HU223367B1 - Antimikrobiális proteinek - Google Patents

Antimikrobiális proteinek Download PDF

Info

Publication number
HU223367B1
HU223367B1 HU9601040A HU9601040A HU223367B1 HU 223367 B1 HU223367 B1 HU 223367B1 HU 9601040 A HU9601040 A HU 9601040A HU 9601040 A HU9601040 A HU 9601040A HU 223367 B1 HU223367 B1 HU 223367B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
proteins
seq
cys
int
Prior art date
Application number
HU9601040A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT74395A (en
HU9601040D0 (en
Inventor
Karsten Matthias Kragh
Jorn Dalgaard Mikkelsen
Klaus Kristian Nielsen
Original Assignee
Syngenta Participations Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Participations Ag filed Critical Syngenta Participations Ag
Publication of HU9601040D0 publication Critical patent/HU9601040D0/hu
Publication of HUT74395A publication Critical patent/HUT74395A/hu
Publication of HU223367B1 publication Critical patent/HU223367B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

A találmány tárgya antimikrobiális protein, amely az 1–3. számúszekvenciák bármelyikével rendelkezik. A találmány további tárgya azilyen proteineket kódoló rekombináns DNS; az ilyen, növényekbenexpresszálható és növényben működőképes promoterhez és terminátorhozkapcsolódó DNS-t tartalmazó vektor; az ilyen rekombináns DNS-seltranszformált növények; valamint a DNS-t stabilan genomjukbaintegrálódva és mendeli módon örökölhetően tartalmazó transzformáltnövények és növényi sejtek. ŕ

