JPH09501424A - 抗微生物性蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）の種子から単離しうる抗微生物性蛋白質は、広範な抗真菌活性およびグラム陽性細菌に対する若干の活性を示す。これらの蛋白質をコードするＤＮＡを単離し、ベクター中へ取り込ませることができる。このＤＮＡで形質転換された植物を形成しうる。これらの蛋白質は抗真菌薬または抗菌薬として商業的に利用することができ；形質転換された植物は向上した病害抵抗性を示すであろう。

Description

【発明の詳細な説明】 抗微生物性蛋白質 本発明は、抗微生物性蛋白質、それらの製造および使用方法、ならびにそれら をコードするＤＮＡ配列に関するものである。 これに関して抗微生物性蛋白質は、下記の活性のうち少なくとも１つをもつ蛋 白質であると定義される：抗真菌活性（これは抗酵母活性を含む）；抗菌活性。 活性には一定範囲のアンタゴニスト作用、たとえば部分阻害または死滅が含まれ る。それらの蛋白質はオリゴマー状であってもよく、または単一ペプチドサブユ ニットであってもよい。 抗微生物活性をもつ種々の蛋白質が植物源から単離されており、それらの蛋白 質は侵入または競合する微生物に対して向けられた宿主防御メカニズムに関与す るとしばしば考えられている。若干の蛋白質は十分に解明されており、それらの アミノ酸配列を知ることができる。若干の例では蛋白質をコードするｃＤＮＡま たは遺伝子も単離および配列決定されている。 植物は、潜在的侵入者を排除するために広範な一連の抗真菌性化合物を構成的 または誘導的に産生する。抗真菌性をもつ幾つかの群の蛋白質が現在同定されて おり、それには下記のものが含まれる： キチナーゼ（シュルンバウム（Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ Ａ）ら，１９８６，Ｎ ａｔｕｒｅ，３２４，３６３−３６７）； ベータ−１，３−グルカナーゼ（マウヒ（Ｍａｕｃｈ Ｆ）ら，１９８８，Ｐ ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，８８，９３６−９４２）； キチン結合性レクチン（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ ＷＦ）ら，１９８ ９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，１１００−１１０２；ファン・パリス（ＶａｎＰ ａｒｉｊｓ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８３，２５８−２６４）； パーマチン（ゼアマチンを含む）（ロバーツおよびセリトレニコフ（Ｒｏｂｅ ｒｔｓ ＷＫ，Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ ＣＰ），１９９０，Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３６，２１５０−２１５５；ビガーズ（Ｖｉｇｅｒｓ ＡＪ）ら，１９９１，Ｍｏｌｅｃ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａ ｃｔ，４，３１５−３２３；ウォロシュク（Ｗｏｌｏｓｈｕｋ ＣＰ）ら，Ｐｌ ａｎｔ Ｃｅｌｌ，３，６１９−６２８）； チオニン（ボールマンおよびアペル（Ｂｏｈｌｍａｎｎ，Ａｐｅｌ），１９９ １，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉ ｏｌ，４２：２２７−２４０）； リボソーム不活性化蛋白質（ロバーツおよびセリトレニコフ(Ｒｏｂｅｒｔｓ ＷＫ，Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ ＣＰ)，１９８６，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅ ｐ，６，１９−２９；レー（Ｌｅａｈ）ら，１９９１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ，２６６，１５６４−１５７３；カラスコ（Ｃａｒｒａｓｃｏ）ら，１９８１， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１６，１８５−１８９；ベルノン（Ｖｅｒｎｏ ｎ）ら，１９８５，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２３８，１８ −２９；スティルペおよびバルビエリ（Ｓｔｉｒｐｅ，Ｂａｒｂｉｅｒｉ），１ ９８６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９５，１−８）。 これらの蛋白質は生物制御物質として使用しうる可能性があるため、かなりの 関心がもたれている。 植物病原性真菌に対する活性（およびしばしば何らかの抗菌活性）をもつ他の 群の抗微生物性蛋白質を、特定の植物種から単離することができる。本発明者ら は先にそれらの蛋白質の構造特性および抗真菌性につき記載した。それには下記 のものが含まれる： システインに富む小型の蛋白質Ｍｊ−ＡＭＰ１（抗微生物性プロテイン１）お よびＭｊ−ＡＭＰ２：Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ｊａｌａｐａの種子中に存在（カミ ュ（Ｃａｍｍｕ ＢＰＡ）ら，１９９２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６７：２ ２２８−２２３３；国際特許出願公開第ＷＯ９２／１５６９１号明細書、１９９ ２年９月１７日公開）； Ａｃ−ＡＭＰ１およびＡｃ−ＡＭＰ２：Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔ ｕｓ の種子から（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ ＷＦ）ら，１９９２，Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：４３０８−４３１４；国際特許出願公開第ＷＯ９ ２／２１６９９号明細書、１９９２年１２月１０日公開）； Ｃａ−ＡＭＰ１：Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍから、Ｂｍ−ＡＭＰ１：Ｂ ｒｉｚａ ｍａｘｉｍａから、ならびに関連の蛋白質：Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ，Ｃａｔａｐｏｄｉｕｍ ，ＢａｐｔｉｓｉａおよびＭｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓの各種 を含む他の植物中に見出された（国際特許出願公開第ＷＯ９４／１１５１１号明 細書、１９９４年５月２６日公開）； Ｒｓ−ＡＦＰ１（抗真菌性プロテイン１）およびＲｓ−ＡＦＰ２：Ｒａｐｈａ ｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓの種子から（テラス（Ｔｅｒｒａｓ ＦＲＧ）ら，１９ ９２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６７：１５３０１−１３３０９）、ならびに 関連の蛋白質、たとえばＢｎ−ＡＦＰ１およびＢｎ−ＡＦＰ２：Ｂｒａｓｓｉｃ ａ ｎａｐｕｓから、Ｂｒ−ＡＦＰ１およびＢｒ−ＡＦＰ２：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ から、Ｓａ−ＡＦＰ１およびＳａ−ＡＦＰ２：Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂ ａ から、Ａｔ−ＡＦＰ１：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから、Ｄ ｍ−ＡＭＰ１およびＤｍ−ＡＭＰ２：Ｄａｈｌｉａ ｍｅｒｃｋｉｉから、Ｃｂ −ＡＭＰ１およびＣｂ−ＡＭＰ２：Ｃｎｉｃｕｓ ｂｅｎｅｄｉｃｔｕｓから、 Ｌｃ−ＡＦＰ：Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｃｉｃｅｒａから、Ｃｔ−ＡＭＰ１およびＣ ｔ−ＡＭＰ２：Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａから（国際特許出願公開第 ＷＯ９３／０５１５３号明細書、１９９３年３月１８日公開）。 これらの公開明細書は参考として本明細書に含まれるものとする。 これらおよび他の植物由来の抗微生物性蛋白質は、植物の生育期間中または収 穫後の作物保護のために作物の病害抵抗性または病害耐性を改良する殺真菌薬ま たは抗生物質として有用である。蛋白質は植物組織から抽出するか、または微生 物内での発現により産生させるか、または合成することができる。植物病原体へ の抗微生物性蛋白質の付与は、標準的な農業技術（たとえば表面噴霧）を用いて 蛋白質を植物の部分に適用することにより行うことができる。これらの蛋白質は 、植物体内（単に表面でなく）での発現により真菌性または細菌性病害に対処す るためにも使用しうる。植物組織内へ導入した内部寄生性生物中で抗微生物性蛋 白質を発現させてもよい。抗微生物性蛋白質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡクロ ーン、ゲノムＤＮＡクローン、または標準的な核酸合成装置を用いて製造された ＤＮＡであってもよい）を植物内へ形質転換して、トランスジェニック植物内で 蛋 白質を発現させることもできる。