CN103484469B - 一种小菜蛾抗菌肽defensin及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小菜蛾抗菌肽defensin及其制备方法与应用。所述小菜蛾抗菌肽defensin的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；其相应的核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示。经序列分析发现小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。将小菜蛾抗菌肽defensin基因或其成熟肽基因进行真核表达，得到的成熟肽对多种革兰氏阳性菌具有抑制作用，尤其是对苏云金芽孢杆菌具有显著的抑制或杀死作用，可应用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的制剂。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种小菜蛾抗菌肽defensin及其制备方法与应用。
背景技术
抗菌肽(antibacterial peptide)是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分(Boman and Hultmark, 1987; Bulet et al., 2004)。抗菌肽可作用于革兰氏阴性菌(G-)、革兰氏阳性菌(G+)、真菌、寄生虫、癌细胞甚至是包膜病毒，而绝大多数抗菌肽对哺乳动物正常细胞无害，并且其杀菌机制与传统抗生素完全不同，被学者们认为是一种天然抗生素而备受青睐。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在人类医学、兽医学等领域的独特应用价值(Boulanger et al., 2006; Bulet et al., 2004)。
生物在病原体侵染时，自身会产生一系列的拮抗物质，以阻止病害的传播和病原微生物的进一步侵染，这种系统被称为防御系统。编码这些拮抗物质的基因统称为防御基因。防御素（defensin）是近年来发现的广泛存在于植物、昆虫、两栖类、鸟类和哺乳动物体内的一类富含半胱氨酸的天然广谱抗菌小分子多肽 (Tecle et al., 2010)。防御素通常由 29~54 个氨基酸组成，其中包括 6～8 个保守半胱氨酸，可通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的β片状结构，或含有一个α螺旋结构 (Tecle et al., 2010; 余兴邦 等， 2006)。防御素分子结构稳定且具有广谱的抗菌活性。根据分子结构特征和来源的不同，动物防御素可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3 种。除此之外，还有昆虫防御素和植物防御素。防御素是一种富含半胱氨酸的小分子多肽，对细菌等微生物具有广谱抗性，且作用机制特殊。昆虫防御素是 1989 年由法国学者 Hoffmann 等人首先分离得到，它与兔子肺吞噬细胞防御素分子同源(Hoffmann and Hetru, 1992)。昆虫防御素大量存在于昆虫血淋巴液中，至今已在昆虫纲动物体内发现了数十种防御素和抗菌肽。成熟的昆虫防御素一般含有34～43个氨基酸，其分子链中在Cys3与Cys4 之间有3个保守的Gly残基。此外，其分子内的 3 对二硫键配对也与 α-和β-防御素不同，分别为 Cysl--Cys4、Cys2--Cys5、Cys3--Cys6。研究表明，昆虫防御素能够抵抗细菌的感染，但仅对抗革兰氏阳性菌表现抗性，对革兰氏阴性菌几乎无作用；昆虫防御素对真核细胞无作用，而且也未见昆虫防御素抗病毒感染的报道(付蓝宝等，2011)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小菜蛾defensin基因。
本发明另一目的在于提供一种小菜蛾defensin蛋白。
本发明另一目的在于提供一种小菜蛾defensin成熟肽蛋白的制备方法。
本发明另一目的在于提供一种小菜蛾defensin和其成熟肽的应用，所述应用为用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌制剂。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
一种小菜蛾抗菌肽defensin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。
一种小菜蛾抗菌肽defensin，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
一种小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；成熟肽对应核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
一对扩增小菜蛾抗菌肽defensin的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。
一种重组表达载体，由出发载体的多克隆位点插入如上所述小菜蛾抗菌肽defensin基因序列（如SEQ ID NO：1～2所示）或其成熟肽对应核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
优选地，所述重组表达载体为pMTA-PxDef 。
一种重组细胞系，是由如上所述的重组表达载体转入S2细胞中所得。
一种小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的制备方法，具体方法为向如上所述的重组细胞系中加入终浓度为250 mM的硫酸铜，连续收集10天诱导24小时后培养基上清，将收集的培养基上清混合在一起，离心，收集上清，除去细胞碎片，首先用平衡buffer平衡Anti-V5 凝胶珠，其次与收集的上清进行充分的温育，然后将Anti-V5凝胶珠混合液加入柱子中，流速为0.05 ml/min，将所有收集的无细胞培养基通过柱子流过几次后，用平衡buffer洗脱柱子，直到收集的流出液测定蛋白浓度A280接近零时，用洗脱buffer 洗脱蛋白，并预先在收集蛋白的管中加入100 ml1 M Tris-base, pH 8.0 收集流出液，并将收集的组分用15% SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯度和浓度，最后将收集的蛋白进行脱盐，利用超纯水对脱盐柱Excellulose GF-5进行平衡，然后将收集的蛋白加入到柱子中去，收集流出的蛋白，即为成熟肽。