Description

KIVONAT
A találmány tárgya antimikrobiális protein, amely az 1-3. számú szekvenciák bármelyikével rendelkezik. A találmány további tárgya az ilyen proteineket kódoló rekombináns DNS; az ilyen, növényekben expresszálható és növényben működőképes promoterhez és terminátorhoz kapcsolódó DNS-t tartalmazó vektor; az ilyen rekombináns DNS-sel transzformált növények; valamint a DNS-t stabilan genomjukba integrálódva és mendeli módon örökölhetően tartalmazó transzformált növények és növényi sejtek.
A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 9 lap ábra)
HU 223 367 B1
HU 223 367 Β1
A találmány tárgya cukorrépából izolálható antimikrobiális proteinek, melyek az alábbi aminosavszekvenciával rendelkeznek: AA!-AA2-AA3-Cys-AA5-AA6AA7-AA8-AA^-Cy s-A A 3 j - AA j 2-AAj 3-AA 14-Cys-CysAA]7-AAi8-AAj9-AA2o-AA2i-Cys23-AA24-AA25AA26-AA27-AA28-Cys-AA30, ahol „AA” jelentése az általánosan előforduló 20 aminosav bármelyike. Előnyös, ha AA7 és AA14 jelentése tirozin és AA18 jelentése lizin. Még előnyösebb, ha AA24 jelentése valin, AA26 jelentése arginin és AA27 jelentése alanin.
Az antimikrobiális protein olyan protein (önmagában vagy más anyagokkal kombinációban), amely mindenféle körülmények között bármilyen mikroorganizmusra - beleértve a baktériumokat (leginkább a Grampozitív baktériumokat), vírusokat és különösen a gombákat - toxikus vagy növekedést gátló hatású. Az ilyen antimikrobiális proteinek közé tartoznak azok, amelyek a mikroorganizmussal való érintkezés folytán fejtenek ki antimikrobiális aktivitást, továbbá azok, amelyek a mikroorganizmusok asszimilációja és respirációja következtében antimikrobiális hatásúak.
A találmány további tárgya az 1 - 3. számú szekvenciák bármelyikével rendelkező antimikrobiális protein.
A találmány további tárgya tiszta protein, amely lényegében hasonló a fentebb említett proteinek valamelyikéhez.
A „lényegében hasonló” kifejezés olyan tiszta proteinekre vonatkozik, amelyek a találmány szerinti proteinek aminosavszekvenciájával legalább 85%-os azonosságot mutatnak. Előnyös, ha az azonosság mértéke 90%, még előnyösebb, ha az azonosság legalább 95%-os.
A találmány fenti értelmében, két aminosavszekvencia, amelyek egymással legalább 85%-os, 90%-os, illetve 95%-os azonosságot mutatnak, optimálisan egymás alá rendezve (allignment; legfeljebb két hézagot megengedve, azzal a kikötéssel, hogy az egyes hézagok összesen legfeljebb három aminosavgyököt érinthetnek) azonos helyeken legalább 85%-ban, 90%-ban, illetve 95%-ban azonos vagy konzervatívan helyettesített aminosavgyökökkel rendelkeznek. Az 1. és 2. számú szekvenciával rendelkező proteinek esetében a hézagok száma 4-ig növelhető, azzal a kikötéssel, hogy az egyes hézagok összesen legfeljebb öt aminosavgyököt érinthetnek.
A találmány céljainak megfelelően, konzervatív helyettesítések az alábbi csoportokba tartozó aminosavak között végezhetők:
(i) szerin és treonin;
(ii) glutaminsav és aszparaginsav;
(iii) arginin és lizin;
(iv) aszparagin és glutamin;
(v) izoleucin, leucin, valin és metionin;
(vi) fenil-alanin, tirozin és triptofán;
(vii) alanin és glicin.
A találmány további tárgya tiszta proteinek, amelyek legalább 90%-ban azonosak a találmány szerinti antimikrobiális proteinekkel, valamint olyan tiszta proteinek, amelyek a találmány szerinti antimikrobiális proteinek specifikus aktivitásának legalább 90%-ával rendelkeznek. A találmány értelmében a specifikus aktivitás egy adott protein meghatározott mennyiségének egy adott mikroorganizmus meghatározott mennyiségének növekedésére és szaporodására gyakorolt gátlásának mérőszáma.
A találmány további tárgya az említett tiszta proteinek 4-6. számú szekvenciával rendelkező proteinek legalább egyikével alkotott kombinációja. Az ilyen kombinált proteinek az ismert patogenezissel kapcsolatos (PR) proteinek közül eggyel vagy többel továbbkombinálhatók. A növények gomba- vagy víruspatogénekkel történő fertőzése a vegetatív szövetekben körülbelül 10 homológ, patogenezissel kapcsolatos proteincsalád (PR proteinek) szisztémás szintézisét indukálhatja. A PR proteineket 5 csoportba sorolják. A PR2, PR-3, illetve PR-5 proteinek a P-l,3-glükanáz, a kitinázok, illetve a taumatinszerű proteinek. A PR-1 és PR-4 csoport esetében nem határoztak meg specifikus működést. A PR-4 proteinek hasonlóak a prohevein és a burgonya feltételezett sérülés indukálta WIN proteinjeinek C-terminális doménjéhez, így az N-terminális heveindomén hiányzik belőlük. A találmány szerinti proteineket előnyösen egy vagy több olyan proteinnel kombináljuk, amelyek a PR-4 proteincsoport bázikus párjai, vagyis amelyek a prohevein és a burgonya feltételezett sérülés indukálta WIN proteinjeinek C-terminális doménjéhez hasonlóak. Különösen előnyös, ha az említett, patogenezissel kapcsolatos proteinek bázikus páija egy kitinkötő WIN protein, elsősorban amelyet árpaszem vagy stresszhatásnak kitett árpa levelei termelnek.