たとえばオオムギリボソーム不活性化蛋白質を 発現するトランスジェニックタバコは、真菌性病原体Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ に対して向上した抵抗性をもち（ローゲマン（Ｌｏｇｅｍａｎｎ） ら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０：３０５−３０８）；オオムギα− チオニンを発現するトランスジェニックタバコは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の 細菌性病原体に対して向上した抵抗性をもち（カルモナ（Ｃａｒｍｏｎａ）ら， １９９３，Ｐｌａｎｔ Ｊ，３（３）：４５７−４６２）；マメキチナーゼを発 現するトランスジェニックタバコは、真菌性病原体Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓ ｏｌａｎｉ に対して向上した抵抗性をもつ（ブログリー（Ｂｒｏｇｌｉｅ）ら， １９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１９４−１１９７）。 最近、他の一群の植物蛋白質が植物防御における潜在的役割に関連をもつこと が認められた。非特異的脂質伝達蛋白質（以下、ｎｓＬＴＰと呼ぶ）は未知の機 能をもつ一群の蛋白質であり、それらはインビトロで膜小胞または細胞小器官間 でリン脂質を輸送する能力に基づいて脂質伝達蛋白質として分類される。これら の蛋白質は２膜系間でリン脂質または他の非極性化合物を転位させることができ る。非特異的脂質伝達蛋白質は、下記を含む単子葉植物および双子葉植物の両方 から単離されている： Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ（Ｓｏ−ｎｓＬＴＰ；ベルンハルト（Ｂ ｅｒｎｈａｒｄ ＷＲ）ら，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，９５：１ ６４−１７０）； Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＣＢ−Ａ、ＣＢ−ＢおよびＣＢ−Ｃ；タ キシマ（Ｔａｋｉｓｈｉｍａ Ｋ）ら，１９８８，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ，１９０，１０７−１１２）； Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ（Ｄｃ−ｎｓＬＴＰまたはＥＰ２；スターク（Ｓ ｔｅｒｋ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，９：９０７−９２１）； Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ(ＴｏｂＬＴＰ；マスタ（Ｍａｓｕｔａ Ｃ）ら，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ；３１１：１１９−１２３)； Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（ＰＡＰＩ，マンディーおよびロジャース（ Ｍｕｎｄｙ Ｊ，Ｒｏｇｅｒｓ ＪＣ），１９８６，Ｐｌａｎｔａ，１６９： ５１−６３； Ｚｅａ ｍａｙｓ（Ｚｍ−ｎｓＬＴＰ；チャン（Ｔｃｈａｎｇ Ｆ）ら，１９ ８８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６３：１６８４９−１６８５５）。 これらの蛋白質は、細胞小器官間での細胞質脂質輸送、すなわち小胞体から細胞 および細胞小器官膜へのリン脂質の輸送において役割をもつと従来考えられてい た（アロンデルおよびカダー（Ａｒｏｎｄｅｌ Ｖ，Ｋａｄｅｒ ＪＣ），１９ ９０，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，４６，５７９−５８５）。しかし最近の証明は 、少なくとも若干のｎｓＬＴＰが細胞外に存在することを示しており、これによ れば膜の生合成において提唱されているそれらの機能は考えられないものとなる （スターク（Ｓｔｅｒｋ Ｐ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：９０ ７−９２１；トーマ（Ｔｈｏｍａ Ｓ）ら，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｊ，３：４ ２７−４３６）。 本発明者らは先に、ダイコンの種子から単離された抗微生物性蛋白質であって 、他の植物種から単離された非特異的脂質伝達蛋白質とそれとの相同性からＲｓ −ｎｓＬＴＰ（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ非特異的脂質伝達蛋白質）と 表示されるものにつき記載した（国際特許出願公開第ＷＯ９３／０５１５３号明 細書、１９９３年３月１８日公開）。Ｒｓ−ｎｓＬＴＰはインビトロで数種類の 真菌の増殖を阻害し、他の植物源からの種々の非特異的脂質伝達蛋白質と３８− ５３％の配列一致を示す。従って本発明者らは、ｎｓＬＴＰが微生物攻撃に対す る防御において役割をもつモデルを提示した（テラス（Ｔｅｒｒａｓ ＦＲＧ） ら，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１００：１０５５−１０５８）。 モリナ（Ｍｏｌｉｎａ Ａ）ら（１９９３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ；３１ ６(２)：１１９−１２２）は、オオムギの葉から病原体Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌ ａｎｉ の増殖を阻害する４種類の均一な蛋白質（ＣＷ１８、ＣＷ２０、ＣＷ２１ 、ＣＷ２２）を単離した。これらの蛋白質のアミノ酸配列は植物からの既知のｎ ｓＬＴＰと相同であった（一致する位置３２−６２％）。相同蛋白質（ＣＷ₄₁） がトウモロコシの葉から精製され、阻害性をもつことも認められた。従ってモリ ナ らは植物からの非特異的脂質伝達蛋白質につき防御の役割を提唱した。国際特許 出願公開第ＷＯ９２／２０８０１号明細書（Universidad Politecnica de Madri d；１９９２年１１月２６日公開）には、リン脂質伝達蛋白質（特にオオムギ蛋 白質ＣＷ１８、ＣＷ２０、ＣＷ２１およびＣＷ２２）の抗病原体活性（特に抗菌 活性）、それらの蛋白質を含有する抗病原性組成物、それらの蛋白質をコードす るＤＮＡ配列、およびそれらの蛋白質を発現するトランスジェニック植物につき 論じられている。 本発明者らは、植物病原性真菌に対する広域活性をもち、かつ若干の抗菌活性 をもつ新規で有効な抗微生物性蛋白質を今回見出した。 本発明によれば、実質的に配列番号：１に示されるアミノ酸配列をもつ抗微生 物性蛋白質が提供される。 本発明による抗微生物性蛋白質は、ネギ類（the family Alliaceae）の種子か ら、特にネギ属（the genus Allium）から単離することができる。それらの蛋白 質は関連種および非関連種双方の種子からも単離することができ、または任意の 適切な方法で調製または合成することができる。 本発明はさらに、本発明による蛋白質をコードするＤＮＡ配列、およびその配 列を含むベクターを提供する。このＤＮＡを、コードされる蛋白質の発現を可能 にする生物系にクローニングまたは形質転換することができる。 他の観点においては、本発明は本発明による抗微生物性蛋白質をコードするＤ ＮＡで形質転換された植物を提供する。 本発明はさらに、本発明による蛋白質に暴露することによる、真菌または細菌 の駆除方法を提供する。 本発明による抗微生物性蛋白質はタマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ，ｏｎｉ ｏｎ）の種子から単離され、以下Ａｃｅ−ＡＭＰ１（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ− 抗微生物性プロテイン１）と呼ぶ。Ａｃｅ−ＡＭＰ１は一定範囲の植物病原性真 菌に対して活性を示す。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸配列は、蛋白質の直接配列決定により、お よび全長Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡ配列の翻訳により決定された。Ａｃｅ−Ａ ＭＰ１は独特の一次構造をもつ。Ａｃｅ−ＡＭＰ１は種々の植物源からの非特異 的脂質伝達蛋白質（ｎｓＬＴＰ）と部分的に相同であるが、幾つかの点でｎｓＬ ＴＰと区別される。Ａｃｅ−ＡＭＰ１は既知のすべてのｎｓＬＴＰが保存残基を 共有する位置の２２％において異なる。ｎｓＬＴＰと対比してＡｃｅ−ＡＭＰ１ は著しくアルギニンに富む（９３残基中１９のアルギニン；アミノ酸含量の約２ ０％がアルギニンである）。前記に述べたように、若干のｎｓＬＴＰは抗微生物 活性を示した。しかしＡｃｅ−ＡＭＰ１の抗微生物活性はｎｓＬＴＰのものより かなり強い（実施例７の比較試験を参照されたい）。Ａｃｅ−ＡＭＰ１は特に強 い抗真菌活性、および特に広域の抗真菌活性を示す。さらにＡｃｅ−ＡＭＰ１の 抗微生物活性は、生理的濃度の無機カチオンの存在下で評価した場合にｎｓＬＴ Ｐのものより著しく高い。さらにＡｃｅ−ＡＭＰ１は脂質伝達活性をもたないと 思われる。すなわち試験によれば、トウモロコシまたはコムギの種子などから単 離されたｎｓＬＴＰと対比して、Ａｃｅ−ＡＭＰＩはリポソームからミトコンド リアへリン脂質を伝達し得ないことが示された。他の相違点として、Ａｃｅ−Ａ ＭＰ１をコードするｃＤＮＡクローンの構造はプレプロ蛋白質構造をもち、これ に対し既知のｎｓＬＴＰをコードするｃＤＮＡはプレ蛋白質構造をもつ（実施例 ９、１０および１１を参照されたい）。 本発明による抗微生物性蛋白質は抗真菌活性をもち、実質的に配列番号：１に 示すアミノ酸配列をもつ蛋白質である。特に本発明による抗微生物性蛋白質はア ルギニンに富む。 その一次構造を知ることは、抗微生物性蛋白質またはその一部を標準的なペプ チド合成装置を用いる化学合成により製造するのを可能にする。それはまた、抗 微生物性蛋白質をコードするＤＮＡ構築体の製造を可能にする。ＤＮＡ配列は既 知のアミノ酸配列から推定するか、または配列を植物由来のＤＮＡライブラリー から単離することができる。 