JP3347326B2

JP3347326B2 - 殺生物性蛋白質

Info

Publication number: JP3347326B2
Application number: JP50987992A
Authority: JP
Inventors: ブロケルト，ヴイレム，フランス; カム，ブルノ，フイリツプ，エンジエロ; リース，サラ，ブロンウエン; ヴアン−デルレイデン，ヨセフ
Original assignee: ゼネカ・リミテツド
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-03
Publication date: 2002-11-20
Anticipated expiration: 2017-11-20
Also published as: WO1992021699A1; AU663500B2; AU1780092A; CA2110403A1; DE69232498D1; BR9206105A; ATE214732T1; GB9112300D0; EP0593501B1; EP0593501A1; DE69232498T2; JPH07502976A; NZ243063A; ES2173865T3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は殺生物性蛋白質（biocidal protein）、その
製造方法及び使用方法及びこれをコードするDNA配列に
関する。特に、本発明はアマランサス（Amaranthus）か
ら単離された抗菌性蛋白質（antimicrobial protein）
に関する。

アマランサスカウダタス（Amaranthus caudatus）
［アマランサス（amaranth）］は熱帯、亜熱帯及び温帯
地域において広範囲に生育している、薬草（herb）及び
灌木（shrub）の大きな科（family）、ヒユ科（Amarant
haceae）に属している。アマランサスはアメリカの古来
の食用作物であり、中央及び南部アメリカ、アジア及び
アフリカの一部で穀物の生産のために依然として栽培さ
れている。アマランサスの種子は膨脹させ（popped）、
焼き（toasted）、調理してかゆ（gruel）にし、粉砕し
て粉末としまた平らなパン（flat bread）にすることが
でき、かつ、特に高い栄養価を有する（Betschart等,19
81,J.Food Sci,46,1181−1187;Pedersen等,1987,Plant
Foods,Hum,Nutr,36,309−324）。アマランサスは庭園観
賞用植物としても世界中で広く栽培されている。

植物は、通常、菌類生物（fungal organism）に著し
く富む基体（substrate）上で生長するが、感染した状
態になることは希である。潜在的な侵入物（potential
invader）を排斥するために、植物はその構成要素とし
て又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生
する。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されている
ものはフィトアレキシン、即ち、適当な防御関連信号分
子（defence−related signal molecule）の知覚（perc
eption）に基づいて特異的に合成される、広範囲の抗菌
活性を有する二次代謝産物（secondary metabolite）で
ある。フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生
合成経路の酵素をコードする一連の遺伝子の転写活性化
（transcriptional activation）に基づいている。しか
しながら、最近の10年間に幾つかの植物蛋白質は植物病
原性菌類（phytopathogenic fungi）の制御においてよ
り直接的な役割を果たし得ることが次第に明らかになっ
た。現在では、ベーター−1,3−グルカナーゼ、リボソ
ーム−不活性化蛋白質、チオニン（thionin）、キチナ
ーゼ、キチン結合性レクチン（chitin−binding lecti
n）及びゼアマチン（zeamatin）を包含する、抗菌性を
有する種々の蛋白質が確認されている。

キチン（ポリ−β−1,4,−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン）は菌類（fungi）の細胞壁及び無脊椎動物の外
骨格中で見出だされる多糖である。植物はキチン又はキ
チン状構造体を含有していないが、この多糖に対して強
い親和性を示す蛋白質が種々の植物源から単離されてい
る（Raikhel及びBroekaert,1991,Verma編,Control of p
lant gene expression,印刷中）。

かかるキチン結合性蛋白質の例は、マメ（bean）（Bo
ller等,1983,Planta,157:22−31）、小麦（Molano等,19
79,JBiol Chem,254:4901−4907）及びタバコ（Shinsi
等,1987,Proc Natl Acad Soci USA,84:89−93）からの
塩基性キチナーゼ；小麦（Rice及びEtzler,1974,Bioche
m Biophys Res Comm,59:414−419）、大麦（Peumans等,
1982,Biochem J,203:239−143）、イネ（Tsuda,1979,J
Biochem,86:1451−1461）及びスチンギングネットル（s
tinging nettle）（Peumans等,1983,FEBS Lets,177:99
−103）からのキチン結合性レクチン；及びヘベイン（h
evein）と呼ばれるゴムの木のラテックスからの小蛋白
質（Van Parijs等,1991,Planta,183:258−264）であ
る。これらのキチン結合性蛋白質の全ては約40〜43アミ
ノ酸の相同性の（homologous）システイン／グリシン富
化領域（cysteine/glycine−rich domain）を占めてお
り、この領域は２回（ネットルレクチンの場合）又は４
回（小麦、大麦及びイネレクチン場合）反復しているか
又は関係のない領域と融合している（塩基性キチナーゼ
の場合）。

これらの蛋白質の正確な生理学的役割は不明である
が、これらは全て生体外で抗生物活性（antibiotic act
ivity）を示し、防御関連機能（defence−related func
tion）を示唆している。抗菌特性（antifungul propert
y）はキチナーゼ（Schlumbaum等,1986,Nature,324:365
−367;Broekaert等,1988,Physiol Mol Plant Pathol,3
3:319−331）、ネットルレクチン（Broekaert等,1989,S
ocience,245:1100−1102）及びヘベイン（Van Parijs
等,1991,Planta,183:258−264）によるものとされてい
る。小麦レクチンは昆虫の幼虫の発育に対して有害な作
用を生ずる（Murdock等,1990,Phytochem,29:85−89;Cza
pla及びLang,1990,J Econ Entomol,83:2480−2485）。
しかしながら、菌類及び昆虫において観察される殺生物
活性がこれらの蛋白質のキチン結合活性と関係があるか
否かは確立されていない。

植物を菌による病害に対して保護する際にキチン結合
性蛋白質、特にキチナーゼ、を適用して成功したことが
報告されている。米国特許第4940840号（DNA Plant Tec
hnology Corporation）によれば、バクテリア、セラチ
アマルセッセンス（Serratia marcescens）からのキ
チナーゼ遺伝子を発現するタバコ植物は、菌類、アルテ
ルナリアロンギペス（Alternaria longipes）に対し
て感受性が少ないように思われる。欧州特許出願第4186
95号（Ciba Geigy）には、タバコキチナーゼ遺伝子から
の調節DNA配列を使用して、病原体に対する改善された
抵抗性を有するトランスジェニック植物を生ずる導入遺
伝子を発現させることが記載されている。特許出願第WO
90070001号（Du Pont de Nemours Company）には、菌病
原体に対する改善された抵抗性を与えるキチナーゼを過
発現する（over−express）トランスジェニック植物の
生産が記載されている。

今般、本発明者はキチン結合特性を示す、新規な種類
の重要な抗菌性（antimicrobial）蛋白質を精製した。

本発明によれば、アマランサス（Amaranthus）の種子
から単離することのできる抗菌性蛋白質が提供される。

別の要旨によれば、本発明は本発明による蛋白質をコ
ードするDNA配列を含有するベクターを包含する。このD
NAはエンコードされた（encoded）蛋白質の発現を可能
にする生物学的な系にクローンするか又は形質転換し得
る。

