ES2660965T3 - Defensinas vegetales modificadas útiles como agentes antipatógenos - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido de defensina Clase II solanácea artificialmente modificada aislado con una región bucle (Bucle 1B) entre una primera cadena ß y una hélice β en su porción del extremo N-terminal y que tiene actividad antifúngica, y en el que dicho Bucle 1B está reemplazado por un Bucle 1B de otra defensina, teniendo dicho polipéptido una porción del extremo C-terminal con al menos una 70 % de similitud a SEQ ID NO:52 después de alineación óptima.
Description
modificada. Una construcción genética sencilla descrita en la presente memoria puede codificar una defensina modificada que comprende una región Bucle 1B alterada y un inhibidor de proteinasa o precursor del mismo tal como NaPin1A (de Nicotiana alata), inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI), cistatina de tomate, inhibidor, S1Cys9, o cistatina de cebada, HvCPI6. En otra realización, las construcciones múltiples se usan cada una por
5 separado codificando una o más de una defensina modificada y un inhibidor de proteinasa o forma precursora del mismo.
Cuando se usa la defensina modificada en combinación con otro agente tal como un inhibidor de proteinasa o una cistatina, se puede usar una construcción genética sencilla que codifica todas las proteínas para transformar una
10 célula vegetal o construcciones múltiples, codificando cada una una proteína. Alternativamente, una planta modificada para expresar una defensina, se puede someter a la aplicación tópica de un inhibidor de proteinasa o patogenicida químico.
En la Tabla 1 se proporciona un compendio de identificadores de secuencia usados por toda la memoria objeto.
15
TABLA 1
- Compendio de identificadores de secuencia
- SEQ ID Nº
- DESCRIPCIÓN
- 1
- Secuencia de aminoácidos genérica de la región Bucle 1B
- 2
- Secuencia de aminoácidos de la porción de NaD1 (Nicotiana alata) que contiene el Bucle 1B
- 3
- Secuencia de aminoácidos de la porción de PhD1 (Petunia hybrida) que contiene el Bucle 1B
- 4
- Secuencia de aminoácidos de la porción de PhD2 (Petunia hybrida) que contiene el Bucle 1B
- 5
- Secuencia de aminoácidos de la porción de TPP3 (Solanum lycopersicum) que contiene el Bucle 1B
- 6
- Secuencia de aminoácidos de la porción de FST (Nicotiana tabacum) que contiene el Bucle 1B
- 7
- Secuencia de aminoácidos de la porción de g-tionina (Nicotiana excelsior) que contiene el Bucle 1B [NeThio1]
- 8
- Secuencia de aminoácidos de la porción de g-tionina (Nicotiana excelsior) que contiene el Bucle 1B [NeThio2]
- 9
- Secuencia de aminoácidos de la porción de g-tionina (Nicotiana attenuata) que contiene el Bucle 1B [Na-gth]
- 10
- Secuencia de aminoácidos de la porción de g-tionina (Nicotiana paniculata) que contiene el Bucle 1B [NpThio1]
- 11
- Secuencia de aminoácidos de la porción de g-tionina (Capsicum chinense) que contiene el Bucle 1B [Cc-gth]
- 12
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de NaD1, NsD1 y NsD2
- 13
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de PhD1
- 14
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de PhD2
- 15
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de TPP3
- 16
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de FST
- 17
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de g-tionina (N. excelsior) [NeThio1]
- 18
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de g-tionina (N. excelsior) [NeThio2]
- 19
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de g-tionina (N. attenuata) [Na-gth]
- 20
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de g-tionina (N. paniculata) [NpThio1]
- 21
- Secuencia de aminoácidos del Bucle de 1B g-tionina (C. chinense) [Cc-gth]
- 22
- Secuencia de aminoácidos de defensina NaD2 que contiene Bucle 1B
- 23
- Secuencia de aminoácidos de defensina g1-H que contiene Bucle 1B
- 24
- Secuencia de aminoácidos de defensina Psd1 que contiene Bucle 1B
- 25
- Secuencia de aminoácidos de defensina MsDefl que contiene Bucle 1B
- 26
- Secuencia de aminoácidos de defensina DmAMP1 que contiene Bucle 1B
- 27
- Secuencia de aminoácidos de defensina RsAFP2 que contiene Bucle 1B
- 28
- Secuencia de aminoácidos de defensina g-zeationina2 (Zea2) que contiene Bucle 1B
- 29
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de NaD2
- 30