オリゴヌクレオチドプローブを既知のアミノ酸配列から誘導し、これらを用い て、前記蛋白質の一部または全部をコードするｃＤＮＡクローンを得るためにｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。これらの同じオリゴヌ クレオチドプローブまたはｃＤＮＡクローンを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングすることにより、実際の抗微生物性蛋白質遺伝子（１または ２以上）を単離することができる。それらのゲノムクローンは植物ゲノム内で作 動する制御配列を含むことができる。従って抗微生物性（またはその他の）蛋白 質の発現を駆動するために使用しうるプロモーター配列を単離することもできる 。これらのプロモーターは環境条件（たとえば真菌性病原体の存在）に対して特 に応答性であってもよく、任意の標的遺伝子の発現を駆動するために用いること ができる。 Ａｃｅ−ＡＭＰＩ ｃＤＮＡは実施例９に記載したＰＣＲに基づくクローニン グにより単離された。 抗微生物性蛋白質をコードするＤＮＡ（これはｃＤＮＡクローン、ゲノムＤＮ Ａクローン、または標準的な核酸合成装置を用いて製造されたＤＮＡであっても よい）を、次いでその蛋白質またはその蛋白質の一部を発現しうる生物系内へク ローニングすることができる。ＤＮＡは構成性または誘導性プロモーターの制御 下に置くことができる。誘導系の例には、病原体誘導による発現および化学的誘 導が含まれる。従って蛋白質を使用するために、適切な微生物または培養細胞に おいて産生させ、抽出し、そして単離することができる。適切な微生物には、大 腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ ）および酵母が含まれる。適切な細胞には、培養された昆虫細胞お よび培養された哺乳動物細胞が含まれる。遺伝子材料はウイルスまたはバクテリ オファージ中へもクローニングすることができる。ＤＮＡを既知の方法で任意の 植物種内へ形質転換し、これにより抗微生物性蛋白質を植物内で発現させること もできる。 本発明に従った植物細胞を多様な既知の方法により本発明の構築体で形質転換 することができる（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉプ ラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロ ジェクタイルガン（microprojectile gun）など）。次いで適切な場合には、形 質転換細胞を全植物体中へ再生することができ、ここで新たな核材料がゲノム中 へ安定に取り込まれる。形質転換した単子葉植物および双子葉植物の両方がこの 方法で得られる。 形成しうる遺伝的に修飾された植物の例には、農作物、穀類、果実および野菜 、 たとえば菜種、カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、 ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マ ンゴー、モモ、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、バレイショ、ニン ジン、レタス、キャベツ、タマネギが含まれる。 本発明の抗微生物性蛋白質は意外なほど高い活性を示し、多様な植物病原性真 菌の増殖をマイクロモル未満の用量で阻止する。これらの蛋白質は広範な抗真菌 活性のみでなく、グラム陽性細菌に対する活性をも示す。従ってこれらの蛋白質 は殺真菌薬または抗生物質として、農業または薬剤などの用途に有用である。抗 微生物性蛋白質への植物病原体の暴露は、植物に、または植物が生育する土壌に 付与された微生物（内部寄生性生物を含む）内での蛋白質の発現により行われて もよい。これらの蛋白質は、標準的な農業技術（たとえば噴霧）を用いて植物の 部分に蛋白質を付与することにより真菌性または細菌性病害に対処するのにも使 用しうる。抗微生物性組成物は、抗微生物用として有効な量の蛋白質、ならびに 農業用蛋白質配合物に一般的に用いられている、農業用として受容しうるキャリ ヤーおよび／または佐剤（固体または液体佐剤、溶剤、界面活性剤など）を含む ことができる。これらの蛋白質は植物の生育期間中に、または収穫後の作物保護 のために、植物体内で発現させることにより真菌性または細菌性病害に対処する のにも使用しうる。これらの蛋白質は哺乳動物の感染症を処置するための殺真菌 薬もしくは抗菌薬として、または微生物による汚染を受けやすい製品（たとえば 加工食品）の防腐にも使用しうる。 これらの抗微生物性蛋白質は適宜な種子から単離および精製するか、それらの 既知のアミノ酸配列から人工的に合成するか、または適切な微生物内で組換えＤ ＮＡの発現により産生させることができる。これらの蛋白質はトランスジェニッ ク植物内で発現させてもよい。 本発明は図面を参照することによりさらに理解されるであろう： 図１は、Ａｃｅ−ＡＭＰ１についてのカチオン交換クロマトグラムおよび付随 する真菌増殖阻止のグラフを示す。 図２は、精製Ａｃｅ−ＡＭＰ１のＨＰＬＣプロフィールを示す。 図３は、Ａｃｅ−ＡＭＰ１および種々の植物非特異的脂質伝達蛋白質のアミノ 酸配列を一列に並べたものを示す。 図４は、Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡおよび翻訳された蛋白質の配列を示す。 図５は、ベクターｐＦＡＪ３０３３およびｐＦＡＪ３０３４の図である。 本発明はさらに配列表を参照することによっても理解されるであろう： 配列番号：１−１４は図３に示したアミノ酸配列を表す： 配列番号：１は成熟Ａｃｅ−ＡＭＰ１である； 配列番号：２はＲｓ−ｎｓＬＴＰである； 配列番号：３はＳｏ−ｎｓＬＴＰである； 配列番号：４はＥＰ２である； 配列番号：５はＴｏｂｎｓＬＴＰである； 配列番号：６はＬｅ−ｎｓＬＴＰである； 配列番号：７はＣＢ−Ａである； 配列番号：８はＣＢ−Ｂである； 配列番号：９はＣＢ−Ｃである； 配列番号：１０はＰＡＰＩである； 配列番号：１１はＣＷ１８である； 配列番号：１２はＣＷ２１である； 配列番号：１３はＴａ−ｎｓＬＴＰである； 配列番号：１４はＺｍ−ｎｓＬＴＰである； 配列番号：１５−１６は図４の配列を表す： 配列番号：１５はＡｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡの核酸配列である； 配列番号：１６はこのｃＤＮＡ配列から翻訳されたＡｃｅ−ＡＭＰ１のアミ ノ酸配列である； 配列番号：１７−２５は表５に挙げたオリゴヌクレオチドを表す： 配列番号：１７はＯＷＢ１１４である； 配列番号：１８はＯＷＢ１１６である； 配列番号：１９はＯＷＢ１１７である； 配列番号：２０はＯＷＢ１１１である； 配列番号：２１はＯＷＢ１３２である； 配列番号：２２はＯＷＢ１３３である； 配列番号：２３はＯＷＢ１５８である； 配列番号：２４はＯＷＢ１５９である； 配列番号：２５はＯＷＢ１６０である。 以下の実施例は本発明を説明するものである。 実施例１ 抗真菌および抗菌活性のアッセイ 抗真菌活性は先に記載されている微量分光分析により測定された（ブレケルト （Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ），１９９０，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ，６９：５５−６０）。２０μｌの（フィルター滅菌）被験溶液および８０μｌ の真菌胞子懸濁液（２×１０⁴胞子／ｍｌ）を用いて、半濃度（ｈａｌｆ ｓｔ ｒ ｅｎｇｔｈ）バレイショデキストロースブロス（培地Ａ）またはＣａＣｌ₂ およびＫＣｌをそれぞれ１ｍＭおよび５０ｍＭの最終濃度となるように添加した 半濃度バレイショデキストロースブロス（培地Ｂ）中で、通常通り試験を行った 。 カチオンのアンタゴニスト作用についての試験に関しては、合成増殖培地を用 いた。合成増殖培地はＫ₂ＨＰＯ₄（２．５ｍＭ）、ＭｇＳＯ₄（５０μＭ）、Ｃ ａＣｌ₂（５０μＭ）、ＦｅＳＯ₄（５μＭ）、ＣｏＣｌ₂（０．１μＭ）、Ｃｕ ＳＯ₄（０．１μＭ）、Ｎａ₂ＭｏＯ₄（２μＭ）、Ｈ₃ＢＯ₃（０．５μＭ）、Ｋ Ｉ（０．１μＭ）、ＺｎＳＯ₄（０．５μＭ）、ＭｎＳＯ₄（０．１μＭ）、グル コース（１０ｇ／ｌ）、アスパラギン（１ｇ／ｌ）、メチオニン（２０ｍｇ／ｌ ）、ミオイノシトール（２ｍｇ／ｌ）、ビオチン（０．２ｍｇ／ｌ）、チアミン −ＨＣｌ（１ｍｇ／ｌ）、およびピリドキシン−ＨＣｌ（０．２ｍｇ／ｌ）から なっていた。 別途明記しない限り被験生物はフザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ ）（株ＩＭＩ １８０４２０）であり、インキュベーションは ２５℃で４８時間行われた。試料の抗真菌活性（単位／ｍｌ）は、アッセイ混合 物中の５０％増殖阻止を与える試料の容量でアッセイ混合物の全容量を割ったも のであると定義される（＝５０％増殖阻止に関する希釈係数）。増殖阻止率は、 対照ミクロ培養物の５９５ｎｍにおける補正吸光度に対する、対照ミクロ培養物 の補正吸光度から被験ミクロ培養物の補正吸光度を差し引いたものの比率の１０ ０倍であると定義される。補正吸光度値は、４８時間後に測定された培養物の５ ９５ｎｍにおける吸光度から３０分後に測定された５９５ｎｍにおける吸光度を 差し引いたものである。 抗菌活性は下記に従って微量分光分析により測定された。細菌を２％トリプト ン中３０℃で回転振盪器内において一夜、前培養した。軟アガロース培地（２％ トリプトン；０．５％低融点アガロース）に細胞密度１０⁵コロニー形成単位／ ｍｌとなるように細菌を接種した。アリコート（８０μｌ）の細胞懸濁液を平底 ９６ウェルミクロプレート内でフィルター滅菌試料（２０μｌ）に添加し、凝固 させた。２８℃で３０分および２４時間のインキュベーション後に、ミクロプレ ート読み取り装置により培養物の５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗真菌 活性アッセイにつき上記に述べたと同様に増殖阻止率を計算した。 