KR101951057B1 - 항병원성 물질로서 유용한 변경된 식물 데펜신 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 루프 IB 영역에 대한 변경을 갖는, 항병원체 활성을 나타내는 변경된 데펜신(defensin) 분자를 포함하는 항병원성 물질 분야에 관한 것이다. 원예 및 농업에서 사용되고 동물 및 인간 약제로서 사용될 변경된 데펜신 및 항병원체 조성물을 발현하거나 함유하는 유전으로 변경된 식물 및 이의 자손 또는 부분도 제공된다. 니코티아나 수아볼렌스(Nicotiana suaveolens)로부터 유래된 데펜신도 제공된다.

Description

항병원성 물질로서 유용한 변경된 식물 데펜신{MODIFIED PLANT DEFENSINS USEFUL AS ANTI-PATHOGENIC AGENTS}
출원 데이터
본원은 2011년 2월 7일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/440,309호(발명의 명칭: "항병원성 물질"; 이의 전체 내용은 본원에 참고로 도입됨)와 관련되어 있고 상기 가특허출원에 대한 우선권을 주장한다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 항병원체 활성을 갖는 변경된 데펜신 분자를 포함하는 항병원성 물질의 분야에 관한 것이다. 일반적으로, 원예 및 농업에서 사용되고 동물 및 인간 약제로서 사용될 변경된 데펜신 및 항병원체 조성물을 발현하거나 함유하는 유전으로 변경된 식물 및 이의 자손 또는 부분도 제공된다.
본 명세서에서 저자에 의해 인용된 공개문헌들의 서지 세부목록은 본 명세서의 끝 부분에 알파벳순으로 정리되어 있다.
본 명세서에서 임의의 종래기술의 언급은 이 종래기술이 임의의 국가에서 공통된 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의의 형태의 암시가 아니고 이러한 인정 또는 암시로서 간주되어서는 안 된다.
원예 및 농업 산업이 직면하는 주요 어려움 중 하나는 병원체, 예컨대, 진균 병원체에 의한 감염 및 발생된 손상의 제어이다. 식물 병원체는 연간 수백억 톤의 생산 손실의 원인이 된다. 살진균제 및 다른 항병원성 화학물질이 성공적으로 사용되고 있지만, 식물 해충을 제어하기 위한 화학물질의 계속된 사용과 관련된 다양한 환경적 및 규제적 우려사항이 존재한다. 나아가, 화학 구충제(pesticide)의 증가하는 사용은 해충 집단에서 내성의 출현에 대한 선택적 압박을 제공하고 있다. 병원체, 예컨대, 진균, 곤충, 미생물, 선충, 절지동물, 원생동물 및 바이러스에 대한 저항성을 식물에 도입하는 대안적 기작을 발생시킬 필요성이 명확히 존재한다.
식물 선천성 면역 시스템은 항시성(constitutive) 구성요소 또는 미리 형성된 유도성 구성요소 둘다를 포함한다. 미리 형성된 면역은 다양한 물리적 장벽, 예컨대, 잎 및 단단한 세포벽 상의 왁스 층뿐만 아니라 다양한 항미생물성 단백질의 발현을 포함한다(Nurnberger et al. (2004) Immunol Rev 198:249-266). 유도성 반응은 세포벽의 강화(Showalter (1993) Plant Cell 5(1):9-23)뿐만 아니라, 다양한 생물 자극 및 비-생물 자극에 반응하여 일어나는 이차 대사물질(Metlen et al. (2009) Plant Cell Environ 32(6):641-653) 및 항미생물성 단백질(Berrocal-Lobo et al. (2002) Plant Physiol 128(3):951-961; Li and Asiegbu (2004) J Plant Res 117(2):155-162)의 상향조절도 포함할 수 있다. 이들 반응들은 식물의 감염 부위에서 또는 식물의 멀리 떨어진 비-감염된 부분에서 국소적으로 일어나 전신 반응을 생성할 수 있다. 유전자에 대한 유전자(gene-for-gene) 반응을 통해 유도성 면역도 일어날 수 있고, 이로써 병원체 관련 분자 패턴(PAMPS)이 병원체의 추가 확산을 예방하는 과민성 반응을 야기하는 특이적 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 인식된다(문헌(Jones and Dangl (2006) Mature 444(7117):323-329) 참조).
작은 이황화-풍부 단백질들은 식물 면역의 항시성 양태 및 유도성 양태 둘다에 있어서 큰 역할을 수행한다. 이들은 이들의 시스테인 정렬에 기초하여 패밀리로 분류될 수 있고, 티오닌(thionin), 스내킨(snakin), 타우마틴(thaumatin) 유사 단백질, 해베인(havein) 유형 또는 노틴(knottin) 유형 단백질, 지질 전달 단백질 및 사이클로타이드뿐만 아니라 데펜신도 포함한다.
식물 데펜신은 4개 내지 5개의 이황화 결합을 갖는 작은(45개 내지 54개 아미노산) 염기성 단백질이다(Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):8214-8222). 이들은 공통된 이황화 결합 패턴, 및 삼중 가닥 역평행 β-시트(sheet)가 3개의 이황화 결합에 의해 α-나선(helix)에 부착되어 시스테인에 의해 안정화된 αβ 모티프(CSαβ[도 1 참조])를 형성하는 공통된 구조적 폴드(fold)를 공유한다. 제4 이황화 결합도 N-말단과 C-말단을 연결하여 매우 안정한 구조를 발생시킨다. 항균 활성, 단백질 합성 억제, 및 α-아밀라제 및 단백질 억제를 포함하는 다양한 기능들이 데펜신에 귀속되어 있다(Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194; Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104). 식물 데펜신은 형질전환 식물에서 발현되어 표적 병원체에 대한 저항성을 증가시킨다. 예를 들면, 자주개자리(alfalfa) 데펜신(MsDef1, 이전에 alfAFP로서 공지됨)을 발현하는 감자는 비-형질전환된 대조군에 비해 진균 병원체 버티실리움 달리아(Verticillium dahliae)에 대한 상당한 저항성을 보였다(Gao et al. (2000) Nat Biotechnol 18(12): 1307-1310). 벼에서 달리아 데펜신(DmAMP1)의 발현은 2종의 주요 벼 병원체, 즉 매그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로부터의 보호를 제공하기에 충분하였다(Jha et al. (2009) Transgenic Res 18(1):59-69).
식물 데펜신들은 그들의 보존된 구조에도 불구하고 완전히 보존된 8개의 시스테인 잔기만을 가지면서 매우 적은 서열 동일성을 공유한다. 상기 시스테인 잔기들은 그들의 존재 및 위치가 데펜신들 사이에 보존되어 있기 때문에 "불변 시스테인 잔기"로서 통상적으로 지칭된다. 식물 데펜신들은 서열 유사성에 기초하여 상이한 군으로 분류될 수 있다(도 2 참조). 각각의 군 내에서, 서열 상동성은 상대적으로 높은 반면, 군 사이의 아미노산 유사성은 낮다. 상이한 군의 항진균 데펜신은 상이한 기작을 통해 작용하는 것으로 보인다.
식물 데펜신들은 2종의 주요 클래스로 나누어질 수 있다. 클래스 I 데펜신은 소포체(ER) 신호 서열에 이어서 성숙 데펜신 도메인으로 구성된다. 클래스 II 데펜신은 약 33개의 아미노산으로 구성된 C-말단 전구도메인 또는 전구펩티드(CTPP)를 갖는 보다 더 큰 전구체로서 생성된다. 지금까지 확인된 대다수의 클래스 II 데펜신들은 가지과(solanaceous) 식물 종에서 발견되었다. 클래스 II 가지과 데펜신들의 정렬은 도 3에 제공되어 있다. 도 3에서 언급된 NsD1 및 NsD2는 본 개시내용에 따라 확인된 신규 데펜신을 대표한다. 이들을 도 3에 포함시킨 것은 이들이 종래기술의 일부를 형성한다는 것을 내포하기 위한 것이 아니다.
클래스 II 가지과 데펜신은 항진균 활성을 나타내고 꽃 조직에서 발현된다. 이들은 꽃담배 니코티아나 알라타(Nicotiana alata)의 꽃에서 고농도로 발현되는 NaD1을 포함한다(Lay et al. (2003) Plant Physiol 131(3):1283-1293). NaD1은 항진균 활성의 기작이 연구된 유일한 클래스 II 가지과 데펜신이다. 이 펩티드의 활성은 세포벽에의 결합, 원형질막의 투과능(permeabilization) 및 균사의 세포질 내로의 상기 펩티드의 도입을 포함한다(van der Weerden et al. (2008) J Biol Chem 283(21):14445-14452). 많은 다른 데펜신들과 달리, NaD1은 사상 진균에 대해 특이적인 것으로 보이고 효모, 세균 또는 포유동물 세포의 생장에 영향을 미치지 않는다.
