zeigt das Umkehrphasenchromatogramm der aktiven Fraktion, gereinigt durch Kationenaustauschchromatographie. Das untere Diagramm zeigt die Überwachung des Eluats auf Protein durch Messung der Extinktion bei 280 nm. Das obere Diagramm zeigt die Antipilzaktivität gemäß Test durch den mikrospektrophotometrischen Test. Das Chromatogramm zeigt drei Peaks, von denen der erste, der bei 25 % Acetonitril eluiert, die gesamte Antipilzaktivität enthält. Der aus diesem Peak isolierte aktive Faktor (angegeben durch eine Pfeilspitze in 2) wird Hs-AFP1 genannt (Heuchera sanguinea-Antipilzprotein 1).
Beispiel 3
Molekulare Struktur des gereinigten Antipilzproteins, Hs-AFP1
Die molekulare Struktur des gereinigten Antipilzproteins wurde weiter durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. SDS-PAGE wurde auf vorgegossenen gewerblichen Gelen (PhastGel High Density von Pharmacia) unter Verwendung einer PhastSystem-Elektrophoresevorrichtung (Pharmacia) durchgeführt. Der Probenpuffer enthielt 200 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1 % (G/V) SDS, 1 mM EDTA, 0,005 % Bromphenolblau und, wenn nichts anderes angegeben ist, 1 % (G/V) Dithioerythrit (DTE). 200 ng der Proteine wurden auf den Gelen getrennt. Myoglobinfragmente wurden als Molekulargewichtsmarker (Pharmacia) mit den folgenden Größen verwendet: 17 kDa, 14,5 kDa, 8 kDa, 6 kDa und 2,5 kDa. Proteine wurden nach Elektrophorese in 12,5 %igem Glutaraldehyd fixiert und gemäß Heukeshoven und Dernick mit Silber angefärbt (1985, Electrophoresis, 6, 103-112).
Nach Reduktion der Cysteinreste durch DTE zeigt Hs-AFP1 eine einzelne Bande mit einer scheinbaren molekularen Masse von circa 5 kDa. Unreduziertes Hs-AFP1 wandet als einzelne Bande von circa 10 kDa. Diese Ergebnisse zeigen, daß das native Hs-AFP1 ein oligomeres Protein sein kann, das höchstwahrscheinlich aus einem Dimer des 5 kDa-Polypeptids besteht. Die oligomere Struktur scheint durch Disulfidbrücken stabilisiert zu sein.
Beispiel 4
Antipilz- und antibakterielle Wirksamkeit
Die Antipilzwirksamkeit des gereinigten Proteins wurde an unterschiedlichen Pflanzen-pathogenen Pilzen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Tests bewertet. Das Wachstum der Pilze, das Auffangen und das Ernten von Pilzsporen und die Zubereitung von Myzelfragmenten erfolgten wie zuvor beschrieben (Broekaert et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett., 69:55-60). Serielle Verdünnungen der Antipilzproteine wurden auf die Pilze ausgebracht, entweder unter Verwendung von Wachstumsmedium SMF- (das synthetische Wachstumsmedium aus Beispiel 1), Medium SMF+ (Medium SMF-, ergänzt mit 1 mM CaCl₂ und 50 mM KCl), Wachstumsmedium 1/2 PDB- (halbkonzentrierte Kartoffeldextrosebouillon wie in Beispiel 1) oder Wachstumsmedium 1/2 PDB+ (Medium 1/2 PDB-, ergänzt mit 1 mM CaCl₂ und 50 mM KCl). Die prozentuale Wachstumsinhibierung wurde durch Mikrospektrophotometrie gemessen. Die für eine 50 %ige Wachstumshemmung nach 48 h Inkubation erforderliche Konzentration (IC₅₀-Wert) wurde aus den Dosis-Reaktions-Kurven berechnet.