A találmány további tárgya rekombináns DNS, amely a fentebb említett antimikrobiális proteinek aminosavszekvenciájával rendelkező proteint kódol. Közelebbről, a DNS legalább egy olyan proteint kódol, amelynek aminosavszekvenciája megegyezik az 1-3. számú szekvenciák valamelyikével, s adott esetben legalább egy olyan proteint is kódol, amelynek aminosavszekvenciája megegyezik a 4-6. számú szekvenciák valamelyikével. A rekombináns protein ezenkívül kódolhat herbicidrezisztenciával, illetve növénynövekedést elősegítő, gombaellenes, antibakteriális, antivirális és/vagy fonalféreg-ellenes tulajdonsággal rendelkező proteint is. Amennyiben a DNS-t idegen (heterológ) organizmusba kívánjuk bevinni, a DNS-t az ismert mRNS instabilitási motívumok (például A és T bázisokban gazdag régiók) és a poliadenilációs jelek (ha vannak egyáltalán) eltávolításával módosíthatjuk, és/vagy nukleotidszekvenciájába olyan kodonokat inszertálhatunk, amelyek abban az organizmusban, amelybe a rekombináns DNS-t be akaijuk juttatni, előnyösek. E módosítások révén az említett idegen organizmusban a módosított DNS expressziója lényegében hasonló proteint eredményez, mint amit a módosítatlan rekombináns DNS expressziójával abban az organizmusban kapunk, amelyben a találmány szerinti antimikrobiális protein endogénnek számít.
A találmány további tárgya rekombináns DNS, amely a fentebb leírt DNS-hez „hasonló”. A „hasonló DNS” kifejezésen olyan szekvenciát értünk, amely a találmány szerinti rekombináns szekvenciához hibridizál2
HU 223 367 Β1 ni képes tesztelőszekvenciával komplementer. Amennyiben a tesztelő- és a találmány szerinti szekvenciák kétszálúak, a tesztelőszekvenciát alkotó nukleinsav TMértéke előnyösen 20 °C-kal tér el a találmány szerinti szekvencia TM-értékétől. Amennyiben a tesztelő- és a találmány szerinti szekvenciákat összekeveqük, és egyszerre denaturáljuk, a szekvenciák TM-értéke előnyösen 10 °C-kal tér el egymástól. A hibridizációt előnyösebben szigorú (stringent) körülmények között végezzük, melynek során előnyösen mind a tesztelő-, mind a találmány szerinti denaturált szekvenciát először hordozóhoz kapcsoljuk, és a hibridizációt 0,1% SDS-t tartalmazó kétszeres erősségű citrátpufferelt sóoldatban (SSC) 50-70 °C-on meghatározott ideig végezzük, majd a hordozót csökkentett SSC-koncentrációjú pufferben, azonos hőmérsékleten öblítjük. A körülmények szükséges „szigorúságának” mértékétől (és ennélfogva a szekvenciák hasonlóságától) függően a csökkentett koncentrációjú puffer rendszerint 0,1% SDS-t tartalmazó egyszeres erősségű SSC, 0,1% SDS-t tartalmazó feles erősségű SSC és 0,1% SDS-t tartalmazó egytized erősségű SSC. Azok a legnagyobb mértékű hasonlóságot mutató szekvenciák, amelyek hibridizációját legkevésbé befolyásolja a csökkentett koncentrációjú pufferekben végzett mosás. Legelőnyösebb, ha a tesztelő- és találmány szerinti szekvenciák olyan mértékben hasonlóak, hogy hibridizációjukat lényegében nem befolyásolja a 0,1% SDS-t tartalmazó, egytized erősségű nátriumcitrát-pufferben végzett mosás vagy inkubálás.
A találmány további tárgya olyan DNS-szekvencia, amely a találmány szerinti rekombináns DNS-sel szigorú körülmények között hibridizáló DNS-szekvenciával komplementer.
A találmány további tárgyai: vektor, amely a fentebb leírt, növényekben expresszálható és a növény működőképes promoteréhez és terminátorához kapcsolódó DNS-t tartalmazza; az ilyen DNS-sel transzformált növények; a DNS-t genomjukban stabilan integrálódva és mendeli módon örökölhetően tartalmazó transzformáit növények, valamint növényi sejtek. A transzformáit növényeket ismert eljárásokkal állítjuk elő, melyek során a találmány szerinti DNS-sel az ismert módszerek valamelyikének (Agrobacterium Ti- és Ri-plazmidok alkalmazása, elektroporáció, mikroinjektálás, mikrolövedékes bombázás stb.) alkalmazásával transzformáit növényi sejtekből vagy protoplasztokból teljes növényt regenerálunk. A transzformált sejt kedvező esetben olyan teljes növénnyé regenerálható, amelyben a bevitt DNS stabilan beépült a növény genomjába. Ezzel a módszerrel egyszikű és kétszikű növények egyaránt előállíthatok. A találmány szerinti transzformált növények példái közé tartoznak a gyümölcsök, például paradicsom, mangó, őszibarack, alma, körte, szamóca, banán és dinnye; a szántóföldi terménynövények, mint például canola, napraforgó, dohány, cukorrépa, búza, árpa, rizs, kukorica, gyapot; valamint a zöldségek, mint például a burgonya, sárgarépa, saláta, káposzta és vöröshagyma.
A találmány további tárgya az említett DNS expressziójából származó protein és a rekombináns DNS expressziója által (a DNS-sel transzformált növényben) termelődött antimikrobiális protein.
A találmány további tárgyai: antimikrobiális készítmény, amely egy vagy több, találmány szerinti proteinből áll; eljárás gombafertőzés leküzdésére, melynek során a gombákat a találmány szerinti proteinek hatásának vetjük alá; és eljárás antimikrobiális proteinek szerves anyagokból történő kivonására, melynek során az anyagot - előnyösen mikroorganizmus alakjában - beáztatjuk és oldószeres kivonásnak vetjük alá. Megjegyezzük, hogy az antimikrobiális protein kismértékű (vagy semmilyen) antimikrobiális hatást gyakorol az említett szerves anyag forrásául szolgáló mikroorganizmusra.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán CM-Sepharose oszlopról származó intercelluláris mosófolyadék jellemző elúciós görbéjét mutatjuk be.
A 2. ábrán az 1. ábrán bemutatott 0,3 M NaClkoncentrációval eluált frakció Mono S FPLC oszlopról származó jellemző elúciós görbéje látható.
A 3. ábrán a 2. ábrán 3. csúcsot alkotó proteinek reverz fázisú HPLC-oszlopról származó jellemző elúciós görbéje látható.
A 4. ábrán a 3. ábra 3.1 és 3.2 csúcsát alkotó proteinek (1. számú, illetve 2. számú szekvencia) 10 pg-jának gombaellenes aktivitását mutatjuk be.