목화에서 NaD1의 발현은 진균 병원체 푸사리움 옥시스포룸 품종 바신펙툼(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum) 및 버티실리움 달리아에 대한 저항성을 향상시킨다. 포장(圃場)(field) 조건 하에서, NaD1을 발현하는 식물은 비-형질전환된 대조군 식물보다 2배 더 높은 생존가능성을 보였고, 헥타르 당 린트(lint) 수율은 2배이었다. 이것에도 불구하고, NaD1 발현 식물에서 상당한 수준의 질환이 여전히 존재하였다.
데펜신의 구조는 시스테인 잔기들 사이의 영역으로서 정의된 7개의 "루프"로 구성된다. 루프 1은 제1 β-가닥(1A)뿐만 아니라, 처음 2개의 불변 시스테인 잔기들 사이에서 이 β-가닥을 α-나선(1B)에 연결하는 유연성 영역의 대부분도 포괄한다. 도 5는 보존된 시스테인 잔기를 포함하는 NaD1의 루프 구조를 보여준다. 루프 2 및 3, 및 루프 4의 시작 부분(4A)은 α-나선을 구성하지만, 남은 루프(4B 내지 7)는 β-가닥 2 및 3, 및 이들을 연결하는 유연성 영역(β-헤어핀 영역)을 구성한다. 식물 데펜신의 이 헤어핀 영역은 다양한 클래스들의 많은 항미생물 펩티드들에서 발견되는 γ-코어 모티프를 형성한다(Yount and Yeaman (2005) Protein Pept Lett 12(1):49-67).
이 β-헤어핀 영역은 식물 데펜신의 생물학적 활성에 필수적인 것으로 보인다. 무(radish) 데펜신 RsAFP2(도 2 참조)의 이 영역 내의 돌연변이는 일반적으로 그의 항진균 활성에 부정적인 영향을 미친다. 실제로, 항진균 활성에 필수적인 잔기로서 확인된 12개의 잔기들 중 8개의 잔기들은 이 영역에 위치한다(De Samblanx et al. (1997) J Biol Chem 272(2):1171-1179). 나아가, 상기 분자의 이 영역에 상응하는 화학적으로 합성된 펩티드는 그 자신에 대한 항진균 활성도 갖는다(Schaaper et al. (2001) J. Pept. Res. 57(5):409-418). 별도의 연구에서, 녹두의 데펜신인 VrD2의 루프 5에 위치한 6개의 잔기들은 상기 데펜신의 α-아밀라제 억제 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다(Lin et al. (2007) Proteins 68(2):530-540). 제3 연구는 항진균 활성을 갖는 데펜신(MsDef1) 및 상기 활성을 갖지 않는 데펜신(MtDef2)의 영역을 함유하는 키메라 단백질의 활성을 연구하였다. MsDef1의 β2-β3 헤어핀 영역을 함유하는 키메라 데펜신은 전체 MsDef1 단백질과 거의 동일한 활성을 가졌고, MtDef2의 이 영역을 함유하는 키메라 데펜신은 활성을 갖지 않았다(Spelbrink et al. (2004) Plant Physiol 135(4):2055-2067).
제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단에서 인접하여 위치하는 제1 β-가닥과 α-나선을 연결하는 유연성 루프(루프 1B)는 루프 5의 잔기와 패치로서 연결되어 있을 때 몇몇 데펜신들의 항진균 활성에 있어서 중요하지 않은 역할을 수행하는 것으로 보고되어 있다. RsAFP2의 돌연변이유발 연구는 이 영역에 위치하는, 활성에 중요한 2개의 아미노산을 확인하였다(상기 문헌(De Samblanx et al, 1997)). 그러나, 항진균 데펜신 MsDef1의 이 영역이 비-항진균 데펜신의 상응하는 영역으로 교체되었을 때, 항진균 활성의 그다지 크지 않은 변화만이 존재하였다(상기 문헌(Spelbrink et al, 2004)).
클래스 II 가지과 데펜신은 진균에 대한 가변 활성도를 갖는다. 몇몇 클래스 I 데펜신은 매우 낮은 항진균 활성을 나타낸다. 이들의 항병원체 활성을 개선하고 넓히기 위해 데펜신을 변경시키고자 하는 시도는 지금까지 거의 성공적이지 못하였다. 몇몇 데펜신들에 대한 내성 발달도 잠재적인 문제점이다. 데펜신의 항병원체 활성의 수준 및 범위를 조작하는 프로토콜을 개발할 필요성이 존재한다. 또한, 항병원체 활성을 갖는 다양한 신규 데펜신의 생성은 내성의 발달에 대항하는 것을 용이하게 한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 전체에서 단어 "포함한다" 또는 이의 어미변화, 예컨대, "포함하고" 또는 "포함하는"은 기재된 요소, 정수 또는 방법 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 방법 단계들의 군을 포함한다는 것을 내포하지만 임의의 다른 요소, 정수 또는 방법 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 방법 단계들의 군을 배제하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 "1개", "하나" 및 "한"은 복수형 양태를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "1개의 데펜신"의 언급은 단일 데펜신뿐만 아니라 2개 이상의 데펜신도 포함하고, "하나의 아미노산, 치환, 추가 및/또는 결실"은 단일 아미노산, 치환, 추가 및/또는 결실뿐만 아니라 2개 이상의 아미노산, 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하고, "한 양태"의 언급은 단일 양태뿐만 아니라 본 명세서에 교시된 2개 이상의 양태도 포함한다.
뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 서열 식별기호(서열번호)에 의해 언급된다. 서열번호는 서열 식별기호 <400>1(서열번호 1), <400>2(서열번호 2) 등에 수치적으로 상응한다. 서열 식별기호의 요약은 표 1에 제공되어 있다. 서열목록은 특허청구범위 다음에 제공된다.
본 개시내용은 항병원체 활성을 갖는 신규 패밀리의 데펜신을 구성하는 인공적으로 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 교시한다. 한 실시양태에서, 상기 변경된 클래스 II 가지과 데펜신에서 항병원체 활성은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신에 비해 특히 활성의 수준 및/또는 범위, 안정성 및/또는 막 투과능 중 하나 이상의 활성 면에서 향상된다. 상기 변경된 데펜신은 원예 및 농업에서 병원체 감염 및 생장을 제어하는 데에 유용할 뿐만 아니라 동물 및 인간 약제의 제조에서도 유용한 것으로 본원에서 교시된다. 상기 데펜신은 단독으로 사용될 수 있거나, 화학 살균제(pathogenicide), 항병원체 단백질 및/또는 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태와 함께 사용될 수 있다. 또한, 상기 신규 패밀리의 데펜신의 사용가능성은 특정 데펜신에 대한 병원체 내성에 대항하는 데에 있어서 도움을 준다.
클래스 II 가지과 데펜신은 골격으로서 사용되는데, 이때 데펜신 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥(β-가닥 1)과 α-나선 사이의 루프 영역(제1 유연성 루프로서도 기재됨)이 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되고/되거나, 이 루프 영역의 전부 또는 일부를 대체하도록 또 다른 데펜신의 루프 영역 또는 이의 변경된 형태가 클래스 II 가지과 데펜신 상으로 이식된다. 골격 데펜신은 임의적으로 이 루프 영역 외부에서 추가 돌연변이도 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실의 형태로 1개 내지 약 50개의 추가 돌연변이가 루프 1B 영역 외부의 하나 이상의 영역에서 만들어질 수 있다.
(i) 그의 N-말단 영역 내에서 루프 도메인을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신으로부터 유래되거나 이 데펜신에 상응하는 아미노산 골격; 및
(ii) (a) 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실, 및/또는 (b) 또 다른 데펜신의 루프 또는 이의 변경된 형태에 의한 제1 루프 도메인의 전부 또는 일부의 대체 중 하나 이상에 의해 변경된, 상기 골격 상의 루프 도메인
을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신으로서, 항병원체 활성을 나타내는 인공적으로 생성된 데펜신이 제공된다. 본 개시내용은 클래스 II 가지과 데펜신 제1 루프 도메인, 특히 루프 1B를 클래스 I 데펜신의 루프 도메인에 상응하는 아미노산 서열로 전환시키는 단계를 포함하는, 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 교시한다. 대안적으로, 또 다른 클래스 II 데펜신 루프 1B 영역을 사용하여 클래스 II 데펜신 상의 루프 1B를 대체한다. 변경된 클래스 II 가지과 데펜신은 이 루프 영역 외부에서 하나 이상의 추가 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실도 함유할 수 있다. 존재하는 경우, 1개 내지 약 50개의 추가 돌연변이가 상기 루프 영역 외부에 위치할 수 있다.
한 실시양태에서, 항병원체 활성은 변경 전 클래스 II 데펜신에 비해 향상된다. "향상된"은 비-변경된 클래스 II 데펜신에 비해 활성의 수준 및/또는 범위, 안정성 및/또는 막 투과능 중 하나 이상의 개선을 의미한다.
골격으로서 사용될 클래스 II 가지과 데펜신은 가장 C-말단에 있는 불변 시스테인(C) 잔기를 포함하는 NaD1 성숙 도메인의 C-말단에 존재하는 대략 20개의 인접 아미노산 잔기 서열(서열번호 52)에 대해 70% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 데펜신을 포함한다. 클래스 II 가지과 데펜신의 예로는 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth 및 Cc-gth가 있다. 다른 골격 데펜신은 캡시쿰(Capsicum)의 C20 및 니코티아나의 SL549를 포함한다. 각각 서열번호 49 및 51에 기재된 아미노산 서열을 갖는 NsD1 및 NsD2는 니코티아나 수아베올렌스(Nicotiana suaveolens)로부터 유래된다.