Die Ergebnisse für Hs-AFP1 sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die verwendeten Abkürzungen sind: IC₅₀ = für 50 %ige Wachstumshemmung erforderliche Konzentration, bestimmt wie in Beispiel 1 beschrieben; ND = nicht bestimmt; Sp = Sporen; PrSp = Sporen, die im Medium für 24 Stunden vorgekeimt wurden; MF = Myzelfragmente, vorinkubiert für 48 Stunden im Medium vor der Zugabe der Proteine; BHR = breiter Wirtebereich; SF = saprophytischer Pilz; SMF- = synthetisches Wachstumsmedium wie in Beispiel 1 beschrieben; SMF+ = SMF-, ergänzt mit 1 mM CaCl₂ und 50 mM KCl; 1/2PDB- _ halbkonzentrierte Kartoffeldextrosebouillon wie in Beispiel 1 beschrieben; 1/2PDB+ = 1/2PDB-, ergänzt mit 1 mM CaCl₂ und 50 mM KCl.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 veranschaulichen das breite Spektrum der Antipilzaktivität des Hs-AFP1-Proteins.
In den Medien SMF+ und 1/2PDB+ (die Salzadditive enthalten, um die Ionenstärke der physiologischen Bedingungen in Pflanzengeweben zu reflektieren) ist die Aktivität beider Proteine im Vergleich mit ihrer Aktivität in den Medien SMF- oder 1/2PDB- reduziert. Die salzabhängige Aktivitätsreduktion ist ersichtlich abhängig vom Testorganismus.
Hs-AFP1 wechselwirkt mit pilzlichen Wachstumsprozessen, gezeigt durch eine Reduktion der Pilzfadenlänge. Hs-AFP1 verursacht ebenfalls eine Überverzweigung der Pilzfäden von Fusarium culmorum. Eine ähnliche Wirkung wird durch die Antipilzproteine Rs-AFP1 und Rs-AFP2 aus Raphanus sativus-Samen erzeugt (Terras FRG et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:15301-15309).
Die antibakterielle Aktivität von Hs-AFP1 wurde an vier Gram-positiven Bakterien (Bacillus subtilis JHCC 553331; Micrococcus luteus ATCC 93411; Staphylococcus aureus ATCC 25923; Streptococcus feacolis ATCC 29212) und zwei Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli HB101 und Proteus vulgaris JHCC 558711) gemessen. Hs-AFP1 inhibierte nicht das Wachstum dieser Bakterien, die mit Raten von 200 µg/ml getestet wurden.
Beispiel 5
Inhibierung von α-Amylase
Ein roher α-Amylaseextrakt wurde aus zerteilten Därmen ausgewachsener Schaben (Blatta orientalis) durch Homogenisieren in 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂ und Entfernung von Zelltrümmern durch Zentrifugieren zubereitet. Menschliche und α-Amylase vom Schwein wurden von Sigma erworben. Typ 1-α-Amylase-Inhibitor aus Weizen (erworben von Sigma) wurde als Positivkontrolle verwendet. Amylaseextrakte wurden mit Peptiden für 20 min bei 30°C vor der Zugabe von Stärke inkubiert, und die Enzymaktivität wurde unter Verwendung des Verfahrens von Bernfeld (1955, Methods Enzymol., Colwick und Kaplan, Hrsg., Bd. 1:149-158) bestimmt.
Die α-Amylase-Inhibierungsaktivitäten von Hs-AFP1 wurden an α-Amylasen aus den drei Quellen mit denjenigen des Sorgum bicolor-Homologs SIα3 verglichen, von dem zuvor berichtet wurde, daß es Insektendarm-α-Amylasen hemmt (Bloch und Richardson, 1991, FEBS Lett., 279:101-104). SIα3 hemmte die Aktivität der Enzyme aus Insektendarm und menschlichem Speichel zu mehr als 70 % mit Raten von so niedrig wie 5 µg/ml. Eine vergleichbare Hemmung wurde mit 10 E/ml einer gewerblichen Zubereitung von Typ 1--Amylase-Inhibitor aus Weizen erreicht. SIα3 war im wesentlichen inaktiv am Enzym aus Bauchspeicheldrüse aus Schwein, wie zuvor von Bloch und Richardson (1991) berichtet.