Az 5. ábrán az 1. ábrán látható 0,1 M frakció Sephadex G75 oszlopon kapott gélfiltrációs kromatogramja látható.
A 6. ábrán az 5. ábrán látható csúcs (V.) Mono S FPLC oszlopról származó jellemző elúciós görbéjét mutatjuk be.
A 7. ábrán a 6. ábrán látható 1. és 2. csúcsot képviselő protein (3. számú szekvencia) 10 pg-jának gombaellenes aktivitását mutatjuk be.
A 8/A ábrán a 2. és 3. számú szekvenciával rendelkező proteinek 2-2 pg-jának, a 8/B ábrán pedig a 2. és 5. számú szekvenciával rendelkező proteinek 2-2 pg-jának egyesített gombaellenes aktivitását mutatjuk be.
A 9/A és 9/B ábrán a találmány szerinti antimikrobiális proteinek nélkül növesztett C. beticola hifáinak morfológiáját mutatjuk be. A 9/C, illetve 9/D ábrán a 2 pg 2. számú szekvenciájú protein, illetve 2 pg 3. számú szekvenciájú protein jelenlétében 48 óráig növesztett gombák hifái láthatók. A vizsgálatot az alábbiakban leírtak szerint mikrotiterlemezeken végeztük; a 9/A ábra nagyítása 76 x, a 9/B-9/D ábráké pedig 294 x.
A szekvencialistában az 1. számú szekvencia a 3. ábrán látható 3.1 csúcsban megjelenő protein aminosavszekvenciája. A 2. számú szekvencia a 3. ábrán
HU 223 367 Β1 látható 3.2 csúcsban megjelenő protein aminosavszekvenciája. A 3. számú szekvencia a 6. ábrán látható 1. és 2. csúcsban megjelenő protein aminosavszekvenciája. A 4-6. számú szekvenciák három ismert gombaellenes protein aminosavszekvenciáját mutatják be. A 7. számú szekvencia a 3. számú szekvenciával rendelkező proteint kódoló cDNS nukleotidszekvenciája. A 8. számú szekvencia a 7. számú szekvenciával rendelkező cDNS által kódolt transzkriptum transzlációs termékének a szekvenciája, amely az N- és C-terminálisán további aminosavakat tartalmazó, 3. számú szekvenciával rendelkező proteinnel azonos.
Intercelluláris mosófolyadék (IWF) izolálása
500-700 g cukorrépalevélből intercelluláris mosófolyadékot izolálunk oly módon, hogy a leveleket 20 mM koncentrációjú ecetsavba (pH=4,5) merítjük, majd a leveleket szárítószekrénybe helyezzük, és vákuum alatt 5 percig, 5,3 kPa maximális nyomás mellett impregnáljuk. A levelek felületének levegővel végzett szárítása után az intercelluláris mosófolyadékot 500 ml-es centrifugálócsövekben 15 percig 500 xg-vei centrifugálva gyűjtjük össze.
Kationcserélő kromatográfia
A fenti módon kapott intercelluláris mosófolyadékot, előzetesen kiindulási pufferrel (20 mM ecetsav, pH=4,5) ekvilibrált, 10 ml-es CM-Sepharose oszlopon (Pharmacia LKB) kationcserélő kromatográfiával ffakcionáljuk. A frakcionálási 4 °C-on 25 ml/óra átfolyási sebességgel végezzük. 3 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az oszlophoz nem kötődött proteineket az oszlop kiindulási pufferrel végzett erőteljes mosásával távolítjuk el. A kötött proteineket lépcsőzetesen növekvő koncentrációban (0,1 M, 0,3 M és 0,5 M) NaCl-ot tartalmazó kiindulási pufferrel eluáljuk. Az eluátum abszorbanciáját 280 nmnél méljük, és azokat a frakciókat, melyekről úgy ítéljük, hogy tartalmaznak proteineket, korábban leírt mikrotiterlemezes biológiai vizsgálattal (WO 92/17591 nemzetközi közzétételi számú, PCT/DK92/00108 számú szabadalmi bejelentés, jelenleg a Sandoz LTD tulajdona) gombaellenes aktivitásukra teszteljük.
Az 1. ábrán egy jellemző elúciós görbét mutatunk be. A 0,3 M és 0,1 M NaCl-ot tartalmazó kiindulási pufferek felvitelével kapott eluátumokat az alábbiak szerint tovább tisztítjuk.
A CM-Speharose oszlopról származó 0,3 MNaCleluátumban lévő gombaellenes proteinek tisztítása FPLC-kromatográfia
A 0,3 M NaCl-frakciót 4 °C-on 20 mM ecetsavval (pH=4,5) szemben egy éjszakán át dializálva sómentesítjük. A dializált proteinfrakcióhoz 5 m/V % koncentrációban betaint adunk. A kapott oldat 4 ml-ét 5 m/V % betaint tartalmazó 20 mM ecetsavval (pH=4,5) (A puffer) ekvilibrált Mono S HR 5/5 oszlop (Pharmacia LKB) alkalmazásával kationcserélő FPLC-kromatográfiával frakcionáljuk. A kötött proteineket 30 ml A pufferben lineáris NaCl-gradienssel (0 M-tól 0,3 M-ig) eluáljuk, majd ugyanazon pufferben 1,0 M NaCl-koncentrációval egylépéses elúciót végzünk (az átfolyási sebesség 1 ml/perc).
A 2. ábrán látható, hogy a 0,3 M NaCl-frakciók számos különálló proteint tartalmaznak, melyek közül a legnagyobb mennyiségben jelen levőket 1-től 5-ig jelöljük (csúcsok). A csúcsoknak megfelelő frakciókat Phast System (Pharmacia LKB) alkalmazásával SDS-PAGE analízissel elkülönítve az ezüstfestésű 10-15% gradiens Phast géleken vagy High Density géleken (Pharmacia LKB) azt látjuk, hogy az 1-5. csúcsok mindegyike 2-5 proteinsávot tartalmaz.
Reverz fázisú HPLC
A Mono S oszlopról származó (2. ábrán látható) 3. proteincsúcsot Vydac C4 szilikagél oszlopon (The Separations Group, CA, USA) reverz fázisú HPLC-vei tovább tisztítjuk. Oldószerrendszerként 0,1%-os vizes TFA-t („A” puffer) és 0,1%-os acetonitriles TFA-t (,3” puffer) alkalmazunk. A proteineket a minta felvitele után 18 percig 5%->45% B puffer lineáris gradienssel, majd 2 percig 60%-os B pufferrel, 0,7 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A proteint az eluátum abszorbanciáját 214 nm-nél és 280 nm-nél mérve mutatjuk ki. Az elkülöníthető proteincsúcsokat összegyűjtjük és liofilizáljuk. A liofilizált proteineket vízben kétszer mossuk, újraliofilizáljuk, majd 10 mM Tris-HCl-pufferben (pH=8,0) ismét feloldjuk, és vizsgáljuk tisztaságukat és gombaellenes aktivitásukat.
