DE69433407T2

DE69433407T2 - Anti-mikrobielle Proteine

Info

Publication number: DE69433407T2
Application number: DE69433407T
Authority: DE
Inventors: Matthias Karsten KRAGH; Dalgaard Jorn MIKKELSEN; Kristian Klaus NIELSEN
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1993-10-21
Filing date: 1994-10-20
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2014-10-21
Also published as: DK0724641T3; RU2158762C2; US6300103B1; HU9601040D0; HUT74395A; CA2170506A1; US6218508B1; EP0724641B1; WO1995011306A1; AU683952B2; CZ112296A3; DE69433407D1; AU8058794A; EP0724641A1; PL313526A1; PL181851B1; GB9321714D0; HU223367B1; ATE256193T1; JPH09504427A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft antimikrobielle Proteine, die aus Zuckerrübe isolierbar sind.
Erfindungsgemäß wird antimikrobielles Protein bereitgestellt, das ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz umfaßt: AA₁-AA₂-AA₃-Cys-AA5-AA₆-AA₇-AA₈-AA₉-Cys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-Cys-Cys-AA₁₇-AA₁₈-AA₁₉-AA₂₀-AA₂₁-Cys-AA₂₃-AA₂₄-AA₂₅-AA₂₆-AA₂₇-AA₂₈-Cys-AA₃₀, worin "AA" eine beliebige der üblicherweise gefundenen 20 Aminosäuren bezeichnet. Es ist bevorzugt, daß AA₇ Tyr ist; AA₁₄ Tyr ist; und AA₁₈ Lys ist. Zusätzlich ist es weiter bevorzugt, daß AA₂₄ Val ist; AA₂₆ Arg ist; und AA₂₇ Ala ist.
Ein antimikrobielles Protein schließt ein Protein (allein oder in Kombination mit einem anderen Material) ein, das unter beliebigen Umständen gegen einen beliebigen Mikroorganismus toxisch oder wachstumshemmend ist, einschließlich gegen Bakterien (insbesondere Gram-positive Bakterien), Viren und insbesondere Pilze. Solche antimikrobiellen Proteine schließen diejenigen ein, die eine antimikrobielle Aktivität bei Kontakt mit einem Mikroorganismus aufweisen, und diejenigen, die antimikrobiell als Ergebnis ihrer Assimilation oder Respiration sind.
WO 92/21699 offenbart biozide Proteine die aus Amaranth isoliert werden. Die Proteine zeigen eine breite Antipilz-Aktivität und sind aktiv gegen Gram-positive Bakterien. WO 92/17591 offenbart die Zuckerrübe-Chitinase 4, die Antipilz-Aktivität besitzt.
Die Erfindung schließt ebenfalls ein antimikrobielles Protein mit der in einer beliebigen der SEQ ID Nrn. 1–3 dargestellten Sequenz ein.
Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung ist die spezifische Aktivität ein Maß der Höhe der Wachstums- oder Vermehrungshemmung, die durch eine angegebene Menge des Proteins auf eine angegebene Menge eines angegebenen Mikroorganismus erzeugt wird.
Die Erfindung schließt weiterhin die reinen Proteine in Kombination mit wenigstens einem Protein ein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den in SEQ ID Nrn. 4–6 dargestellten besteht. Solche kombinierten Proteine können ferner mit einem oder mehreren der bekannten "Pathogenese bezogenen Proteine" kombiniert werden. Die Infektion von Pflanzen mit pilzlichen oder viralen Pathogenen kann eine systemische Synthese von ca. 10 Familien von homologen Pathogenese-bezogenen Proteinen (PR-Proteinen) im vegetativen Gewebe induzieren. Solche PR-Proteine wurden in 5 Gruppen klassifiziert. Die PR-2-, PR-3- und PR-5-Proteine sind beta-1,3-Glucanase, Chitinasen bzw. thaumatinartige Proteine. Spezifische Funktionen wurden den PR-1- und PR-4-Gruppen von Proteinen nicht zugeordnet. Die PR-4-Proteine sind ähnlich den C-terminalen Domänen des Prohevein und der mutmaßlichen Wund-induzierten WIN-Proteine der Kartoffel, wodurch ihnen die N-terminale Hevein-Domäne fehlt. Es ist besonders bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Proteine mit einem oder mehreren Proteinen kombiniert sind, die basische Gegenstücke der PR-4-Gruppe von Proteinen sind, was die basischen Gegenstücke von Proteinen ähnlich den C-terminalen Domänen des Prohevein und der mutmaßlichen Wund-induzierten WIN-Proteine der Kartoffel bedeutet. Es ist besonders bevorzugt, daß das basische Gegenstück der Pathogenese-bezogenen Proteine ein chitinbindendes WIN-Protein ist, insbesondere dasjenige, das durch Gerstenkörner oder gestreßte Gerstenblätter erzeugt wird.