酵母に対する抗生活性を抗菌活性の場合と同様に測定し、ただし増殖培地は半 濃度バレイショデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ）および０．５％低融点アガ ロースからなっていた。この培地中における酵母細胞懸濁液（１０⁶細胞／ｍｌ ）８０μｌを２０μｌの被験溶液に添加した。 実施例２ タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）種子からの塩基性、熱安定性蛋白質の抽出 １００ｇのタマネギ種子（ＡＶＥＶＥより、ベルギー）をコーヒーミルで粉砕 し、得られた粗挽き粉を４℃で２時間、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、１５ｍＭのＮ ａ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび２ｍＭのチオ尿素を含 有する氷冷された抽出用緩衝液２００ｍｌで抽出した。抽出後にスラリーをウェ アリング（ＷＡＲＩＮＧ）ブレンダーで混合し、次いでジャムミンサーにより絞 って抽出液を固体残渣から分離した。得られた抽出液を遠心分離（５，０００× ｇで１０分）により透明化した。固体硫酸アンモニウムを上清液に添加して８５ ％の相対飽和度となし、４℃に一夜放置することにより沈殿を生成させた。７， ０００×ｇで３０分間の遠心分離後に、沈殿を１００ｍｌの蒸留水に再溶解し、 蒸留水に対して十分に透析した。透析後に１０倍濃度の緩衝液の添加により溶液 を５０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）に調整し、５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）中 で 平衡化したＱ−セファロース・ファスト・フロー（ファルマシア、スウェーデン 国ウプサラ）カラム（１２×５ｃｍ）に導通した。カラムを通過した蛋白質画分 を凍結乾燥し、２００ｍｌの５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ５．５）に再溶解した 。 この材料は種子の塩基性（ｐＩ＞９）蛋白質画分である。この画分を実施例３ の記載に従ってさらに精製した。 実施例３ タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）種子からの抗微生物性蛋白質の精製 タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）抗微生物性蛋白質の単離のための出発原 料は、実施例２に従って成熟種子から抽出された塩基性蛋白質画分であった。こ の抽出液のカチオン交換クロマトグラフィーにより蛋白質をさらに精製した。 約２００ｍｌ塩基性蛋白質画分を、５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ５．５）中で 平衡化したＱ−セファロース・ハイ・パフォーマンス（ファルマシア）カラム（ １０×１．６ｃｍ）に付与した。カラムを２．０ｍｌ／分で５０ｍＭから２Ｍま でのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ５．５）の直線濃度勾配により１８０分間にわたって溶離 した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸光度のオンライン測定により蛋白質につき 監視し（結果を図１の下側パネルに示す）、２０ｍｌずつの画分で採取した。そ れぞれの画分から１ｍｌの試料を凍結乾燥により乾燥させ、１ｍｌの蒸留水に再 溶解し、そのうち２０μｌを実施例１の記載に従って培地ＡおよびＢの両方にお いて抗真菌活性につきアッセイした（結果を図１の上側パネルに示す）。 クロマトグラフィーにより、抽出液はアッセイ培地（培地Ｂ）中のＣａＣｌ₂ およびＫＣｌの存在に対して異なる感受性をもつ少なくとも２種類の活性成分か らなる幅広い複雑な抗真菌活性ピーク、ならびに約１．５ＭのＮＨ₄−アセテー トにおいて溶出する明瞭な活性ピークを与えた。Ｃａ²⁺およびＫ⁺による拮抗が より少ない後者のピークを逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。このピーク画 分１ｍｌを０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したＰＥＰ−Ｓ（多孔 質シリカＣ₂／Ｃ₁₈、ファルマシア）カラム（２５×０．４ｃｍ）に装填した。 カラムを１ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡから１００％アセトニトリル／０．１％Ｔ ＦＡまでの直線濃度勾配により５０分間にわたって展開した。溶出液を２８０ｎ ｍにおける吸光度のオンライン測定により蛋白質につき監視した（結果を図２の 下側パネルに示す）。１ｍｌずつの画分を採取し、真空乾燥し、１ｍｌの蒸留水 に再溶解し、そのうち２０μｌを実施例１の記載に従った抗真菌性アッセイに使 用した（結果を図２の上側パネルに示す）。解像度の良好な最初の活性ピークを Ａｃｅ−ＡＭＰ１（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ−抗微生物性プロテイン１）と呼ん だ。 実施例４ 精製した抗微生物性蛋白質Ａｃｅ−ＡＭＰ１の分子構造 精製した抗微生物性蛋白質の分子構造をさらに分析した。ドデシル硫酸ナトリ ウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、市販のプレキ ャストゲル（ファストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ）８−２５％、ファルマシアから ）上でファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）（ファルマシア）電気泳動 装置により実施した。試料用緩衝液は、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８． ３）、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ブロモフェノール ブルー、および別途明記しない限り１％（ｗ／ｖ）ジチオエリトリトール（ＤＴ Ｅ）を含有していた。電気泳動後に蛋白質を１２．５％グルタルアルデヒド中で 固定し、銀染色した：ヒュークショーベンおよびデルニック（Ｈｅｕｋｅｓｈｏ ｖｅｎ，Ｄｅｒｎｉｃｋ）（１９８５，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，６： １０３−１１２）に従う。比較のために泳動させた分子量マーカーは下記のもの であった：ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６． ２ｋＤａ）、オボアルブミン（４２．７ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ （３１．０ｋＤａ）、ダイズトリプシンインヒビション（２１．５ｋＤａ）、お よびリゾチーム（１４．４ｋＤａ）。 還元および非還元Ａｃｅ−ＡＭＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、それぞれ 約１０ｋＤａおよび２２ｋＤａの単一バンドが認められた。分子量約１０ｋＤａ の還元Ａｃｅ−ＡＭＰ１は、２０ｋＤａ未満の蛋白質につき高い解像が可能なフ ァストゲル・ハイ・デンシティー（ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔ ｙ）（ファルマシア）上での同様なＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認することがで きた。スーパローズ−１２（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２）（ファルマシア）上での ゲル濾 過による天然Ａｃｅ−ＡＭＰ１の分子量測定によれば、約７．５ｋＤａの値が得 られた。非還元Ａｃｅ−ＡＭＰ１についての２２ｋＤａというＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分子量値は、この小型の蛋白質のＳＤＳ結合能が比較的低いことによる過大評価 の可能性がある。 デュボア（Ｄｕｂｏｉｓ）ら（１９５６，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２８：３５０ −３５６）のフェノール−硫酸法、および基準としてのＤ−グルコースを用いた 共有結合糖の測定は陰性であり、Ａｃｅ−ＡＭＰ１はグリコシル化されていない ことが示唆された。 非還元Ａｃｅ−ＡＭＰ１は遊離チオール基を含まなかったので、Ａｃｅ−ＡＭ Ｐ１のシステイン残基はすべてジスルフィド結合に関与していると思われる。チ オール基測定は、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ，ＧＬ）（１９５９；Ａｒｃｈ Ｂｉ ｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，８２，７０−７４）のジチオニトロ安息香酸法に より１０ｍｌの蛋白質を用いて行われた。還元蛋白質試料は１０ｍＭのＤＴＴと ４５℃で１時間反応させたのち蒸留水に対して十分に透析することにより調製さ れた。 実施例５ Ａｃｅ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列決定 システイン残基をカミュ（Ｃａｍｍｕｅ ＢＰＡ）ら，１９９２；Ｊ Ｂｉｏ ｌ Ｃｈｅｍ，２６７：２２２８−２２３３の記載に従ってＳ−カルボキシアミ ドメチル化により修飾した。試薬をＰｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈）（フ ァルマシア）カラム（２５×０．４ｃｍ）上でのＨＰＬＣにより除去した。