如上所述小菜蛾抗菌肽defensin的应用，用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌的制剂。
如上所述小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的应用，用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌的制剂。
本发明利用农业重要害虫小菜蛾作为研究对象，利用深度测序获得小菜蛾725条免疫相关的unigenes，从中筛选了defensin unigene，并利用3′-RACE 和5′RACE 技术获得了defensin的全长cDNA序列，并在S2细胞中高效表达了有活力的重组蛋白defensin。Bt是一个生物杀虫剂，但是抗菌肽对Bt产生抑制，如果能将抗菌肽defensin表达抑制，就增强了Bt的杀虫活力，可以通过基因工程手段将抗菌肽defensin的表达阻断，就为生产绿色有机蔬菜和食品开辟了新的途径。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从重要农业害虫小菜蛾中首次克隆得到抗菌肽defensin基因。并将抗菌肽defensin基因序列或其成熟肽基因序列通过真核表达系统进行表达得到有活性的的成熟肽，得到的成熟肽对多种革兰氏阳性菌具有抑制作用，尤其是对苏云金芽孢杆菌具有显著的抑制或杀死作用，可应用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的制剂。
说明书附图
图1 SDS-PAGE检检测重组蛋白PxDef 。
图2 重组蛋白PxDef处理苏云金芽孢杆菌24 h后的致凋亡作用；A：0.1%DMSO对照； B：10 μg/mL重组蛋白PxDef；左上象限：坏死细胞；右上象限：晚期凋亡细胞；左下象限：活细胞；右下象限:早期凋亡细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
S1.实验室饲养小菜蛾（Plutella xylostella）幼虫，用大肠杆菌（Escherichia coli）和B. thuringiensis作为供试菌种。
S2.小菜蛾转录组序列的测定：收集小菜蛾1龄到4龄幼虫，预蛹、蛹、成虫，抽取总RNA后进行利用RNA-seq技术测定其转录组序列，总RNA的提取方法参照Trizol （Invitrogen ,USA）试剂盒说明书操作。共测定了34,522,812条clean reads，reads平均长度为90bp，获得3,107,053,080个碱基。最后组装成107710个Unigene，长度范围为200~3000bp。COG、GO、KEGG注释和分析后共获得68984条具较高注释可信度的Unigene，与昆虫免疫直接相关的Unigenes 725条，其中Defensin的Unigene 1条，其序列为342 bp，SEQ ID NO：8 所示。
S3.根据defensin的Unigene设计3′端和5′端RACE 末端快速扩增反应的特异引物，3′RACE引物序列为：5′-GCAGGAGACAGTGGTTGAGGAG-3′，如SEQ ID NO：9所示，5′RACE引物为 5′- GTTGGCAAATTGTATCTTCAGTGGCGTC -3′，如SEQ ID NO：10所示。3′端和5′端RACE 分别和UPMs配对进行RACE末端快速扩增反应，UPMs引物序列为：UPM-L：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’如SEQ ID NO：11所示和UPM-S:5’-CTAATACGAC TCACTATAGGGC-3’ 如SEQ ID NO：12所示。
S4. cDNA第一链合成：
首先，提取小菜蛾总RNA：用OD值为0.8～1.0的大肠杆菌菌液刺激小菜蛾4龄幼虫，进行肽聚糖识别蛋白的诱导。取0.5～1g经6小时诱导后的小菜蛾，液氮中研磨，用Trizol法提取小菜蛾总RNA；总RNA的提取方法参照Trizol （Invitrogen ,USA）试剂盒说明书操作。
按照CLONTECH公司RACE试剂盒说明书进行，10μg 总RNA，加反应液20μL，42℃反应90分钟。72℃10分钟终止反应。反应液组成：50毫摩尔氯化钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔 Tris-HCL pH8.3，1毫摩尔DTT，5微摩尔d NTP，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶。
S5.3′RACE和5′RACE反应：以步骤S4反转录得到的cDNA第一链为模板，S3所示的引物进行PCR反应，链式聚合酶反应（PCR）试剂与条件如下：
首先将下列试剂混合在一起
在3′-RACE中，正向引物和反向引物分别为3′-RACE（如SEQ ID NO：9所示)和UPMs引物（如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示）；5′-RACE中，正向引物和反向引物分别为5′-RACE（如SEQ ID NO：10所示)和UPMs引物（如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示）。
PCR反应条件为：首先94℃变性5分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，65℃30 秒，72℃ 50秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟。