Die Erfindung schließt weiterhin rekombinante DNA ein, die eine Sequenz umfaßt, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der oben offenbarten antimikrobiellen Proteine codiert. Insbesondere kann die DNA wenigstens eines der Proteine codieren, deren Sequenzen in SEQ ID Nrn. 1–3 dargestellt sind, gegebenenfalls zusätzlich zu wenigstens einem der Proteine, deren Sequenz in SEQ ID Nrn. 4–6 dargestellt sind. Die rekombinante DNA mag ferner ein Protein mit Herbizidresistenz-, pflanzenwachstumsfördernden, Antipilz-, antibakteriellen, antiviralen und/oder Antinematoden-Eigenschaften codieren. Für den Fall, daß die DNA in einen heterologen Organismus eingeführt werden soll, kann sie modifiziert werden, um bekannte mRNA-Instabilitätsmotive (wie AT-reiche Regionen) und Polyadenylierungssignale (falls sie vorhanden sind) zu entfernen, und/oder Codonen, die durch den Organismus bevorzugt sind, in den die rekombinante DNA inseriert werden soll, können verwendet werden, so daß die Expression der so modifizierten DNA im Organismus im wesentlichen ähnliches Protein zu demjenigen liefert, das durch Expression der unmodifizierten rekombinanten DNA im Organismus erhalten wird, in dem das erfindungsgemäße antimikrobielle Protein endogen ist.
Ebenfalls eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der die oben offenbarte DNA enthält, die in Pflanzen exprimierbar ist und an einen in einer Pflanze funktionsfähigen Promotor und Terminator gebunden ist. Pflanzen können mit solcher DNA unter Verwendung bekannter Verfahren transformiert werden, und Pflanzenzellen oder Protoplasten, die mit der DNA der Erfindung transformiert sind, können gemäß einer Vielzahl bekannter Verfahren regeneriert werden (Agrobakterium Ti- und Ri-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilkanone etc.). Die transformierte Zelle kann in geeigneten Fällen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, in denen das Kernmaterial stabil im Genom eingefügt ist. Sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden. Beispiele für solche transformierten Pflanzen schließen ein: Früchte, einschließlich Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen; Feldfrüchte wie Raps, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, kleinkörniges Getreide wie Weizen, Gerste und Reis, Mais und Baumwolle und Gemüse wie Kartoffel, Karotte, Salat, Kohl und Zwiebel. Die Erfindung schließt ferner aus der Expression der DNA stammendes Protein und durch Expression der rekombinanten DNA innerhalb von damit transformierten Pflanzen erzeugtes antimikrobielles Protein ein.
Die Erfindung schließt ferner eine antimikrobielle Zusammensetzung ein, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine enthält; ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen, welches ihr Inkontaktbringen mit solchen Proteinen umfaßt. Man wird einsehen, daß das antimikrobielle Protein wenig, falls überhaupt, antimikrobielle Wirkung auf den Mikroorganismus ausübt, der die Quelle des im vorherigen Satz bezeichneten organischen Materials ist.
Die Erfindung wird aus der folgenden Beschreibung und den damit verbundenen Zeichnungen und Sequenzprotokollen weiter ersichtlich werden. 1 zeigt ein typisches Elutionsprofil der interzellulären Waschflüssigkeit aus einer CM-Sepharosesäule;
2 zeigt ein typisches Elutionsprofil aus einer Mono S FLPC-Säule der in 1 gezeigten 0,3 M NaCl-Fraktion;
3 zeigt ein typisches Elutionsprofil aus einer RP-HPLC-Säule der durch Peak 3 in 2 dargestellten Proteine;
4 zeigt die Antipilz-Aktivität von 10 μg des Proteins, das durch die Peaks 3.1 und 3.2 in 3 dargestellt ist (SEQ ID Nrn. 1 bzw. 2);
5 zeigt ein Sephadex G75 Gelfiltrationschromatogramm der in 1 dargestellten 0,1 M-Fraktion;
6 zeigt ein typisches Elutionsprofil aus einer Mono S FLPC-Säule des Peaks (Ansammlung) V, der in 5 dargestellt ist;
7 zeigt die Antipilz-Aktivität von 10 μg des Proteins, das in den Peaks 1 und 2 (SEQ ID Nr. 3) in 6 dargestellt ist.