A 3. ábrán látható, hogy a 2. ábrán bemutatott kromatogramból származó 2. csúcsot négy csúcsra különítettük el (a 3. ábrán 3.1-3.4 csúcsok). A 3.1-3.4 csúcsok SDS-PAGE analízise azt mutatja, hogy mindegyik csúcs tiszta proteinekből áll, melyek molekulatömege 7 kD (3.1, 3.2 és 3.3 csúcs), illetve 2,5-3 kD (3.4 csúcs).
A CM-Sepharose oszlopról származó 0,1 MNaCleluátumban lévő gombaellenes proteinek tisztítása Az 1. ábrán látható 0,1 M NaCl-eluátum 5 ml-ét mM MES-pufferrel (pH=6,0) ekvilibrált 370 ml Sephadex G-75 oszlopon (Pharmacia LKB) 20 ml/óra átfolyási sebességgel frakcionáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, melyeket hat nagyobb, egyenként kb. 50 mles frakcióban egyesítjük (5. ábra, I-VI.).
Kationcserélő kromatográfia (Mono S oszlop)
A Sephadex G-75 oszlopról származó V. egyesített frakciót (5. ábra) 5 m/V% betaint tartalmazó 50 mM MES (pH=6,0) pufferrel (A puffer) ekvilibrált Mono S FPLC oszlopra töltjük. Az oszlop A pufferrel végzett mosása után a kötött proteineket 30 ml A pufferben 0 M—>0,5 M lineáris NaCl-gradienssel, 1 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk (6. ábra). Az 1. és 2. csúcsokban lévő proteineket DTT jelenlétében SDS-gélelektroforézissel analizálva két elkülöníthető sáv figyelhető meg. Az első sáv molekulatömege 2,5-3 kD, a második sávé (amely az első sáv proteinjének redukálatlan dimere) pedig 5 kD.
Gombaellenes proteinek azonosítása
Gombaellenes aktivitás
A 4., 7., 8. és 9. ábrán látható, hogy a 3. ábrán a 3.1 és 3.2 csúcsoknak megfelelő proteinek (1. számú szekvencia, illetve 2. számú szekvencia), valamint a
6. ábrán az 1. és 2. csúcsoknak megfelelő protein (3. számú szekvencia) jelentős gombaellenes aktivitással rendelkeznek, többek között a C. beticola ellen. A gombanövekedés gátlását 96 üregű mikrotiterlemezeken
HU 223 367 Β1
620 nm-nél mérjük, lényegében a WO 92/17591 közzétételi számú bejelentésben leírtak szerint. A 9. ábrán látható, hogy az ilyen proteinekkel kezelt C. beticola elsatnyult hifákkal rendelkezik, melyek vastagabbak és elágazóbbak (9/C és 9/D ábra), mint a gombaellenes proteinek nélkül növesztett gombák hifái (9/A és 9/B ábra).
A proteineket önmagukban vagy WIN N proteinnel [melyet Hejgaard és munkatársai (FEBS Letters, 307, 389-392,1992) által leírt módon árpaszemből és stresszhatásnak kitett árpalevélből tisztítottunk] és/vagy a 4-6. számú szekvenciák legalább egyikének megfelelő szekvenciával rendelkező proteinnel kombinációban C. beticola spóráival inkubáljuk. A vizsgálati elegy (240 μΐ) 100 mM Tris és 20 mM NaCl elegyében (pH=8,0) 100 μΐ burgonyadextróz táplevest (Difco) és 40 μΐ proteinmintát (vagy pufferkontrollt), valamint 100 μΐ vízben kb. 400 spórát tartalmaz. A mikrotiterlemezeket a párolgás és szennyeződés elkerülése érdekében szigetelőszalaggal lezáquk, és szobahőmérsékleten 200-as percenkénti fordulattal inkubáljuk. Az abszorbanciát 620 nm-nél 8 napon keresztül naponta mérjük, és a protein koncentrációját az idő függvényében ábrázoljuk.
Aminosavszekvenálás
A CM-Sepharose oszlop 0,3 M NaCl eluátumából származó (1. ábra) 3.1 és 3.2 csúcsoknak (3. ábra) megfelelő tisztított, gombaellenes proteinek (1. számú szekvencia, illetve 2. számú szekvencia), és a CM-Sepharose oszlop 0,1 M NaCl eluátumából származó 1. és
2. csúcsoknak (6. ábra) megfelelő proteint karboxi-metiláljuk, és Vydac C4 oszlopon reverz fázisú HPLC-nek vetjük alá. Oldószerrendszerként 0,1%-os vizes TFA-t (A puffer) és 0,1%-os acetonitriles TFA-t (B puffer) alkalmazunk. A proteinek némileg eltérő retenciós időkkel, különálló csúcsokként eluálódtak. A proteinek Cterminális szekvenciáit endo-R-proteinázzal végzett hasítással és Vydac C18 oszlopon reverz fázisú HPLC-vel végzett tisztítással kapjuk.
Transzformált növények előállítása
A találmány szerinti proteineket kódoló géneket növényekbe visszük be. A proteineket kódoló gének kódolórégióit (génsepcifikus primerek alapján) a megfelelő mRNS-ből PCR-technikával szintetizáljuk. A promoter- és terminátorszekvenciák hozzáadása után az említett proteineket kódoló géneket növényi transzformációs vektorokba építjük be. A vektor adott esetben tartalmazhat (árpalevélből vagy árpaszemből származó) WIN proteint kódoló gént és/vagy a 4. számú, 5. számú és/vagy 6. számú szekvenciával rendelkező proteint kódoló gént, és/vagy kitinázt és/vagy glükanázt kódoló gént is. Az előnyös kitináz a PCT/DK92/00108 számú szabadalmi bejelentésben (WO 92/17591) leírt kitináz 4. Ezekkel a vektorokkal például Agrobacterium tumefacienst transzformálhatunk. Ezután a növényi sejteket transzformált Agrobacteriummat kezeljük, és az így transzformált növényi sejteket teljes növénnyé regeneráljuk, melyekben az új genetikai anyag stabilan beépült a növény genomjába. Tudni kell azonban, hogy a találmány szerinti proteint vagy ilyen proteinek kombinációját, és adott esetben egyéb proteineket is kódoló DNS egyéb ismert módszerekkel is bevihető a növényi sejtekbe, például mikrolövedékes bombázással, elektroporációval, elektrotranszformációval, mikroinjektálással stb., és a transzformált növényi sejtet a szakember számára ismert eljárásokkal regeneráljuk, például ha a regenerációs gyakoriság növelése érdekében szükséges, citokinekkel végzett kezeléssel.