클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 영역에 존재하는 "루프 도메인"의 언급은 처음 2개의 (불변) 시스테인(C) 아미노산 잔기에 의해 플랭킹됨으로써 한정된 전체 루프 영역을 포함한다. 이것은 상기 데펜신의 N-말단 영역에 존재하는 제1 유연성 루프이다. 그러나, 한 실시양태에서, "루프 도메인"은 제1 β-가닥의 말단에서 시작되어 제2 불변 시스테인 아미노산 잔기의 N-말단측에서 종결되는 루프 영역을 지칭한다. 이 영역은 도 5에서 "L1B"[루프 1B]로서 지칭된다. 클래스 II 가지과 데펜신의 일례인 NaD1에서, 이 영역 또는 도메인은 1-문자 코드 NTFPGI로 표시된 아미노산 서열을 포함한다(도 5 참조). 다른 클래스 II 가지과 데펜신 제1 루프 영역은 도 3에 나타나 있다. 도 4는 8개의 보존된 시스테인 잔기들을 보여주는 상이한 클래스의 데펜신들의 아미노산 정렬을 나타낸다.
따라서, 클래스 II 가지과 데펜신 골격의 루프 1B 영역을 돌연변이시키거나 이의 위치에 또 다른 데펜신, 예컨대, 클래스 I 데펜신 또는 또 다른 클래스 II 데펜신의 루프 1B 영역을 이식시킴으로써 1-문자 아미노산 명명법의 이용에 의해 표시된 X1X2X3X4X5X6의 루프 1B 아미노산 서열을 발생시킬 수 있고, 이때 X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 돌연변이된 클래스 II 가지과 데펜신에서 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 골격을 형성하는 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
한 실시양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신 골격의 루프 1B 영역을 돌연변이시키거나 이의 위치에 또 다른 데펜신, 예컨대, 클래스 I 데펜신의 루프 1B 영역을 이식시킴으로써 1-문자 아미노산 명명법의 이용에 의해 표시된 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 발생시키고, 이때 X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 골격을 형성하는 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신 골격의 루프 1B 영역을 돌연변이시키거나 이의 위치에 또 다른 데펜신, 예컨대, 클래스 I 데펜신의 루프 1B 영역을 이식시킴으로써 1-문자 아미노산 명명법의 이용에 의해 표시된 X1X2X3X4X5X6의 아미노산 서열을 발생시키고, 이때 X1은 N, H, Q, D, K 또는 E이고/이거나; X2는 R, H, T, K 또는 G이고/이거나; X3은 F, H, Y 또는 W이고/이거나; X4는 P, K, S 또는 R이고/이거나; X5는 G 또는 F이고/이거나; X6은 P, V, I 또는 N이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
한 실시양태에서, 인공적으로 생성된 또는 변경된 데펜신은 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열에서, 루프 1B 영역은 X1X2X3X4X5X6으로서 정의되고, 이때 X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
한 실시양태에서, 인공적으로 생성된 또는 변경된 데펜신은 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열에서, 루프 1B 영역은 X1X2X3X4X5X6으로서 정의되고, 이때 X1은 N, H, Q, D, K 및 E로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X2는 R, H, T, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X3은 F, H, Y 및 W로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X4는 P, K, S 및 R로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X5는 G 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X6은 P, V, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
한 실시양태에서, 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 39에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 단리된 가지과 클래스 II 데펜신이 본원에서 교시되고, 이때 변경은 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 아미노산 서열에 대한 아미노산 치환, 추가 또는 결실이다. 서열번호 39는 HXP4를 생성하는, NaD1 골격 내의 NaD2 루프 1B 서열(HRFKGP)의 아미노산 서열이다. 본 개시내용은 NaD1에 관한 것이 아니라 이의 루프 1B 서열이 변경되어 있는 변경된 NaD1에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 FST, NeThio1, NeThio2, C20, SL549, PhD1, PhD2, TPP3, Na-gth 또는 Cc-gth에 관한 것이 아니라 이의 루프 1B 서열이 변경되어 있는 변경된 형태의 FST, NeThio1, NeThio2, C20, SL549, PhD1, PhD2, TPP3, Na-gth 또는 Cc-gth에 관한 것이다.
전술된 바와 같이, 이들 양태들은 NaD1 성숙 도메인의 C-말단 영역에 존재하는 대략 20개의 인접 아미노산 잔기 서열에 대해 70% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 데펜신을 포함하는 임의의 클래스 II 가지과 데펜신에 적용된다.
한 실시양태에서, 골격 아미노산 서열 상의 루프 1B 영역은 HRFKGP(서열번호 29), QHHSFP(서열번호 30), DTYRGV(서열번호 31), 서열번호 67 내지 79 중 어느 한 서열, PTWEGI(서열번호 32), DKYRGP(서열번호 33), KTFKGI(서열번호 34), KTWSGN(서열번호 35), EGWGK(서열번호 36), GTWSGV(서열번호 37) 또는 AGFKGP(서열번호 38)[1-문자 아미노산 명명법을 사용함]로 변경된다. 편리하게는, 이것은 NaD2(HRFKGP), γ-제아티오닌(zeathionin)2(QHHSFP), PsD1(DTYRGV), MsDef1(DKYRGP), SoD2(KTFKGI) 또는 DmAMP1(KTWSGN)의 루프 1B 영역, 또는 서열번호 67 내지 79에 의해 정의된 루프 1B를 그의 루프 1B 아미노산 서열의 부위에서 클래스 II 가지과 데펜신 골격 상으로 이식시키거나 기존 루프 1B 영역을 변경시켜 HRFKGP, QHHSFP, DTYRGV, DKYRGP, KTFKGI 및 KTWSGN으로부터 선택된 루프 1B 아미노산 서열을 발생시킴으로써 달성된다. 클래스 II 가지과 데펜신은 변경된 루프 영역을 단독으로, 또는 루프 영역 외부의 데펜신 골격에 대한 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실과 함께 포함할 수 있다. 전술된 바와 같이, 서열번호 67 내지 79에 정의된 루프 1B도 사용될 수 있거나 클래스 II 가지과 루프 1B가 또 다른 클래스 II 가지과 데펜신 골격 상으로 치환될 수 있다.
따라서, 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신이 제공되고, 이때 상기 루프 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 아미노산 치환, 결실 및/또는 추가에 의해 변경되어 있다.
한 실시양태에서, 제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단에서 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신이 제공되고, 이때 상기 루프 1B 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있다.
또 다른 실시양태는 제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단에서 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 제공하고, 이때 상기 루프 1B 영역은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신에 비해 향상된 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있고, 상기 클래스 II 가지과 데펜신은 최적 정렬 후 서열번호 52에 기재된 아미노산 서열에 대해 약 70% 이상의 유사성을 갖는 성숙 도메인의 C-말단 부분을 포함한다. "아미노산 치환, 추가 및/또는 결실"의 언급은 하나 이상의 치환, 추가 및/또는 결실을 의미한다.
한 실시양태에서, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 서열번호 57에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 인공적으로 변경된 가지과 클래스 II 데펜신이 제공되고, 이때 상기 변경은 가지과 클래스 II 데펜신 루프 1B 영역에 대한 변경이다.
한 실시양태에서, 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 서열번호 84에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 인공적으로 변경된 가지과 클래스 II 데펜신이 제공되고, 이때 상기 변경은 가지과 클래스 II 데펜신 루프 1B 영역에 대한 변경이다.
한 실시양태에서, 항병원체 활성은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신에 비해 특히 활성의 수준 및/또는 범위, 안정성 및/또는 막 투과능 중 하나 이상의 활성 면에서 향상된다. 한 실시양태에서, 항병원체 활성은 항진균 활성이다. 한 실시양태에서, 항병원체 활성은 항곤충 활성이다.
추가 실시양태에서, NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신이 제공되고, 이때 상기 루프 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 루프 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, 상기 루프 영역은 제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단측 상에 위치하는 루프 1B이다.
한 실시양태에서, NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신이 제공되고, 이때 상기 루프 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 루프 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, T 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, 상기 루프 영역은 제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단 상에 위치하는 루프 1B이다.
한 실시양태에서, NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신이 제공되고, 이때 상기 데펜신 골격 상의 상기 루프 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 NaD2(HRFKGP), Zea2(QHHSFP), PsD1(DTYRGV), MsDef1(DKYRGP), SoD2(KTFKGI) 및 DmAMP1(KTWSGN)로 구성된 목록으로부터 선택된 데펜신의 루프 영역 또는 이의 변경된 형태, 또는 서열번호 67 내지 79로부터 선택된 루프 1B 서열로 교체되어 있다.