本発明は、更に、本発明による抗菌性蛋白質をエンコ
ードする組換え体DNAを使用して形質転換した植物も包
含する。

本発明は、更に、菌類（fungi）又はバクテリア（bac
teria）を本発明による蛋白質に暴露することからな
る、菌類又はバクテリアの撲滅方法も包含する。

新規な種類の有効な抗菌性蛋白質はアマランサスカ
ウダタス（Amaranthus caudatus）［アマランサス（am
aranth）］の種子から単離された。この種の蛋白質は以
下において、それぞれ、Ac−AMP1［アマランサスカウ
ダタス−抗菌性蛋白質１（Amaranthus caudatus−antim
icrobial protein 1）］及びAc−AMP2［アマランサス
カウダタス−抗菌性蛋白質２（Amaranthus caudatus−
antimicrobial protein 2）］と称する２種の蛋白質因
子（proteinfactor）を包含する。両者共、二量体状蛋
白質であり、２個の同一の3kDaサブユニットからなる。
両者の蛋白質は高度に塩基性であり、10以上のpI値を有
する。類似する抗菌活性を有する蛋白質をアマランサス
パニクラタス（Amaranthus paniculatus）、アマラ
ンサスレトロフレクス（Amaranthus retroflexu
s）、アマランサスリビダス（Amaranthus lividus）
及びゴムフレナグロボサ（Gomphrena globossa）を包
含する種々の密接な関連を有する種の種子から抽出し
た。

Ac−AMP1のアミノ酸配列（29残基）とAc−AMP2のアミ
ノ酸配列（30残基）は、後者がカルボキシル末端に１個
の追加の残基を有すること以外、同一である。これらの
アミノ酸配列についての知識により、標準的なペプチド
シンセサイザーを使用してAc−AMP蛋白質を製造するこ
とが可能である。

Ac−AMP1とAc−AMP2のアミノ酸配列は多くのキチン結
合性蛋白質中に存在するシステイン／グリシン富化領域
と高度に相同性である。更に、Ac−AMP1とAc−AMP2はキ
チンに結合しかつ低いpHで脱着されることができ（キチ
ナーゼとレクチンにより示される性質）、従って、キチ
ン結合性蛋白質の群の新規な一員と考えられ得る。しか
しながら、従来特性が測定されているキチン結合性蛋白
質中で見出だされる、通常の40−43アミノ酸のシステイ
ン／グリシン富化領域と比較した場合、Ac−AMPsは種々
の特徴により区別される。これらの特徴としては塩基性
アミノ酸の高い存在量（abundance）、追加のアミノ末
端残基（amino−terminal residue）の存在、６位及び
９位での４個のアミノ酸のギャップの存在及び10−12残
基のカルボキシ末端蛋白質の欠如が挙げられる。

Ac−AMPsをエンコードするcDNAを単離し、配列決定を
行った。Ac−AMP2をエンコードするcDNAの特性を測定し
た。このDNAは86−アミノ酸プレプロテイン（preprotei
n）と25−アミノ酸カルボキシ末端エクステンションを
エンコードする。このプレプロテインは他の既知のキチ
ン結合性蛋白質の先駆体の全てと異なる。Ac−AMP1をエ
ンコードするcDNAはAc−AMP2の翻訳後分解生成物（post
−translational cleavage product）と同定された。

このDNAは標準核酸シンセサイザーを使用して製造す
ることができ、或いは、適当なプローブ（既知の配列か
ら誘導）を使用して植物ゲノムから実際のAc−AMP遺伝
子と制御配列を単離し得る。ついでこの遺伝物質を構成
プロモーター（constitutive promoter）又は誘導性プ
ロモーター（inducible promoter）の制御下での蛋白質
の発現を可能にする生物学的系にクローンし得る。従っ
て、蛋白質を適当な微生物又は培養細胞（cultured cel
l）中で製造し、抽出しついで単離して使用し得る。適
当な微生物としては大腸菌及びシュウドモナス（Pseudo
monas）が挙げられる。適当な細胞としては培養昆虫細
胞及び培養哺乳動物細胞が挙げられる。このDNAを使用
して既知の方法により任意の植物種を形質転換し、その
結果、抗菌性蛋白質をこの植物内で発現させる。

本発明による植物細胞は、本発明による構築物（cons
truct）を使用して多数の既知の方法［アグロバクテリ
ウム（Agrobacterium）Tiプラスミド、エレクトロポレ
ーション（electroporation）、マイクロインジェクシ
ョン（microinjection）、マイクロプロジェクテイルガ
ン（microprojectile gun）等］により形質転換し得
る。ついで、適当な場合には、形質転換細胞を、新規な
核物質がゲノム中に安定に組込まれている全植物（whol
e plant）として再生させることができる。この方法に
よりモノコット（monocot）及びジコット（dicot）植物
を得ることができるが、通常、後者の方が再生がより容
易である。

本発明に従って遺伝的に修飾した（genetically modi
fied）植物の例としては次のものが挙げられる：トマ
ト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及
びメロンのごとき果実；カノラ（canola）、ヒマワリ、
タバコ、テンサイ、小麦、大麦及び米のごとき小粒穀
類、トウモロコシ及び綿のごとき屋外作物（field cro
p）；及びニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギの
ごとき野菜。

Ac−AMP蛋白質は広範囲の抗菌活性を示し、グラム陽
性バクテリアに対しても活性である。Ac−AMP蛋白質は
植物体部分に適用することにより殺菌剤又は抗生物質と
して使用し得る。Ac−AMP蛋白質は植物体内で発現させ
ることにより菌類及びバクテリアを撲滅するのにも使用
し得る。

Ac−AMP1及びAc−AMP2は、驚くべきことに、高い活性
を示す；これらは、従来から既知の抗菌性キチン結合性
蛋白質よりはるかに低い施用量において種々の植物病原
菌の生長を抑制する。新規な蛋白質の抗菌活性はCa²⁺に
より拮抗される。

ある種のキチン結合性蛋白質はキチンからなる外骨格
を有する昆虫に対して効果を有することが知られてい
る。Ac−AMPsと既知のキチン結合性蛋白質との配列の類
似性は、Ac−AMPsも殺虫活性を有し得ることを示唆して
いる。

Ac−AMP蛋白質はアマランサスカウダタス種子から
単離し、精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工
的に合成するか又は組換え体DNAの発現により適当な微
生物内で製造し得る。この蛋白質はトランスジェニック
植物（transgenic plant）内でも発現させ得る。

本発明は図面を参照することにより更に理解されるで
あろう：図１は抗菌性蛋白質についてのカチオン交換クロマト
グラムとこれに付随する菌生長抑制率についてのグラフ
を示す。

図2Aは精製Ac−AMP1のHPLCプロフィールを示す。

図2Bは精製Ac−AMP2のHPLCプロフィールを示す。

図３は精製抗菌性蛋白質のSDS−PAGE分析を示す。

図4AはAc−AMP1とAc−AMP2のアミノ酸配列を示す。

図4Bはタバコキチナーゼ、マメキチナーゼ、ヘベイ
ン、小麦レクチン、ネットルレクチン及びAc−AMP2のア
ミノ酸配列の列を示す。

図５はキチン上の抗菌性蛋白質のアフィニテイクロマ
トグラフィーを行った後の、種々の溶出液のSDS−PAGE
分析を示す。

図６は抗菌性蛋白質の濃度を変化させて測定した、菌
の生長抑制率曲線を示す。

図７は抗菌性蛋白質の濃度を変化させかつKCl又はCaC
l₂を添加するか又は添加することなしに測定した、B.シ
ネレアの生長抑制率曲線を示す。

図８はAc−AMP2をエンコードするcDNAのヌクレオトド
配列と推定（deduced）アミノ酸配列を示す。

図９は発現ベクターpAC11とpAC12の構造を示す。

図10は植物形質転換ベクターpAC111とpAC112の構造を
示す。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例１アマランサスカウダタスの種子からの塩基性熱安定性
蛋白質の抽出。