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de Zea2
- 31
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de PsD1
- 32
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de PsD2
- 33
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de MsDefl
- 34
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de SoD2
- 35
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de DmAMP1
- 36
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de VrD1
- 37
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de RsAFP2
- 38
- Secuencia de aminoácidos del Bucle 1B de g1-H
- 39
- Secuencia de aminoácidos de HXP4 (Bucle 1B de NaD2 [NaD2L1B] en NaD1)
- 40
- Secuencia de aminoácidos de HXP34 (Bucle 1B de Zea2 [Zea2L1B] en NaD1)
7
- Compendio de identificadores de secuencia
- SEQ ID Nº
- DESCRIPCIÓN
- 41
- Secuencia de aminoácidos de HXP35 (Bucle 1B de PsD1 [PsDL1B] en NaD1)
- 42
- Secuencia de aminoácidos de HXP91 (Bucle 1B de MsDeF1 [MsDef1L1B] en NaD1)
- 43
- Secuencia de aminoácidos de HXP92 (Bucle 1B de SoD1 [SoD1L1B] en NaD1)
- 44
- Secuencia de aminoácidos de HXP58 (Bucle 1B de DmAMP1 [DMAMPL1B] en NaD1)
- 45
- Secuencia de aminoácidos de HXP37 (Bucle 1B de VrD1 [VrD1L1B] en NaD1)
- 46
- Secuencia de aminoácidos de HXP72 (Bucle 1B de NaD2 [NaD2L1B] en PhD2)
- 47
- Secuencia de aminoácidos de HXP95 (Bucle 1B de NaD2 [NaD2L1B] en NsD1)
- 48
- Secuencia de nucleótidos que codifica defensina de Nicotiana suaveolens
- 49
- Secuencia de aminoácidos de NsD1
- 50
- Secuencia de nucleótidos que codifica NsD2 de Nicotiana suaveolens
- 51
- Secuencia de aminoácidos que codifican NsD2
- 52
- Secuencia de aminoácidos de secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de NaD1 que termina e incluye el resto de cisteína invariante más C-terminal
- 53
- Secuencia de aminoácidos de cola C-terminal de NaD1
- 54
- Secuencia de aminoácidos de región variable de la región Bucle 1B
- 55
- Secuencia de aminoácidos de región variable de la región Bucle 1B
- 56
- Secuencia de aminoácidos de región variable de la región Bucle 1B
- 57
- Secuencia de aminoácidos de cadena principal de NaD1 que tiene un Bucle 1B definida por X1 a X6
- 58
- Secuencia de aminoácidos de C20
- 59
- Secuencia de aminoácidos de SL549
- 60
- Secuencia de aminoácidos de Bucle 1B de C20
- 61
- Secuencia de aminoácidos de NaPin1A
- 62
- Secuencia de aminoácidos de BPTI
- 63
- Secuencia de aminoácidos de CI-1B
- 64
- Secuencia de aminoácidos de HVCPI6
- 65
- Secuencia de aminoácidos de S1Cys9
- 66
- Secuencia de aminoácidos de OsIa
- 67
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 68
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 69
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 70
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 71
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 72
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 73
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 74
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 75
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 76
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 77
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 78
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 79
- Secuencia de aminoácidos en Bucle 1B de sustitución identificada siguiendo cribado de alto rendimiento
- 80
- Secuencia de nucleótidos de construcción que expresa HvCPI6 para la expresión de maíz
- 81
- Secuencia de aminoácidos de HvCPI6
- 82
- Secuencia de nucleótidos de construcción que comprende HvCPI6-L-HXP4-PPCT (NaD1)
- 83
- Secuencia de aminoácidos de HvCPI6-L-HXP4-PPCT (NaD1)
- 84
- Secuencia de aminoácidos de cadena principal de NaD1 que tiene un Bucle 1B definida por X1 a X6
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Bloqueador del canal de sodio Las Figuras 3A y B son representaciones de las alineaciones de secuencia de las defensinas solanáceas Clase II NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThiol, NeThio2, Na-gth, NpThiol y Cc-gth. El sombreado en la Figura 3A representa el alto nivel de la conversación entre las secuencias. La Figura 4 es una representación de la alineación de secuencia de defensinas de diferentes clases que revela que, aparte de los ocho restos de cisteína que están conservados, solamente los aminoácidos en las posiciones 7 y 10 están altamente conservados. La numeración se basa en relación con NaD1. La