8A zeigt die kombinierte Antipilz-Aktivität von 2 μg jedes der Proteine, die durch SEQ ID Nrn. 2 und 3 dargestellt sind; 8B zeigt die kombinierte antimikrobielle Aktivität von 2 μg jedes der Proteine, die durch SEQ ID Nrn. 2 und 5 dargestellt sind.
9A und 9B zeigen die Morphologie von Hyphen von C. beticola, gezüchtet in Abwesenheit der antimikrobiellen Proteine der Erfindung. 9C und 9D zeigen die Hyphen, wenn der Pilz für 48 Stunden in Gegenwart von 2 μg der Proteine mit den in SEQ ID Nrn. 2 bzw. 3 gezeigten Sequenzen gezüchtet wird. Der Test wird in Mikrotiterplatten wie nachfolgend angegeben durchgeführt; Vergrößerung 9A, 76×; Figuren 9B–9D, 294×.
SEQ ID Nr. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des durch Peak 3.1 in 3 dargestellten Proteins; SEQ ID Nr. 2 zeigt die Aminosäuresequenz des durch Peak 3.2 in 3 dargestellten Proteins; und SEQ ID Nr. 3 zeigt die Aminosäuresequenz des durch Peaks 1 und 2 in 6 dargestellten Proteins; SEQ ID Nrn. 4–6 zeigen die Aminosäuresequenzen drei bekannter Antipilz-Proteine; SEQ ID Nr. 7 zeigt die Nukleotidsequenz der cDNA, die das in SEQ ID Nr. 3 dargestellte Protein codiert; und SEQ ID Nr. 8 zeigt das Translationsprodukt des Transkripts, das durch die in SEQ ID Nr. 7 dargestellte cDNA-Sequenz codiert wird, wobei das Produkt N- und C-terminale Verlängerungen des in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Proteins einschließt.
Isolierung von interzellulärer Waschflüssigkeit
IWF wird aus 500 bis 700 g Zuckerrübenblättern durch deren Eintauchen in 20 mM HAc (pH 4,5) isoliert. Die so eingetauchten Blätter werden dann in einen Exsikkator gegeben und für 5 min bei 4 Torr (max) getränkt. Im Anschluß an Lufttrocknung der Blattoberfläche wird die IWF durch Zentrifugieren bei 500 g für 15 min in 500 ml-Zentrifugenröhrchen aufgefangen.
Kationenaustauscherchromatographie Die so erhaltene IWF wird durch Kationenaustauscherchromatographie an einer 10 ml CM-Sepharosesäule (Pharmacia LKB), die in Ausgangspuffer (20 mM HAc (pH 4,5)) voräquilibriert wurde, fraktioniert. Die Fraktionierung wird bei 4°C mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/h durchgeführt. Fraktionen von 3 ml werden aufgefangen. Nicht an die Säule gebundene Proteine werden durch umfassendes Spülen der Säule mit Ausgangspuffer entfernt. Gebundene Proteine werden durch Aufbringen von weiterem Ausgangspuffer auf die Säule eluiert, was das schrittweise Erhöhen der Salzkonzentrationen umfaßt: nämlich 0,1 M NaCl, 0,3 M NaCl und 0,5 M NaCl. Die Extinktion bei 280 nm des Eluats wird gemessen, und Fraktionen, die als proteinhaltig beurteilt werden, werden auf ihre Antipilz-Aktivität gegen C. beticola unter Verwendung des zuvor beschriebenen Mikrotiterplatten-Bioassays getestet (PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/DK92/00108, Veröffentlichungs-Nr. WO 92/17591, jetzt umgeschrieben auf Sandoz LTD).
Ein typisches Elutionsprofil ist in 1 gezeigt. Die Eluate, die aus der Aufbringung von Ausgangspuffer, der 0,3 M NaCl und 0,1 M NaCl umfaßt, auf die Säule resultieren, werden weiter wie nachfolgend beschrieben gereinigt.