30〜75％の間の相対飽和度（relative saturation）
で沈殿する蛋白質の硫酸アンモニウム分別を行った後、
pH9で平衡化したＱ−セファロース（Ｑ−Sepharose）
（Pharmacia）アニオン交換カラム上を通過させること
により塩基性蛋白質フラクション（pI＞９）を単離し
た。詳細な方法は以下に記載する。

1kgのＡカウダタス種子（ベルギー、ウオンツ、Gon
thierから入手）をコーヒーミル中で粉砕し、得られた
粗い粉末を、10mMのNaH₂ PO₄、15mMのNa₂ H PO₄、100mM
のKCl、2mMのEDTA、2mMのチオ尿素、1mMのPMSF及び1mg/
のロイペプチンを含有する氷冷抽出緩衝液（extracti
on buffer）３を使用して４℃で２時間抽出した。ホ
モジネート（homogenate）をチーズクロス（cheeseclot
h）を通して絞り、遠心分離（7000 x gで５分間）によ
り清澄化した。上澄液に固体硫酸アンモニウムを添加し
て相対飽和度を30％とし、室温で１時間放置後に生成し
た沈殿を遠心分離（7000 x gで10分間）により除去し
た。上澄液の硫酸アンモニウムの相対飽和度を75％に調
節しついで室温で一夜放置して生成した沈殿を遠心分離
（7000 x gで30分間）により捕集した。ペレットを300m
の蒸留水に再度溶解させた後、不溶性物質を再度の遠
心分離（7000 x gで20分間）により除去した。透明な上
澄液を2000Daの分子量カットオッフ（molecular weight
cut off）を有するベンゾイル化セルロースチューブ
（benzoylated cellulose tubing）（Sigmaセントルイ
ス、MO）を使用して蒸留水に対して長時間（extensivel
y）透析した。透析後、10倍に濃縮した緩衝液（ten−fo
ld concentrated buffer）を添加することにより溶液を
50mM Tris−HCl（pH9）に調整し、ついで、50mM Tris−
HCl（pH9）と平衡なＱ−セファロースファストフロー
（Ｑ−Sepharose Fast Flow）カラム（Pharmaciaスエー
デン、アップサラ）（12 x5cm）上を通過させた。カラ
ムを通過した蛋白質を20mM燐酸ナトリウム緩衝液に対し
て長時間透析した。

この物質はＡカウダタス種子の塩基性蛋白質フラク
ションに相当する。これについて更に行ったクロマトグ
ラフィーによる精製は実施例３に記載されている。

実施例２抗菌活性及び抗バクテリア活性の評価。

抗菌活性は従来の文献（Broekaert,1990,FEMS Microb
iol Lett,69,55−60）に記載されているごとき顕微分光
分析（microspectrophotometry）により測定した。試験
は、慣用的に、20μの（フィルター−殺菌）試験溶液
と、1/2濃度の（half strength）馬鈴薯デキストロース
ブロス（Potato Dexitrose Broth）（Difco）中の菌胞
子懸濁液（胞子数2 x10⁴/m）又は菌糸体フラグメント
80μを使用して行った。カチオンの拮抗作用の実験に
ついては馬鈴薯デキストロースブロスの代わりに合成増
殖培地を使用した。合成増殖培地はK₂ H PO₄（2.5m
M）、MgSO₄（50μＭ）、CaCl₂（50μＭ）、FeSO₄（５μ
Ｍ）、CoCl₂（0.1μＭ）、CuSO₄（0.1μＭ）、NA₂ MoO₄
（２μＭ）、H₃ BO₃（0.5μＭ）、KI（0.1μＭ）、ZnSO
₄（0.5μＭ）、MnSO₄（0.1μＭ）、グルコース（10g/
）、アスパラギン（1g/）、メチオニン（20mg/
）、myo−イノシトール（2mg/）、ビオチン（0.2mg
/）、チアミン−HCl（1mg/）及びピリドキシン−HC
l（0.2mg/）からなる。対照ミクロ培養液（control m
icroculture）は20μの（殺菌）蒸留水と80μの菌
胞子懸濁液を含有していた。

特に説明がない限り、供試微生物はフサリウムクル
モルム（Fusarium culmorum）（菌株IMI 180420）であ
り、インキュベーションは25℃で48時間行った。生長抑
制率（％）は595nmにおける対照ミクロ培養液の修正吸
光度（corrected absorbance）に対する、対照ミクロ培
養液の修正吸光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を
差し引いたものの比の100倍と定義される。修正吸光度
値は48時間後に測定した培養液の595nmでの吸光度か
ら、30分後に測定した595nmでの吸光度を差し引いた値
に等しい。15％より低い生長抑制率の値はクロマトグラ
ムに示されない。抗菌活性（ｍ当りの単位数）は、所
与の評価条件下で50％の生長抑制率が得られる供試溶液
の稀釈率（dilution factor）の50倍として算定した。

抗バクテリア活性は顕微分光分析により以下に述べる
ごとき方法で測定した。軟質栄養アガロース［トリプト
ン10g/；シープラーク（Seaplaque）アガロース（FM
C）5g/］に接種することによりバアクテリア懸濁液を
調製し、固化を防止するために37℃に保持した。バアク
テリア懸濁液（1m当り、10⁵コロニー形成単位）のア
リコート（80μ）を平底96−ウエル（well）マイクロ
プレート（microplate）中のフィルター殺菌試料（20μ
）に添加した。28℃でのインキュベーションを30分及
び24時間行った後、マイクロプレートリーダーを使用し
て、培養液の595nmでの吸光度を測定した。生長抑制率
は抗菌活性評価について述べたごとくして算定した。

実施例３Ａカウダタス種子からの抗菌性蛋白質の精製。

Ａカウダタス抗菌性蛋白質の単離のための出発原料
は実施例１に記載のごとくして成熟種子から抽出した塩
基性蛋白質フラクションであった。これらの蛋白質を図
１に示すごとくカチオン交換クロマトグラフィーにより
更に分離した。

約100mgの塩基性蛋白質フラクションを20mMの燐酸ナ
トリウム緩衝液（pH7）に溶解し、予め燐酸ナトリウム
緩衝液で平衡化したＳ−セファロース高性能（Ｓ−Seph
arose High Performance）カラム（Pharmacia）（10 x
1.6cm）上に供給した。カラムを０〜150mMのNaClを含有
する20mMの燐酸ナトリウム緩衝液（pH7）210mを使用
して直線的勾配で30m／分の速度で溶離した。溶出液
を280nmでの吸光度のオンライン測定により蛋白質つい
て監視し（その結果は図１の下方パネルに示されてい
る）、7.5mのフラクションを回収し、その20μを実
施例２で記載したごとき顕微分光分析による抗菌活性評
価において試験した（その結果は図１の上方パネルに示
されている）。

分画の際に、混合物は、４個の明確なピークに分離
（resolve）された。抗菌活性物質は、それぞれ、ピー
ク２及び４の物質から共溶離（co−elute）された。

最後に、活性フラクションを逆相クロマトグラフィー
により精製した。約1mgの量のピーク２物質（図2A）と
ピーク４物質（図2B）を、0.1％TFAで平衡化したPep−
Ｓ（多孔質シリカC₂/C₁₈,Pharmacia）カラム（2.5 x 0.
93cm）上に充填した。カラムの溶離は5m／分の速度で
かつ下記の濃度勾配で行った（溶剤Ｂは0.1％TFAを含有
するメタノールである）:0−３分、０−15％B;3−23
分、15−35％B;23−25分、35−100％Ｂ。溶出液は280nm
での吸光度をオンライン測定することにより蛋白質につ
いて監視した。5mの溶出液のフラクションを捕集し、
真空乾燥し、最後に0.5mの蒸留水に溶解させた；その
10μを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で使用し
た。