Ｓ− カルボキシアミドメチル化蛋白質が、カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ Ａ）から０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルまでの直線濃度勾配で溶離すること により回収された。得られた蛋白質画分を４７７Ａプロテイン・シーケンス（ア プライド・バイオシステムズ）により、１２０Ａアナライザー（アプライド・バ イオシステムズ）によるフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体のオンライン 検出を用いて、アミノ酸配列分析した。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１を配列決定する最初の試みにより、蛋白質はＮ末端遮断され ていることが示された。ピログルタメートアミノペプチダーゼ（ベーリンガー、 ＦＲＧ）による脱遮断が行えなかったので、Ａｃｅ−ＡＭＰ１をエンドプロテイ ナーゼＡｒｇ−ＣおよびＡｓｐ−Ｎ（両方とも配列決定用、ベーリンガー、ＦＲ Ｇから）で消化した。消化は製造業者の指示に従って、還元化およびＳ−カルボ キシアミドメチル化Ａｃｅ−ＡＭＰ１につき、推奨された最小の蛋白質／酵素比 （ｗ／ｗ）および推奨された最大インキュベーション時間を適用して行われた。 次いで消化されたペプチドを、Ｐｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈；ファルマ シア）カラム（２５×０．４ｃｍ）上で、０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡ含 有アセトニトリルまでの直線溶離濃度勾配を１００分で１ｍｌ／分において用い るＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。Ａｒｇ−Ｃによる消化によって少なくとも１ ０種類の分離可能なペプチドが得られ、これは既にＡｃｅ−ＡＭＰ１の比較的高 いアルギニン含量を示唆した。Ａｓｐ−Ｎによる処理は３種類の蛋白質フラグメ ントを生成した。これらのペプチドを配列決定したのち、遮断されたＮ末端部分 を除いてＡｃｅ−ＡＭＰ１の一次構造を再構築した。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１アミノ酸配列は、下記を含めた種々の植物源からの非特異的 脂質伝達蛋白質（ｎｓＬＴＰ）と部分的に相同性であることが見出された：Ｒｓ −ｎｓＬＴＰ、Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓの種子から（テラス（Ｔｅｒ ｒａｓ ＦＲＧ）ら，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１００： １０５５−１０５８）；Ｓｏ−ｎｓＬＴＰ、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅ ａ の葉から（ベルンハルト（Ｂｅｒｎｈａｒｄ ＷＲ）ら，１９９１，Ｐｌａｎ ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９５：１６４−１７０）；Ｅｐ２、Ｄａｕｃｕｓｃ ａｒｏｔａ の接合胞子から（ｚｙｇｏｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ）（スターク（Ｓｔ ａｒｋ）ら，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：９０７−９２１）；Ｔｏｂ ＬＴＰ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの花から(マスタ（Ｍａｓｕｔａ Ｃ）ら，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ；３１１：１１９−１２３)；Ｌｅ− ｎｓＬＴＰ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｅから（トネス−シ ューマン（Ｔｏｎｎｅｓ−Ｓｃｈｕｍａｎｎ Ｓ）ら，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１８：７４９−７５７）；ＣＢ−Ａ、ＣＢ−ＢおよびＣＢ− Ｃ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ若木から（タキシマ（Ｔａｋｉｓｈｉｍ ａ Ｋ）ら，１９８８，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９０，１０７−１１ ２）；ＰＡＰＩ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの種子から（マンディーおよ びロジャース（Ｍｕｎｄｙ Ｊ，Ｒｏｇｅｒｓ ＪＣ），１９８６，Ｐｌａｎｔ ａ，１６９：５１−６３；ＣＷ１８およびＣＷ２１、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇ ａｒｅ の葉から（モリナ（Ｍｏｌｉｎａ Ａ）ら，１９９３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ ｔ；３１６：１１９−１２２）；Ｔａ−ｎｓＬＴＰ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓ ｔｉｖｕｍ から（シモレ（Ｓｉｍｏｒｒｅ ＪＰ）ら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅ ｍ，３０：１１６００−１１６０８）；Ｚｍ−ｎｓＬＴＰ、Ｚｅａ ｍａｙｓの 若木から（チャン（Ｔｃｈａｎｇ Ｆ）ら，１９８８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ，２６３：１６８４９−１６８５５）。Ａｃｅ−ＡＭＰ１とこれらのｎｓＬＴＰ の配列の比較を図３に示す。最適な並列のために導入したギャップを点線で示す 。最初の９個のＮ末端アミノ酸はＡｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配 列に由来する（実施例５参照）。 図３に示したｎｓＬＴＰ配列（Ａｃｅ−ＡＭＰ１以外のすべての配列）の比較 から、以下のコンセンサスモチーフが導かれる。８個のシステインは保存された ４、１４、３０、３１、５１、５３、７７および９３位にある(番号は図３に示 したもの):疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｖ、Ｍ）または芳香族残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ） は、２、７、１１、１７、１８、３４、３７、４１、５４、６１、６４、６９、 ７３、８２、８５、８７および９６位にある；プロリンは２５および７４位にあ る；塩基性残基（Ｈ、Ｒ、Ｋ）は４７および５５位に保存される；ヒドロキシ残 基（Ｓ、Ｔ）は４３および８８位にある；ならびに保存されたアスパラギン酸は ４６位を占める。Ａｃｅ−ＡＭＰ１はこのコンセンサスモチーフに部分的に一致 するが、下記の位置において異なる：２、１８、６１および６９位に疎水性／芳 香族残基をもたない；それぞれ４６、５５および８８位の保存されたアスパラギ ン酸、リシンおよびセリンをもたない。従ってｎｓＬＴＰ蛋白質の保存残基のう ち約２２％がＡｃｅ−ＡＭＰ１においては変化している。さらにＡｃｅ−ＡＭＰ １は、はるかに高いアルギニン含量により他のすべての既知ｎｓＬＴＰ配列と異 なる。Ａｃｅ−ＡＭＰ１は少なくとも１９個のアルギニンを含むが、ｎｓＬＴＰ 蛋白質中のアルギニンの数は１個（Ｓｏ−ｎｓＬＴＰ）から６個（Ｚｍ−ｎｓＬ ＴＰ）の範囲である。 動物に見出されるシステインに富む抗生性ペプチドの大部分、たとえばデフェ ンシン（レーラー（Ｌｅｈｒｅｒ ＲＩ）ら，１９９１，Ｃｅｌｌ，６４：２２ ９−２３０）、β−デフェンシン（セルステッド（Ｓｅｌｓｔｅｄ ＭＥ）ら， １９９３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６８：６６４１−６６４８）、およびバ クテネシン（ロメオ（Ｒｏｍｅｏ Ｄ）ら，１９８８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ，２６３：９５７３−９５７５；ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ Ｒ）ら，１９８９， Ｉｎｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎ，５７：３１４２−３１４６）も特にアルギニンに富 むことが注目される。 実施例６ 蛋白質の抗真菌活性の安定性 表１にＡｃｅ−ＡＭＰ１の抗真菌活性の安定性についての他の試験の結果をま とめる。 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍの胞子を含有する増殖培地で５倍希釈し た試料２０μｌを用いて、抗真菌活性についての試験を実施例１に記載したアッ セイ法に従って実施した。未処理対照試料は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ７）中の１００μｇ／ｍｌの被験蛋白質からなっていた。被験蛋白質のアリ コートを最高１００℃の種々の温度で１０分間加熱することにより、熱安定性試 験を行った。消化のためにプロテアーゼを４００μｇ／ｍｌで添加し、３７℃で １６時間インキュベートした。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１の抗真菌活性は最高１００℃までの１０分間の熱処理により 影響されなかった。Ａｃｅ−ＡＭＰ１はキモトリプシン、トリプシンおよびプロ テイナーゼＫによる処理に対して比較的抵抗性であったが、プロナーゼＥによる 消化は活性をほぼ完全に低下させた。 