Reinigung von Antipilz-Proteinen im 0,3 M NaCl-Eluat aus der CM-Sepharose-FPLC-Chromatographie Die 0,3 M NaCl-Proteinfraktion wird durch Übernachtdialyse (MG-Grenze: 3 kDa) gegen 20 mM HAC (pH 4,5) bei 4°C entsalzt. Betain wird in einer Konzentration von 5% (G/V) zur so dialysierten Proteinfraktion hinzugegeben. 4 ml der resultierenden Lösung werden dann durch Kationenaustausch-"fast protein liquid chromatography" (FPLC) unter Verwendung einer Mono S HR 5/5-Säule (Pharmacia LKB), die in 20 mM HAc (pH 4,5), das 5% (G/V) Betain enthält (A-Puffer), äquilibriert wurde, fraktioniert. Gebundene Proteine werden mit einem linearen Salzgradienten von 0 zu 0,3 M NaCl in 30 ml des A-Puffers, gefolgt von einer stufenweisen Elution mit 1,0 M NaCl im gleichen Puffer eluiert. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 1 ml/min.
2 zeigt, daß die 0,3 M-NaCl-Fraktion eine Anzahl ausgeprägter Proteine enthält, deren quantitativ am meisten bedeutende als Peaks 1 bis 5 bezeichnet werden. Bei Trennung durch SDS-PAGE unter Verwendung des Phast System (Pharmacia LKB) zeigen silbergefärbte Phast-Geltrennungen oder High Density-Geltrennungen mit einem Gradienten von 10 bis 15% (Pharmacia LKB), daß jeder der Peaks 1-5 2 bis 5 Proteinbanden enthält.
Umkehrphasen-HPLC
Der Protein-Peak 3 (dargestellt in 2) aus der Mono S-Säule wird weiter durch Umkehrphasen-(RP-)-HPLC an einer Vydac C4-Kieselerdesäure (The Separations Group, CA, USA) gereinigt. Das Lösungsmittelsystem ist A: 0,1% TFA in Wasser und B: 0,1% TFR in Acetonitril. Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 5 zu 45% des B-Puffers, aufgetragen in 18 min nach der Probenauftragung, gefolgt von 60% B-Puffer in 2 min eluiert. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,7 ml/min. Protein wird durch Überwachung der Extinktion des Eluats bei 214 und 280 nm nachgewiesen. Diskrete Protein-Peaks werden aufgefangen und lyophilisiert. Die so lyophilisierten Proteine werden zweimal mit Wasser gewaschen, erneut lyophilisiert und anschließend in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) vor der Analyse auf Reinheit und Antipilz-Aktivität gelöst.
3 zeigt, daß Peak 3 aus 2 in vier Peaks (bezeichnet als 3.1–3.4 in 3) an der RP-Säule getrennt wird. SDS-PAGE der Peaks 3.1-3.4 zeigt, daß jeder aus reinen Proteinen mit einem Molekulargewicht von ca. 7 kDa (Peaks 3.1, 3.2 und 3.3) und 2.5-3 kD (3.4) zusammengesetzt ist.
Reinigung von Antipilz-Proteinen im 0,1 M NaCl-Eluat aus der CM-Sepharose 5 ml des 0,1 M NaCl-Eluats aus 1 werden durch Gelfiltration an einer 370 ml Sephadex G-75-Säule (Pharmacia LKB), die in 50 mM MES (pH 6,0) äquilibriert wurde, mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h fraktioniert. Fraktionen von 10 ml werden aufgefangen. Solche Fraktionen werden anschließend in sechs größeren Fraktionen gesammelt, I-VI, die jeweils ca. 50 ml enthalten (5).
Kationenaustausch (Mono S) Sammlung V (gezeigt in 5) aus der Sephadex G-75-Säule wird auf eine Mono S FPLC-Säule geladen, die in Puffer A: 50 mM MES (pH 6,0), der 5% Betain (G/V) enthält, äquilibriert wurde. Nach Spülen mit dem A-Puffer werden gebundene Proteine mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in 30 ml des A-Puffers eluiert (6). wenn das durch Peaks 1 und 2 dargestellte Protein der SDS-Gelelektrophorese in Gegenwart von DTT unterworfen wird, werden zwei ausgeprägte Banden beobachtet. Die erste Bande hat ein Molekulargewicht zwischen 2,5 und 3 kDa, und die zweite Bande, die ein nicht-reduziertes Dimer des Proteins der ersten Bande darstellt, hat ein Molekulargewicht von ca. 5 kDa.