反应产物纯化：利用OMEGA BIO-TEK公司产品（Gel Extraction Kit）操作步骤按产品说明书进行；将纯化的产物克隆后送上海invitrogen公司进行测序。
S6. 小菜蛾抗菌肽defensin基因全长cDNA的获得
根据RACE测序结果，设计一对引物DefORFF和DefORFR，引物序列SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
以小菜蛾4龄幼虫的cDNA为模板，反应条件如下：
所述混合液组成如下：
将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、40秒，56℃、40秒，72℃、50秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，扩增完毕后置4℃终止反应。反应产物纯化：利用OMEGA BIO-TEK公司产品（Gel Extraction Kit）操作步骤按产品说明书进行。
S7. 抗菌肽基因克隆：取纯化产物5μL，与pMD18-T（TaKaRa）载体连接。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素（100mg/mL）和异丙基硫代半乳糖苷（ 0.1mol/mL）的平板生长过夜，挑取6个白斑，在LB液体培养基（5mL，含100μg/mL氨苄青霉素）过夜培养。
质粒纯化：收取过夜培养菌液1~2mL，离心（10000转，1分钟）收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒（OMEGA BIO-TEK）纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
序列测序与同源检索：取500μL菌液，送上海invitrogen公司进行测序。将所得序列与基因库序列比较。
经实施例1克隆得到的小菜蛾defensin的基因的全长序列为524bp（如SEQ ID NO：1所示），ORF 为360 bp（如SEQ ID NO：2所示），能编码119个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO：3所示；经序列分析发现：前16个氨基酸为信号肽；信号肽序列为MYFTKLLFVIVIAFVFVPSALC（共22 aa ）；序列如SEQ ID NO：4所示。
YPRDVAVQRTEEVKAQIIETEAKPQPTTVVEPQQETVVEPQQETVVEESTEPLNIEHVHG（共60 aa ）为前导肽序列；序列如SEQ ID NO：5所示。
RIPCQYEDATEDTICQQHCLPKGYSYGICVSYRCSCV（共37 aa ）为成熟肽序列，序列如SEQ ID NO：6所示；成熟肽对应核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
实施例2 制备有杀菌功能的小菜蛾重组蛋白defensin的方法：
S1. 设计扩增小菜蛾defensin 成熟肽的引物:
DEF-F：5’-GCGATATGTAGAATACCTTGCCAGTACGAAGACG-3’；ATATGT表示引入的酶切位点为BglⅡ。如SEQ ID NO：15所示。
DER-R：5’-GCCTCGAGAACACAGCTGCACCGGTAGCTGACAC-3’；CTCGAG表示引入的酶切位点为XhoI。如SEQ ID NO：16所示。
S2. 编码小菜蛾defensin 成熟肽的cDNA序列的PCR扩增：
以小菜蛾4龄幼虫的cDNA为模板，反应条件如下：
所述混合液组成如下：
含20 mM Mg2+的10×PCR 缓冲液 5 μl；
浓度各为2.5 mM的 dNTP 混合物 4μl；
10μM引物DER-F 4μl ；
10μM引物DEF-R 4μl；
5U/μl的高保真DNA聚合酶 0.5μl；
灭菌水 32.5μl。
将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、40秒，60℃、40秒，72℃、50秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，扩增完毕后置4℃终止反应。
S3. 小菜蛾defensin 成熟肽在S2细胞中的瞬时表达，在下面的步骤中小菜蛾defensin 成熟肽简称为PxDef；含有小菜蛾defensin 成熟肽序列的重组pMTA质粒简称为pMTA-PxDef重组质粒。pMTA-PxDef重组质粒的制备参照分子克隆的常规技术方法。
S31. S2细胞的培养方法：在容器中加入预配制培养液95% 体积的超纯水，加入Grace’s昆虫干粉培养基并轻轻搅拌。按培养基说明书加入适量NaHCO3，搅拌溶解并以超纯水定容。缓慢搅拌加入1 mol/L NaOH或HCl调节pH值，其pH应比预期pH低0.2 ~ 0.3。调节pH值后，每升溶液中分别加入3.0 g酵母提取物、3.0 g水解乳蛋白并混合均匀。将上述溶液通过0.22 μm过滤器过滤除去污染后，装在血清瓶中置于4 ℃保存，即为果蝇S2细胞Grace’s不完全培养基。作为果蝇S2细胞培养的Grace’s完全培养基，在不完全培基使用前加入10 %胎牛血清（FBS）和1%充分混匀后即为果蝇S2细胞Grace’s完全培养基。
S32. 瞬时转染果蝇S2细胞方法：当转染pMTA-PxDef DNA时，种子细胞要在无血清培养基中培养过夜，根据转染试剂说明书转染pMTA-PxDef DNA，铺板的细胞达到70%融合率后，开始转染。将测序鉴定正确的重组质粒pMTA-PxDef瞬时转染果蝇S2细胞，转染过夜后，换成新鲜的Grace’s完全培养基，培养24小时后，在75cm2的细胞培养瓶中加入终浓度为250 mM的硫酸铜诱导蛋白48小时，利用Tricine-SDS-PAGE电泳检测defensin在 S2细胞中的表达情况。
S4. 小菜蛾defensin 成熟肽在S2细胞中稳定细胞系的筛选
稳定细胞系的筛选：利用DES Inducible/Secreted 试剂盒结合 pCoBlast来筛选稳定的细胞系pMTA-PxDef。为了构建稳定的细胞系，质粒pCoBlast 和质粒pMTA-PxDef共转染到S2 细胞中，转染48小时后，离心细胞，除去上清，用加有25 mg/ml Blasticidine S hydrochloride完全培养基重悬细胞，慢慢培养一个星期，抗性克隆就可以筛选出来了。