한 실시양태에서, 루프 영역은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경된다. 한 실시양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신은 변경된 루프 영역, 및 이 루프 영역 외부의 골격 영역 내의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실 둘다를 포함한다. 존재하는 경우, 1개 내지 약 50개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실이 상기 루프 영역 외부에서 만들어질 수 있다.
병원체는 (사상 또는 비-사상) 진균, 미생물, 곤충, 절지동물, 선충, 원생동물 또는 바이러스일 수 있다. 한 실시양태에서, 병원체는 진균이다. 또 다른 실시양태에서, 병원체는 곤충이다. 용어 "향상된 항병원체 활성"은 보다 더 넓은 범위의 작용, 보다 더 높은 수준의 활성, 보다 더 큰 안정성 및/또는 향상된 막 투과 활성을 포함한다.
한 실시양태에서, 병원체는 식물 진균 및 동물 진균을 포함하는 진균이다. "동물 진균"은 인간을 포함하는 포유동물을 감염시키는 진균, 예컨대, 담자균(basidiomycete) 및 자낭균(ascomycete)을 포함한다.
인공적으로 생성된 데펜신 분자를 포함하는 조성물 및 상기 분자를 코딩하는 핵산 분자도 본원에서 제공된다. 상기 조성물은 식물 내에서 또는 상에서, 또는 동물, 예컨대, 인간을 포함하는 포유동물 내에서 또는 상에서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 추가 물질, 예컨대, 화학 살균제, 단백질성 살균제 및/또는 세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체를 함유할 수 있다.
병원체 저항성 식물을 발생시키는 프로토콜뿐만 아니라 병원체 감염, 생장 및/또는 유지를 치료하거나 예방하기 위해 식물 및 동물(포유동물, 예컨대, 인간을 포함함)을 치료하는 프로토콜도 제공된다. 본 개시내용은 항병원체 약제의 제조에 있어서 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신의 용도를 추가로 교시하고, 이때 상기 루프 영역은 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있다. 한 양태에서, 화학 또는 단백질성 살균제 및/또는 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체는 변경된 데펜신과 함께 사용된다. 한 양태에서, 단일 유전 구축물(genetic construct)은 변경된 루프 1B 영역을 포함하는 변경된 데펜신 및 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태, 예컨대, (니코티아나 알라타로부터의) NaPin1A, 소 췌장 트립신 억제제(BPTI), 토마토 시스타틴(cystatin)인 억제제 S1Cys9, 또는 보리 시스타틴인 HvCPI6을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 변경된 데펜신 및 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태 중 하나 이상을 각각 별도로 코딩하는 다수의 구축물들이 사용된다.
한 실시양태에서, 상기 루프 영역은 루프 1B이다.
한 실시양태에서, 호주 천연 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신, 및 골격 데펜신 분자로서의 이의 용도가 제공된다. 니코티아나 수아베올렌스 데펜신은 NsD1 및 NsD2를 포함한다. NsD1의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 48 및 49에 기재되어 있다. NsD2의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열번호 49 및 51에 기재되어 있다. 변경된 루프 1B를 단독으로, 또는 골격에 대한 1개 내지 약 50개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실과 함께 보유하는 니코티아나 수아베올렌스 데펜신도 본원에서 고려된다. 예를 들면, 이종 프로모터 및/또는 벡터 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 니코티아나 수아베올렌스 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자도 제공된다.
따라서, 본원에서 교시된 또 다른 양태는 서열번호 49[NsD1]에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신이다. 본원에서 교시된 또 다른 양태는 서열번호 51[NsD2]에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신에 관한 것이다.
이들 양태들에 따라, 니코티아나 수아베올렌스 데펜신은 단리되고 정제된 형태일 수 있거나, 상기 데펜신 및 희석제, 담체, 부형제, 방부제, 안정화제 및/또는 고체 또는 액체 첨가제를 포함하는 제제 또는 조성물의 일부로서 존재할 수 있다.
본원은 NsD1(서열번호 48) 및 NsD2(서열번호 50)를 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라, 최적 정렬 후 서열번호 48 또는 서열번호 50에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자, 또는 중간 엄격성 조건 하에서 서열번호 48 또는 서열번호 50 또는 이들의 상보적 형태에 혼성화하는 핵산 분자도 제공한다(이들 핵산 분자들은 예를 들면, 이종 프로모터 및/또는 벡터 핵산 분자에 작동가능하게 연결됨).
변경된 데펜신이 또 다른 물질, 예컨대, 단백질분해효소 억제제 또는 시스타틴과 함께 사용되는 경우, 모든 단백질들을 코딩하는 단일 유전 구축물 또는 한 단백질을 각각 코딩하는 다수의 구축물을 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 대안적으로, 데펜신을 발현하도록 변경된 식물은 단백질분해효소 억제제 또는 화학 살균제로 국소 처리될 수 있다.
본 명세서 전체에서 사용된 서열 식별기호의 요약은 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
Figure 112013078531563-pct00001
Figure 112013078531563-pct00002
Figure 112013078531563-pct00003
Figure 112013078531563-pct00004
표 2는 예시된 변경된 데펜신을 기술하는 데에 이용된 명명법의 요약을 제공한다.
[표 2]
Figure 112013078531563-pct00005
표 3은 본원에서 사용된 아미노산 잔기에 대한 1-문자 코드 및 3-문자 코드의 목록이다.
[표 3]
Figure 112013078531563-pct00006
도 1은 공통된 이황화 결합 패턴, 및 삼중 가닥 역평행 β-시트가 3개의 이황화 결합에 의해 α-나선에 부착되어 시스테인에 의해 안정화된 αβ 모티프(CSαβ)를 형성하는 공통된 구조적 폴드를 보이는 데펜신인 NaD1, RsAFP1, VrD2 및 브라제인(Brazzein)의 개략도이다. 제4 이황화 결합도 N-말단과 C-말단을 연결하여 안정한 구조를 발생시킨다.
도 2는 서열 유사성에 기초하여 데펜신을 16개의 군으로 분류한 것을 보여주는 도해이다.
Figure 112013078531563-pct00007

도 3a 및 3b는 클래스 II 가지과 데펜신 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, Na-gth, NpThio1 및 Cc-gth의 서열 정렬을 나타낸다. 도 3a에서 음영은 서열들 사이의 높은 보존도를 표시한다.
도 4는 보존되어 있는 8개의 시스테인 잔기들과 별개로 위치 7 및 10의 아미노산들만이 고도로 보존되어 있다는 것을 보여주는, 상이한 클래스들의 데펜신들의 서열 정렬을 나타낸다. 넘버링은 NaD1을 기준으로 한다.
도 5는 β-가닥 1과 α-나선을 연결하는 루프 1B의 위치를 보여주는 NaD1의 루프 구조의 도해이다.
도 6a는 재조합 NaD1(rNaD1)의 발현 및 정제를 보여주는 면역블롯을 나타낸다. 48시간에서 수집된 피키아 파스토리스(P. pastoris) 발현 배지(30 ㎕)뿐만 아니라, 비-결합된 분획(30 ㎕), 세척 분획(30 ㎕) 및 처음 5개의 1.5 ㎖ 용출 분획(각각 30 ㎕)을 포함하는 SP 세파로스 정제의 다양한 단계들의 샘플들을 SDS-PAGE로 분리하고 α-NaD1 항체를 사용하는 면역블롯팅으로 조사하였다. 꽃으로부터 정제된 NaD1(200 ng)을 양성 대조군으로서 사용하였다. rNaD1은 상기 48시간 발현 배지에서뿐만 아니라 SP 세파로스 용출 분획들에서도 검출될 수 있었다.
도 6b는 SP 세파로스를 사용하여 피키아 파스토리스로부터 정제한 rNaD1의 순도를 보여주는 역상 HPLC 기록을 나타낸다. rNaD1을 함유하는 SP 세파로스 용출 분획을 분석 C8 RP-HPLC 컬럼 상에 적재하고 40분 선형 구배(0% 내지 100% 완충제 B)를 이용하여 용출하였다. 단백질을 215 nm에서 흡광도로 검출하였다. 단일 주요 단백질이 검출되었는데, 이것은 단백질이 매우 순수하다는 것을 표시한다.
도 6c는 rNaD1의 구조 대 꽃으로부터 정제된 천연 NaD1의 구조를 나타낸다. rNaD1(개방된 정사각형)의 원자외선 원편광이색 스펙트럼과 천연 NaD1(폐쇄된 마름모형)의 원자외선 원편광이색 스펙트럼이 비교되었고 유의한 차이를 나타내지 않았는데, 이것은 rNaD1이 정확하게 폴딩되었다는 것을 표시한다.
도 6d는 rNaD1의 항진균 활성 대 꽃으로부터 정제된 천연 NaD1의 항진균 활성을 나타낸다. rNaD1(개방된 정사각형) 또는 천연 NaD1(폐쇄된 마름모형)의 존재 하에서 푸사리움 옥시스포룸 품종 바신펙툼의 균사 생장이 동일한 기간 동안 단백질 부재 대조군의 생장에 대해 상대적으로 작도되어 있다. 그래프는 사중으로 수행된 3개의 별도의 실험으로부터 수득된 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 7은 NaD1 및 NsD1과 비교된, 루프 교환을 위해 사용된 클래스 I 데펜신의 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)에 대한 항진균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 푸사리움 그라미네아룸(Fgr)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체들 HXP4, HXP34 및 HXP35의 상대적 항진균 활성을 그래프로 나타낸다.