A találmány szerinti proteint kódoló gént (vagy géneket) tartalmazó vektorral olyan alkalmas mikroorganizmusokat is transzformálhatunk, amelyekben a találmány szerinti proteinek nem különösebben toxikusak, hogy a transzformált mikroorganizmusok az adott proteineket termeljék. A mikroorganizmusok tartalmazhatnak egyéb proteineket kódoló géneket is, például a WIN proteint és/vagy a 4., 5. vagy 6. számú szekvenciák közül eggyel vagy többel megegyező szekvenciájú proteint kódoló géneket. Az ilyen egyéb proteinek közé tartoznak a különböző kitinázok és/vagy glükanázok is. Egy különösen előnyös egyéb protein a kitináz 4 (lásd PCT/DK92/00108 számú szabadalmi bejelentés, WO 92/17591).
A transzformált mikroorganizmusok a növénypatogének elleni küzdelemben alkalmazhatók. Például a transzformált mikroorganizmusokat megszárítva fertőzött (vagy fertőzés veszélyének kitett) növényekre permetezhetjük.
SZEKVENCIALISTA
SZEKVENCIÁK SZÁMA: 8
TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 91 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Béta vulgáris (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA
Ile Thr Cys Gly Leu Va1 Alá Ser Lys Leu Alá Pro Cys I le Gly Tyr 15 10 15
HU 223 367 Β1
Leu Gin
Gly Leu
Thr Cys 50
Lys Alá 65 e Ser
Gly A1 a 20
Asn 35 Ser
Leu Lys
A1 a Ser
Pro Asn
Pro Gly
Alá Alá
Ser Alá
Leu Pro 70
Thr Asn 85
Pro Ser
Alá Ser 40
Alá Thr 55
Arg Gin
Cys Asn
Alá Gly 25
Pro Alá
Ser 11 e
Cys Gly
Alá 11 e 90
Cys Cys
Asp Arg
Lys Gly 60
Val Ser 75
Hi s
Gly Gly 30
Lys Thr 45
I le Asn
Val Pro
I 1 e Lys
Alá Cys
Tyr Gly
Tyr Alá
TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 91 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS :
(A) ORGANIZMUS: Béta vulgáris (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA
I le Thr Cys Gly Leu Val Alá Ser Lys Leu
Leu Gin
Gly Leu
Thr Cys 50
Lys Alá 65 e Ser
Gly Alá 20
Asn Ser 35
Leu Lys
Alá Ser
Pro Asn
Pro Gly
Alá Alá
Ser Alá
Leu Pro 70
Thr Asn 85
Pro Ser
Alá Ser 40
Alá Thr 55
Arg Gin
Cys Asn
Alá Gly 25
Pro Alá
Ser Me t
Cys Gly
Alá 11 e 90
Alá Pro
Cys Cys
Asp Arg
Lys Gly 60
Val Ser 75
Hi s
Cys 11 e
Gly Gly 30
Lys Thr 45 e Asn e Pro
Gly Tyr 15
I1e Lys
Alá Cys
Tyr Gly
Tyr Alá
TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 30aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Béta vulgáris (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA
Ser Gly Glu Cys Asn Me t Tyr Gly Arg Cys 1 5 10
Pro Pro
Gly Tyr
Cys Cys 15
HU 223 367 Β1
Ser Lys Phe
Gly Tyr 20
Cys Gly Va1
Gly
Arg Alá Tyr Cys
Gly
TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 46 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS: Béta vulgáris (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA
Alá 1 I le Cys Lys Lys 5 Pro Ser Lys Phe Phe 10 Lys Gly Alá Cys Gly 15 Arg
Asp A1 a Asp Cys Glu Ly s A1 a Cy s Asp Gin Glu Asn Trp Pro Gly Gly
20 25 30
Val Cy s Val Pro Phe Leu Arg Cy s Glu Cys Gin Arg Ser Cy s
35 40 45
TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 46 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Béta vulgáris (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA
Alá 1 Thr Cy s Arg Ly s 5 Pro Ser Me t Tyr Phe 10 Ser Gly A1 a Cys Phe Ser 15
Asp Thr Asn Cys 20 Gin Lys A1 a Cys Asn 25 Arg Glu As p Trp Pro 30 Asn Gly
Lys Cys Leu 35 Val Gly Phe Lys Cys 40 Glu Cys Gin Arg Pro 45 Cys
TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Béta vulgáris (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA
Arg Cys I le Pro Cys Gly Gin Asp Cys I le Ser 1 5 10
Ser Arg Asn
Cys
Cy s
HU 223 367 Β1
Ser Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Va1 Pro Arg Cys Thr Asn 20 25 30
TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 550bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: ismeretlen (iii)HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Béta vulgáris (ix) SAJÁTOS JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KÓD: kódolószekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 66.. .293 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ACTCAACAAA TTCAGAAAAA AACAGAAGCA AAAAAAGTTT ATTGAAAGAG TAAGTTGAGG TGAAA ATG ATG AAA AGC TTT GTG ATA GTT ATG TTG GTC
Me t Me t Lys Ser Phe Va1 I le Val Met Leu Val 1 5 10
ATG TCC ATG ATG GTG GCT ACA TCT ATG GCA AGT GGT GAA TGC AAT
Me t Ser Me t Me t 15 Val A1 a Thr Ser Me t 20 A1 a Ser Gly Glu Cy s 25 Asn
ATG TAT GGT CGA TGC CCC CCA GGG TAT TGT TGT AGC AAG TTT GGC
Me t Tyr Gly Arg 30 Cys Pro Pro Gly Tyr 35 Cys Cys Ser Lys Phe 40 Gly
TAC TGT GGT GTC GGA CGC GCC TAT TGT GGC GAT GCT GAG CAG AAG
Tyr Cys Gly Val 45 Gly Arg A1 a Tyr Cys 50 Gly As p A1 a Glu Gin 55 Ly s
GTT GAA GAT CAT CCA TCT AAT GAT GCT GAT GTT CCT GAG TTT GTT
Val Glu Asp Hi s 60 Pro Ser Asn As p A1 a 65 Asp Val Pro Glu Phe 70 Val
143
188
233
278
GGA GCT GGT GCC CCA TGATGCTCGA AGCCAGGTAA TCGTAATGGC
Gly Alá Gly Alá Pro 75
ATGGGTTACC TAATAAGTAA ACTCATTGTG CCTAGCTTGC TACATGCTTA TCCACTATAA ATAAGCTCCT ACAGGAGTTG TGTTTTTCTT TTAATTTTGT AATCAAGGGT TTGACTTTAA TTAATGAGAC CAATGTATAC TTGCATGTCG GATAAATATN TAACTAAGCC ACTCGTATTG GTTTATTATA AAACTACTAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA
TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 76aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA Me t Me t Lys Ser Phe Val I le Val Me t Leu Val Me t Ser Me t Me t Val
10 15
323
373
423
473
523
550
HU 223 367 Β1
A1 a Thr Ser Me t A1 a Ser Gly Glu Cy s Asn Me t Tyr Gly Arg Cy s Pro
20 25 30
Pro Gly Tyr Cy s Cy s Ser Ly s Phe Gly Tyr Cy s Gly Val Gly Arg Al a
35 40 45
Tyr Cy s Gly Asp Al a Glu Gin Ly s Val Glu Asp Hi s Pro Ser Asn As p
50 55 60
A1 a As p Val Pro Glu Phe Va 1 Gly Al a Gly Al a Pro
65 70 75
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (7)