S5. 小菜蛾defensin 成熟肽的纯化
小菜蛾defensin 成熟肽纯化结果如图1，具体操作如下：是将带有pMTA-PxDef质粒的S2稳定细胞系在75cm2的细胞培养瓶中加入终浓度为250 mM的硫酸铜诱导蛋白。连续收集10天诱导24小时后培养基上清，并每次添加新鲜的培养基到75cm2的细胞培养瓶中。为了纯化蛋白，把所有收集的培养基上清混合在一起，常温下1000 g离心10 min，收集上清，除去细胞碎片。首先用平衡buffer（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4）平衡Anti-V5 凝胶珠，其次与先收集的上清进行充分的温育，目的是所以的蛋白与Anti-V5结合，然后将Anti-V5凝胶珠混合液加入一个1.5ml柱子中，流速为0.05 ml/min，将所有收集的无细胞培养基通过柱子流过几次后，用平衡buffer洗脱几次柱子，直到收集的流出液测定蛋白浓度A280接近零时，用1 ml 洗脱buffer (0.1 M glycine-HCl, pH 3.5, 1% Triton X-100)洗脱蛋白，并预先在收集蛋白的管中加入100 ml1 M Tris-base, pH 8.0 收集流出液，并将收集的组分用15% SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯度和浓度。最后将收集的蛋白进行脱盐，利用超纯水对脱盐柱Excellulose GF-5进行平衡，然后将收集的蛋白加入到柱子中去，收集流出的蛋白，即为我们需要的蛋白，测定蛋白浓度后备用。
S6. 小菜蛾defensin 成熟肽的生物活性测定
采用Hultmark的液相法对小菜蛾defensin 成熟肽进行杀菌谱测定。具体操作：将纯化的小菜蛾defensin成熟肽用0.01% 的乙酸和0.2% 小牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）1/2倍梯度稀释。取对数生长期的革兰氏阳性菌100 μl，再加入10 μl不同浓度的成熟肽，使每管成熟肽的终浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μg/ml，混匀，在96孔平板上30℃过夜孵育24hr，用酶标仪在492 nm处测定各管的吸光度。吸光度没有明显变化的小菜蛾defensin成熟肽的最低浓度为最小抑制浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）。测定结果如表1。
表 1 小菜蛾defensin成熟肽对革兰氏阳性菌的最小抑制浓度
S7. 小菜蛾defensin成熟肽（PxDef）对苏云金芽孢杆菌的作用机理
为了探讨小菜蛾defensin成熟肽对苏云金芽孢杆菌的作用是影响苏云金芽孢杆菌的膜还是影响其它的生理。我们将小菜蛾defensin成熟肽PxDef处理过的苏云金芽孢杆菌和碘化丙啶（propidium iodide ,PI）温浴，PI不能通过细胞的质膜，因而只可染无胞浆膜的裸露DNA，正常的细胞对PI表现为拒染，因此PI对破裂的死细胞表现为高染。因此可以通过细菌细胞发出的荧光强度来反应PI和细菌DNA结合的强度。经FACScan分析表明，无PxDef处理的苏云金芽孢杆菌只有0.29 %的PI信号，PxDef处理的细菌有25.86 %的PI信号(结果如图2)；以上结果显示，小菜蛾defensin成熟肽PxDef处理过的苏云金芽孢杆菌表现出了对PI的强染性，表明小菜蛾defensin成熟肽PxDef作用于细菌的细胞膜使DNA外漏的结果，表明PxDef抑制或杀死苏云金芽孢杆菌是靠作用细菌的细胞膜的结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种小菜蛾抗菌肽defensin及其制备方法与应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 524
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<213> 小菜蛾defensin基因全长序列
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gatgtggcgg tgcagaggac tgaggaggtc aaagctcaaa taattgagac tgaagctaaa 180
ccacaaccaa cgacggtggt tgaaccacaa caggagacag tggttgaacc acagcaggag 240
acagtggttg aggagtcaac agaacctttg aacatagagc atgtccacgg cagaatacct 300
tgccagtacg aagacgccac tgaagacaca atttgccaac aacactgcct cccaaaaggg 360
tattcctacg gtatttgtgt cagctaccgg tgcagctgtg tttgattctc agtgacaata 420
aataataata gaaaattatc gattgtaaag tgtaaaataa taattttaaa gttaaataaa 480
taaatatgat ttagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagt 524
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<212> DNA
<213> 小菜蛾defensin基因ORF序列
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cacggcagaa taccttgcca gtacgaagac gccactgaag acacaatttg ccaacaacac 300
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<213> 小菜蛾defensin蛋白序列