Figura 5 es una representación esquemática de la estructura bucle de NaD1 que muestra la localización del Bucle 1B que conecta la cadena β 1 y la hélice α. La Figura 6A es una representación de una inmunotransferencia que representa la expresión y purificación del NaD1 recombinante (rNaD1). El medio de expresión de P. pastoris recogido a las 48 horas (30 µl) así como las muestras de diversas fases de purificación con SP Sepharose incluyendo la fracción no unida (30 µl), la fracción de lavado (30 µl) y las primeras cinco fracciones de elución de 1,5 ml (30 µl de cada una) se separaron por SDS-PAGE y se examinaron por inmunotransferencia con el anticuerpo α-NaD1. La NaD1 de flores (200 ng) se usó como control positivo. La rNaD1 se podría detectar en los medios de expresión de 48 horas así como las fracciones de elución de Sepharose SP. La Figura 6B es una representación de una traza de HPLC de fase inversa que ilustra la pureza de rNaD1 purificada de P. pastoris usando SP Sepharose. Las fracciones de elución con SP Sepharose que contienen rNaD1 se cargaron en una columna de RP-HPLC C8 analítica y se eluyeron usando un gradiente lineal de 40 min (tampón B al 0 a 100 %). Las proteínas se detectaron por absorbancia a 215 nm. Se detectó una proteína principal sencilla indicando que la proteína era altamente pura. La Figura 6C es una representación de la estructura de rNaD1 a NaD1 nativa purificada de flores. El espectro de dicroísmo circular en UV lejano de rNaD1 (cuadrados abiertos) y NaD1 nativa (diamantes cerrados) se compara y demuestra no diferencias significativas indicando que rNaD1 estaba correctamente plegada. La Figura 6D es una representación de la actividad antifúngica de rNaD1 a NaD1 nativa purificada de flores. El crecimiento hifal de Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum en presencia de rNaD1 (cuadrados abiertos) o NaD1 nativa (diamantes cerrados) se traza en una gráfica en relación con el crecimiento de un control no proteico durante el mismo periodo. La gráfica representa los datos de tres experimentos separados realizados por cuadruplicado. Las barras de error representan el error típico de la media. La Figura 7 es una representación gráfica de la actividad antifúngica frente a Fusarium graminearum de defensinas Clase I usadas para los intercambios de bucle en comparación con NaD1 y NsD1. La Figura 8 es una representación gráfica de la actividad antifúngica relativa de variantes de bucle HXP4, HXP34 y HXP35 en comparación con NaD1 frente a F. graminearum (Fgr). La Figura 9 es una representación gráfica de la actividad antifúngica relativa de variantes de bucle HXP4, HXP34 y HXP35 en comparación con NaD1 frente a F. verticilloides (Fve). La Figura 10 es una representación gráfica de la actividad antifúngica relativa de variantes de bucle HXP4, HXP34 y HXP35 en comparación con NaD1 frente a C. graminicola (Cgr). La Figura 11 es una representación esquemática de la construcción pHEX138. El ADN se insertó entre los bordes izquierdo y derecho del vector binario pBIN19 (Bevan (1984) Nucleic Acids Research 12:8.711-8.721). El ADN se produjo modificando el gen de NaD1. Las abreviaturas en sentido horario son:
oriV: origen de replicación vegetativa ColE1 orl: origen de replicación derivado de colicina E1; BD ADNT: borde derecho de ADNT de Agrobacterium tumefaciens; Promotor Nos: promotor del gen Nos de nopalina sintasa; NPTII: secuencia genética que codifica fosfotransferasa de neomicina II; Terminador Nos: secuencia terminadora del gen Nos; lacZ alterado: segmento de ADN que codifica la secuencia parcial de B-galactosidasa; Promotor CaMV 35S: promotor de la proteína del virus del mosaico de coliflor (CaMV) 35S; HXP4: ADN que codifica el Bucle 1B de NaD2 [NaD2L1B] en NaD1 más la PPCT; Terminador de CaMV 35S: secuencia terminadora de los genes que codifican la proteína CaMV 35S; M13 ori: origen de la replicación del virus M13; BI ADNT: borde izquierdo de ADNT; Todas las flechas indican la dirección de la transcripción.
La Figura 12 es una representación gráfica de la actividad antifúngica relativa de la variante de bucle HXP4 en comparación con NaD1 frente a Aspergillus niger. Las Figuras 13A a C son representaciones gráficas de la actividad antifúngica relativa de HXP4 en comparación con NaD1 frente a Cryptococcus spp.
10
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