図2A及び図2Bに、それぞれ、精製ピーク２物質とピー
ク４物質のHPLCプロフィールが示されている。下方パネ
ルには280nmでの吸光度を測定することによる溶出液の
蛋白質についての監視結果が示されている。顕微分光分
析による抗菌活性評価の結果は上方パネルに示されてい
る。

ピーク２物質とピーク４物質の両者から、抗菌活性物
質と共に共溶離される、十分に分離された（resolved）
主ピークが得られた。ピーク２から精製された活性因子
をAc−AMP1（アマランサスカウダタス−抗菌性蛋白質
１）と称し、ピーク４から精製された活性因子をAc−AM
P2と称する。

実施例４精製抗菌性蛋白質の分子構造。

Ac−AMPsの分子構造を更に分析した。ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS−PAGE）を
ファストシステム（PhastSystem）（Pharmcia）電気泳
動装置を使用して、予備注型された（precast）市販の
ゲル［Pharmaciaからのファストゲルハイデンシテ
イ（PhastGel High Density）］上で行った。試料緩衝
液には200mMのTris−HCl（pH8.3）、１％（w/v）のSD
S、1mMのEDTA、0.005％のブロムフェノールブルー及
び、特に説明のない場合、１％（w/v）のジチオトレイ
トール（DDT）を含有させた。蛋白質は６％のグルタル
アルデヒド中での電気泳動の後に固定し（fix）、Heuke
shoven及びDernick（1985,Electrophoresis,6:103−11
2）に従って銀染色した（silver stained）。

アマランサス抗菌性蛋白質をジチオトレイトールで還
元する前と後にSDS−PAGEにより分析した。還元Ac−AMP
1及びAc−AMP2は両者とも約3kDaの見掛け分子量につい
ての単一バンドとして移行した（migrate）。しかしな
がら、Ac−AMP1及びAc−AMP2は、その還元されていない
状態では、それぞれ、4kDa及び6kDaのバンドを生じた。
従って、抗菌性因子はジスルフィドブリッジによって安
定化されている、各々、２個の同一の3kDaサブユニット
からなる二量体状蛋白質であると考えられる。スーパー
ロース（Superrose）−12又はスパーデックス（Superde
x）−75（Pharmacia）上でのゲル濾過により天然Ac−AM
Psの分子量を測定する試みは、蛋白質が遅延するため、
成功しなかった。

図３は精製抗菌性蛋白質のSDS−PAGE分析の結果を示
している：レイン（lane）１は還元Ac−AMP1であり、レ
イン２は還元Ac−AMP2であり、レイン３は非還元Ac−AM
P1であり、レイン４は非還元Ac−AMP2である。200ナノ
メーターの蛋白質がゲル上で分離された。レインＭは、
次の大きさ:17kDa、14.5kDa、8kDa、6kDa及び2.5kDaに
ついての分子量マーカー（Pharmacia）として使用され
るミオグロビンフラグメントを示す。

遊離のシステインチオール基を下記のごとくして定性
的に分析した。100mMの燐酸ナトリウム緩衝液（pH7）と
1mMのEDTAを含有する6Mグアニジニウム−Cl（guanidini
um−Cl）中に100μｇの量の還元又は非還元蛋白質を溶
解させた。混合物を5,5'−ジチオニトロ安息香酸と反応
させ、Creightonの方法（1989,Protein structure,a pr
actical approach,155−167）によりニトロチオ安息香
酸塩の遊離を監視した。蛋白質の還元はTris−HCl（pH
8.6）を100mMまで、ジチオトレイトールを30mMまで添加
しついで45℃で１時間インキュベートすることにより行
った。蛋白質はC₂/C₁₈シリカカラム上での逆相クロマト
グラフィーにより過剰の反応剤から分離した。

非還元Ac−AMPsは遊離のシステインチオール基を含有
しておらず、これに対して、還元蛋白質は遊離のシステ
インチオール基を含有しており、全てのシステイン残基
がジスルフィド結合に関与していることを示した。かか
る小さいポリペプチド中に比較的大きい数のジスルフィ
ド結合が存在することは、Ac−AMPsがコンンパクトな構
造を有することを示唆している。

Ac−AMP1とAc−AMP2のpI値を等電点電気泳動により測
定し、それぞれ、10.3及び10.6であることが判った。等
電点電気泳動は4.7〜10.6のpI範囲の標識蛋白質（Pharm
acia）を使用して、8M尿素中で再水和させた、予備注型
インムービリンドライストリップ（Immobiline Dry Str
ips）（Pharmacia）上で行った。

実施例５ Ac−AMPsのアミノ酸配列。

抗菌性蛋白質のシステイン残基を以下に述べるごとく
Ｓ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ−carboxyamidometh
ylation）により変性した:100μｇの量の精製蛋白質
を、30mMのDTTを含有する0.3M Tris−HCl（pH8.6）150
μに溶解し、45℃で１時間反応させた。ヨードアセト
アミドを最終濃度が100mMになるまで添加し、混合物を3
7℃で１時間反応させた。最後に、最終濃度が100mMにな
るまでDTTを添加することにより反応を停止し（quenc
h）ついで37℃で更に１時間反応させた。過剰の反応剤
を逆相クロマトグラフィーにより除去した。得られた蛋
白質フラクションのアミノ酸配列分析は、477A蛋白質シ
ークエンサー（Applied Biosystems）を使用して、120A
アナライザー（Applied Biosystems）によりフェニルチ
オヒダントインアミノ酸誘導体をオンライン検出するこ
とにより行った。

還元しかつカルボキシアミドメチル化した抗菌性蛋白
質のアミノ酸配列は直接的Ｎ−末端配列決定（Ｎ−term
inal sequencing）により決定した。図4AにAc−AMP1とA
c−AMP2のＮ−末端アミノ配列が示されている。Ac−AMP
1は29アミノ酸の長さであり、これに対し、Ac−AMP2は3
0個のアミノ酸残基を有する。Ac−AMP2のアミノ酸配列
は、そのカルボキシル末端に１個の追加のアミノ酸（ア
ルギニン）を有すること以外はAc−AMP1のアミノ酸配列
と同一である。Ac−AMPsは、特に、システイン（６残
基）、グリシン（６残基）及び塩基性アミノ酸（Ac−AM
P1及びAc−AMP2について、それぞれ、４及び５残基）に
富んでいる。

Ac−AMP1はAc−AMP2のトランケートされた形（trunca
ted form）であると考えられる。この２種の蛋白質は分
画翻訳後プロセッシング（differential post−transla
tional processing）により同一の先駆体から生成させ
ることができる。

アミノ酸配列データーから算定した理論的等電点は、
全てのシステイン残基がジスルフィド結合に関与してい
ると仮定して、Ac−AMP1及びAc−AMP2について、それぞ
れ、10.1及び10.0である。これらの値は実施例４に示さ
れている測定pI値と良く対応する。

図4Bにタバコキチナーゼ（Shinshi等,1987,Proc Natl
Acad Sci USA,84:89−93）、マメキチナーゼ（Broglie
等,1986,Proc Natl Acad Sci USA,83:6820−6824）、ヘ
ベイン（Broekaert等,1990,Proc Natl Acad Sci USA,8
7:7633−7637）、小麦レクチン（Raikhel及びWilkins,1
987,Proc Natl Acad Sci USA,84:6745−6749）、ネット
ルレクチン（Chapot等,1986,FEBS Lett,195:231−234）
のＮ−末端アミノ酸配列及びAc−AMP2のＮ−末端アミノ
酸配列が示されている。タバコキチナーゼとの配列同一
性（sequence identity）は大文字で示されており、保
存変化（conserved change）はイタリックで示されてお
り、非保存変化（non−conserved change）は小文字で
示されている。保存変化はアミノ酸相同性基（amino ac
id homology group）FWY、MILV、RKH、ED、NQ、ST及びP
AG内での置換であると考えられる。最適な配列のために
導入されたギャップは星印で表されている。

Ac−AMPsのアミノ酸配列はキチナーゼ、キチン結合性
レクチン及びヘベインのごときキチン結合性蛋白質のシ
ステイン／グリシン富化領域との顕著な類似性を示す。
しかしながら、Ac−AMPsは固有の特徴部分も含有する。
Ac−AMP2及びタバコからの塩基性キチナーゼのＮ−末端
のアミノ酸配列（図4b）は最初の30個の残基中に14個の
同一のアミノ酸と５個の保存変化を示した。キチン結合
性蛋白質について最適配列を可能にするためには、４個
のアミノ酸の単一のギャップをAc−AMP2のＮ−末端部分
に導入しなければならない。このギャップを導入した後
には、システイン残基の全てが一定の位置に出現した。

実施例６ Ac−AMPsのキチン結合活性。

Ac−AMPsとキチン結合性蛋白質はアミノ酸配列水準が
類似しているので、アマランサス抗菌性蛋白質のキチン
支持体に結合する能力を検討した。

キチンを充填したマイクロカラムにAc−AMP1又はAc−
AMP2を導入しついで中性のpH及び低いpH（pH2.8）で溶
離した。キチンはMolanoの方法（1977,Anal Biochem,8
3:648−656）に従ってキトサン（Sigma,St Louis,MO）
のＮ−アセチル化により調製した。蛋白質試料（50μ
ｇ）を1mの燐酸緩衝溶液（pH7）に溶解した後、キチ
ン充填マイクロカラム（2.5 x 6mm）に供給し、このカ
ラムに３回再循環させた。カラムを1mの燐酸緩衝溶液
（PBS）を用いて５回、1mの100mM酢酸（pH2.8）を用
いて１回溶離させた。溶出液のフラクション（1m）を
脱塩し、逆相クロマトグラフィーにより濃縮し、最後に
SDS−PAGE分析を行うために50μの試料緩衝液（sampl
e buffer）に再び溶解させた。

このアフィニテイクロマトグラフィーを行った後の、
Ac−AMP1（レイン１〜５）及びAc−AMP2（レイン５〜
８）についてのSDS−PAGE分析の結果が図５に示されて
いる。レイン１及び５はカラムに充填したものと等しい
量の抗菌性蛋白質である；レイン２及び６はカラムを通
過したフラクションである；レイン３及び７はPBS（pH
7）により溶離されたフラクションである；レイン４及
び８は100mM酢酸（pH2.8）により溶離されたフラクショ
ンである。Ac−AMPsはカラムを通過したフラクションと
中性pH洗液（washing）には存在せず、低pH脱着緩衝液
中に回収されることが認められ得る。これらの結果はAc
−AMP1及びAc−AMP2の両者がキチンに対して親和性を示
すことを示している。

実施例７ Ac−AMPsの抗菌活性の安定性。

抗菌活性の試験は実施例２に記載の評価方法に従っ
て、フサリウムクルモルム胞子を含有する増殖培地で
５倍に稀酌した20μの試料を使用して行った。非処理
対照試料は10mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7）中に500μ
g/mの供試蛋白質を含有していた。消化のために、種
々のプロテアーゼを100μg/m添加し、37℃で16時間イ
ンキュベートした。熱安定性試験は供試蛋白質のアリコ
ートを100℃までの種々の温度で10分間加熱することに
より行った。pH安定性試験は供試蛋白質を20mMグリシン
−HCl（pH2）又はグリシン−NaOH（pH11）中で１時間イ
ンキュベートしついでベンゾイル化（benzoylated）セ
ルロースチューブを使用して10mM燐酸ナトリウム緩衝液
に対して16時間透析することにより行った。還元はジチ
オトレイトールを30mM、Tris−HCl（pH8.6）を300mM添
加することにより行った。反応剤は逆相クロマトグラフ
ィーにより除去した。反応剤だけを含有する対照処理液
は透析又は逆相クロマトグラフィー工程の後に、抗菌活
性について負であることが証明された。

Ac−AMPsの抗菌活性はプロテイナーゼＫ、プロナーゼ
Ｅ、キモトリプシン又はトリプシンによる消化に対して
抵抗性であった。更に、Ac−AMPsは100℃までの温度で1
0分間の熱処理にも、また、pH2又はpH11という過酷なpH
条件にも影響されなかった。しかしながら、ジチオトレ
イトールによるそのシステイン残基の還元により、抗菌
活性は完全に消滅した。

この蛋白質は、その生物学的活性がプロテアーゼ処理
又は過酷な温度及びpH条件への暴露により影響されない
という理由で、著しく安定である。この安定性は比較的
多数のジスルフィド結合により保持されるコンパクトな
球形構造によるものであり得る。これらのジスルフィド
結合は生物学的活性に対して重要である。

実施例８ Ac−AMPsの抗菌効力（antifungal potency）。

実施例２に記載の評価方法を使用して、AC−AMPsの抗
菌効力を14種の植物病原菌（plant pathogenic fungu
s）について試験した。菌の生長、菌胞子の捕集と収穫
及び菌糸フラグメントの調製は従来の方法（Broekaert,
等;1990;FEMS Microbial Lett,69.55−60）で行った。
下記のごとき菌株を使用した：アルテルナリアブラシ
コラ（Alternaria brassicola）MUCL 20297、アスコキ
タピシ（Ascochyta pisi）MUCL 30164、ボトリチス
シネレア（Botrytis cinerea）MUCL 30158、セルコ
スポラベチコラ（Cercospora beticola）菌株K897、
コレトトリクムリンデムチアヌム（Colletotrichum
lindemuthianum）MUCL 9577、フサリウムクルモルム
（Fusarium culmorum）IMI 180420、ミコスファエレラ
フィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）フィ
ジエンシス（fijiensis）変種IMI 105378、フィトフト
ラインフェスタンス（Phytophthora infestans）、
リゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）CBS 207
−84、スクレロチニアスクレロチアヌム（Sclerotini
a sclerotianum）MUCL 30163、セプトリアノドルム
（Septoria nodorum）MUCL 30111、トリコデルマハ
マタム（Trichoderma hamatum）MUCL 29736、ベルチシ
リウムダリアエ（Verticillium dahliae）MUCL 1921
0及びベンツリアインアエクアリス（Venturia inaequ
alis）MUCL 15927。

Ｃベチコラ、Ｒソラニ、Ｓスクレロチアヌム、
Ｓノドルム、Ｍフィジエンシス及びＰインフェス
タンスについては、菌糸フラグメントを接種材料として
使用した。他の全ての菌は胞子として接種した。

次の供試菌類:A ブラシコラ（★）;A ピシ（ｘ）;B
シネレア（＋）;C リンデムチアヌム（□）;F クル
モルム（■）;V ダリアエ（▲）を使用して、Ac−AMP1
（パネルＡ）及びAc−AMP2（パネルＢ）の濃度を変化さ
せて測定した菌生長抑制率の施用量−応答曲線を図６に
示す。

前記した14種の植物病原菌に対するAc−AMPsの抗菌活
性を、既知のキチン結合性蛋白質、ネットルレクチン及
びエンドウキチナーゼの抗菌活性と比較した。その結果
は表１に要約されている:IC₅₀は接種から48時間後に50
％の抑制率を得るのに必要な濃度（μg/m）である。
生長の遅い菌、Ｓノドルム及びＶインアエクアリス
は接種から、それぞれ、５日及び15日後に測定した。ネ
ットルレクチン［又はウルチカジオイカ（Urtica di
oica）凝集素（aggulutinin）、UDA］は、文献（Peuman
s等,1983,FEBS Lett,177:99−103）に記載の方法に従っ
て、スチンギングネットル（ウルチカジオイカ）の根
茎から単離した。キチナーゼはMauch等の方法（1988,Pl
ant Physiol,87:325−333）の方法に従ってエンドウの
さや（pod）から単離した。

接種から48時間後に50％の抑制率を得るのに必要なAc
−AMPsの濃度（IC₅₀）は供試微生物の種類に応じて0.8
〜30μg/mの間で変動した。Ac−AMP1の抗菌効力はAc
−AMP2の抗菌効力と殆ど同一であった。

Ac−AMPsはこの研究で試験した14種の菌の全てについ
ての強力な抑制剤であった。その特異性は、１〜10μg/
mのIC₅₀値で典型的に菌の生長を抑制する小麦チオニ
ンと匹敵する（Cammue等,1992,J Biol Chem,267:2228−
2233）。ネットルレクチン又はキチナーゼのごとき他の
キチン結合性蛋白質と比較して、Ac−AMPsははるかに高
い特殊な活性を有する。ネットルレクチンは100μg/m
以下の濃度では11種の菌の内、６種の菌しか抑制しない
が、この濃度においては、エンドウキチナーゼは試験し
た７種の菌の内、１種の菌しか抑制しない。

生体外での菌の生長の強力な抑制剤としてのAc−AMPs
の独特な性質は、菌微生物による侵入に対して種子及び
苗木を保護することにおいてその役割を果たし得ること
を示唆している。

実施例９抗菌活性に対するイオンの影響。

Ac−AMPsの特殊な活性は増殖培地のイオン濃度に大き
く依存することが認められた。KCl又はCaCl₂を種々の量
で添加した又は添加していない低イオン濃度合成増殖培
地における、B.シネレアの生長抑制についてのAc−AMP1
（パネルＡ）及びAc−AMP2（パネルＢ）の施用量−応答
曲線を図７に示す。Ac−AMPsによって惹起されるB.シネ
レアの生長抑制に対するK⁺及びCa²⁺の拮抗作用は明白で
ある。2.5mMの一価カチオンと0.1mMの二価カチオンを含
有する参照培地（■）においては、Ac−AMP1及びAc−AM
P2は、それぞれ、2.2及び1.6μg/mのIC₅₀を有してい
た。この培地に10mMのKClを添加した場合（ｘ）には、
施用量−応答曲線は大きな影響を受けないが、KCl濃度
が50mMの場合（□）には、IC₅₀が約３倍まで増大した。
CaCl₂ははるかに大きい劇的な拮抗作用を有する。参照
培地に1mM添加した場合（★）には、CaCl₂によりIC₅₀が
５〜６倍まで増大した。CaCl₂を5mM添加した場合（＋）
には、生長抑制活性の低下は50倍以上であった。NaCl及
びNH₄ Clのごとき一価カチオンを有する他の塩の拮抗作
用はKClに類似していたが、MgCl₂及びBaCl₂のごとき二
価カチオンを有する塩の拮抗作用はCaCl₂の拮抗作用に
類似していた。

これらの結果はAc−AMPsの抗菌活性は無機塩の存在に
よって著しく減少することを示している。塩の拮抗作用
は主としてカチオンによるものである；二価カチオンは
一価カチオンより強力な拮抗剤である。

実施例 10 バクテリアに対するAc−AMPsの効果。

抗バクテリア活性を実施例２に記載の方法で測定し
た。次のバクテリア菌株を使用した：バシルスメガテ
リウム（Bacillus megaterium）ATCC 13632、エルウイ
ニアカロトボラ（Erwinia carotovora）菌株3192、
エシエリシアコリ（Escherichia coli）菌株HB 101
及びサルシナルテア（Sarcina lutea）ATCC 9342。A
c−AMPsの抗バクテリア活性はバクテリア懸濁液に蛋白
質の連続稀釈物を添加することにより測定した。最高試
験濃度は500μg/m（最終濃度）であった。結果を表２
に示す。

Ac−AMPsはグラム陽性バクテリア、Ｂメガテリウム
及びＳルテアの生長は抑制した。しかしながら、Ac−
AMPsはグラム陰性バクテリア、Ｅカロトボラ及びＥ
コリは抑制しなかった。

実施例 11 培養ヒト細胞に対する精製抗菌性蛋白質の効果。

Ac−AMPsを哺乳動物に対するその潜在的な毒性作用に
ついて評価した。

ヒト細胞に対する毒性の評価は96−ウエル（96−wel
l）マイクロプレート中で培養した、へそ（umbilical）
静脈内皮細胞（Alessei等,1988,Eur J Biochem,175,531
−540）又は皮膚筋肉繊維芽細胞（Van Damme等,1987,Eu
r J Immunol,17,1−７）について行った。増殖培地の代
わりに、80μの無血清培地［内皮細胞についてはオプ
チメン（Optimen）１、繊維芽細胞についてはイーグル
の最小必須培地（Eagle's minimal essential medium）
（EMEM）］を使用し、これに20μのフィルター殺菌供
試溶液を添加した。更に、細胞を５％CO₂雰囲気及び100
％相対湿度の下で、37℃で24時間インキュベートした。
細胞の生存率（viability）をトリパンブルー（燐酸緩
衝液,PBS中、400mg/）で10分間染色した後、顕微鏡で
評価した。別法として、細胞をニュウトラルレッド（ne
utral red）（PBS中、56mg/）で37℃で２時間染色し
た。細胞を酸性エタノール（50％のエタノールを含有す
る100mMクエン酸、pH4）中に溶解させ（lyse）、染料の
遊離（release）を540nmでの顕微分光光度分析により測
定した。

培養したヒトへそ静脈内皮細胞又は皮膚筋肉繊維芽細
胞に500μg/mまで添加した場合、Ac−AMP1及びAc−AM
P2はいずれも、24時間のインキュベートの後に、細胞の
生存率に影響を与えなかった。これに対して、β−プロ
チオニンは、50μg/m添加した場合、両者の細胞の生
存率を90％以上まで減少させた。

実施例 12 Ac−AMP2 cDNAの分子クローニング。

十分に成熟させたアマランサスカウダタスの種子を
屋外で成長させた植物から回収し、直ちに液体窒素中で
凍結し、−80℃で貯蔵した。De Vries等の方法（1988,P
lant Molecular Biology Manual,B6,1−13）により、組
織1g当り、6mの1:2フェノール:RNA抽出緩衝液混合物
と2mのクロロホルムを使用して、5gの粉砕した種子か
ら全RNAを抽出した。Silflow等により文献に記載された
オリゴ（dT）−セルロースアフィニテイクロマトグラフ
ィー（1979,Biochemistry,18,2725−2731）によりポリ
（Ａ）⁺RNAを精製して、約７μｇのポリ（Ａ）⁺RNAを得
た。Gubler及びHoffmanの方法（1983,Gene,25,263−26
9）に従って、1.5μｇのポリ（Ａ）⁺RNAから二重鎖cDNA
を調製しついでPharmaciaからのcDNA合成キット（cDNA
Synthesis Kit）を使用してEcoR I/Not Iアダプター
に連結した。cDNAをλZAP IIファージベクター（Strata
gene）中にクローンしついでギガパック II ゴールドパ
ッキングシステム（Gigapack II Gold packing syste
m）（Stratagene）を使用して，製造業者の取扱説明書
に従って生体外でパッケージした。

cDNAライブラリーのスクリーニングのためのDNAプロ
ーブを以下の方法でポリメラーゼ鎖反応（PCR）により
製造した:2個の縮重（degenerate）オリゴヌクレオチ
ド： OWB13（5'GTNGGNGARTGKGTNMGNGG）及び OWB14（5'CCRCARTAYTTNGGNCCYTTNCC）を合成した。OWB13はAc−AMP1のアミノ酸１〜７に相当
し、センス配向（sense orientation）を有する。OWB14
はAc−AMP1のアミノ酸22〜29に相当し、アンチセンス配
向（antisense orientation）を有する。PCRはアンプリ
ファイアーとしてOWB13及びOWB14を使用し、ターゲトDN
Aとして25ngのcDNAを使用してかつTaqポリメラーゼを使
用して標準的な条件下（Sambrook等,1989,Molecular Cl
oning,Cold Spring Harbour Lab Press）で行った。温
度プログラムは94℃で５分間の初期工程、30サイクル
（94℃で１分間;45℃で２分間;72℃で３分間）及び72℃
で10分間の最終工程から構成した。100bp PCR増幅生成
物（amplification product）を３％アガロース（NuSie
ve,FMC）ゲル上で精製しついで反応混合物に200μＭのd
TTPの代わりに130μＭのdTTPと70μＭのジゴキシゲニン
−11−dUTP（digoxigenin−11−dUTP）を含有させたこ
と以外、前記と同一の条件下でのPCRにより再増幅させ
た。ジゴキシゲニン標識した（digoxigenin−labelle
d）PCR生成物を３％ヌシーブアガロースゲル（NuSieve
agarose gel）上で精製した。

約100,000プラーク形成単位（plaque forming unit）
のλNAP II cDANライブラリーを、ナイロン膜［ハイボ
ンド−Ｎ（Hybond−Ｎ）Amersham］を使用してin situ
プラークハイブリダイゼーション（in situ plaque hy
bridisation）を行うことによりジゴキシゲニン標識PCR
生成物を使用してスクリーンした。ナイロン膜を風乾
し、DNAを膜上でUV光線（0.15J/cm²）の下で架橋させ
た。ハイブリダイゼーションは5 x SSC、１％ブロッキ
ング剤（blocking agent）（Boehringer Mannheim）、
0.1％Ｎ−ラウリルサルコシン、10ng/mの熱変性（hea
t−denatuated）ジゴキシゲニン標識プローブを含有す
る0.02％ドデシル硫酸ナトリウム中で65℃で16時間行っ
た。2 x SSC/0.1％SDS中で25℃で５分間、２回及び0.1
x SSC/0.1％SDS中で60℃で15分間、２回、洗浄すること
により、非特異的に結合した（non−specifically boun
d）プローブを除去した。プローブの検出（detection）
はアルカリ燐酸塩に結合されたアンチ−ジゴキシゲニン
抗体（anti−digoxigenin antibody）（Boehringer Man
nheim）及びその基体、５−ブロモ−４−クロル−３−
インドリルホスフェート（Boehringer Mannheim）を使
用してその製造業者の使用説明書に従って行った。正の
プラーク（positive plaque）を同一のプローブを使用
してかつ同一の条件下で２回の追加的なスクリーニング
工程を行うことにより精製した。精製プラークからのイ
ンサートを、生体内で、製造業者の使用説明書に従って
ヘルパ−ファージR408を使用して切除して（excite）、
ｐブルースクリプトファージミド（pBluescript phagem
ide）型にした。ヌクレオチドの配列決定（sequencin
g）は、フルオレセイン標識M13前進及び逆行プライマ−
（M13 forward and reverse primer）（Pharmacia）を
使用して、ALF自動シークエンサーを使用して行った。
配列分析はインテリジェニックスPC−遺伝子ソフトウエ
アー（Intelligenetics PC−genesoftware）により行っ
た。

種々の正のクローン（positive clone）からのインサ
ートをEcoR I消化により遊離させ（release）、その長
さをアガロース電気泳動により比較した。最長のインサ
ートを有するクローン（AC1）をヌクレオチド配列分析
にかけた。AC1は590ヌクレオチドの長さであり、86アミ
ノ酸のオープンリーデイングフレームを含有している。
25アミノ末端アミノ酸は（−1,−３）−ルール（Von He
ijne,1985,Mol.Biol,184,99−105）に従った、予測され
た（predicated）シグナルペプチド構造を有する。推定
上のシグナルペプチド（putative signal peptide）の
後の領域の、推定アミノ酸配列（deduced amino acid s
equence）は、蛋白質配列決定によって測定したごと
き、成熟Ac−AMP2の30アミノ酸配列と同一である。更
に、成熟蛋白質領域（mature protein domain）は31−
アミノ酸カルボキシ末端領域によって伸長されている。
このカルボキシ末端の伸長はAc−AMP2の準細胞ターゲッ
チング（subcellular targeting）において役割を果た
す。AC1は5'及び3'末端に、それぞれ、45ヌクレオチド
及び284ヌクレオチドの非翻訳領域を有する。3'末端非
翻訳領域はポリ（Ａ）テイル（tail）によって末端停止
されておらず、これは、AC1は完全な長さのcDNAクロー
ンでないことを示している。

他の９種の配列決定された（sequenced）正のクロー
ンの全てはAC1と同一の推定アミノ酸配列を有してい
た。これらは5'及び3'末端におけるトランケーション
（truncation）の程度によって相互に相違していた。10
種の配列決定されたクローンの全てが成熟蛋白質領域の
30の位置にアルギニンを含有しているという事実は、Ac
−AMP1及びAc−AMP2の両者が同一のプレ蛋白質から誘導
されていることを示唆している。

カルボキシ末端伸長ペプチドはアミノ酸水準又はヌク
レオチド水準において、それぞれ、スイス−プロット
（Swiss−prot）［リリース（release）20］又はEBML遺
伝子バンク（リリース29）からのエントリー（entry）
のいずれとも適切な相同性（relevant homology）を示
さなかった。従って、Ac−AMP2 cDNAの構造は独特のも
のでありかつキチン結合性蛋白質をエンコードする既知
の遺伝子の構造とは明らかに異なると考えられる。

図８は、クローンAC1のヌクレオチド配列と推定アミ
ノ酸配列を示す。推定シグナル配列にはアンダーライン
が引かれており、成熟Ac−AMP2のアミノ酸配列は四角形
で囲まれている。停止コドンには星印が付されている。

実施例 13 発現ベクターpAC11及びpAC12の構築（construction）。

２種の異なる発現カセットをクローンAC1のインサー
トの２つの部分に基づいて構築した。

第１の発現ベクター（図９に示すpAC11）はAc−AMP2
cDNAの完全コーデイング領域であって、その5'末端に、
高い転写活性を与えるための重複（duplicated）エンハ
ンサー成分（Kay等,1987,Socience,236,1299−1392）を
有するカリフラワーモザイクウイルスの35S RNA、CaMV3
5S（Odell等,1985,Nature,313,810−812）の強力な構成
プロモーターが隣接（flank）しているものを含有して
いる。Ac−AMP2 cDNAのコーデイング領域は、その3'側
にCaMV35Sポリアデニレーション配列が隣接している。
このベクターのプラスミド主鎖はファージミド（phagem
id）pUC120（Vieira及びMessing,1987,Method Enzymol,
153,3−11）である。

pAC11は次の方法でクローンAC1から構築した。クロー
ンAC1は、5'末端がM13普遍プライマー（universal prim
er）結合部位に向合うようにｐブルースクリプトSK
（＋）（Stratagene製）のEcoR I部位にクローンされて
いるAc−AMP2 cDNA（図８に示されている）からなる。A
C1をEcoR V（ｐブルースクリプトのSKポリリンカー内で
切断）及びNhe I（停止コドンの９塩基下流にある塩基
位置315にある、Ac−AMP2 cDNA配列内で内部的に切断）
により消化した。EcoR I/Nhe I 322塩基フラグメント
を、Sma IとXba Iで予め消化した発現ベクターpFAJ3002
中にサブクローンした。pFAJ3002は、特定のEcoR I部位
がHind III部位によって置換されている発現ベクターpF
F19（Timmermans等,1990,J Biotechnology,14,333−34
4）の誘導体である。

第２の発現ベクター（図9Bに示すpAC12）は、Ac−AMP
プレ蛋白質のシグナルペプチドと成熟領域をコードする
オープンリーデイングフレームを含有している。このオ
ープンリーデイングフレームはその5'側に重複CaMV35S
プロモーターが隣接しており、3'側にCaMV35Sポリアデ
ニレーション配列が隣接している。

pAC12は次の方法で構築した。216bpフラグメントを、
DNA鋳型としてAC1を使用し、センス及びアンチセンスプ
ライマーとして、それぞれ、OWB32及びOWB33を使用して
ポリメラーゼ鎖反応により増幅した。プライマーOWB32
（5'AATTGGATCCAGTCAAGAGTATTAATTAGG）はAc−AMP2 cDN
Aのヌクレオチド17〜36に相当し、PCR増幅生成物の5'末
端にBamH I部位を導入する。OWB33（5'AATTGTCGACTCAAC
GGCCACAGTACTTTGGGCC）はAc−AMP2 cDNAのヌクレオチド
190〜210に相当し、インフレーム停止コドンとSal I部
位をPCR増幅生成物の3'末端に連結する。OWB32及びOWB3
3の両者は制限部位の前の5'末端に4bpのランダム配列を
有する。PCR生成物をBamH I及びSal Iで消化しついで上
記と同一の制限酵素で予め消化した発現ベクターpFAJ30
02中にサブクローンした。

実施例 14 植物形質転換ベクターpAC111及びpAC112の構築。

発現ベクターpAC11及びpAC12をHind IIIで消化しつい
でAc−AMP2 cDNA発現カセットを含有するフラグメント
をpBin19Riの固有の（unique）Hind III部位中にサブク
ローンしたした。pBin19Riは植物形質転換ベクターpBin
19の修飾体（modified version）（Bevan,1984,Nucleic
Acids Research,12:22,8711−8721）であり、このpBin
19Riにおいては固有のEcoR I及びHind III部位がスイッ
チされておりかつ欠陥（defective）npt II発現カセッ
ト（Yenofsky等,1990,Proc Natl Acad Soc USA,87:3435
−3439）がAn等により文献（1985,EMBOJ,4:277−284）
に記載のnpt II発現カセットにより置換されている。

pAC11発現カセットを含有する植物形質転換ベクター
は消化されたpAC111であり、一方、pAC12発現カセット
を含有する植物形質転換ベクターは消化されたpAC112で
ある。２種の形質転換ベクターの構造は図10に示されて
いる。

実施例 15 植物形質転換。

安全化した（disarmed）アグロバクテリウムツメフ
ァシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA440
4［pAL4404］（Hoekema等,1983,Nature,303:179−180）
はFramond A等の方法（Biotechnology,1:262−９）を使
用して、ベクターpAC111又はpAC112により形質転換し得
る。

タバコの形質転換はHozsch RB等の方法（1985,Scienc
e,227,1229−31）に基づいて、ニコチナタバクムサ
ムスン（Nicotina tabacum Samsun）の葉の円盤を使
用し、pAC111又はpAC112を含有するアグロバクテリウム
菌株と共に共培養することにより行い得る。共培養は10
0μg/mのカナマイシンの選択圧（selective pressur
e）下で行い得る。トランスジェニック植物（pAC111又
はpAC112で形質転換）は100μg/mのカナマイシンを含
有する培地で再生し得る。これらのトランスジェニック
植物は標準ウエスタンブロッテイング技術を使用して、
新規に導入された遺伝子の発現について分析し得る。ト
ランスジェニック植物は菌又はバクテリアによる病害に
対する改善された抵抗性についても分析し得る。

導入された遺伝子の構成的発現を行うことのできる植
物を選択し、自花受粉させて種子を得ることができる。
Ac−AMP遺伝子の安定な組込みを示す種子の後代はAc−A
MP遺伝子についての典型的なメンデルの遺伝様式を示す
ことが期待されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者リース，サラ，ブロンウエンイギリス国．アールジイ12・３エツクスエツクス．バークシヤー．ブラツクネル．フオーレスト・パーク．ミツチエルドバー・ウエイ．32 (72)発明者ヴアン−デルレイデン，ヨセフベルギー国．ビイ−3001・ヘヴエルリー．カステンイエラーン．12 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アマランサスの種子から単離されたかつ下
記（１）又は（２）のアミノ酸配列を有する抗菌性蛋白
質：
【請求項２】アマランサスの種子から単離することので
きるかつ下記（１）のアミノ酸配列を有する純粋な蛋白
質、Ac−AMP1:
【請求項３】アマランサスの種子から単離することので
きるかつ下記（２）のアミノ酸配列を有する純粋な蛋白
質、Ac−AMP2:
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質の
アミノ酸配列を有する純粋な蛋白質。
【請求項５】合成物である、請求項４に記載の蛋白質。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質を
コードする組換え体DNA。
【請求項７】請求項６に記載のDNAを含有するベクタ
ー。
【請求項８】植物ゲノムから単離されたDNAを含有す
る、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】請求項６に記載のDNAの発現により産生さ
れる蛋白質。
【請求項１０】請求項１〜５又は９のいずれかに記載の
蛋白質の１種又はそれ以上を含有する抗菌性組成物。
【請求項１１】菌類又はバクテリアを、請求項１〜５の
いずれかに記載の蛋白質又は請求項10に記載の組成物に
暴露することからなる、菌類又はバクテリアの撲滅方
法。
【請求項１２】請求項１〜５又は９のいずれかに記載の
蛋白質を、これを含有する有機材料から製造するための
抽出方法であって、上記有機材料をマーセレーション及
び溶剤抽出にかけることからなる、殺生物活性を有する
蛋白質を製造するための抽出方法。
【請求項１３】蛋白質を引続いて遠心分離、クロマトグ
ラフィー及び透析により精製する、請求項12に記載の方
法。
【請求項１４】有機材料がアマランサスの種子からな
る、請求項12又は13に記載の抽出方法。