도 9는 푸사리움 버티실로이데스(F. verticilloides)(Fve)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체들 HXP4, HXP34 및 HXP35의 상대적 항진균 활성을 그래프로 나타낸다.
도 10은 콜레토트리쿰 그라미니콜라(C. graminicola)(Cgr)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체들 HXP4, HXP34 및 HXP35의 상대적 항진균 활성을 그래프로 나타낸다.
도 11은 pHEX138 구축물의 도해이다. DNA는 이원(binary) 벡터 pBIN19(Bevan (1984) Nucleic Acids Research 12:8711-8721)의 좌측 경계와 우측 경계 사이에 삽입되었다. DNA는 NaD1 유전자의 변경에 의해 생성되었다. 약어는 시계방향 순서로 다음과 같다:
oriV: 무성(vegetative) 복제기점;
ColE1 orl: 콜리신(colicin) E1로부터 유래된 복제기점;
TDNA RB: 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) TDNA의 우측 경계;
Nos 프로모터: 노팔린(nopaline) 합성효소 Nos 유전자의 프로모터;
NPTII: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) II를 코딩하는 유전 서열;
Nos 종결부위: Nos 유전자의 종결부위 서열;
파괴된 lacZ: β-갈락토시다제(galactosidase)의 부분적 서열을 코딩하는 DNA 절편;
CaMV 35S 프로모터: 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 단백질의 프로모터;
HXP4: NaD1 내의 NaD2 루프 1B[NaD2L1B] + CTPP를 코딩하는 DNA;
CaMV 35S 종결부위: CaMV 35S 단백질을 코딩하는 유전자의 종결부위 서열;
M13 ori: M13 바이러스 복제기점;
TDNA LB: TDNA 좌측 경계;
모든 화살표들은 전사 방향을 표시한다.
도 12는 아스퍼길러스 니게르(Aspergillus niger)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체 HXP4의 상대적 항진균 활성을 그래프로 나타낸다.
도 13a 내지 13c는 크립토코커스(Cryptococcus) 종에 대해 NaD1과 비교된 HXP4의 상대적 항진균 활성을 그래프로 나타낸다.
도 14a 내지 14c는 NaD1과 비교된, 아시아 대두 녹균(Asian soybean rust) (파콥소라 파키리지(Phakopsora pachyrhizi))에 대한 발아(24시간, 도 14a), 부착기(24시간, 도 14b) 및 후-부착기 구조체(48시간, 도 14c)에 대한 HXP4의 효과를 그래프로 나타낸다.
도 15는 옥수수(corn)에서 사용될, HvCPI6(보리 시스타틴)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구축물의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. HvCPI6의 아미노산 서열도 제공되어 있다.
도 16은 옥수수에서 사용될, HvCPI6(보리 시스타틴) 및 변경된 데펜신 HXP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구축물의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. HvCPI6 및 HXP4의 아미노산 서열도 제공되어 있다.
항병원체 활성을 갖는 변경된 데펜신 분자가 제공된다. 용어 "변경된 데펜신", "변이체 데펜신", "돌연변이된 데펜신" 및 "키메라 데펜신" 모두가 본원에 기재된 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 기술하는 데에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신은 이 데펜신의 N-말단 부분에서 제1 β-가닥(β-가닥 1)과 α-나선 사이의 루프 영역에서 변경된다. 한 실시양태에서, 상기 루프 영역은 제2 불변 시스테인 잔기 또는 이의 등가물의 N-말단에 있는 6개 아미노산을 포함한다. 이 영역은 "루프 1B"로서 정의된다(도 5 참조). 클래스 II 가지과 데펜신은 성숙 도메인의 상대적으로 보존된 C-말단 부분에 의해 다른 데펜신들과 구별된다. "클래스 II 가지과 데펜신"의 언급은 NaD1 성숙 도메인에서 가장 C-말단에 있는 불변 시스테인에서 종결되고 이 불변 시스테인을 포함하는 대략 20개의 인접 아미노산 잔기들(예를 들면, 서열번호 52)을 포함하는, NaD1 성숙 도메인의 C-말단 부분에 대해 70% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 임의의 데펜신을 포함한다. "70% 이상"은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상을 의미한다. 표 4는 NaD1의 C-말단 아미노산 서열과 다수의 클래스 II 가지과 데펜신 성숙 도메인 사이의 % 동일성을 제공한다.
클래스 II 가지과 데펜신 내의 루프 1B 아미노산 서열은 1-문자 아미노산 명명법의 이용에 의해 표시된 서열 X1X2X3X4X5X6으로 변경되고, 이때 X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
한 실시양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신 내의 루프 1B 서열은 서열 X1X2X3X4X5X6으로 변경되고, 이때 X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
한 실시양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신 내의 루프 1B 서열은 서열 X1X2X3X4X5X6으로 변경되고, 이때 X1은 N, H, Q, D, K 또는 E이고/이거나; X2는 R, H, T, K 또는 G이고/이거나; X3은 F, H, Y 또는 W이고/이거나; X4는 P, K, S 또는 R이고/이거나; X5는 G 또는 F이고/이거나; X6은 P, V, I 또는 N이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
"X1X2X3X4X5X6"의 언급은 루프 1B 영역에 상응하는 6개의 인접 아미노산 잔기를 의미한다.
한 실시양태에서, 인공적으로 생성된 또는 변경된 데펜신은 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열에서, 루프 1B 영역은 X1X2X3X4X5X6으로서 정의되고, 이때 X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
한 실시양태에서, 인공적으로 생성된 또는 변경된 데펜신은 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열에서, 루프 1B 영역은 X1X2X3X4X5X6으로서 정의되고, 이때 X1은 N, H, Q, D, K 및 E로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2는 R, H, T, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 F, H, Y 및 W로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 P, K, S 및 R로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5는 G 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6은 P, V, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
클래스 II 가지과 데펜신인 NaD1의 경우, 루프 1B 아미노산 서열은 NTFPGI(서열번호 12)이다. 결과적으로, NTFPGI는 N이 A, R, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태인 X1 중 하나로 교체되고/되거나, T가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태인 X2로 교체되고/되거나, F가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태인 X3으로 교체되고/되거나, P가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태인 X4로 교체되고/되거나, G가 A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태인 X5로 교체되고/되거나, I가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V인 X6으로 교체되도록 변경되되, 단, 루프 1B 아미노산 서열은 NaD1의 루프 1B에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, 루프 1B 영역은 X1X2X3X4X5X6으로서 정의되고, 이때 X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다. 루프 1B 서열은 단일 아미노산 변화를 가질 수 있거나, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개의 아미노산이 변경될 수 있다. 이것은 표현 "단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실"에 의해 포괄된다.
루프 1B 영역에 대한 임의의 수의 아미노산 변화를 단독으로 또는 다른 돌연변이와 함께 이용하여 클래스 II 가지과 데펜신을 변경시킬 수 있다. 다른 돌연변이는 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함한다. 루프 1B 영역 외부에 있는 돌연변이는 1개 내지 약 50개의 돌연변이일 수 있다. "변화"는 한 데펜신의 루프 1B 영역이 클래스 II 가지과 데펜신 루프 1B 영역 상으로 이식되는 것을 포함한다. 공급원은 클래스 I 데펜신 루프 1B 또는 또 다른 클래스 II 데펜신의 루프 1B일 수 있다. 이들 양태들은 하나 이상의 식물 또는 동물 병원체에 대한 변경된 데펜신의 항병원체 활성이 유지되어야 한다는 조건에 기초한다. 한 실시양태에서, 항병원체 활성은 활성의 수준 또는 범위, 안정성 및/또는 투과능의 면에서 변경 전 클래스 II 데펜신에 비해 상대적으로 향상된다.
본원은 N-말단 부분 상의 β-가닥 1과 α-나선 사이의 루프 영역이 항병원체 활성을 갖는 변이체 데펜신을 발생시키도록 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있는 변경된 클래스 II 가지과 데펜신 골격을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 루프 영역은 제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단에 있는 6개의 아미노산 잔기들로 정의된 루프 1B이다. 도 3 내지 5를 참고할 수 있다. 임의의 데펜신 내의 그의 등가 영역이 본원에서 고려된다. 1개 내지 약 6개의 아미노산 변화가 루프 1B 영역에서 만들어질 수 있다. 한 실시양태에서, 항병원체 활성은 항진균 활성 또는 항곤충 활성이다. 한 실시양태에서, 변경된 클래스 II 가지과 데핀신에서 항병원체 활성은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신에 비해 특히 활성의 수준 및/또는 범위, 안정성 및/또는 막 투과능 중 하나 이상의 활성 면에서 향상된다.
본원에서 교시된 또 다른 양태는 제2 불변 시스테인 잔기의 N-말단에서 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 제공하고, 이때 상기 루프 1B 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있다.