Identifizierung von Antipilz-Proteinen
Antipilz-Aktivität
4 und 7-9 zeigen, daß die durch Peaks 3.1 und 3.2 (SEQ ID Nrn. 1 bzw. 2) in 3 und Peaks 1 und 2 (SEQ ID Nr. 3) in 6 dargestellten Proteine eine signifikante Antipilz-Aktivität u.a. gegen C. beticola haben. Die Hemmung des Pilzwachstums wird in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 620 nm im wesentlichen wie in WO 92/17591 beschrieben gemessen. 9 zeigt, daß mit solchem Protein behandelte C. beticola verkrüppelte Hyphen besitzt, die im Vergleich zu denjenigen von Pilz, der in Abwesenheit der antimikrobiellen Proteine gezüchtet wurde (9A, 9B), verdickt und verzweigter sind (9C, 9D).
Die Proteine, entweder allein oder in Kombination mit WIN N (das aus Gerstenkorn oder gestreßtem Gerstenblatt wie von Hejgaard et al. beschrieben gereinigt wird (FEBS Letters, 307, 389–392 (1992)), und/oder ein Protein mit einer Sequenz, die wenigstens einem der in SEQ ID Nrn. 4–6 angegebenen entspricht, werden mit Sporen von C. beticola inkubiert. Die Testmischung (240 μl) enthält 100 μl Kartoffeldextrosebouillon (Difco), 40 μl Proteinprobe (oder Pufferkontrolle) in 100 mM Tris und 20 mM NaCl (pH 8,0) sowie ca. 400 Sporen in 100 μl Wasser. Die Mikrotiterplatten werden mit Folie versiegelt, um Verdampfung und Verunreinigung zu verhindern, und anschließend bei Raumtemperatur auf einem mit 200 U/min betriebenen Schüttler inkubiert. Die Extinktion bei 620 nm wird jeden Tag für 8 Tage gemessen und für jede Proteinkonzentration gegen die Zeit aufgetragen.
Aminosäuresequenzierung
Die den Peaks 3.1 und 3.2 in 3 entsprechenden gereinigten Antipilz-Proteine (SEQ ID Nrn. 1 bzw. 2), die aus dem 0,3 M NaCl-Eluat aus der CM-Sepharose-Säule stammen (1); und Protein, das Peaks 1 und 2 in 6 entspricht (SEQ ID Nr. 3), das aus dem 0,1 M NaCl-Eluat aus der CM-Separose-Säule stammt, werden carboxymethyliert und der RP-HPLC an einer Vydac C4-Säule unterworfen. Das Lösungsmittelsystem ist A: 0,1% TFA in Wasser und B: 0,1% TFA in Acetonitril. Die Proteine eluieren als einzelne Peaks mit geringfügig unterschiedlichen Retentionszeiten. Die C-terminalen Sequenzen der Proteine werden durch deren Spaltung mit endo-R-Proteinase und anschließende Reinigung durch RP-HPLC an einer Vydac C₁₈-Säule erhalten.
Herstellung von transformierten Pflanzen
Die Gene, die erfindungsgemäße Proteine codieren, werden in Pflanzen eingefügt. Auf Basis von genspezifischen Primern werden die codierenden Regionen der Gene, die die Proteine codieren, aus entsprechender mRNA unter Verwendung von PCR synthetisiert. Nach Addition von Promotor- und Terminatorsequenzen werden die Gene, die die Proteine codieren, in einen Pflanzentransformationsvektor eingeführt. Der Vektor kann gegebenenfalls ein Gen, das ein WIN-Protein codiert, wie dasjenige, das aus gestreßtem Gerstenblatt oder Gerstenkorn erhalten wird, und/oder ein Gen, das ein in SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und/oder SEQ ID Nr. 6 dargestelltes Protein codiert, und/oder ein Gen einschließen, das eine Chitinase und/oder eine Glucanase codiert. Die bevorzugte Chitinase ist die in der PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/DK92/00108 (Veröffentlichungs-Nr. WO 92/17591) beschriebene Chitinase 4. Agrobacterium tumefaciens kann z.B. mit diesen Vektoren transformiert werden. Pflanzenzellen werden dann mit solchem transformierten Agrobacterium behandelt, und die so transformierten Pflanzenzellen werden zu ganzen Pflanzen regeneriert, in denen das neue Kernmaterial stabil im Genom eingebaut ist. Man wird jedoch einsehen, daß die DNA, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert (oder eine Kombination solcher Proteine), und die gegebenenfalls weiterhin andere Proteine codiert, in Pflanzenzellen durch andere bekannte Verfahren eingefügt werden kann, einschließlich der Verwendung einer Mikroprojektilkanone, Elektroporation, Elektrotransformation und Mikroinjektion etc., und daß die Regeneration von transformierten Pflanzenzellen gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt wird, einschließlich der Behandlung der Zellen mit Cytokinen, wo dies erforderlich oder wünschenswert ist, um die Regenerationshäufigkeit zu verbessern.