実施例７ Ａｃｅ−ＡＭＰ１の抗真菌効力 精製蛋白質の抗真菌効力を種々の植物病原性真菌に対して、実施例１に記載し たアッセイ法を用いて評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収穫は先の 記載（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９０，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，６９：５５−６０）に従って行われた。下記の真菌株を用 いた：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ ＭＵＣＬ ２０２９７、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｐｉｓｉ ＭＵＣＬ ３０１６４、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃ ｉｎｅｒｅａ ＭＵＣＬ ３０１５８、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎ ｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ ＭＵＣＬ ９５７７、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏ ｒｕｍ ＩＭＩ １８０４２０、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ．ｐｉｓｉ ＩＭＩ ２３６４４１、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ ＭＵＣＬ ９０９、Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ コレクション・ファン・エッテン１６０−２−２、Ｐｈｏｍａ ｂｅｔａｅ ＭＵＣＬ ９９１６、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒ ｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ ＭＵＣＬ ３０２１７、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉ ａ ｏｒｙｚａｅ ＭＵＣＬ ３０１６６、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈ ｌｉａｅ ＭＵＣＬ ６９６３。 真菌用合成増殖培地（ＳＭＦ）（実施例１参照）にそれぞれ最終濃度１ｍＭお よび５０ｍＭとなるようにＣａＣｌ₂およびＫＣｌを補充したもの（ＳＭＦ⁺）ま たは補充しないもの（ＳＭＦ^-）を用いて、抗真菌性蛋白質の系列希釈液を真菌 に付与した。増殖阻止率％を微量分光分析により測定した。４８時間のインキュ ベーション後に５０％増殖阻止に要した濃度（ＩＣ₅₀値）を用量応答曲線から計 算した。 種々の植物病原性真菌に対するＡｃｅ−ＡＭＰ１のＩＣ₅₀値を表２に提示し、 それらを同一条件下で下記の３種類のｎｓＬＴＰについて測定したものと比較す る：Ｒｓ−ｎｓＬＴＰ（データはテラス（Ｔｅｒｒａｓ）ら，１９９２，Ｐｌａ ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１００：１０５５−１０５８より得た）、Ｚｍ−ｎｓＬ ＴＰおよびＴａ−ｎｓＬＴＰ（シモレ（Ｓｉｍｏｒｒｅ）ら，１９９１，Ｂｉｏ ｃｈｅｍ，３０：１１６００−１１６０８の記載に従って単離）。 培地ＳＭＦ^-およびＳＭＦ⁺の両方において、Ａｃｅ−ＡＭＰ１は１０μｇ／ｍ ｌ（約１μＭに相当）以下の濃度で１２種類の被験真菌すべてを５０％阻止する 。従ってＡｃｅ−ＡＭＰ１は広域阻止スペクトルを示す有効な植物抗真菌性蛋白 質である。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１がＳＭＦ⁺においてＳＭＦ^-におけるとほとんど同様に有効で あるのは驚くべきことである。すべての植物細胞コンパートメントは比較的高い カチオン濃度を含有するので、ＳＭＦ⁺のようにカチオンを含有する培地におい て抗真菌性蛋白質が活性であるのは生理学的に妥当である（テラス（Ｔｅｒｒａ ｓ ＦＲＧ）ら，１９９２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６７：１５３０１−１ ５３０９）。 ＳＭＦ⁺中におけるＡｃｅ−ＡＭＰ１の効力は他の比較的カチオン不感受性で ある抗真菌性蛋白質、たとえば表２に挙げた１２中８の真菌を１０μｇ／ｍｌ未 満の濃度で阻害するＲｓ−ＡＦＰ２に匹敵する（テラス（Ｔｅｒｒａｓ ＦＧ） ら，１９９２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６７：１５３０１−１５３０９）。 またＡｃｅ−ＡＭＰ１は最近報告された、Ａｃｅ−ＡＭＰ１に部分的に相同な（ 図３参照）Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓからのｎｓＬＴＰ様蛋白質である Ｒｓ−ｎｓＬＴＰ（テラス（Ｔｅｒｒａｓ ＦＲＧ）ら，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１００：１０５５−１０５８）よりはるかに効力が高い。実 際に、表２に挙げた真菌はいずれもＳＭＦ⁺中においてＲｓ−ｎｓＬＴＰにより １００μｇ／ｍｌ未満の濃度では阻害されない（テラス（Ｔｅｒｒａｓ ＦＲＧ ）ら，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１００：１０５５−１０５８） 。さらにトウモロコシおよびコムギから単離された２種類のｎｓＬＴＰ、それぞ れＺｍ−ｎｓＬＴＰおよびＴａ−ｎｓＬＴＰは、ＳＭＦ⁺中において試験した９ 真菌のいずれの増殖も２００ＥＭＧ／ＭＬ未満の濃度では阻害しなかった（表２ 参照）。オオムギの葉から単離されたｎｓＬＴＰ蛋白質（ＣＷ１８およびＣＷ２ １を含む、図３参照）の、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉに対するＩＣ₅₀値は 、培地としてのバレイショデキストロースブロース中で評価を行った際に約２５ −１８０μｇ／ｍｌ（イソ型に応じて）であった（モリナ（Ｍｏｌｉｎａ Ａ） ら，１９９３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ；３１６：１１９−１２２）。しかし他の真 菌に対するこれらの蛋白質の活性およびカチオンに対するそれらの感受性につい ては記載されていない。 種々のカチオンを補充した合成増殖培地におけるＦｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍ ｏｒｕｍ に対するＡｃｅ−ＡＭＰ１の活性（実施例１の記載に従ってアッセイ） を、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓの種子からのＡｃ−ＡＭＰ１抗微 生物性ペプチド（ブレケルト（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ）ら，１９９２，Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４３０８−４３１４）、およびコムギ内胚乳からのβ− ピューロチオニン（抗微生物活性をもつ他のタイプの植物種子蛋白質；レッドマ ンおよびフィッシャー（Ｒｅｄｍａｎ ＤＧ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ），１９６９ ， Ｊ Ｓｃｉ Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉ，２０：４２７−４３２）の活性と直接に比較 した。表３に種々の条件下でのＩＣ₅₀値をまとめる。Ａｃｅ−ＡＭＰ１は試験し たすべてのカチオンの存在に対して極めて感受性であるが、Ａｃ−ＡＭＰ１およ びβ−ピューロチオニンの活性はむしろカチオンにより刺激されると思われる。 ただしＣａ²⁺によっては刺激されない。しかしＣａ²⁺の拮抗作用はチオニンに対 してよりＡｃｅ−ＡＭＰ１に対しての方がはるかに低い。 実施例８ Ａｃｅ−ＡＭＰ１の抗菌および抗酵母活性 精製蛋白質を、下記の細菌の増殖に対するその作用につき評価した：Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １３６３２、Ｓａｒｃｉｎａ ｌ ｕｔｅａ ＡＴＣＣ ９３４２、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ ＬＭＧ １８８、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｌ ＭＧ １１９５、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＡＴＣＣ ２９１４５、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ ｃａｒｏ ｔｏｖｏｒａ ＬＭＧ ２４５８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１ ０１株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＬＭＧ ２２９ ３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ ｔａｂａｃｉ ＬＭＧ ５１９２、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ ｃ ａｍｐｅｓｔｒｉｓ ＬＭＧ ５８２。それをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓｐ１株の増殖に対する作用についても評価した。バイオ アッセイは実施例１の記載に従って実施された。結果を表４にまとめる。