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Glu Glu Val Lys Ala Gln Ile Ile Glu Thr Glu Ala Lys Pro Gln Pro
35 40 45
Thr Thr Val Val Glu Pro Gln Gln Glu Thr Val Val Glu Pro Gln Gln
50 55 60
Glu Thr Val Val Glu Glu Ser Thr Glu Pro Leu Asn Ile Glu His Val
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His Gly Arg Ile Pro Cys Gln Tyr Glu Asp Ala Thr Glu Asp Thr Ile
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Cys Gln Gln His Cys Leu Pro Lys Gly Tyr Ser Tyr Gly Ile Cys Val
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Ser Tyr Arg Cys Ser Cys Val
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20
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<213> 前导肽
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Ile Ile Glu Thr Glu Ala Lys Pro Gln Pro Thr Thr Val Val Glu Pro
20 25 30
Gln Gln Glu Thr Val Val Glu Pro Gln Gln Glu Thr Val Val Glu Glu
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Ser Thr Glu Pro Leu Asn Ile Glu His Val His Gly
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<212> DNA
<213> 成熟肽对应的核苷酸序列
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tgccagtacg aagacgccac tgaagataca atttgccaac aacactgcct ccccaaaggg 300
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<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> DER
<400> 16
gcctcgagaa cacagctgca ccggtagctg acac 34
Claims (2)
1.一种小菜蛾抗菌肽defensin基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。
2.一种小菜蛾抗菌肽defensin，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3. 一种小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽，其特征在于，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；成熟肽对应核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
4. 一对扩增小菜蛾抗菌肽defensin基因的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO：13～14所示。
5. 一种重组表达载体，其特征在于，由出发载体的多克隆位点插入权利要求1所述小菜蛾抗菌肽defensin基因的核苷酸序列或权利要求3所述小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽对应核苷酸序列。
6. 根据权利要求5所述重组表达载体，其特征在于，所述出发载体为pMTA载体 。
7. 一种重组细胞系，其特征在于，是由权利要求5或6所述的重组表达载体转入S2细胞中所得。
8. 一种小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的制备方法，其特征在于，具体方法为向权利要求7所述的重组细胞系中加入终浓度为250 mM的硫酸铜，连续收集10天诱导24小时后培养基上清，将收集的培养基上清混合在一起，离心，收集上清，除去细胞碎片，首先用平衡缓冲液平衡Anti-V5 凝胶珠，其次与收集的上清进行充分的温育，然后将Anti-V5凝胶珠混合液加入柱子中，流速为0.05 ml/min，将所有收集的无细胞培养基通过柱子流过几次后，用平衡缓冲液r洗脱柱子，洗脱到测定蛋白浓度A280接近零时，换成洗脱缓冲液 洗脱目的蛋白，在收集蛋白时，预先在收集蛋白的管中加入100 μL 1 M、pH 8.0的 Tris-base收集流出液，利用15% SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯度和浓度，最后将收集的蛋白进行脱盐，利用超纯水对脱盐柱Excellulose GF-5进行平衡，然后将收集的蛋白加入到柱子中去，收集流出的蛋白，即为成熟肽。
9. 权利要求1所述小菜蛾抗菌肽defensin基因的应用，其特征在于，用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌的制剂。
10. 权利要求3所述小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的应用，其特征在于，用于制备抑制或杀死苏云金芽孢杆菌的制剂。
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