Außerdem können geeignete Mikroorganismen (d.h. diejenigen, in denen die Produktion der erfindungsgemäßen Proteine im wesentlichen nicht toxisch ist) mit einem Vektor transformiert werden, der das Gen (oder die Gene), das das Protein codiert, transformiert werden, so daß die transformierten Mikroorganismen solches Protein erzeugen. Die Mikroorganismen können ferner die Gene umfassen, die andere Proteine codieren, wie ein WIN-Protein und/oder ein Protein, dessen Sequenz in einer oder mehreren der SEQ IDs Nrn. 4–6 dargestellt wird. Außerdem können solche anderen Proteine ferner verschiedene Chitinasen und/oder Glucanasen umfassen. Ein solches besonders bevorzugtes anderes Protein ist die wie in PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/DK92/00108 (Veröffentlichungs-Nr. WO 92/17591) beschriebene Chitinase 4.
Diese Mikroorganismen können dann zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenen verwendet werden. Z.B. können die transformierten Mikroorganismen getrocknet und auf infizierte Pflanzen oder einem Infektionsrisiko ausgesetzten Pflanzen aufgesprüht werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antimikrobielles Protein, das ein Peptid mit der folgenden Aminosequenz umfasst: AA₁-AA₂-AA₃-Cys-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-AA₉-Cys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-Cys-Cys-AA₁₇-AA₁₈-AA₁₉-AA₂₀-AA₂₁-Cys-AA₂₃-AA₂₄-AA₂₅-AA₂₆-AA₂₇-AA₂₈-Cys-AA₃₀, worin "AA" eine beliebige der üblicherweise gefundenen 20 Aminosäuren bezeichnet.
Antimikrobielles Protein gemäss Anspruch 1, worin AA₇ Tyr ist; AA₁₄ Tyr ist; und AA₁₈ Lys ist.
Antimikrobielles Protein gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, worin AA₂₄ Val ist; AA₂₆ Arg ist; und AA₂₇ Ala ist.
Antimikrobielles Protein, das aus der in einer der SEQ ID Nrn. 1–3 dargestellten Sequenz besteht.
Reine Proteine gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit wenigstens einem Protein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den in SEQ ID Nrn. 4–6 dargestellten besteht, und/oder wenigstens einem weiteren Protein mit Herbizidresistenz-, pflanzenwachstumsfördernden, Antipilz-, antibakteriellen, antiviralen und/oder Antinematoden-Eigenschaften.
Rekombinante DNA, die eine Sequenz umfasst, die ein Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert, oder rekombinante DNA mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Sequenz.
Rekombinante DNA-Sequenz gemäss Anspruch 6, die ferner eine Sequenz umfasst, die wenigstens eines der in SEQ ID Nrn. 4–6 dargestellten Proteine codiert, und/oder die ferner ein Protein mit Herbizidresistenz-, pflanzenwachstumsfördernden, Antipilz-, antibakteriellen, antiviralen und/oder Antinematoden-Eigenschaften codiert.
Rekombinante DNA gemäss einem der Ansprüche 6 oder 7, die modifiziert ist, indem bekannte mRNA-Instabilitätsmotive oder Polyadenylierungssignale entfernt sind und/oder Codonen, die vom Organismus bevorzugt werden, in den die rekombinante DNA eingefügt werden soll, verwendet werden, so dass die Expression der so modifizierten DNA im Organismus ein Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 liefert.
Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 6 bis 8 enthält, wobei die Sequenz in Pflanzen exprimierbar ist und an einen in einer Pflanze funktionsfähigen Promotor und Terminator gebunden ist.
Antimikrobielle Zusammensetzung, die eines oder mehrere der Proteine gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen in Pflanzen, welches das In-Kontakt-Bringen der Pilze mit Proteinen oder Zusammensetzungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 und 10 umfasst.