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１は試験した両方のグラム陽性細菌（Ｂ ｍｅｇａｔｅｒｉｕ ｍ およびＳ ｌｕｔｅａ）の増殖を阻害するが、試験した８種のグラム陰性細菌 のいずれに対しても、または酵母Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対しても作用をほ とんど又は全く及ぼさなかった。Ｒｓ−ｎｓＬＴＰおよびＺｍ−ｎｓＬＴＰはＢ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに対してのみ阻害性ではあったが、この細菌に対してＡ ｃｅ−ＡＭＰ１より少なくとも１０倍は活性が低かった。オオムギの葉から単離 されたｎｓ−ＬＴＰ（ＣＷ１８およびＣＷ２１を含む、図３参照）は、グラム陽 性細菌Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ ｓ ｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ およびグラム陰性細菌Ｐ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの増 殖を阻害すると報告されている（モリナ（Ｍｏｌｉｎａ）ら，１９９３，ＦＥＢ Ｓ Ｌｅｔｔ；３１６：１１９−１２２）。 実施例９ Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡの５′および３′部分のＰＣＲに基づくクローニン グ 開花の１５、２１および３０日後に採集した未熟な種子の混合物から全ＲＮＡ を抽出した。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡの３′部分を下記によりクローニングした。１２ 単位のトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ベーリンガー・マンハイム）、適宜 な緩衝液成分（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プ レス）、および１０ｐｍｏｌの修飾されたオリゴ−ｄＴプライマー（プライマー ＯＷＢ１１４、表５参照）を含有する３０μｌの反応混合物中で、全ＲＮＡ（１ μｇ）を逆転写し、５２℃で３０分間インキュベートした。逆転写反応物の一部 （０．５μｌ）を、５ｐｍｏｌのアンチセンスプライマーＯＷＢ１１４、５ｐｍ ｏｌのセンスプライマーＯＷＢ１１１（Ａｃｅ−ＡＭＰ１の内部アミノ酸配列、 すなわちＰＲＦＱＮＩＰに対応する縮重プライマー）、５ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、 ０．５単位のＴａｑポリメラーゼ、およびＴａｑポリメラーゼ用緩衝液成分（サ ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）を含有する ２５μｌのＰＣＲ反応混合物に移した。標準的な条件（サムブルック（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ）ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，コールド・ス プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に従って、プライマーアニーリン グ温度５５℃を用いて、ＰＣＲのための温度サイクル工程を実施した。ＰＣＲ反 応生成物をアガロースゲル電気泳動により分析し、約４００ｂｐのバンド（同一 鋳型を含むが、両プライマーのうち一方のみを含む対照ＰＣＲ反応には存在しな かったもの）をＰｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅキット（バイオラド）を用いて、製造業 者の指示に従って単離した。ＰＣＲ生成物をＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＥ ＭＢＬ１８＋（ベーリンガー・マンハイム）中へサブクローニングし、この挿入 配列をＡＬＦ自動シークエンサー（ファルマシア）でオートリード（Ａｕｔｏｒ ｅａｄ）配列決定キット（ファルマシア）を用いて蛍光標識Ｍ１３正方向および 逆方向プライマーにより配列決定した。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡの５′部分を下記によりクローニングした。前記 に従ってＯＷＢ１１４またはＯＷＢ１３３（Ａｃｅ−ＡＭＰ１特異的プライマー 、 Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡの３′部分のヌクレオチド配列に由来する）をプラ イマーとして用いて、全ＲＮＡを逆転写した。１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤ ＴＡ、３００ｍＭのＮａＣｌ、０.０５％(ｗ／ｖ)のＳＤＳ（ｐＨ８）中で平衡 化したクロマスピン（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）＋ＴＥ−１００（クローンテク） カラムでのゲル濾過により、過剰のプライマーを除去した。次いでＲＮＡをアル カリ加水分解により除去し、デロルト（Ｄｅｌｏｒｔ）ら（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ，１７：６４３９−６４４８）の記載に従ってｓｓＤＮＡをエタノー ル沈殿させ、最後に１０μｌの蒸留水に再溶解した。これらのｓｓＤＮＡ調製物 の３′末端（ｍＲＮＡの５′末端に対応）を、ホスフェート基をその５′末端に もち（ｓｓＤＮＡへのライゲーションを可能にするために）、かつアミノ基をそ の３′末端にもつ（プライマーの自己ライゲーションを避けるために）ように合 成されたオリゴヌクレオチドＯＷＢ１１６にライゲートした。ｓｓＤＮＡライゲ ーション反応混合物（３０μｌ）は、５ｐｍｏｌのプライマーＯＷＢ１１６、２ ．５μｌのｓｓＤＮＡ（前記参照）、１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼ（ニュー ・イングランド・バイオラボズ）、およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ用緩衝液成分（ テシール（Ｔｅｓｓｉｅｒ）ら，１９８６，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１５８ ：１７１−１７８）を含有し、インキュベーションは２２℃で１６時間行われた 。ｓｓＤＮＡライゲーション反応混合物の一部（０．１μｌ）を、５ｎｍｏｌの プライマーＯＷＢ１１７（ＯＷＢ１１６に対して部分的に相補性である）、５ｍ ｍｏｌのｄＮＴＰｓ、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ、およびＴａｑポリメ ラーゼ用緩衝液成分を含有する２５μｌのＰＣＲ反応混合物に移した。アニーリ ング温度６０℃での５ＰＣＲサイクル後に、２５ｐｍｏｌのＡｃｅ−ＡＭＰ１特 異的プライマー（ＯＷＢ１３２、ＯＷＢ１３３の位置のすぐ上流の、Ａｃｅ−Ａ ＭＰ１ ｃＤＮＡの位置に対応）を反応混合物に添加し、アニーリング温度５５ ℃においてさらに３０ＰＣＲサイクルを実施した。単一プライマーＰＣＲ対照に 存在しなかった約４００ｂｐのＰＣＲ反応生成物を前記に従ってゲル精製した。 第１鎖合成にＯＷＢ１１３またはＯＷＢ１１４のいずれを用いたかに関係なく、 同じ４００ｂｐのＰＣＲバンドが得られた。このＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ消化 し、ｐＥＭＢＬ１８＋中へサブクローニングし、挿入配列のヌクレオチド配列を 前記 に従って決定した。 ５′および３′部分のヌクレオチド配列（３８ヌクレオチドが重複）を結合さ せることにより、全長Ａｃｅ−ｎｓＬＴＰ ｃＤＮＡに相当する６８６ｂｐの配 列が得られた。 Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡは、１３２アミノ酸をコードする３９６ｂｐの読 み取り枠(open reading frame)、３６ｂｐの５′側リーダー配列、およびポリ（ Ａ＋）テイルに至るまでに２３２ｂｐの３′側非翻訳領域を含む（図４）。コー ド領域の分析により、２７アミノ酸の推定シグナルペプチドの存在が明らかにな った。予想シグナルペプチド開裂部位（図４に矢印で示した）は、フォン・ハイ ジン（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）（1986,Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４： ４６８３−４６９０）の規則、および大部分の成熟植物ｎｓＬＴＰは４位にシス テインおよび７位にバリンをもつという所見と一致する。コード領域のアミノ酸 ３７と１２０の間のアミノ酸配列（図４に下線を施した）は、成熟Ａｃｅ−ＡＭ Ｐ１につき実験的に決定されたアミノ酸配列と一致する。ｃＤＮＡ由来のコード 領域は、成熟Ａｃｅ−ＡＭＰ１が実施例５において決定された配列と対比してＮ 末端にさらに９個のアミノ酸をもつことを予想させた。この配列は、成熟Ａｃｅ −ＡＭＰ１には遮断されたＮ末端アミノ酸が存在するため実験的に決定すること はできなかった。さらにＡｃｅ−ＡＭＰ１ ｍＲＮＡの翻訳生成物はそのカルボ キシル末端に成熟Ａｃｅ−ＡＭＰ１には存在しない１２アミノ酸をもつ。このカ ルボキシル末端プロペプチドは疎水性および酸性の残基に富み、これは液胞性（ ｖａｃｕｏｌａｒ）植物蛋白質の前駆物質中に存在するカルボキシル末端プロペ プチドの特徴的な点である（ナカムラおよびマツオカ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍａ ｔｓｕｏｋａ），１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１０１：１−５）。 