"단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실"은 표현 "아미노산 치환, 추가 및/또는 결실"에 의해 포괄된다. 인공적으로 생성된 데펜신은 신규 패밀리의 데펜신을 대표한다. 변경된 데펜신이 병원체 감염 및 생장을 제어하기 위해 원예 및/또는 농업에서 사용될 것이고 동물 또는 인간에서 사용될 약제로서 사용될 것임이 본원에서 교시된다. 변경된 데펜신은 단독으로 사용될 수 있거나, 화학 살균제, 단백질성 항병원체 물질 및/또는 세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태와 함께 사용될 수 있다. 데펜신의 집단으로부터 선택하는 능력은 데펜신에 대한 병원체 내성의 발달에 대항하는 데에 있어서 도움을 준다.
단백질분해효소 억제제 또는 항병원체 물질과 함께 사용될 때, 이들은 별도로 국소 처리될 수 있거나, 하나는 유전적으로 변경된 식물에서 발현되고 또 다른 하나는 국소 처리될 수 있거나, 또는 변경된 데펜신 및 단백질분해효소 억제제 및/또는 항병원체 물질 전부가 단일 또는 다수의 유전 구축물 상에서 발현될 수 있다.
루프 "1B"는 제2 불변 시스테인 잔기 또는 도 5에 나타낸 이의 등가물의 N-말단에 있는 6개의 아미노산 잔기를 의미한다. 몇몇 데펜신, 예컨대, VrD1 및 NeThio1은 5개의 아미노산 잔기만을 갖는다. 그러나, 이 경우, 루프 1B 영역은 상기 5개의 잔기를 포함한다. 상기 영역은 β-가닥 1과 α-나선 사이의 제1 유연성 루프 영역으로서도 기술된다. 루프 1A(도 5 참조)는 β-가닥이다.
전술된 바와 같이, "아미노산 치환, 추가 및/또는 결실"의 언급은 루프 1B가 또 다른 데펜신의 루프 1B로 교체되는 것을 포괄하는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함한다. 이러한 교체는 본원에서 도메인 교환, 루프 교환, 이식 또는 다른 유사한 표현으로서 지칭된다. "또 다른 데펜신"의 언급은 클래스 I 데펜신이든 아니면 클래스 II 데펜신이든 관계없이 임의의 데펜신을 포함한다(도 2 또한 참조). 클래스 II 데펜신 골격은 임의적으로 C-말단 꼬리(즉, CTPP)의 제거, 또는 기존 CTPP와 또 다른 꼬리의 교환에 의해 추가로 변경되고/되거나, 상기 골격은 상기 언급된 루프 영역 외부의 골격 상의 위치에서 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 가질 수 있다. "클래스 II 가지과 데펜신"은 최적 정렬 후 서열번호 52에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 임의의 데펜신을 포함한다. 서열번호 52는 NaD1 성숙 도메인에서 가장 C-말단에 존재하는 시스테인 잔기에서 종결되고 이 시스테인 잔기를 포함하는 20개의 인접 아미노산 잔기들을 나타낸다. 서열번호 52에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 이러한 클래스 II 가지과 데펜신의 예는 표 4에 나열되어 있다.
따라서, 항병원체 활성을 갖는 변경된 데펜신을 발생시키도록 그의 루프 1B 영역에 대한 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신 골격을 포함하는 변경된 데펜신이 본원에서 교시된다. 한 실시양태에서, 항병원체 활성은 변경 전 클래스 II 데펜신에 비해 상대적으로 향상된다.
한 실시양태에서, 항병원체 활성을 갖는 변경된 데펜신을 발생시키도록 그의 루프 1B 영역에 대한 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신 골격을 포함하는 변경된 데펜신이 제공되고, 이때 상기 클래스 II 가지과 데펜신은 최적 정렬 후 서열번호 52에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 그의 성숙 도메인의 그의 C-말단 영역에서 포함한다.
한 실시양태에서, 서열번호 39에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 39에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 단리된 가지과 클래스 II 데펜신이 본원에서 교시되고, 이때 변경은 클래스 II 가지과 데펜신 내의 루프 1B 아미노산 서열에 대한 아미노산 치환, 추가 또는 결실이다. 한 실시양태에서, 항병원체 활성은 항진균 활성이다.
서열번호 57에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 서열번호 57에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 인공적으로 변경된 가지과 클래스 II 데펜신도 본원에서 교시되고, 이때 변경은 가지과 클래스 II 데펜신 루프 1B 영역에 대한 변경이다.
한 실시양태에서, 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 서열번호 84에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 인공적으로 변경된 가지과 클래스 II 데펜신이 본원에서 교시되고, 이때 변경은 가지과 클래스 II 데펜신 루프 1B 영역에 대한 변경이다.
"70% 이상의 유사성"의 언급은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 유사성을 포함한다. 한 실시양태에서, 이것은 동일성으로도 지칭될 수 있다.
본 개시내용은 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥(β-가닥 1)과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 추가로 제공하고, 이때 상기 루프 1B 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, 상기 루프 1B 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I, N 및 이의 천연 발생 변경된 형태로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
본 개시내용은 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥(β-가닥 1)과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 추가로 제공하고, 이때 상기 루프 1B 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
한 실시양태에서, X1은 N, H, Q, D, K 또는 E이고/이거나; X2는 R, H, T, K 또는 G이고/이거나; X3은 F, H, Y 또는 W이고/이거나; X4는 P, K, S 또는 R이고/이거나; X5는 G 또는 F이고/이거나; X6은 P, V, I 또는 N이고, 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 서열의 예로는 NaD1(니코티아나 알라타), NsD1(니코티아나 수아베올렌스), NsD2(니코티아나 수아베올렌스), NeThio2(니코티아나 엑셀시오르) 및 FST(니코티아나 타바쿰)의 NTFPGI; PhD1(페투니아 하이브리다)의 PTWDSV; PhD2(페투니아 하이브리다)의 PTWEGI; TPP3(솔라눔 라이코퍼시쿰)의 QTFPGL; Na-gth(니코티아나 애테누아타)의 NTFEGF; Np-Thio1(니코티아나 파니쿨라타)의 NTFPGL; NeThio1(니코티아나 엑셀시오르)의 IFTGL; 및 Cc-gth(캡시쿰 치넨스)의 KHFKGL이 있다. 또 다른 루프 1B 서열은 KYFKGL(서열번호 60)이다.
본원에서 교시된 또 다른 양태는 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth 및 Cc-gth로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신에 관한 것이고, 이때 상기 데펜신 골격 상의 루프 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 NaD2(HRFKGP), Zea2(QHHSFP), PSD1(DTYRGV), MsDef1(DKYRGP), SoD2(KTFKGI) 및 DmAMP1(KTWSGN)로 구성된 목록으로부터 선택된 데펜신의 루프 영역 또는 이의 변경된 형태, 또는 서열번호 67 내지 79로부터 선택된 루프 1B 서열로 교체된다.
한 실시양태에서, 항병원체 활성은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신에 비해 향상된다. 향상된 활성을 결정하는 파라미터는 활성의 수준 및/또는 범위, 안정성의 정도 및/또는 투과 활성의 수준을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 루프 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 루프 1B이다. 이것은 데펜신에서 제1 유연성 루프이다.
전술된 바와 같이, 클래스 II 가지과 데펜신 상의 루프 1B 영역은 각각의 X가 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하고, 이때 한 양태에서 모든 6개(또는 상응하는 5개)의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상이 일반적으로(그러나, 배타적인 것은 아님) 또 다른 데펜신, 예컨대, 클래스 I 데펜신 또는 또 다른 클래스 II 데펜신의 루프 1B 또는 이의 유도체에 상응하는 서열로 교체된다.
(i) 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 1B 영역을 포함하는 클래스 II 가지과 데펜신으로부터 유래된 골격 아미노산 서열; 및
(ii) 또 다른 데펜신 루프 1B와 유사한, 상동한 또는 달리 기능적으로 유사한 루프 1B 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가, 결실 또는 교환에 의해 변경된 상기 데펜신 상의 루프 1B 영역
을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 변경된 데펜신도 제공되고,
(iii) 이때, 발생된 루프 1B는 1-문자 아미노산 명명법의 이용에 의해 표시된 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하고, 이때 X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
(i) 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 1B 영역을 포함하는 클래스 II 가지과 데펜신으로부터 유래된 골격 아미노산 서열; 및
(ii) 또 다른 데펜신 루프 1B와 유사한, 상동한 또는 달리 기능적으로 유사한 루프 1B 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가, 결실 또는 교환에 의해 변경된 상기 데펜신 상의 루프 1B 영역
을 포함하는, 항병원체 활성을 갖는 변경된 데펜신도 제공되고,
(iii) 이때, 발생된 루프 1B는 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하고, 이때 X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
상기 골격 아미노산 서열은 루프 1B 영역 외부의 영역에 대한 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 약 1개 내지 약 50개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실이 루프 1B 영역 외부의 골격 아미노산 서열에서 만들어질 수 있다. "1개 내지 50개"는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개를 의미한다. 한 실시양태에서, 추가 돌연변이는 II형 가지과 데펜신의 C-말단 꼬리(CTPP) 내에 존재한다.
1-문자 아미노산 명명법의 이용에 의해 표시된 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 루프 1B 서열을 도입하도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경된 루프 1B 영역 또는 이의 등가물을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스(호주 천연)의 골격 데펜신 분자를 포함하는 변경된 데펜신도 제공되고, 이때 X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않고, 변경된 데펜신은 항병원체 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, 니코티아나 수아베올렌스 데펜신은 NsD1 및 NsD2로부터 선택된다.
본원에서 제공된 또 다른 실시양태는 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 루프 1B 서열을 도입하도록 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경된 루프 1B 영역 또는 이의 등가물을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스(호주 천연)의 골격 데펜신 분자를 포함하는 변경된 데펜신을 포함하고, 이때 X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않고, 변경된 데펜신은 항병원체 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, 니코티아나 수아베올렌스 데펜신은 NsD1 및 NsD2로부터 선택된다.
한 실시양태에서, X1X2X3X4X5X6은 하기 아미노산 잔기들로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함한다: X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
이와 관련하여, 본 개시내용은 서열번호 49[NsD1]에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신을 추가로 제공하다. 본 개시내용의 또 다른 양태는 서열번호 51[NsD2]에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신에 관한 것이다. NsD1 및 NsD2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 각각 서열번호 48 또는 서열번호 50; 또는 최적 정렬 후 서열번호 48 또는 서열번호 50에 대해 70% 이상의 동일성을 갖거나 중간 엄격성 조건 하에서 서열번호 48 또는 서열번호 50, 또는 서열번호 48 또는 서열번호 50의 상보적 형태에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열도 본원에서 고려된다. "70% 이상의 동일성"은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 의미한다. 한 양태에서, 항병원체 활성은 활성의 범위 또는 수준, 안정성의 수준, 및/또는 투과능을 유도하는 능력에 기초할 때 변경 전 NsD1 또는 NsD2에 비해 향상된다.
한 실시양태에서, 클래스 II 데펜신 상의 루프 영역은 X1X2X3X4X5X6으로 치환되고, 이때 X1은 N, H, Q, D, K 또는 E이고/이거나; X2는 R, H, T, K 또는 G이고/이거나; X3은 F, H, Y 또는 W이고/이거나; X4는 P, K, S 또는 R이고/이거나; X5는 G 또는 F이고/이거나; X6은 P, V, I 또는 N이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
골격 데펜신이 NaD1인 경우, 루프 1B는 변경될 수 있고, 이때 변경은 하기 변경을 포함하고 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 NaD1의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다: N은 A, R, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나; T는 A, R, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나; F는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나; P는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나; G는 A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나; I는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환된다.
골격 데펜신이 NaD1인 경우, 루프 1B는 변경될 수 있고, 이때 변경은 하기 변경들 중 하나 이상을 포함한다: G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S, T 및 R로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된 N; K, R, G, H, L, N, F, I, S 및 Y로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된 T; W, Y, H, L, G 및 P로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된 F; K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 및 G로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된 P; S, K, Y, F 및 H로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된 G; 및/또는 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H 및 Y로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된 I.
한 실시양태에서, X1X2X3X4X5X6은 하기 아미노산 잔기들로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함한다: X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
X1 내지 X6 중 "하나 이상"은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개의 아미노산 잔기가 변경된다는 것을 의미한다. 루프 1B 영역 외부에 있는 돌연변이는 존재하는 경우 1개 내지 약 50개의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함한다.
"병원체"의 언급은 진균, 세균을 포함하는 미생물, 곤충, 절지동물, 바이러스 및 선충뿐만 아니라 원생동물도 포함한다. 한 실시양태에서, 병원체는 진균 또는 곤충이다.
"진균"의 언급은 감염시키는 진균, 및 식물 또는 동물의 다른 병원체인 진균을 포함한다. 동물 진균 병원체는 인간을 포함하는 포유동물 진균 병원체를 포함한다. 구체적인 진균 병원체는 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 디플로디아 메이디스(Diplodia maydis), 푸사리움 그라미네아룸 및 푸사리움 버티실로이데스를 포함한다. 주요 작물에 대한 특정 병원체는 하기 병원체들을 포함한다: 옥수수: 지베렐라 제애(Gibberella zeae)(푸사리움 그라미네아룸), 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 스테노카펠라 메이디(Stenocarpella maydi)(디플로디아 메이디스), 푸사리움 모닐리포름 변종 서브굴루티난스(Fusarium moniliforme var. subglutinans), 푸사리움 버티실로이데스, 비폴라리스 메이디스(Bipolaris maydis) O, T(코클리오볼리스 헤테로스트로퍼스(Cochliobolis heterostrophus)), 엑세리오힐룸 투르시쿰(Exserohilum turcicum) I, II 및 III, 서코스포라 제애-메이디스(Cercospora zeae-maydis), 파이티움 이레굴라레(Pythium irregulare), 파이티움 데바리아눔(Pythium debaryanum), 파이티움 그라미니콜라(Pythium graminicola), 파이티움 스플렌덴스(Pythium splendens), 파이티움 울티뭄(Pythium ultimum), 파이티움 아파니데르마툼(Pythium aphanidermatum), 아스퍼길러스(Aspergillus) 종, 아스퍼길러스 플라버스(Aspergillus flavus), 헬민쏘스포리움 카보눔(Helminthosporium carbonum) I, II 및 III(코클리오볼러스 카보눔(Cochliobolus carbonum)), 헬민쏘스포리움 페디셀라툼(Helminthosporium pedicellatum), 파이소데르마 메이디스(Physoderma maydis), 파일로스틱타 메이디스(Phyllosticta maydis), 카바티엘라 메이디스(Kabatiella maydis), 서코스포라 소르기(Cercospora sorghi), 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 제애(Ustilago zeae), 푹시니아 소르기(Puccinia sorghi), 푹시니아 폴리소라(Puccinia polysora), 마크로포미나 파세세올리나(Macrophomina phaseolina), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum), 니그로스포라 오리재(Nigrospora oryzae), 클라도스포리움 허바리움(Cladosporium herbarium), 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata), 쿠르불라리아 이내쿠알리스(Curvularia inaequalis), 쿠르불라리아 펠레센스(Curvularia pallescens), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 클라비셉스 소르기(Claviceps sorghi), 디플로디아 마크로스포라(Diplodia macrospora), 스클레로프쏘라 마크로스포라(Sclerophthora macrospora), 페로노스클레로스포라 소르기(Peronosclerospora sorghi), 페로노스클레로스포라 필리피넨시스(Peronosclerospora philippinensis), 페로노스클레로스포라 메이디스(Peronosclerospora maydis), 페로노스클레로스포라 사카리(Peronosclerospora sacchari), 스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana), 파이소펠라 제애(Physopella zeae), 세팔로스포룸 메이디스(Cephalosporum maydis), 세팔로스포룸 아크레모니움(Cephalosporum acremonium); 대두: 푸사리움 비르굴리포름(Fusarium virguliforme), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 투쿠마니애(Fusarium tucumaniae), 파콥소라 파키리지(Phakopsora pachyrhizi), 파이토프쏘라 메가스페르마 품종 글리시네아(Phytophthora megasperma f.sp. glycinea), 파이토프쏘라 소재(Phytophthora sojae), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 디아포르테 파세올로룸 변종 소재(Diaporthe phaseolorum var. sojae)(포몹시스 소재(Phomopsis sojae)), 디아포르테 파세올로룸 변종 카울리보라(Diaporthe phaseolorum var. caulivora), 스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii), 서코스포라 키쿠치이(Cercospora kikuchii), 서코스포라 소지나(Cercospora sojina), 페로노스포라 만슈리카(Peronospora manshurica), 콜레토트리쿰 데마티움(Colletotrichum dematium)(콜레토트리쿰 트룬카툼(Colletotrichum truncatum)), 코리네스포라 카스시이콜라(Corynespora cassiicola), 셉토리아 글리시네스(Septoria glycines), 파일로스틱타 소지콜라(Phyllosticta sojicola), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 마이크로스패라 디푸사(Microsphaera diffusa), 푸사리움 세미텍툼(Fusarium semitectum), 피알로포라 그레가타(Phialophora gregata), 글로메렐라 글리시네스(Glomerella glycines), 파이티움 아파니데르마툼(Pythium aphanidermatum), 파이티움 울티뭄(Pythium ultimum), 파이티움 데바리아눔(Pythium debaryanum); 캐놀라: 알부고 캔디다(Albugo candida), 알터나리아 브라스시캐(Alternaria brassicae), 