1 -0 I-* tn Ni ts) tsi cn © tn © © © © *· © © • © © © © © ©
ω ©
© ©
© ©
4000,00
0,20 5,00 10,00 15,00 20,99
Cd μ
.13
1. ábra
HU 223 367 B1
Int. Cl.7: C 12 N 15/82
Fehére (280 nm)
1. Antimikrobiális protein, amely az 1., 2. és 3. számú szekvencia valamelyikével rendelkezik.
2. ábra
HU 223 367 B1
Int. Cl.7: C 12 N 15/82
2. Tiszta protein, amely az 1. igénypont szerinti pro- 20 teinek valamelyikével legalább 90%-os azonosságot mutat.
3. ábra
HU 223 367 Β1
Int Cl.7: C 12 N 15/82
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti tiszta proteinek legalább egy, a 4., 5. és 6. számú szekvenciák valamelyikével rendelkező proteinnel alkotott kombinációja. 25
4. ábra
HU 223 367 B1 Int. Cl?: C 12 N 15/82
Idő (perc)
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti tiszta proteinek legalább egy további proteinnel alkotott kombinációi, mely további protein herbicidrezisztenciával, illetve növényi növekedést elősegítő, gombaellenes, antibakteriális, antivirális és/vagy fonalféreg-ellenes tulajdonság- 30 gal rendelkezik.
5. ábra
HU 223 367 B1
Int. Cl.7: C 12 N 15/82
Fehérje (280 nm)
5. Rekombináns DNS, amely egy 1. vagy 2. igénypont szerinti proteint kódoló szekvenciát tartalmaz, vagy a 7. számú szekvenciával rendelkezik.
6. ábra
HU 223 367 Β1
Int. Cl.7: C 12 N 15/82
6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS-szek- 35 vencia, amely tartalmaz még egy olyan szekvenciát is, amely legalább egy, a 4., 5. és 6. számú szekvenciák valamelyikét tartalmazó proteint kódol.
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns DNS, amely herbicidrezisztenciával, illetve növényi nö- 40 vekedést elősegítő, gombaellenes, antibakteriális, antivirális és/vagy fonalféreg-ellenes tulajdonsággal rendelkező proteint is kódol.
8. Az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS, amelyet úgy módosítottak, hogy az ismert mRNS instabilitási motívumokat vagy poliadenilációs jeleket eltávolították és/vagy a rekombináns DNS bejuttatására szolgáló organizmus által előnyben részesített kodonokat alkalmaznak benne, ahol az így módosított DNS-ről az említett organizmusban az 1. vagy 2. igénypont szerinti protein termelődik.
9. DNS-szekvencia, amely szigorú körülmények között az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti DNS-sel hibridizáló DNS-szekvenciával komplementer.
10. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti, növényekben expresszálható és növényben működőképes promoterhez és terminátorhoz kapcsolt DNS-szekvenciát tartalmazó vektor.
11. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-sel transzformált növény.
12. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t tartalmazó növényi sejt.
13. Antimikrobiális készítmény, mely az 1. vagy 2. igénypont szerinti proteinek közül egyet vagy többet tartalmaz.
14. Eljárás gombák leküzdésére, azzal jellemezve, hogy a gombákat az 1. vagy 2. igénypont szerinti proteinekkel, vagy a 3. vagy 4. igénypont szerinti kombinációkkal, vagy a 13. igénypont szerinti készítményekkel hozzuk érintkezésbe.
HU 223 367 B1
Int. Cl.7: C 12 N 15/82
Fehérje (280 nm)
CL o
(perc)
7. ábra
HU 223 367 Β1 Int. Cl?: C 12 N 15/82
OD620 OD620
HU9601040A 1993-10-21 1994-10-20 Antimikrobiális proteinek HU223367B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939321714A GB9321714D0 (en) 1993-10-21 1993-10-21 Improvements in or relating to organic compounds
PCT/EP1994/003449 WO1995011306A1 (en) 1993-10-21 1994-10-20 Anti-microbial proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9601040D0 HU9601040D0 (en) 1996-06-28
HUT74395A HUT74395A (en) 1996-12-30
HU223367B1 true HU223367B1 (hu) 2004-06-28