Im Gegensatz wurde keine Inhibierung der α-Amylase-Aktivität mit Hs-AFP1 oder Ah-AMP1 beobachtet, die an drei Enzymen getestet wurden, selbst wenn sie mit Raten von so hoch wie 200 µg/ml eingeschlossen wurden.
Beispiel 6
Aminosäuresequenzierung von Hs-AFP1
Cysteinreste des Antipilzproteins wurden durch S-Pyridylethylierung unter Verwendung des Verfahrens von Fullmer modifiziert (1984, Anal. Biochem., 142, 336-341). Die Reagenzien wurden durch HPLC an einer Pep-S-Säule (poröse Kieselerde C₂/C₁₈; Pharmacia; 25 x 0,4 cm) entfernt. Die S-pyridylethylierten Proteine wurden durch die Elution der Säule mit einem linearen Gradienten von 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) zu Acetonitril, das 0,1 % TFA enthielt, gewonnen. Die resultierenden Proteinfraktionen wurden der Aminosäuresequenzanalyse in einem 477A Protein Sequence (Applied Biosystems) mit unmittelbarem Nachweis von Phenylthiohydantoin-Aminosäurederivaten in einem 120A Analyser (Applied Biosystems) unterworfen.
Die Aminosäuresequenz von Hs-AFP1 wurde durch N-terminalen automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die vollständige Aminosäuresequenz für Hs-AFP1 ist als SEQ ID NO: 1 angegeben.
Hs-AFP1 hat eine Länge von 54 Aminosäuren. Es enthält acht Cysteine, und basische Aminosäurereste sind relativ häufig.
Hs-AFP1 enthält einen Tyrosinrest in Position 41, einen Phenylalaninrest in Position 43 und einen Prolinrest in Position 44. Identische Amino-säuren werden in entsprechenden Positionen von Rs-AFP1 und Rs-AFP2 gefunden (Y in Position 38, F in Position 40, P in Position 41), aber werden durch nicht-homologe Aminosäurereste in den anderen Proteinen vom Rs-AFP-Typ ersetzt. Eine Untersuchung der 3-dimensionalen Faltung eines verwandten Proteins aus Weizensamen (Bruix et al., 1993, Biochemistry, 32:715-724) zeigt an, daß sich diese konservierten Aminosäuren auf einer Proteinschlaufe befinden, die zwei antiparallele β-Faltblätter verbindet. Diese Schlaufe kann Teil des aktiven Zentrums sein, das verantwortlich für die Wechselwirkung mit (einem) mutmaßlichen Rezeptor (en) auf Pilzfäden ist.
Es ist beachtenswert, daß Rs-AFP1, Rs-AFP2 und Hs-AFP1 alle eine Überverzweigung der Pilze verursachen, wohingegen Dm-AMP1, Dm-AMP2, Cb-AMP2 und Cb-AMP2 dies nicht tun. Dies weist darauf hin, daß jede Gruppe von Proteinen entweder mit einem unterschiedlichen Ziel im Pilz oder mit dem gleichen Ziel in einer unterschiedlichen Weise wechselwirken kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antipilzprotein, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 60 % Identität mit der gesamten, in SEQ 2D NO:1 gezeigten Aminosäuresequenz hat.
DNA, die ein Antipilzprotein gemäß Anspruch 1 codiert.
Mikroorganismus, kultivierte Zelle oder transgene Pflanze, die DNA gemäß Anspruch 2 enthält, worin die DNA rekombinante heterologe DNA ist.
Transgene Pflanze, die verbesserte Resistenz gegen ein Pilzpathogen im Vergleich zu Pflanzen vom Wildtyp aufweist und rekombinante heterologe DNA enthält, die ein Antipilzprotein gemäß Anspruch 1 exprimiert.
Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzen-pathogenen Pilzen, umfassend den Kontakt der Pilze mit einem Antipilzprotein gemäß Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Antipilzprotein gemäß Anspruch 1 umfaßt.
Antipilzprotein gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als Pharmazeutikum.