それらのカルボキシル末端プロペプチドは多数の例において、蛋白質を液胞へ 標的定め（targetting）するための決定因子であることが証明されている（ベド ナレクおよびレイケル（Ｂｅｄｎａｒｅｋ，Ｒａｉｋｈｅｌ），１９９１，Ｐｌ ａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：１１９５−１２０６；ノイハウス（Ｎｅｕｈａｕｓ）ら ，１９９１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：１０３６ ２ −１０３６６）。ｎｓＬＴＰ様蛋白質はすべてＡｃｅ−ＡＭＰ１の場合に見られ るプレプロ蛋白質構造と異なるプレ蛋白質として翻訳されることが示された（ア ロンデルおよびカダー（Ａｒｏｎｄｅｌ，Ｋａｄｅｒ），１９９０，Ｅｘｐｅｒ ｉｅｎｔｉａ，４６：５７９−５８５；マドリッドおよびフォン・ウェットスタ イン（Ｍａｄｒｉｄ，ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ），１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２９：７０５−７１１）。 実施例１０ 発現ベクターの構築 プライマーＯＷＢ１１４を用いて実施例９の記載に従って全タマネギ種子ＲＮ Ａを逆転写した。反応混合物の一部（０．５μｌ）を標準的な条件下で（サムブ ルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、プライマーの 組み合わせＯＷＢ１５８−ＯＷＢ１５９をプライマーアニーリング温度６５℃で 、またはプライマーＯＷＢ１５８−ＯＷＢ１６０をプライマーアニーリング温度 ５５℃で用いる、ＰＣＲ増幅反応に使用した。プライマーＯＷＢ１５８はＡｃｅ −ＡＭＰ１ ｃＤＮＡ（開始コドンを含む）の天然Ｎｃｏｌ部位のすぐ上流にＫ ｐｎＩ部位を導入し、プライマーＯＷＢ１５９はアミノ酸１２０（成熟Ａｃｅ− ＡＭＰ１の最終アミノ酸）のコドンの後方に終止コドンおよびＢａｍＨＩ部位を 導入し、プライマーＯＷＢ１６０はＡｃｅ−ＡＭＰ１の天然終止コドンの後方に ＢａｍＨＩ部位を導入する。得られたＯＷＢ１５８−ＯＷＢ１５９およびＯＷＢ １５８−ＯＷＢ１６０増幅生成物をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、プラス ミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−の対応する部位へサブクローニング して、それぞれプラスミドｐＡｃｅ２およびｐＡｃｅｌを得た。これらの挿入配 列をヌクレオチド配列決定により確認した。プラスミドｐＡｃｅｌおよびｐＡｃ ｅ２の挿入配列をＮｃｏＩおよびＳａｃＩで消化することにより単離し、次いで 発 現ベクターｐＢＩ５０５の対応する部位へライゲーションし（デトラ（Ｄｅｔｌ ａ）ら，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９４：１３９−１４９）、こ うしてそれぞれプラスミドｐＡｃｅ３およびｐＡｃｅ４を形成した。発現ベクタ ーｐＡｃｅ３においては、Ａｃｅ−ＡＭＰ１のコード領域はその５′末端におい て、重複エンハンサー要素をもつカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮ Ａの強力な構成性プロモーター（高い転写活性を得るため、ケイ（Ｋａｙ）ら， １９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１２９９−１３０２）、およびアルファル ファモザイクウイルスの５′側リーダー配列（高い翻訳活性を得るため、ダトラ （Ｄａｔｌａ）ら，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９４：１３９−１ ４９）でフランキングされている。Ａｃｅ−ＡＭＰ１ｃＤＮＡのコード領域はそ の３′末端においては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化配列でフランキングされている（ベ バン（Ｂｅｖａｎ）ら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０４：１８４−１８７）。 ベクターｐＡｃｅ４は、コード領域がプロペプチドの１２カルボキシル末端アミ ノ酸をコードするドメインを欠如する点以外はｐＡｃｅ３と同一である。 実施例１１ 植物形質転換ベクターの構築 実施例１０に記載した発現ベクターｐＡｃｅ３およびｐＡｃｅ４をＨｉｎｄＩ ＩＩおよびＳａｃＩで消化し、Ａｃｅ−ＡＭＰ１発現カセットを含むフラグメン トをＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ消化した植物形質転換ベクターｐＧＰＴＶ−ＫＡ Ｎ（ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）ら，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２０：１１９５−１１９７）中へサブクローニングして、それぞれ植物形質転換 ベクターｐＦＡＪ３０３３およびｐＦＡＪ３０３４を得た。これらのベクターの 模式図を図５に示す。図５に用いた記号は下記のものである： ＲＢ： Ｔ−ＤＮＡの右端 ＬＢ： Ｔ−ＤＮＡの左端 Ｔｎｏｓ： Ｔ−ＤＮＡノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター ＣＴＰＰ： Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡのカルボキシ末端プロペプチド ドメイン ＭＰ： Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡの成熟蛋白質ドメイン ＳＰ： Ａｃｅ−ＡＭＰ１ ｃＤＮＡのシグナルペプチドドメイン ＡＭＶ： アルファルファモザイクウイルス５′側リーダー配列 Ｐｅｎｈ３５Ｓ： 重複エンハンサー領域をもつカリフラワーモザイクウイルス の３５Ｓ ＲＮＡのプロモーター Ｐｎｏｓ Ｔ−ＤＮＡノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター ｎｐｔＩＩ： ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子のコード 領域 Ｔｇ７： Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７のターミネーター 実施例１２ 植物の形質転換 攻撃力を失わせた（disarmed）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４株（ｐＡＬ４４０４）（ヘケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）ら， １９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９−１８０）をフラモンド（Ｆｒａｍｏ ｎｄ）ら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：２６２−２６９）の方法により形 質転換ベクターで形質転換する。 ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９ −１２３１）の方法に基づいてＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓ ｕｎの葉のディスクを使用し、ｐＦＡＪ３０３３またはｐＦＡＪ３０３４を保有 するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株と共培養して、タバコの形質転換を実施する 。共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）はカナマイシン１００μｇ／ｍｌの 選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の下で実施される。カナマイ シン１００μｇ／ｍｌを含有する培地上でトランスジェニック植物が再生される 。これらのトランスジェニック植物を、新たに導入された遺伝子の発現につき標 準的ウェスタンブロット法により分析することができる。導入された遺伝子を構 成的に発現しうる植物を選択し、自家受粉させて、種子を形成させることができ る。トランスジェニック植物のＦ１若木を植物病原体に対して増大した抵抗性に つきさらに分析することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 9450−4Ｈ Ａ０１Ｎ 65/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ａ０１Ｎ 65/00 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リーズ，サラ・ブロンウェン イギリス国バークシャー アールジー12 ３エックスエックス，ブラックネル，フォ レスト・パーク，マイケルデヴァー・ウェ イ 32

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する抗微生物性蛋白質。 ２．実質的に配列番号：１６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗 微生物性蛋白質。 ３．ネギ類（the family Alliaceae）の種子から単離しうる、請求項１または２ に記載の抗微生物性蛋白質。 ４．ネギ属（the genus Allium）の種子から単離しうる、請求項３に記載の抗微 生物性蛋白質。 ５．蛋白質Ａｃｅ−ＡＭＰ１である、請求項４に記載の抗微生物性蛋白質。 ６．請求項１に記載の抗微生物性蛋白質をコードするＤＮＡ。 ７．実質的に配列番号：１５に示す配列を有する、請求項６に記載のＤＮＡ。 ８．請求項６に記載のＤＮＡを保有する生物系。 ９．微生物である、請求項８に記載の生物系。 １０．植物である、請求項８に記載の生物系。 １１．真菌または細菌を請求項１に記載の抗微生物性蛋白質に暴露することを含 む、真菌または細菌の駆除方法。