Family

ID=10743902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601040A HU223367B1 (hu) 1993-10-21 1994-10-20 Antimikrobiális proteinek

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6218508B1 (hu)
EP (1) EP0724641B1 (hu)
JP (1) JPH09504427A (hu)
AT (1) ATE256193T1 (hu)
AU (1) AU683952B2 (hu)
CA (1) CA2170506A1 (hu)
CZ (1) CZ112296A3 (hu)
DE (1) DE69433407T2 (hu)
DK (1) DK0724641T3 (hu)
GB (1) GB9321714D0 (hu)
HU (1) HU223367B1 (hu)
PL (1) PL181851B1 (hu)
RU (1) RU2158762C2 (hu)
WO (1) WO1995011306A1 (hu)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9526238D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
JP5653624B2 (ja) 2007-03-22 2015-01-14 ノバルティス アーゲー 親水性ポリマー鎖を有するシリコーン含有プレポリマー
JP5721267B2 (ja) 2008-07-21 2015-05-20 ノバルティス アーゲー シリコーンハイドロゲルコンタクトレンズを製造する方法
MY186340A (en) 2010-07-30 2021-07-13 Alcon Inc Silicone hydrogel lenses with water-rich surfaces
RU2638545C1 (ru) 2010-10-06 2017-12-14 Новартис Аг Подвергаемые водной переработке силиконсодержащие форполимеры и варианты их использования
EP2625216B1 (en) 2010-10-06 2019-06-05 Novartis AG Polymerisable chain-extended polysiloxanes with pendant hydrophilic groups
EP2625217B1 (en) 2010-10-06 2018-07-04 Novartis AG Chain-extended polysiloxane crosslinkers with dangling hydrophilic polymer chains
CN106896422B (zh) 2011-06-09 2021-03-23 爱尔康公司 具有纳米纹理化表面的硅氧烷水凝胶透镜
CN103917899B (zh) 2011-10-12 2018-04-03 诺华股份有限公司 通过涂布制备uv吸收性眼用透镜的方法
WO2013074535A1 (en) 2011-11-15 2013-05-23 Novartis Ag A silicone hydrogel lens with a crosslinked hydrophilic coating
EP2788797B1 (en) 2011-12-08 2023-06-07 Alcon Inc. Contact lenses with enzymatically degradable coatings thereon
RU2483109C1 (ru) * 2011-12-12 2013-05-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова Российской академии наук (ИОГенРАН) ГЕНЫ ПШЕНИЦЫ Triticum kiharae, КОДИРУЮЩИЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
BR112014028700B1 (pt) 2012-06-14 2021-01-05 Alcon Inc. copolímero e monômero vinílico contendo azetidínio, lente de contato de silicone hidrogel e métodos de produção da mesma
US9395468B2 (en) 2012-08-27 2016-07-19 Ocular Dynamics, Llc Contact lens with a hydrophilic layer
US9151873B2 (en) 2012-12-14 2015-10-06 Novartis Ag Actinically-crosslinkable amphiphilic prepolymers
MY172901A (en) 2012-12-17 2019-12-13 Alcon Inc Method for making improved uv-absorbing ophthalmic lenses
EP3069195B8 (en) 2013-11-15 2019-07-10 Tangible Science, LLC Contact lens with a hydrophilic layer
US9708087B2 (en) 2013-12-17 2017-07-18 Novartis Ag Silicone hydrogel lens with a crosslinked hydrophilic coating
US9684095B2 (en) 2014-04-25 2017-06-20 Novartis Ag Hydrophilized carbosiloxane vinylic monomers
CA2957287C (en) 2014-08-26 2020-05-26 Novartis Ag Poly(oxazoline-co-ethyleneimine)-epichlorohydrin copolymers and uses thereof
CN106715101B (zh) 2014-08-26 2019-11-05 诺华股份有限公司 用于在硅酮水凝胶接触镜片上施用稳定的涂层的方法
CN107206119B (zh) 2014-12-09 2021-01-29 实体科学公司 具有生物相容性层的医疗设备涂层
SG11201707269UA (en) 2015-05-07 2017-11-29 Novartis Ag Method for producing contact lenses with durable lubricious coatings thereon
US10324233B2 (en) 2015-09-04 2019-06-18 Novartis Ag Soft silicone medical devices with durable lubricious coatings thereon
WO2017037610A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Novartis Ag Method for producing contact lenses with durable lubricious coatings thereon
MY184638A (en) 2015-12-15 2021-04-13 Alcon Inc Method for applying stable coating on silicone hydrogel contact lenses
RU2645070C2 (ru) * 2016-06-06 2018-02-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук Способ получения антимикробных пептидов из тромбоцитов курицы домашней
EP3516429B1 (en) 2016-09-20 2021-02-17 Alcon Inc. Colored hydrogel contact lenses with lubricious coating thereon
CA3032588C (en) 2016-09-20 2021-03-23 Novartis Ag Hydrogel contact lenses with lubricious coating thereon
WO2018055488A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Novartis Ag Method for producing a water-soluble thermally-crosslinkable polymeric material
EP3516431B1 (en) 2016-09-20 2021-03-03 Alcon Inc. Process for producing contact lenses with durable lubricious coatings thereon
WO2018078542A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Novartis Ag Soft contact lenses with a lubricious coating covalently-attached thereon
SG11201902345QA (en) 2016-10-31 2019-05-30 Novartis Ag Method for producing surface coated contact lenses with wearing comfort
SG11202003457WA (en) 2017-12-13 2020-07-29 Alcon Inc Method for producing mps-compatible water gradient contact lenses
US11448796B2 (en) 2018-04-13 2022-09-20 Alcon Inc. Evaluation method for the coverage of a coating on a contact lens surface
US11459479B2 (en) 2018-12-03 2022-10-04 Alcon Inc. Method for making coated silicone hydrogel contact lenses
US11099300B2 (en) 2018-12-03 2021-08-24 Alcon Inc. Method for producing coated silicone hydrogel contact lenses
US11648583B2 (en) 2019-04-10 2023-05-16 Alcon Inc. Method for producing coated contact lenses
WO2023031818A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 Alcon Inc. A method for producing wettable silicone hydrogel contact lenses
WO2024161344A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Alcon Inc. Water gradient silicone hydrogel contact lenses
US20240293985A1 (en) 2023-02-27 2024-09-05 Alcon Inc. Method for producing wettable silicone hydrogel contact lenses

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62135492A (ja) * 1985-12-10 1987-06-18 Takara Shuzo Co Ltd 新規キラ−トキシン
DK61691D0 (da) * 1991-04-08 1991-04-08 Danisco Genetiske konstruktioner
US5514779A (en) * 1991-06-07 1996-05-07 Zeneca Limited Biocidal proteins from plants
GB9112300D0 (en) * 1991-06-07 1991-07-24 Ici Plc Biocidal proteins
BR9307429A (pt) * 1992-11-12 1999-08-31 Zeneca Ltd Proteìna antimicrobiana, composição, sequência de dna recombinante, promotor de sequência, vetor, sistema biológico, planta, sementes e progenitura, processo de combate a fungos ou bactérias e processo de extração para a produção de uma proteìna

Also Published As

Publication number Publication date
US6218508B1 (en) 2001-04-17
CA2170506A1 (en) 1995-04-27
EP0724641A1 (en) 1996-08-07
CZ112296A3 (en) 1997-05-14
EP0724641B1 (en) 2003-12-10
DE69433407T2 (de) 2004-06-09
RU2158762C2 (ru) 2000-11-10
HUT74395A (en) 1996-12-30
PL313526A1 (en) 1996-07-08
HU9601040D0 (en) 1996-06-28
GB9321714D0 (en) 1993-12-15
ATE256193T1 (de) 2003-12-15
US6300103B1 (en) 2001-10-09
PL181851B1 (en) 2001-09-28
AU8058794A (en) 1995-05-08
WO1995011306A1 (en) 1995-04-27
DK0724641T3 (da) 2004-04-13
JPH09504427A (ja) 1997-05-06
AU683952B2 (en) 1997-11-27
DE69433407D1 (de) 2004-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU223367B1 (hu) Antimikrobiális proteinek
EP0448511B1 (en) Anti-pathogenically effective compositions comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes
US6187904B1 (en) Biocidal proteins
US20010020300A1 (en) Transgenic pathogen-resistant organism
HUT67059A (en) A plant chitinase gene and use thereof
CA2180353A1 (en) Antimicrobial proteins from aralia and impatiens
US5446127A (en) Antipathogenic peptides and compositions containing the same
US5608151A (en) Anti-microbial proteins
CA2147122A1 (en) Biocidal chitin binding proteins
JP3347326B2 (ja) 殺生物性蛋白質
US6242574B1 (en) Antimicrobial proteins
CA2351894C (en) Novel protein, gene encoding the same and method of utilization thereof
US6297360B1 (en) Amphipathic protein-1
KR100538975B1 (ko) 고추 유래의 리보뉴클레아제 활성을 갖는 병원관련 단백질 10
HU219505B (hu) Eljárás növényből származó intracelluláris fehérjék extracelluláris térbe való irányítására és patogénellenes hatásuk fokozására

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH

HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20040415

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees