JPH07502976A

JPH07502976A - 殺生物性蛋白質

Info

Publication number: JPH07502976A
Application number: JP4509879A
Authority: JP
Inventors: ブロケルト，ヴイレム，フランス; カム，ブルノ，フイリツプ，エンジエロ; リース，サラ，ブロンウエン; ヴアン−デルレイデン，ヨセフ
Original assignee: ゼネカ・リミテツド
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-03
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2017-11-20
Also published as: GB9112300D0; EP0593501A1; BR9206105A; WO1992021699A1; AU1780092A; DE69232498D1; JP3347326B2; ES2173865T3; DE69232498T2; ATE214732T1; EP0593501B1; AU663500B2; NZ243063A; CA2110403A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】殺生物性蛋白質本発明は殺生物性蛋白質（ｂｉｏｃｉｄａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、その製造方法及び使用方法及びこれをコードするＤＮＡ配列に関する。特に、本発明はアマランサス（＾ｍａｒａｎｔｈｕｓ）から単離された抗菌性蛋白質（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に関する。

アマランサス　力ウダタス（＾ｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｃａｕｄａｔｕｓ）　［アマランサス（ａｍａｒａｎｔｈ）］は熱帯、亜熱帯及び温帯地域において広範囲に生育している、薬草（ｈｅｒｂ）及び潅木（ｓｈｒｕｂ）の大きな科（ｆａｍｉ　ｌｙ）、ヒュ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）に属している。アマランサスはアメリカの古来の食用作物であり、中央及び南部アメリカ、アジア及びアフリカの一部で穀物の生産のために依然として栽培されている。アマランサスの種子は膨張させ（ｐｏｐｐｅｄ）、焼き（ｔｏａｓｔｅｄ）　、調理してかゆ（ｇｒｕｅｌ）にし、粉砕して粉末としまた平らなパン（ｆｌａｔ　ｂｒｅａｄ）にすることかでき、かつ、特に高い栄養価を有する（Ｂｅｔｓｃｈａｒｔ等、　１９８１゜Ｊ、　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　４６．１１８１−１１８７；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等、　１９８７．　Ｐｌａｎｔ　Ｆｏｏｄｓ、Ｈｕｍ。

Ｎｕｔｒ、　３６，３０９−３２４）。アマランサスは庭園観賞用植物としても世界中で広く栽培されている。

植物は、通常、菌類生物（ｆｕｎｇａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）に著しく富む基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上で生長するが、感染した状態になることは希である。

潜在的な侵入物（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　１ｎｖａｄｅｒ）を排斥するために、植物はその構成要素として又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生ずる。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されているものはフィトアレキシン、即ち、適当な防御関連信号分子（ｄｅｆｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の知覚（ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）に基づいて特異的に合成される、広範囲の抗菌活性を有する二次代謝産物（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）である。フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生合成経路の酵素をコードする一連の遺伝子の転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に基づいている。しかしながら、最近の１０年間に幾つかの植物蛋白質は植物病原性菌類（ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ）の制御においてより直接的な役割を果たし得ることが次第に明らかになった。現在では、ベーター−１，３−グルカナーゼ、リボソーム−不活性化蛋白質、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎ）、キチナーゼ、キチン結合性レクチン（ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｉｅｃｔｉｎ）及びゼアマチン（ｚｅａｔｎａｔｉｎ）を包含する、抗菌性を有する種々の蛋白質が確認されている。

キチン（ポリ−β−１，４，−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）は菌類（ｆｕｎｇｉ）の細胞壁及び無を推動物の外骨格中で見出だされる多糖である。植物はキチン又はキチン状構造体を含有していないが、この多糖に対して強い親和性を示す蛋白質が種々の植物源から単離されている（Ｒａｉｋｈｅｌ及びＢｒｏｅｋａｅｒｔ、　１９９］、、　Ｖｅｒｍａ編、　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、印刷中）。

かかるキチン結合性蛋白質の例は、マメ（ｂｅａｎ）　（Ｂｏｌ　ｌｅｒ等、　１９８３゜Ｐｌａｎｔａ、　１５７　：　２２−３１）、小麦（Ｍｏｌａｎｏ等、　１９７９．ＪＢｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２５４　：４９０１−４９０７）及びタバコ（Ｓｈｉｎｓｉ等、　１９８７　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｏｃｊＵＳＡ、　８４．８９−９３）からの塩基性キチナーゼ；小麦（Ｒｉｃｅ及びＥｔｚｌｅｒ、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ、　５９：　４１４−４１９）、大麦（Ｐｅｕｒｎａｎｓ等、１９８２．　Ｂｉｏｃｈｅｒｎ　Ｊ、　２０３：　２３９−１４３）、イネ（Ｔｓｕｄａ　。

１９７９、　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８６：　１４５１−１４６１）及びスチンギングネットル（ｓｔｉｎｇｉｎｇ　ｎｅｔｔｌｅ）（Ｐｅｕｍａｎｓ等、　１９８３．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｓ、　１７７：　９９−１０３）からのキチン結合性レクチン、及びヘベイン（ｈｅｖｅｉｎ）と呼ばれるゴムの木のラテックスからの小蛋白質（Ｖａｎ　Ｐａｒｉｊｓ等、　１９９１．　Ｐｌａｎｔａ。

１８３：　２５８−２６４）である。これらのキチン結合性蛋白質の全ては約４０〜４３アミノ酸の相同性の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）システィン／グリシン富化領域（ｃｙｓｔｅｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｄｏｍａｉｎ）を占めており、この領域ζ１２回（ネットルレクチンの場合）又は４回（小麦、大麦及びイネレクチン場合）反復しているか又は関係のない領域と融合している（塩基性キチナーゼの場合）。

これらの蛋白質の正確な生理学的役割は不明であるが、これらは全て生体外で抗生物活性（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示し、防御関連機能（ｄｅｆｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を示唆している。抗菌特性（ａｎｔｉｆｕｎｇｕｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ）はキチナーゼ（Ｓｃｈ　ｌｕｍｂａｕｍ等、　１９８６゜Ｎａｔｕｒｅ、　３２４：　３６５−３６７　；　Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ等、　１９８８．　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｍｏｌ　ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ、　３３：　３１９−３３１）、ネットルレクチン（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ等、　１９８９゜５ｏｃｉｅｎｃｅ、　２４５：　１１００−１１０２）及びヘベイン（Ｖａｎ　Ｐａｒｉｊｓ等、　１９９１゜Ｐｌａｎｔａ、　１８３：　２５８−２６４）によるものとされている。小麦レクチンは昆虫の幼虫の発育に対して有害な作用を生ずる（Ｍｕｒｄｏｃｋ等、　１９９０゜Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、　２９：　８５−８９　；　Ｃｚａｐｌａ及びＬａｎｇ　、　１９９０．　Ｊ　ＥｃｏｎＥｎｔｏｍｏｌ、　８３：　２４８０−２４８５）　、しかしながら、菌類及び昆虫におし）で観察される殺生物活性がこれらの蛋白質のキチン結合活性と関係があるか否かは確立されていない。

植物を菌による病害に対して保護する際にキチン結合性蛋白質、特にキチナーゼ、を適用して成功したことが報告されている。米国特許第４９４０８４０号（ＤＮＡ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によれば、バクテリア、セラチア　マルセツセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）からのキチナーゼ遺伝子を発現するタバコ植物は、菌類、アルテルナリア　ロンギペス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　Ｉｏｎｇｉｐｅｓ　）に対して感受性が少ないように思われる。欧州特許出願第４１８６９５号（Ｃｉｂａ　Ｇｅ１ｇいには、タバコキチナーゼ遺伝子からの調節ＤＮＡ配列を使用して、病原体に対する改善された抵抗性を有するトランスジエニ・ツク植物を生ずる導入遺伝子を発現させることが記載されている。特許出願第ＷＯ９００７０００１号（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ）には、菌病原体に対する改善された抵抗性を与えるキチナーゼを過発現する（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）　トランスジェニック植物の生産が記載されている。

今般、本発明者はキチン結合特性を示す、新規な種類の重要な抗菌性（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ）蛋白質を精製した。

本発明によれば、アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）の種子から単離することのできる抗菌性蛋白質が提供される。

別の要旨によれば、本発明は本発明による蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターを包含する。このＤＮＡはエンコードされた（ｅｎｃｏｄｅｄ）蛋白質の発現を可能にする生物学的な系にクローンするか又は形質転換し得る。

本発明は、更に、本発明による抗菌性蛋白質をエンコードする組換え体ＤＮＡを使用して形質転換した植物も包含する。

本発明は、更に、菌類（ｆｕｎｇｉ）又はバクテリア（ｂａｃｔｅｒｉａ）を本発明による蛋白質に暴露することからなる、菌類又はバクテリアの撲滅方法も包含する。

単離された。この種の蛋白質は以下において、それぞれ、Ａｃ−ＡＭＰＩ［アマランサス　カウダタスー抗菌性蛋白質１　（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓｃａｕｄａｔｕｓ−ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）コ及びＡｃ−ＡＭＰ２　［アマラン＋７．　カウダタスー抗菌性蛋白質２　（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｃａｕｄａｔｕｓ　−ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２　）　］　と称する２種の蛋白質因子（ｐｒｏｔｅｉｎｆａｃｔｏｒ）を包含する。

両者共、二量体状蛋白質であり、２個の同一の３　ｋＤａサブユニットからなる。両者の蛋白質は高度に塩基性であり、１０以上のｐＩ値を有する。類似する抗菌活性を有する蛋白質を＞”ｊ−７，リビダス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ　１ｉｖｉｄｕｓ　）及びゴムフレナ　グ三ボサ（Ｇｏｍｐｈｒｅｎａ　ｇｌｏｂｏｓｓａ）を包含する種々の密接な関連を有する種の種子から抽出した。

Ａｃ−八ＭＰＩのアミノ酸配列（２９残基）とＡｃ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列（３０残基）は、後者がカルボキシル末端に１個の追加の残基を有すること以外、同一である。これらのアミノ酸配列についての知識により、標準的なペプチドシンセサイザーを使用してＡｃ−ＡＭＰ蛋白質を製造することが可能である。

＾ｃ−ＡＭＰＩとＡＣ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列は多くのキチン結合性蛋白質中に存在するシスティン／グリシン富化領域と高度に相同性である。

更に、ＡＣ−ＡＭＰＩとＡｃ−＾ＭＰ２はキチンに結合しかつ低いｐＨで脱着されることができ（キチナーゼとレクチンにより示される性質）、従って、キチン結合性蛋白質の群の新規な一員と考えられ得る。しかしながら、従来特性が測定されているキチン結合性蛋白質中で見出だされる、通常の４０−４３アミノ酸のシスティン／グリシン富化領域と比較した場合、＾ｃ−ＡＭＰｓは種々の特徴により区別される。これらの特徴としては塩基性アミノ酸の高い存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）　、追加のアミノ末端残基（ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ）の存在、６位及び９位での４個のアミノ酸のギャップの存在及び１０−１２残基のカルボキシ末端蛋白質の欠如が挙げられる。

Ａｃ−ＡＭＰｓをエンコードするｃＤＮＡを単離腰配列決定を行った。

Ａｃ−ＡＭＰ２をエンコードするｃＤＮＡの特性を測定した。このＤＮＡは８６ −アミノ酸プレプロティン（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）と２５−アミノ酸カルボキシ末端エクステンションをエンコードする。このプレプロティンは他の既知のキチン結合性蛋白質の先駆体の全てと異なる。Ａｃ−ＡＭＰＩをエンコードするｃＤＮＡはＡｃ−ＡＭＰ２の翻訳後分解生成物（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）と同定された０このＤＮＡは標準核酸シンセサイザーを使用して製造することかでき、或いは、適当なプローブ（既知の配列から誘導）を使用して植物ゲノムから実際の＾ｃ−ＡＭＰ遺伝子と制御配列を単離し得る。ついでこの遺伝物質を構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）又は誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下での蛋白質の発現を可能にする生物学的系にクローンし得る。従って、蛋白質を適当な微生物又は培養細胞（ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌ）中で製造し、抽出しついで細胞及び培養哺乳動物細胞が挙げられる。

このＤＮＡを使用して既知の方法により任意の植物種を形質転換し、その結果、抗菌性蛋白質をこの植物内で発現させる。

本発明による植物細胞は、本発明による構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を使用して多数の既知の方法［アグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）Ｔｉプラスミド、エレクトロポレーション（６１ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、マイクロプロジエクテイルガン（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｇｕｎ）等コにより形質転換し得る。ついで、適当な場合には、形質転換細胞を、新規な核物質がゲノム中に安定に組込まれている全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）として再生させることができる。この方法によりモノコツト（ｍｏｎｏｃｏｔ）及びジコット（ｄｉｃｏｔ）植物を得ることができるが、通常、後者の方が再生がより容易である。

本発明に従って遺伝的に修飾した（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ）植物の例としては次のものが挙げられるニドマド、マンゴ−、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及びメロンのごとき果実：カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、小麦、大麦及び米のごとき小粒穀類、トウモロコシ及び綿のごとき屋外作物（ｆｉｅｌｄ　ｃｒｏｐ）　；及びニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギのごとき野菜。

Ａｃ−へ肝蛋白質は広範囲の抗菌活性を示し、グラム陽性バクテリアに対しても活性である。＾ｃ−ＡＭＰ蛋白質は植物体部分に適用することにより殺菌剤又は抗生物質として使用し得る。Ａｃ−ＡｋｌＰ蛋白質は植物体内で発現させることにより菌類及びバクテリアを撲滅するのにも使用し得る。

＾ｃ−ＡＭＰＩ及び＾ｃ−ＡＭＰ２は、驚くべきことに、高い活性を示す；これらは、従来から既知の抗菌性キチン結合性蛋白質よりはるかに低い施用量において種々の植物病原菌の生長を抑制する。新規な蛋白質の抗菌活性はＣａ２＋により拮抗される。

ある種のキチン結合性蛋白質はキチンからなる外骨格を有する昆虫に対して効果を有することが知られている。Ａｃ−＾ＭＰｓと既知のキチン結合性蛋白質との配列の類似性は、Ａｃ−＾ＭＰｓも殺虫活性を有し得ることを示唆している。

Ａｃ−ＡＭＰ蛋白質はアマランサス　力ウダタス種子から単離し、精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工的に合成するか又は組換え体ＤＮＡの発現により適当な微生物内で製造し得る。この蛋白質はトランスジェニック植物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ）内でも発現させ得る。

本発明は図面を参照することにより更に理解されるであろう：図１は抗菌性蛋白質についてのカチオン交換クロマトグラムとこれに付随する菌生長抑制率についてのグラフを示す。

図２＾は精製Ａｃ−ＡＭＰＩの［１ＰＬＣプロフイールを示す。

図２Ｂは精製＾ｃ−ＡＭＰ２のＨＰＬＣプロフィールを示す。

図３は精製抗菌性蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

図４＾はＡｃ−ＡＭＰＩとＡｃ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列を示す。

図４Ｂはタバコキチナーゼ、マメキチナーゼ、ヘベイン、小麦レクチン、ネットルレクチン及びＡＣ−八ＭＰ２のアミノ酸配列の列を示す。

図５はキチン上の抗菌性蛋白質のアフィニテイクロマトグラフィーを行った後の、種々の溶出液の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

図６は抗菌性蛋白質の濃度を変化させて測定した、菌の生長抑制率曲線を示す。

図７は抗菌性蛋白質の濃度を変化させかつＫＣＡ又はＣａＣｌ２を添加するか又は添加することなしに測定した、Ｂ、シネレアの生長抑制率曲線を示す。

図８はＡｃ−ＡＭＰ２をエンコードするｃＤＮ＾のヌクレオトド配列と推定（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸配列を示す。

図９は発現ベクターｐＡｃ１１とｐＡｃ１２の構造を示す。

図１０は植物形質転換ベクターｐＡｃ１１１とｐＡｃ１１２の構造を示す。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例　１アマランサス　カウダタスの種子からの塩基性熱安定性蛋白質の抽出。

３０〜７５％の間の相対飽和度（ｒｅｌａｔｉｖｅ　５ａｔｕｒａｔｉｏｎ）で沈殿する蛋白質の硫酸アンモニウム分別を行った後、ｐＨ９で平衡化したＱ−セファ０−ス（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオン交換カラム上を通過させることにより塩基性蛋白質フラクション（ｐＩ　＞　９）を単離した。詳細な方法は以下に記載する。

１ｋｇのＬ　カウダタス種子（ベルギー、ウオンツ、Ｇｏｎｔｈｉｅｒから入手）をコーヒーミル中で粉砕し、得られた粗い粉末を、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，１５ｍ１ｌのＮａ２ＨＰＯ４，１００ｍＭのＫＣＩ　、２ｍＭのＥＤＴＡ、　２ｍＭのチオ尿素、１ｍＭのＰＭＳＦ及びｌｌｌ１ｇ／ｌのロイペプチンを含有する水冷抽出緩衝液（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）　３ｊ！を使用して４℃で２時間抽出した。ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）をチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）を通して絞り、遠心分離（７０００ｘ　ｇで５分間）により清澄化した。上澄液に固体硫酸アンモニウムを添加して相対飽和度を３０％とし、室温で１時間放置後に生成した沈殿を遠心分離（７０００ｘ　ｇで１０分間）により除去した。上澄液の硫酸アンモニウムの相対飽和度を７５％に調節しついで室温で一夜放置して生成した沈殿を遠心分離（７０００ｘｇで３０分間）により捕集した。ペレットを３００　ｍ７！の蒸留水に再度溶解させた後、不溶性物質を再度の遠心分離（７０００ｘ　ｇで２０分間）により除去した。

透明な上澄液を２０００　Ｄａの分子量カットオッフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｕｔ　ｏｆｆ）を有するベンゾイル化セルロースチューブ（ｂｅｎｚｏｙｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｔｕｂｉｎｇ）（Ｓｉｇｍａセントルイス、ＭＯ）を使用して蒸留水に対して長時間（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）透析した。透析後、１０倍に濃縮した緩衝液（ｔｅｎ−ｆｏｌｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｂｕｆｆｅｒ）を添加することにより溶液を５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ　（＋）Ｈ９）に調整し、ついで、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９）と平衡なＱ−セファロースファストフロー（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａスエーデン、アップサラ）　（１２ｘ５　ｃｍ）上を通過させた。カラムを通過した蛋白質を２０ｍＭ燐酸すｌ− ＩＪウム緩衝液に対して長時間透析した。

この物質はＬ　カウダタス種子の塩基性蛋白質フラクションに相当する。これについて更に行ったクロマトグラフィーによる精製は実施例３に記載されている。

実施例　２抗菌活性及び抗バクテリア活性の評価。

抗菌活性は従来の文献（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ、　１９９０．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ。

６９、５５−６０）に記載されているごとき顕微分光分析（ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）により測定した。試験は、慣用的に、２０μｌの（フィルター−殺菌）試験溶液と、１！２濃度の（ｈａｌｆｓｔｒｅｎｇｔｈ）馬鈴薯デキストロースブロス（Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｉｔｒｏｓｅ　Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ）中の菌胞子懸濁液（胞子数２　ｘ］、０４／ｍ（１）又は菌糸体フラグメント８０μｌを使用して行った。カチオンの拮抗作用の実験については馬鈴薯デキストロースブロスの代わりに合成増殖培地を使用した。合成増殖培地ハに２ＨＰＯ４（２，５ｍＭ）、Ｍｇ５０４（５０μＭ）、ＣａＣＡ’　２　ｃｓｏ　μ’）、ＦｅＳＯ４（５ｕ　’）、ＣｏＣｊ’　２　（０−１４’）、ｃｕｓ０４（０１μＭ）、Ｎａ２　ＭｏＯ４（２ｕ　”）、［１３ＢＯ３（０，５μＭ）、ＫＩ（０，１ｕ　Ｍ）、ＺｎＳ０４（０，５ｕ　Ｍ）、Ｍｎ５Ｏ４（０−１ｕ　Ｍ）、グルコース（１０ｇｅｌ　）　、アスパラギン（１ｇ＃’　）　、メチオニン（２０ｍｇ／Ａ’　）　、ｍｙｏ−イノシトール（２ｃ＋ｇ／ｌ　）　、ビオチン（０，２ｒｎｇ／Ｉ　）　、チアミン−ＨＣｌ　（１ｍｇ＃！　）及びピリドキシン−［ＩＣ１（０，２ｍｇ＃’　）からなる。対照ミクロ培養液（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍ１ｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）は２０ｕｌの（殺菌）蒸留水と８０μｌの菌胞子懸濁液を含有していた。

特に説明がない限り、供試微生物はフサリウム　クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）　（菌株ＩＭＩ　１８０４２０）であり、インキュベーションは２５℃で４８時間行った。生長抑制率（％）は５９５　ｎｍにおける対照ミクロ培養液の修正吸光度（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）に対する、対照ミクロ培養液の修正吸光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を差し引いたものの比の１００倍と定義される。修正吸光度値は４８時間後に測定した培養液の５９５　ｎｍでの吸光度から、３０分後に測定した５９５　ｎｍでの吸光度を差し引いた値に等しい。１５％より低い生長抑制率の値はクロマトグラムに示されない。抗菌活性（ｍ７！当りの単位数）は、所与の評価条件下で５０％の生長抑制率が得られる供試溶液の稀釈率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）の５０倍として算定した。

抗バクテリア活性は顕微分光分析により以下に述べるごとき方法で測定した。軟質栄養アガロース［トリプトン］Ｏｇ／ｌ；ジープラーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）アガロース（ＦＭＣ）　５　ｇ／Ａ’　］に接種することによりバアクテリア懸濁液を調製し、固化を防止するために３７℃に保持した。バアクテリア懸濁液（］　ｍ１．当り、１０５コロニー形成単位）のアリコート（８０μ７りを平底９６−ウェル（ｗｅｌｌ）マイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）中のフィルター殺菌試料（２０μＡ）に添加した。２８℃でのインキュベーションを３０分及び２４時間行った後、マイクロプレートリーダーを使用して、培養液の５９５　ｎｍでの吸光度を測定した。

生長抑制率は抗菌活性評価について述べたごとくして算定した。

実施例　３Ａ　カウダタス抗菌性蛋白質の単離のための出発原料は実施例１に記載のごとくして成熟種子から抽出した塩基性蛋白質フラクションであった。これらの蛋白質を図１に示すごとくカチオン交換クロマトグラフィーにより更に分離した。

約１００　ｍｇの塩基性蛋白質フラクションを２０　ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、予め燐酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＳ−セファロース高性能（Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　（１０ｘ　１．６　ｃｍ）上に供給した。カラムを０〜１５０１ｎＭのＮａＣ１を含有する２０　ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）　２１０　ｍｌを使用して直線的勾配で３０ｍＡ’／分の速度で溶離した。溶出液を２８０　ｎｍでの吸光度のオンライン測定により蛋白質ついて監視しくその結果は図１の下方パネルに示されている）、７．５ｍｌのフラクションを回収し、その２０μｍを実施例２で記載したごとき顕微分光分析による抗菌活性評価において試験した（その結果は図１の上方パネルに示されている）。

分画の際に、混合物は４個の明確なピークに分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）された。抗菌活性物質は、それぞれ、ピーク２及び４の物質から共溶能（ｃｏ−ｅｌｕｔｅ）された。

最後に、活性フラクションを逆相クロマトグラフィーにより精製した。約１　ｍｇの量のピーク２物質（図２Ａ）とピーク４物質（図２Ｂ）を、０．１％ＴＦ＾で平衡化したＰｅｐ−３（多孔質シリカＣ２／Ｃ１８，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（２，５ｘ　Ｏ，９３ＣＣＩ）上に充填した。カラムの溶離は５ｍ１７分の速度でかつ下記の濃度勾配で行った（溶剤Ｂは０，１％ＴＦＡを含有するメタノールである）０−３分、０−１５％Ｂ；　３−２３分、１５−３５％Ｂ：２３− ２５分、３５−１００％Ｂ０溶出液は２８０ｎｍでの吸光度をオンライン測定することにより蛋白質について監視した。５Ｉｎ１の溶出液のフラクションを捕集し、真空乾燥し、最後に０．５ｍＡ’の蒸留水に溶解させた：その１０μｌを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で使用した。

図２Ａ及び図２Ｂに、それぞれ、精製ピーク２物質とピーク４物質のＨＰＬＣプロフィールが示されている。下方パネルには２８０　ｒ＋ｍでの吸光度を測定することによる溶出液の蛋白質についての監視結果が示されている。顕微分光分析による抗菌活性評価の結果は上方パネルに示されている。

ピーク２物質とピーク４物質の両者から、抗菌活性物質と共に共溶能される、十分に分離された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）主ピークが得られた。ピーク２から精製された活性因子をＡｃ−ＡＭＰＩ　（アマランサス　カウダ９７、−抗菌性蛋白質１）と称し、ピーク４から精製された活性因子を＾ｃ−ＡＭＰ２と称する。

実施例　４精製抗菌性蛋白質の分子構造。

Ａｃ−ＡＭＰｓの分子構造を更に分析した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）　（Ｐｈａｒｍｃｉａ）電気泳動装置を使用して、予備注型された（ｐｒｅｃａｓｔ）市販のゲル［Ｐｈａｒｍａｃｉａからのファストゲル　ハイ　デンシティ（ＰｈａｓｔＧｅｌ　Ｈｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ）］上で行った。試料緩衝液には２００　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ、　１　ｍＭのＥＤＴＡ　。

０、００５％のブロムフェノールブルー及び、特に説明のない場合、１％（ｗ／ｖ）のジチオトレイトール（ＤＤＴ）を含有させた。蛋白質は６％のグルタルアルデヒド中での電気泳動の後に固定しくｆｉｘ）、Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ及びＤｅｒｎｉｃｋ　（１９８５，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　、６：　１０３−１１２）に従って銀染色した（ｓｉｌｖｅｒ　５ｔａｉｎｅｄ）。

アマランサス抗菌性蛋白質をジチオトレイトールで還元する前と後に５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。還元Ａｃ−ＡＭＰＩ及びＡｃ−ＡｌＦ２は両者とも約３　ｋＤａの見掛は分子量についての単一バンドとして移行した（ｍｉｇｒａｔｅ）　ｏ　しかしながら、Ａｃ−ＡＭＰＩ及びＡｃ−ＡｌＦ２は、その還元されていない状態では、それぞれ、４　ｋＤａ及び６　ｋＤａのバンドを生じた。従って、抗菌性因子はジスルフィドブリッジによって安定化されている、各々、２個の同一の３　ｋＤａサブユニットからなる二量体状蛋白質であると考えられる。

スーパーロース（Ｓｕｐｃｒｒｏｓｅ）−１２又はスパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのゲル濾過により天然ＡＣ−＾ＭＰｓの分子量を測定する試みは、蛋白質が遅延するため、成功しなかった。

図３は精製抗菌性蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している・レイン（ｌａｎｅ）　１は還元Ａｃ−ＡＭＰＩであり、レイン２は還元Ａｃ−ＡｌＦ２であり、レイン３は非還元＾ｃ−ＡＭＰｌであり、レイン４は非還元Ａｃ−ＡｌＦ２である。２００ナノメーターの蛋白質がゲル上で分離された。レイン關は、次の大きさ：　１７　ｋＤａ、　１４．５　ｋＤａ、　８　ｋＤａ　、　６　ｋＤａ及び２．５ｋＤａについての分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）として使用されるミオグロビンフラグメントを示す。

遊離のシスティンチオール基を下記のごとくして定性的に分析した。１００　ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）と１　ｍＭのＥＤＴＡを含有する６Ｍグアニジニウム−Ｃ１２（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ＣＡ　）中に１００μｇの量の還元又は非還元蛋白質を溶解させた。混合物を５，５°−ジチオニトロ安息香酸と反応させ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎの方法Ｃ１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ。

ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、１５５−１６７）によりニトロチオ安息香酸塩の遊離を監視した。蛋白質の還元はＴｒｉｓ４ＣＡ　（ｐＨ８，６）を１００　ｍＭまで、ジチオトレイトールを３０　ＩＱＭまで添加しついて４５℃で１時間インキュベートすることにより行った。蛋白質はＣ２／Ｃ１８シリカカラム上での逆相クロマトグラフィーにより過剰の反応剤から分離した。

非還元Ａｃ−ＡＭＰｓは遊離のシスティンチオール基を含有しておらず、これに対して、還元蛋白質は遊離のシスティンチオール基を含有しており、全てのシスティン残基がジスルフィド結合に関与していることを示した。かかる小さいポリペプチド中に比較的大きい数のジスルフィド結合が存在することは、Ａｃ−ＡＭＰｓがコンンパクトな構造を有することを示唆している。

Ａｃ−ＡＭＰＩとＡｃ−ＡｌＦ２のｐＩ値を等電点電気泳動により測定し、それぞれ、１０．３及び１０．６であることが判った。等電点電気泳動は４．７−１０．６のｐｌ範囲の標識蛋白質（Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ）を使用して、８Ｍ尿素中て再水和させた、予備注型インムービリンドライストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　Ｄｒｙ　５ｔｒｉｐｓ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で行った。

実施例　５Ａｃ−ＡＭＰｓのアミノ酸配列。

抗菌性蛋白質のシスティン残基を以下に述べるごとくＳ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ　−ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）により変性した＝１００　ｔｔｇの量の精製蛋白質を、３Ｑ　ｍＭのＤＴＴを含有する０、３ＭＴｒｉｓ−ＨＣＡ　（ｐＨ８，６）　１５０μｌに溶解し、４５℃で１時間反応させた。

ヨードアセトアミドを最終濃度が１００　ｍＭになるまで添加し、混合物を３７ ℃で１時間反応させた。最後に、最終濃度が１００　ｍＭになるまでＤＴＴを添加することにより反応を停止しくｑｕｅｎｃｈ）ついで３７℃で更に１時間反応させた。過剰の反応剤を逆相クロマトグラフィーにより除去した。得られた蛋白質フラクションのアミノ酸配列分析は、４７７Ａ蛋白質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１２０Ａアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体をオンライン検出することにより行った。

還元しかつカルボキシアミドメチル化した抗菌性蛋白質のアミノ酸配列は直接的Ｎ−末端配列決定（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により決定した。図４ＡにＡｃ−ＡＭＰＩとＡｃ−ＡｌＦ２のＮ−末端アミノ配列が示されている。Ａｃ−ＡＭＰＩは２９アミノ酸の長さであり、これに対し、Ａｃ−ＡｌＦ２は３０個のアミノ酸残基を有する。＾ｃ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列は、そのカルボキシル末端に１個の追加のアミノ酸（アルギニン）を有すること以外はＡｃ−ＡＭＰＩのアミノ酸配列と同一である。

Ａｃ−ＡＭＰｓは、特に、システィン（６残基）、グリシン（６残基）及び塩基性アミノ酸（＾ｃ−ＡＭＰＩ及びＡｃ−ＡｌＦ２について、それぞれ、４及び５残基）に富んでいる。

Ａｃ−八ＭＰＩはＡＣ−八ＭＰ２のトランケートされた形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）であると考えられる。この２種の蛋白質は分画翻訳後プロセッシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）により同一の先駆体から生成させることができる。

アミノ酸配列データーから算定した理論的等電点は、全てのシスティン残基がジスルフィド結合に関与していると仮定して、＾ｃ−ＡＭＰＩ及び＾ｃ−ＡＭＰ２について、それぞれ、１０．１及び１０．０である。

これらの値は実施例４に示されている測定ｐＩ値と良く対応する。

図４Ｂにタバコキチナーゼ（Ｓｈｉｎｓｈｉ等、　１９８７　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　ＬＩＳ＾、　８４：　８９−９３）　、？メキチナーゼ（Ｂｒｏｇｌ　ｉｅ等、　１９８６゜Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　１１３＾、　８３：　６８２０−６８２４）、へベイン（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ等、　１９９０　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔｌｓＡ、　８７二７６３３−７６３７）、小麦レクチン（ＲＢｉｋｈｅｌ及びＷｉｌｋｉｎｓ　、　１９８７．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　８４６７４５−６７４９）、ネットルレクチン（Ｃｈａｐｏｔ等、　１９８６．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

１９５　：　２３１−２３４）のＮ−末端アミノ酸配列及びＡｃ−ＡｌＦ２のＮ −末端アミノ酸配列が示されている。タバコキチナーゼとの配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　１ｄｅｎｔｉｔｙ）は大文字で示されており、保存変化（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｃｈａｎｇｅ）はイタリックで示されており、非保存変化（ｎ００〜ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｃｈａｎｇｅ）は小文字で示されている。保存変化はアミノ酸相同性基（ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｇｒｏｕｐ）　ＦｆＹＳＭＩＬＶ、　ＲＫＨ、ＥＤ。

ＮＱＳＳＴ及びＰＡＧ内での置換であると考えられる。最適な配列のために導入されたギャップは星印で表されている。

ＡＣ−ＡＭＰｓのアミノ酸配列はキチナーゼ、キチン結合性レクチン及びヘベインのごときキチン結合性蛋白質のシスティン／グリシン富化領域との顕著な類似性を示す。しかしながら、ＡＣ−八ＭＰｓは固有の特徴部分も含有する。Ａｃ− ＡｌＦ２及びタバコからの塩基性キチナーゼのＮ−末端のアミノ酸配列（図４ｂ）は最初の３０個の残基中に１４個の同一のアミノ酸と５個の保存変化を示した。キチン結合性蛋白質について最適配列を可能にするためには、４個のアミノ酸の単一のギャップをＡｃ−ＡｌＦ２のＮ−末端部分に導入しなければならない。

このギャップを導入した後には、システィン残基の全てが一定の位置に出現した。

実施例　６Ａｃ−ＡＭＰｓのキチン結合活性。

Ａｃ−ＡＭＰｓとキチン結合性蛋白質はアミノ酸配列水準が類似しているので、アマランサス抗菌性蛋白質のキチン支持体に結合する能力を検討した。

キチンを充填したマイクロカラムにＡｃ−ＡＭＰＩ又はＡｃ−ＡｌＦ２を導入しついで中性のｐｆｌ及び低いｐＨ（ｐＨ２，８）で溶離した。キチンはＭｏ１ａｎｏの方法（１９７７、＾ｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、８３：　６４８−６５６）に従ってキトサン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）のＮ−アセチル化により調製した。蛋白質試料（５０μｇ）を１　ｍｌの燐酸緩衝溶液（ｐＨ７）に溶解した後、キチン充填マイクロカラム（２，５ｘ　６　ｍ＋ｎ）に供給し、このカラムに３回再循環させた。カラムを１　ｒｎｌｌの燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて５回、１　ｒｎｌの１００　ｍＭ酢酸（ｐ［１２，８）を用いて１回溶離させた。溶出液のフラクション（１ｍＡ　）を脱塩し、逆相クロマトグラフィーにより濃縮し、最後に５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うために５０μｌの試料緩衝液（ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ）に再び溶解させた。

このアフィニテイクロマトグラフィーを行った後の、＾ｃ−ＡＭＰＩ（レイン１〜５）及びＡｃ−ＡｌＦ２　（レイン５〜８）についての５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果が図５に示されている。レイン１及び５はカラムに充填したものと等しい量の抗菌性蛋白質である；レイン２及び６はカラムを通過したフラクションである；レイン３及び７はＰＢＳ（ｐｆｌ　７）により溶離されたフラクションであるニレイン４及び８は１００　ｍＭ酢酸（ｐＨ２，８）により溶離されたフラクションである。

Ａｃ−ＡＭＰｓはカラムを通過したフラクションと中性ｐＨ洗液（ｗａｓｈｉｎｇ）には存在せず、低ｐｎ脱着緩衝液中に回収されることが認められ得る。これらの結果は＾ｃ−ＡＭＰＩ及びＡｃ−ＡｌＦ２の両者がキチンに対して親和性を示すことを示している。

実施例　７Ａｃ−ＡＭＰｓの抗菌活性の安定性。

抗菌活性の試験は実施例２に記載の評価方法に従って、フサリウム　クルモルム胞子を含有する増殖培地で５倍に稀酌した２０μｌの試料を使用して行った。非処理対照試料は１０　ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中に５００μｇ／１ｌ１１１の供試蛋白質を含有していた。消化のために、種々のプロテアーゼを１００μｇ／　ｍｌ添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。熱安定性試験は供試蛋白質のアリコートを１００℃までの種々の温度で１０分間加熱することにより行った。ｐＨ安定性試験は供試蛋白質を２０　ｍＭグリシン−ＨＣＡ　（ｐＨ２）又はグリシン−１ｌａＯ）１（ｐＨ１１）中で１時間インキュベートしついでベンゾイル化（ｂｅｎｚｏｙｌａｔｅｄ）セルミースチューブを使用して１０１１１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液に対して１６時間透析することにより行った。還元はジチオトレイトールを３０　ｍＷ、　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，６）を３００　ｍｌ添加することにより行った。反応剤は逆相クロマトグラフィーにより除去した。

反応剤だけを含有する対照処理液は透析又は逆相クロマトグラフィ一工程の後に、抗菌活性について負であることか証明された。

Ａ　ｃ　−Ａ　Ｍ　Ｐ　ｓの抗菌活性はプロテアーゼに１プロナーゼＥ１キモトリプシン又はトリプシンによる消化に対して抵抗性であった。更に、＾ｃ−ＡＭＰｓは１００℃までの温度で１０分間の熱処理にも、また、ｐＨ２又はｐＨｌｌという過酷なｐ［１条件にも影響されなかった。しかしながら、ジチオトレイトールによるそのシスティン残基の還元により、抗菌活性は完全に消滅した。

この蛋白質は、その生物学的活性がプロテアーゼ処理又は過酷な温度及びｐ８条件への暴露により影響されないという理由で、著しく安定である。この安定性は比較的多数のジスルフィド結合により保持されるコンパクトな球形構造によるものであり得る。これらのジスルフィド結合は生物学的活性に対して重要である。

実施例　８Ａｃ−八ＭＰｓの抗菌効力（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｐｏｔｅｎｃｙ）。

実施例２に記載の評価方法を使用して、ＡＣ−ＡＭＰｓの抗菌効力を１４種の植物病原菌（ｐｌａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｕｓ）について試験した。菌の生長、菌胞子の捕集と収穫及び菌糸フラグメントの調製は従来の方法（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ、等；　１９９０　；　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｅｔｔ、６９．５５−６０）で行った。下記のごとき菌株を使用した：アルテルナリア　ブラシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ）　ＭＵＣＬ　２０２９７、アスコキタ　、く乞（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ　ｐｉｓｉ）　ＭＩＩＣＬ　３０１６４、ボトリチス　シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ　）　ＭｔｌＣＬ　３０１５８、セルコスポラ　ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏｌａ）菌株に８９７　、コレトトリクム　リンデムチアヌム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　Ｉｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）　ＭＬＩＣＬ　９５７７　、フサリウム　クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）　ＩＭＩ　１８０４２０、ミコスファチアヌム（Ｓｃｌｃｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉａｎｕｍ）　ＭＩＪＣＬ　３０１６３、セプトリアノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ　）　ＭＵＣＬ　３０１１１、トリコデルマ　ニヱタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｍａｔｕｍ　）　ＭＵＣＬ　２９７３６、ベルチシリウム　ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉａｅ　）　ＭＵＣＬ　１９２１０及びベンツリアインアエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ　１ｎａｅｑｕａｌｉｓ　）　ＭＬＩＣＬ　１５９２７゜Ｃベチコラ、Ｒソラニ、Ｓ　スクレロチアヌム、Ｓ　ノドルみ、Ｌ　フィシエンシス及び　ｒ−インフェスタンスについては、菌糸フラグメントを接種材料として使用した。他の全ての菌は胞子として接種した。

次の供試菌類、Ｌ　ブラシコラ（＊）；Ａ　旦＞（ｘ）；Ｂ＞２　（パネルＢ）の濃度を変化させて測定した菌生長抑制率の施用量一応答曲線を図６に示す。

前記した１４種の植物病原菌に対するＡｃ−ＡＭＰｓの抗菌活性を、既知のキチン結合性蛋白質、ネットルレクチン及びエントウキチナーゼの抗菌活性と比較した。その結果は表１に要約されている：ＩＣ５ｏは接種から４８時間後に５０％の抑制率を得るのに必要な濃度（μｇ／　ｍＡ　）である。生長の遅い菌、糺　ノドルム及びＬ　インアエクアリスは接種から、それぞれ、５日及び１５日後に測定した。ネットルレクチン［又はウルチカ　ジオイカ（Ｕｒｔｉｃａ　ｄｉｏｉｃａ）凝集素（ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ）　、ＩＪＤＡ　］は、文献（Ｐｅｕｍａｎｓ等、　１９８３．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

１７７　：　９９−１０３）に記載の方法に従って、スチンギングネットル（ウルチカ　ジオイカ）の根茎から単離した。キチナーゼはＭａｕｃｈ等の方法（１９８８，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８７：　３２５−３３３）の方法に従ってエントウのさや（ｐｏｄ）から単離した。

表１菌類　ＩＣ５ｏ（μｇ／　ｍ／　）Ａｃ−ＡＭＰＩ　Ａｃ−ＡｌＦ２　ＵＤＡ　キチナーゼＮＤ−測定せず接種から４８時間後に５０％の抑制率を得るのに必要なＡｃ−ＡＭＰｓの濃度（工Ｃ３ｏ）は供試微生物の種類に応じて０．８〜３０μｇ／　ｍｌの間で変動した。＾ｃ−ＡＭＰＩの抗菌効力はＡｃ−八ＭＰ２の抗菌効力と殆ど同一であった。

Ａｃ−ＡＭＰｓはこの研究で試験した１４種の菌の全てについての強力な抑制剤であった。その特異性は、１〜１０μｇ／　ｒｎｌのＩ　Ｃ５ｏ値で典型的に菌の生長を抑制する小麦チオエンと匹敵する（Ｃａｍｍｕｅ等、　１９９２゜Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６７　：’２２２８−２２３３）　、ネットルレクチン又はキチナーゼのごとき他のキチン結合性蛋白質と比較して、ＡＣ−ＡＭＰｓははるかに高い特殊な活性を有する。ネットルレクチンは１００μｇ／　ｍＩ！以下の濃度では１１種の菌の内、６種の菌しか抑制しないが、この濃度においては、エントウキチナーゼは試験した７種の菌の内、１種の菌しか抑制しない。

生体外での菌の生長の強力な抑制剤としてのＡｃ−ＡＭＰｓの独特な性質は、菌微生物による侵入に対して種子及び苗木を保護することにおいてその役割を果たし得ることを示唆している。

実施例　９抗菌活性に対するイオンの影響。

ＡＣ−ＡＭＰｓの特殊な活性は増殖培地のイオン濃度に大きく依存することが認められた。ＫＣｌ又はＣａＣ１２を種々の量で添加した又は添加していない低イオン濃度合成増殖培地における、Ｂ、シネレアの生長抑制についてのＡｃ−ＡＭＰＩ　（パネルＡ）及び人ｃ−ＡＭＰ２　（パネルＢ）の施用量一応答曲線を図７に示す。Ａｃ−ＡＭＰｓによって惹起されるる。２．５ｍＭのｍ個カチオンと０．１．ｍＭの二価カチオンを含有する参照培地（■）においては、Ａｃ−ＡＭＰＩ及びＡＣ−八ＭＰ２は、それぞれ、２２及び１．６μｇ／　ｍＡのＩ　Ｃｓ　ｏを有していた。この培地に１０　（ＯＭのＫＣＡ’を添加した場合（ｘ）には、施用量一応答曲線は大きな影響を受けないか、ＫＣｆ、濃度が５０　ｍＭの場合（ロ）には、ＩＣ５ｏか約３倍まで増大しに１．　ｍＷ添加した場合（★）には、ＣａＣ１２により工Ｃ５ｏが５〜６倍まで増大した。ＣａＣ７！　２を５１［１Ｍ　添加した場合（＋）には、生長抑制活性の低下は５０倍以上であった。ＮａＣ１及びＮＨ４ＣＡのごときｍ個カチオンを有する他の塩の拮抗作用はＫＣＡに類似していたが、ＭｇＣｌ２及びＢａＣＥ　２のごとき二価カチオンを有する塩の拮抗作用はＣａＣ１２の拮抗作用に類似していた。

これらの結果はＡｃ−ＡＭＰｓの抗菌活性は無機塩の存在によって著しく減少するこ吉を示している。塩の拮抗作用は主としてカチオンによるものである；二価カチオンはｍ個カチオンより強力な拮抗剤である。

実施例　１０バクテリアに対するＡＣ−ＡＭＰｓの効果。

抗バクテリア活性を実施例２に記載の方法で測定した。次のバクテリア菌株を使用した：バシルス　メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３６３２、エルウィニア　カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）菌株３１９２、ニジエリシア　Ｄ　ＩＪ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ並其）菌株　１１１Ｂ　１０１及びサルシナ　／Ｌ＝７−１（Ｓａｒｃｉｎａ　１ｕｔｅａ）ＡＴＣＣ９３４２゜＾ｃ−ＡＭＰｓの抗バクテリア活性はバクテリア懸濁液に蛋白質の連続稀釈物を添加することにより測定した。最高試験濃度は５００μｇ／ｍＪ（最終濃度）であった。結果を表２に示す。

Ａｃ−ＡＭＰＩ　Ａｃ−ＡＭＰ２実施例　１１培養ヒト細胞に対する精製抗菌性蛋白質の効果。

Ａｃ−ＡＭＰｓを補乳動物に対するその潜在的な毒性作用について評価した。

ヒト細胞に対する毒性の評価は９６−ウェル（９６−ｔｅｌｌ）マイクロプレート中で培養した、へそ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ）静脈内皮細胞（Ａｌｅｓｓｅｉ等。

１９８８、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７５．５３１−５４０）又は皮膚筋肉繊維芽細胞（ＶａｎＤａｍｍｅ等、　１９８７．　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉ＋ｏｍｕｎｏｌ１７．１−７）について行った。増殖培地の代わりに、８０μｌの無血清培地［内皮細胞についてはオプチメン（Ｏｐｔｉｍｅｎ）　１　、繊維芽細胞についてはイーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）］を使用し、これに２０μｌのフィルター殺菌供試溶液を添加した。更に、細胞を５％ＣＯ２雰囲気及び１００％相対湿度の下で、３７℃で２４時間インキュベー）・シた。細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をトリパンブルー（燐酸緩衝液。

ＰＢＳ中、４００　ｍｇ／　Ｉ　）で１０分間染色した後、顕微鏡で評価した。

別法として、細胞をニュウトラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ）　（ＰＢＳ中、５６　ｍｇ／ｌ　）で３７℃で２時間染色した。細胞を酸性エタノール（５０％のエタノールを含有する１、００　ｍＭクエン酸、ｐＨ４）中に溶解させ（ｌｙｓｅ）、染料の遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）を５４０　ｎｍでの顕微分光光度分析により測定した。

培養したヒトへそ静脈内皮細胞又は皮膚筋肉繊維芽細胞に５００μｇ／１ｌ１１７！まで添加した場合、＾Ｃ−＾ＭＰＩ及び＾ｃ−ＡＭＰ２はいずれも、２４時間のインキュベートの後に、細胞の生存率に影響を与えなかった。

これに対して、β−プロチオニンは、５ｅｄｇ／　ｍｊ！添加した場合、両者の細胞の生存率を９０％以上まで減少させた。

実施例　１２ＡＣ−八ＭＰ２　ｃＤＮＡの分子クローニング。

十分に成熟させたアマランサス　力ウダタスの種子を屋外で成長させた植物から回収し、直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。Ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ等の方法（１９８８，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｂ６．１−１３）により、組織１ｇ当り、６ｍｌの１．２フェノール：　ＲＮＡ抽出緩衝液混合物と２ｍ７！のクロロホルムを使用して、５ｇの粉砕した種子から全ＲＮへを抽出した。Ｓｉｌｆｌｏｗ等により文献に記載されたオリゴ（ｄＴ）−七ルロースアフィニテイクロマトグラフィー（１９７９゜＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８．２７２５−２７３１）によりポリ（Ａ）　ＲＮＡを精製して、約十７μｇのポリ　（Ａ）　ＲＮＡを得た。Ｇｕｂｌｅｒ及び）ｌｏｆｆｍａｎの方法（１９８３゜＋Ｇｅｎｅ、　２５．２６３−２６９）に従って、１．５μｇのポリ（＾）　ＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡを調製しついでＰｈａｒｍａｃｉａからのｃＤＮＡ合成キット（ｃＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ）を使用してＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターに連結した。

ｃＤＮＡをλＺＡＰ　ＩＩファージベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローンしついでギガパックＩＩゴールドバッキングシステム（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄｐａｃｋｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従って生体外でパッケージした。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのＤＮＡプローブを以下の方法でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により製造した：２個の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチド：０ＷＢ１３　（５’ＧＴＮＧＧＮＧＡＲＴＧＫＧＴＮＭＧＮＧＧ）及び０ＷＢ１４　（５’ＣＣＲＣＡＲＴＡＹＴＴＮＧＧＮＣＣＹＴＴＮＣＣ）を合成した。０ＷＢ１３はＡｃ−ＡＭＰＩのアミノ酸１〜７に相当し、センス配向（ｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。０ＴＢ１４は＾ｃ−ＡＭＰＩのアミノ酸２２−２９に相当し、アンチセンス配向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。ＰＣＲはアンブリファイア− として０ＷＢ１３及び０ＷＢ１４を使用し、ターゲトＤＮＡとして２５ｎｇのｃＤＮＡを使用してかつＴａｑポリメラーゼを使用して標準的な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、　１，９８９．　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂ　Ｐｒｅｓｓ　）で行った。温度プログラムは９４℃で５分間の初期工程、３０サイクル（９４℃で１分間、４５℃で２分間；７２℃で３分間）及び７２℃で１０分間の最終工程から構成した。１００　ｂｐ　Ｆ’ＣＲ増幅生成物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）を３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ、　ＦＭＣ）ゲル上で精製しついで反応混合物に２００μ証のｄＴＴＰの代わりに１３０μＭのｄＴＴＰと７ｅｄＭのジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄｌＪＴＰ）を含有させたこと以外、前記と同一の条件下でのＰＣＨにより再増幅させた。ジゴキシゲニン標識した（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１ａｂｅｌ　１ｅｄ）ＰＣＲ生成物を３％ヌシーブアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ）上で精製した。

約１００．０００プラ一ク形成単位（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）のλＮＡＰ　ＩＩ　ｃＤＡＮライブラリーを、ナイロン膜［ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）　Ａｍｅｒｓｈａｍコを使用して！！！凹　プラークハイブリダイ膜を風乾し、ＤＮＡを膜上でＵ■光線（０，１５Ｊ／ｃｍ２）の下で架橋させた。

ハイブリダイゼーションは５　ｘ　ＳＳＣ、１％ブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、１０　ｎｇ／　ｍ７！の熱変性（ｈｅａｔ−ｄｅｎａｔｕａｔｅｄ）ジゴキシゲニン標識プローブを含有する０、０２％ドデシル硫酸ナトリウム中で６５°Ｃで１６時間行った。２　ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で２５℃で５分間、２回及び０、１　ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で６０℃で１５分間、２回、洗浄することにより、非特異的に結合した（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｂｏｕｎｄ）プローブを除去した。

プローブの検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）はアルカリ燐酸塩に結合されたアンチージゴキシゲニン抗体（ａｎｔｉ罰ｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）及びその基体、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用してその製造業者の使用説明書に従って行った。正のプラーク（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｌａｑｕｅ）を同一のプローブを使用してかつ同一の条件下で２回の追加的なスクリーニング工程を行うことにより精製した。精製プラークからのインサートを、生体内で、製造業者の使用説明書に従ってヘルパーファージＲ４０８を使用して切除して（ｅｘｃｉｔｅ）、ｐブルースクリプトファージミド（ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｐｈａｇｅｍｉｄｅ）型にした。ヌクレオチドの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、フルオレセイン標識Ｍ１３前進及び逆行プライｖ−（Ｍ１３　ｆｏｒｗａｒｄ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、ＡＬＦ自動シークエンサーを使用して行った。配列分析はインテリジェエックスｐｃ−遺伝子ソフトウエアー（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　ＰＣ−ｇｅｎｅｓｏｆｔｗａｒｅ）により行った。

種々の正のクローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅ）からのインサートをＥｃｏＲＩ消化により遊離させ（ｒｅｌｅａｓｅ）　、その長さをアガロース電気泳動により比較した。最長のインサートを有するクローン（ＡＣＩ）をヌクレオチド配列分析にかけた。ＡＣＩは５９０ヌクレオチドの長さであり、８６アミノ酸のオープンリーディングフレームを含有している。２５アミノ末端アミノ酸は（ −１，−３）−ルール（Ｖｏｎ　Ｈｅｉ　ｊｎｅ、　１９８５．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１８４、９９−１０５）に従った、予測された（ｐｒｅｄｉｃａｔｅｄ）シグナルペプチド構造を有する。推定上のシグナルペプチド（ｐｕｔａｔｉｙｅ　ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）の後の領域の、推定アミノ酸配列（ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、蛋白質配列決定によって測定したごとき、成熟ＡＣ−＾ＭＰ２の３０アミノ酸配列と同一である。更に、成熟蛋白質領域（ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｏｍａｉｎ）は３１−アミノ酸カルボキシ末端領域によって伸長されている。このカルボキシ末端の伸長はＡｃ−ＡＭＰ２の準細胞ターゲッチング（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）において役割を果たす。

ＡＣＩは５゛及び３°末端に、それぞれ、４５ヌクレオチド及び２８４ヌクレオチドの非翻訳領域を有する。３′末端非翻訳領域はポリ（＾）テイル（ｔａｉｌ）によって末端停止されておらず、これは、八Ｃ１は完全な長さのｃＤＮＡクローンでないことを示している。

他の９種の配列決定された（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）正のクローンの全てはＡＣＩと同一の推定アミノ酸配列を有していた。これらは５′及び３′末端におけるトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）の程度によって相互に相違していた。

１０種の配列決定されたクローンの全てが成熟蛋白質領域の３０の位置にアルギニンを含有しているという事実は、ＡＣ−八ＭＰＩ及びＡＣ−八ＭＰ２の両者が同一のプレ蛋白質から誘導されていることを示唆している。

カルボキシ末端伸長ペプチドはアミノ酸水準又はヌクレオチド水準において、それぞれ、スイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ）　［リリース（ｒｅｌｅａｓｅ）２０　］又はＥＢｉ［Ｌ遺伝子バンク（リリース２９）からのエントリー（ｅｎｔｒｙ）のいずれとも適切な相同性（ｒｅｌｅｖａｎｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を示さなかった。従って、＾Ｃ−＾ＭＰ２　ｃＤＮＡの構造は独特のものでありかつキチン結合性蛋白質をエンコードする既知の遺伝子の構造とは明らかに異なると考えられる。

図８は、クローン八Ｃ１のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。推定シグナル配列にはアンダーラインが引かれており、成熟Ａｃ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列は四角形で囲まれている。停止コドンには星印が付されている。

実施例　１３発現ベクター　ｐＡｃｌｌ及びｐＡｃ１２の構築（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）。

２種の異なる発現カセットをクローン八Ｃ１のインサートの２つの部分に基づいて構築した。

第１の発現ベクター（図９に示すｐＡｃｌｌ）はＡｃ−ＡＭＰ２　ｃＤＮＡの完全コーディング領域であって、その５°　末端に、高い転写活性を与えるための重複（ｄｕｐｌ　１ｃａｔｅｄ）エンハンサ−成分（Ｋａｙ等、　１９８７゜５ｏｃｉｅｎｃｅ、　２３６．１２９９−１３９２）を有するカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡ　、　ＣａＭＶ３５Ｓ　（Ｏｄｅｌｌ等、　１９８５．Ｎａｔｕｒｅ、３１３，８１０−８１２）の強力な構成プロモーターが隣接（ｆｌａｎｋ）　しているものを含有している。

Ａｃ−ＡＭＰ２　ｃＤＮＡのコーディング領域は、その３°側にＣａＭＶ３５Ｓポリアゾニレ−ジョン配列が隣接している。このベクターのプラスミド主鎖はファージミド（ｐｈａｇｅｍ司）　ｐＵｃ１２０　（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ、　１９８７゜Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３．３−１１）である。

ｐＡｃｌｌは次の方法でクローンＡＣＩから構築した。クローンＡＣＩは、５“ 末端かＭ１３普遍プライ７−（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ）結合部位に向合うようにｐブルースクリプトＳＫ　（＋）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）のＥｃｏＲＩ部位にクローンされているＡｃ−ＡＭＰ２　ｃＤＮＡ　（Ｉｆｆｌ　８に示されている）からなる。ＡＣＩをＥｃｏＲＶ（ｐブルースクリプトのＳＫポリリンカー内で切断）及びＮｈｅｌ　（停止コドンの９塩基下流にある塩基位置３１５にある、Ａｃ−ＡＭＰ２　ｃＤＮＡ配列内で内部的に切断）により消化した。Ｅｃｏ［ｉＩ／ＮｈｅＩ３２２塩基フラグメントを、５ｔｎａＩ　（！：ＸｂａＩで予め消化した発現ベクターｐＦＡＪ３００２中にサブクローンした。

ｐＦＡＪ３００２は、特定のＥｃｏＲＩ部位がＢｉｎｄｌ工１部位工法部位置換されている発現ベクターｐＦＦ１９　（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ等、　１９９０．　Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、　１４．３３３−３４４）の誘導体である。

第２の発現ベクター（図９Ｂに示すｐＡｃ１２）は、Ａｃ−へ肝プレ蛋白質のシグナルペプチドと成熟領域をコードするオープンリーディングフレームを含有している。このオープンリーディングフレームはその５′側に重複ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが隣接しており、３゛側にＣａＭＶ３５Ｓポリアゾニレ−ジョン配列が隣接している。

ｐＡｃ１２は次の方法で構築した。２１６　ｂｐフラグメントを、ＤＮＡ鋳型としてＡＣＩを使用し、センス及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、０ＷＢ３２及び０ｆＢ３３を使用してポリメラーゼ鎖反応により増幅した。プライ７−０ｆＢ３２　（５°ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧ）は＾ｃ−ＡＭＰ２　ｃＤＮＡのヌクレオチド１７〜３６に相当し、ＰＣＲ増幅生成物の５′末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。０ＩＩＢ３３（５“ ＾ＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＣＣ）はＡＣ−八ＭＰ２　ｃＤＮＡのヌクレオチド１９０〜２１０に相当し、インフレーム停止コドンと５ａｌＩ部位をＰＣ［７増幅生成物の３゛末端に連結する。０ＷＢ３２及び０ＷＢ３３の両者は制限部位の前の５゛末端に４　ｂｐのランダム配列を有する。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及び５ａｌＩで消化しついで上記と同一の制限酵素で予め消化した発現ベクターｐＦＡＪ３００２中にサブクローンした。

実施例　１４植物形質転換ベクターｐＡｃ１１１及びｐＡｃｌｌ２の構築。

発現ベクターｐＡｃ１１及びｐＡｃ１２をＨｉｎｄＩＩＩで消化しついでＡｃ− ＡＭＰ２　ｃＤＮ＾発現カセットを含有するフラグメントをｐＢｉｎ１９Ｒｉの固有の（ｕｎｉｑｕｅ）　ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブ部位−ンしたした。ｐＢｉｎ１９Ｒｉは植物形質転換ベクターｐＢｉｎ１９の修飾体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎ）（Ｂｅｖａｎ。

１９８４、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１２　：　２２．８７１１−８７２１）であり、このｐＢｉｎ１９Ｒｉにおいては固有のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位がスイッチされておりかつ欠陥（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）　ｎｐｔ　ＩＩ発現カセット（Ｙｅｎｏｆｓｋｙ等。

１９９０、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｏｃ　ＵＳＡ、８７　：　３４３５−３４３９）がＡｎ等により文献（１９８５，ＥＭＢＯＪ、４：　２７７−２８４）に記載の虱ＩＩ発現カセットにより置換されている。

ｐＡｃ１１発現カセットを含有する植物形質転換ベクターは消化されたｐＡｃｌｌｌであり、一方、ｐＡｃ１２発現カセットを含有する植物形質転換ベクターは消化されたｐＡｃｌｌ２である。２種の形質転換ベクターの構造は図１０に示されている。

実施例　１５植物形質転換。

安全化した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）菌株ＬＢ＾４４０４　［ｐＡＬ４４０４］（Ｈｏｅｋｅｍａ等、１９８３．Ｎａｔｕｒｅ、　３０３　：１７９−１８０）はＦｒａｍｏｎｄ　Ａ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１　：２６２−９）を使用して、ベクターｐＡｃ１１１又はｐＡｃｌｌ２により形質転換し得る。

タバコの形質転換はＨｏｚｓｃｂ　ＲＢ等の方法（１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１２２９−３１）に基づいて、ニコチナ　タバクム　サムスン（Ｎｉｃｏｔｉｎａ共培養は１００　ｔ、ｔｇ／　ｒｎｌｌのカナマイシンの選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｅｓｓｕｒｅ）下て行い得る。トランスジェニック植物（ｐＡｃｌｌｌ又はｐＡｃｌｌ２で形質転換）は１００μｇ／　ｒｎｌｌのカナマイシンを含有する培地で再生し得る。これらのトランスジェニック植物は標準ウェスタンブロッティング技術を使用して、新規に導入された遺伝子の発現について分析し得る。トランスジェニック植物は菌又はバクテリアによる病害に対する改善された抵抗性についても分析し得る。

導入された遺伝子の構成的発現を行うことのできる植物を選択し、白花受粉させて種子を得ることができる。Ａｃ−ＡＭＰ遺伝子の安定な組込みを示す種子の後代はＡｃ−ＡＭＰ遺伝子についての典型的なメンデルの遺伝様式を示すことが期待されるであろう。

図１溶離時間（分）図２Ａ溶離時間（分）図２Ｂ溶離時間（分）図３図６０．１　１　１０　１００蛋白質濃度（μｇ／　ｍＡ！　）図７蛋白質濃度（μｇ／　ｍｌ　）フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　１／３４　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲｔＪ、　ＳＤ、　ＵＳＦＩ（７２）発明者　リース、サラ、ブロンウエンイギリス国、アールシイ１２・３エツクスエツクス、バークシャー、ブラックネル、フォーレスト・パーク、ミツチェルドバー・ウェイ、３２（７２）発明者　ヴアンーデルレイデン、ヨセフベルギー国、ビイ−３００１・へヴエルリー。

カステンイエラーン、１２

Claims

【特許請求の範囲】

１．アマランサスの種子から単離された抗菌性蛋白質。
２．アマランサスの種子から単離することのできる、純粋な蛋白質、Ａｃ−ＡＭＰ１。
３．アマランサスの種子から単離することのできる、純粋な蛋白質、Ａｃ−ＡＭＰ２。
４．請求の範囲１〜３のいずれかに記載の蛋白質のアミノ酸配列を有する純粋な蛋白質。
５．合成物である、請求の範囲４に記載の蛋白質。
６．請求の範囲１〜５のいずれかに記載の蛋白質をコードする組換え体ＤＮＡ配列。
７．請求の範囲６に記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。
８．植物ゲノムから単離されたＤＮＡ配列を含有する、請求の範囲７に記載ベクター。
９．エンコードされた蛋白質の発現を可能にする、請求の範囲６に記載のＤＮＡを含有する生物学的系。
１０．微生物である、請求の範囲９に記載の生物学的系。
１１．植物である、請求の範囲９に記載の生物学的系。
１２．請求の範囲６に記載の組換え体ＤＮＡを使用して形質転換した植物。
１３．蛋白質Ａｃ−ＡＭＰ１をコードする組換え体ＤＭ配列を使用して形質転換した植物。
１４．蛋白質Ａｃ−ＡＭＰ２をコードする組換え体ＤＮＡ配列を使用して形質転換した植物。
１５．請求の範囲６に記載のＤＮＡの発現から誘導される蛋白質。
１６．請求の範囲１２〜１４のいずれかに記載の植物内での組換え体ＤＮＡの発現により産生される抗菌性蛋白質。
１７．請求の範囲１〜５又は請求の範囲１５〜１６のいずれかに記載の蛋白質の１種又はそれ以上を含有する抗菌性組成物。
１８．菌類又はバクテリアを、請求の範囲１〜５又は請求の範囲１５〜１７のいずれかに記載の蛋白質又は組成物に暴露することからなる、菌類又はバクテリアの撲滅方法。
１９．請求の範囲１〜５又は請求の範囲１５〜１６のいずれかに記載の殺生物活性を有する蛋白質を、これを含有する有機材料から製造するための抽出方法であって、上記有機材料をマーセレーション及び溶剤抽出にかけることからなる、殺生物活性を有する蛋白質を製造するための抽出方法。
２０．蛋白質を引続いて遠心分離、クロマトグラフィー及び透析により精製する、請求の範囲１９に記載の方法。
２１．有機材料がアマランサスの種子からなる、請求の範囲１９又は２０に記載の抽出方法。
２２．有機材料が請求の範囲１０に記載の微生物からなる、請求の範囲１９又は２０に記載の抽出方法。