렙토스패리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 마이코스패렐라 브라스시시콜라(Mycosphaerella brassicicola), 파이티움 울티뭄(Pythium ultimum), 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica), 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 아베나세움(Fusarium avenaceum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata); 목화: 푸사리움 옥시스포룸 품종 바신펙툼, 버티실리움 달리아, 티엘라비옵시스 바시콜라(Thielaviopsis basicola), 알터나리아 마크로스포라(Alternaria macrospora), 서코스포라 고시피나(Cercospora gossypina), 포마 엑시구아(Phoma exigua)(아스코카이타 고시피이(Ascochyta gossypii)), 파이티움 종 리족토니아 솔라니(Pythium spp Rhizoctonia solani), 푹시니아 스케다르디이(Puccinia scheddardii), 푹시니아 카카바타(Puccinia cacabata), 파이마토트리콥시스 옴니보레(Phymatotrichopsis omnivore); 캐놀라: 렙토스패리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 알터나리아 브라스시캐(Alternaria brassicae), 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brasicicola), 플라스모디오포라 브라스시캐(Plasmodiophora brassicae), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸라시움 종, 파이티움 종, 파이토프쏘라 종, 알터나리아 종, 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica), 마이코스패렐라 캡셀래(Mycosphaerella capsellae)(슈도서코스포렐라 캡셀래(Pseudocercosporella capsellae)), 알부고 캔디다(Albugo candida), 파이토프토호라 메가스페르마 변종 메가스페르마(Phytophtohora megasperma var. megasperma), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 에리시페 크루시페라룸(Erysiphe cruciferarum); 밀: 코클리오볼러스 사티버스(Cochliobolus sativus), 드레크슬레라 위르레가넨시스(Drechslera wirreganensis), 마이코스패렐라 그라미니콜라(Mycosphaerella graminicola), 패오스패리아 아베나리아 품종 트리티세아(Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticea), 패오스패리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum), 블루메리아 그라미니스 품종 트리티시(Blumeria graminis f.sp. tritici), 우로시스티스 아그로파이리(Urocystis agropyri), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 클라도스포리움 허바룸(Cladosporium herbarum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 아베나세움(Fusarium avenaceum), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 슈도그라미네아룸(Fusarium pseudograminearum), 우스틸라고 트리티시(Ustilago tritici), 아스코카이타 트리티시(Ascochyta tritici), 세팔로스포리움 그라미네움(Cephalosporium gramineum), 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola), 에리시페 그라미니스 품종 트리티시(Erysiphe graminis f.sp. tritici), 푹시니아 그라미니스 품종 트리티시(Puccinia graminis f.sp. tritici), 푹시니아 레콘디타 품종 트리티시(Puccinia recondita f.sp. tritici), 푹시니아 스트리이포르미스(Puccinia striiformis), 푹시니아 트리티시나(Puccinia triticina), 스클레로프쏘라 마크로스포라(Sclerophthora macrospora), 우로시스티스 아그로파이리(Urocystis agropyri), 파이레노포라 트리티시-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis), 파이레노포라 세메니페르다(Pyrenophora semeniperda), 패오스패리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum), 셉토리아 노도룸(Septoria nodorum), 셉토리아 트리티시(Septoria tritici), 셉토리아 아베내(Septoria avenae), 슈도서코스포렐라 허포트리코이데스(Pseudocercosporella herpotrichoides), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 리족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis), 개우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici), 파이티움 종, 파이티움 아파니데르마툼(Pythium aphanidermatum), 파이티움 아르레노만네스(Pythium arrhenomannes), 파이티움 그라미콜라(Pythium gramicola), 파이티움 울티뭄(Pythium ultimum), 비폴라리스 소로키니아나(Bipolaris sorokiniana), 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea), 타페시아 얄룬대(Tapesia yallundae), 틸레티아 트리티시(Tilletia tritici), 틸레티아 래비스(Tilletia laevis), 틸레티아 카리에스(Tilletia caries), 틸레티아 인디카(Tilletia indica), 우스틸라고 트리티시(Ustilago tritici), 워노위시아 그라미니스(Wojnowicia graminis), 코클리오볼러스 사티버스(Cochliobolus sativus); 수수: 엑세로힐룸 투르시쿰(Exserohilum turcicum), 콜레토트리쿰 수블리네올룸(Colletotrichum sublineolum), 서코스포라 소르기(Cercospora sorghi), 글로에오서코스포라 소르기(Gloeocercospora sorghi), 아스코카이타 소르기나(Ascochyta sorghina), 푹시니아 푸르푸레아(Puccinia purpurea), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 퍼코니아 서시나타(Perconia circinata), 푸사리움 모닐리포름(Fusarium moniliforme), 알터나리아 알터나타, 비폴라리스 소르기콜라(Bipolaris sorghicola), 헬민쏘스포리움 소르기콜라(Helminthosporium sorghicola), 쿠르불라리아 루나타(Curvularia lunata), 포마 인시디오사(Phoma insidiosa), 라물리스포라 소르기(Ramulispora sorghi), 라물리스포라 소르기콜라(Ramulispora sorghicola), 파일라카라 삭카리(Phyllachara saccari), 스포리소리움 레일리아눔(Sporisorium reilianum)(스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana)), 스파셀로테카 크루엔타(Sphacelotheca cruenta), 스포리소리움 소르기(Sporisorium sorghi), 클라비셉스 소르기(Claviceps sorghi), 리족토니아 솔라니, 아크레모니움 스트릭툼(Acremonium strictum), 스클레로프쏘나 마크로스포라(Sclerophthona macrospora), 페로노스클레로스포라 소르기(Peronosclerospora sorghi), 페로노스클레로스포라 필립피넨시스(Peronosclerospora philippinensis), 스클레로스포라 그라미니콜라(Sclerospora graminicola), 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 옥시스포룸, 파이티움 아르레노마네스(Pythium arrhenomanes), 파이티움 그라미니콜라(Pythium graminicola); 해바라기: 플라스모파라 할스테디이(Plasmopara halstedii), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 셉토리아 헬리안티(Septoria helianthi), 포몹시스 헬리안티(Phomopsis helianthi), 알터나리아 헬리안티(Alternaria helianthi), 알터나리아 진니애(Alternaria zinniae), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 포마 맥도날디이(Phoma macdonaldii), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 에리시페 시코라세아룸(Erysiphe cichoracearum), 리조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae), 리조퍼스 아르리저스(Rhizopus arrhizus), 리조퍼스 스톨로니퍼(Rhizopus stolonifer), 푹시니아 헬리안테(Puccinia helianthe), 버티실리움 달리아, 세팔로스포룸 아크레모니움(Cephalosporum acremonium), 파이토프쏘라 크립토게아(Phytophthora cryptogea), 알부고 트라고포고니스(Albugo tragopogonis); 자주개자리(Alfalfa): 파이티움 울티뭄(Pythium ultimum), 파이티움 이레굴라레(Pythium irregulare), 파이티움 스플렌덴스(Pythium splendens), 파이티움 데바리아눔(Pythium debaryanum), 파이티움 아파니데르마툼(Pythium aphanidermatum), 파이토프쏘라 메가스페르마(Phytophthora megasperma), 페로노스포라 트리폴리오룸(Peronospora trifoliorum), 포마 메디카기니스 변종 메디카기니스(Phoma medicaginis var. medicaginis), 서코스포라 메디카기니스(Cercospora medicaginis), 슈도페지자 메디카기니스(Pseudopeziza medicaginis), 렙토트로킬라 메디카기니스(Leptotrochila medicaginis), 푸사리움 옥시스포룸, 버티실리움 알보-아트룸(Verticillium albo-atrum), 아파노마이세스 유테이케스(Aphanomyces euteiches), 스템파일리움 허바룸(Stemphylium herbarum), 스템파일리움 알팔패(Stemphylium alfalfae), 콜레토트리쿰 트리폴리이(Colletotrichum trifolii), 렙토스패룰리나 브리오시아나(Leptosphaerulina briosiana), 우로마이세스 스트리아터스(Uromyces striatus), 스클레로티니아 트리폴리오룸(Sclerotinia trifoliorum), 스타고노스포라 멜리로티(Stagonospora meliloti), 스템파일리움 보트리오숨(Stemphylium botryosum) 및 렙토트리킬라 메디카기니스(Leptotrichila medicaginis).
한 실시양태에서, 옥수수의 진균 병원체는 푸사리움 그라미네아룸, 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 스테노카펠라 메이디스, 푸사리움 버티실로이데스, 코클리오볼리스 헤테로스트로퍼스, 엑세로힐룸 투르시쿰, 서코스포라 제애-메이디스를 포함한다.
한 실시양태에서, 대두의 진균 병원체는 푸사리움 비르굴리포름, 푸사리움 솔라니, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 투쿠마니애 및 파콥소라 파키리지를 포함한다.
포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물의 진균 병원체는 알터나리아(Alternaria) 종, 아스퍼길러스(Aspergillus) 종, 캔디다(Candida) 종, 푸사리움(Fusarium) 종, 트리코파이톤(Trychophyton) 종, 크립토코커스(Cryptococcus) 종, 마이크로스포룸(Microsporum) 종, 페니실리움(Penicillium) 종, 트리코스포론(Trichosporon) 종, 세도스포리움(Scedosporium) 종, 패실리오마이세스(Paeciliomyces) 종, 아크레모니움(Acremonium) 종 및 데르마티아세오우스(Dermatiaceous) 곰팡이(mold)의 종을 포함한다. 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물의 특정 병원체는 하기 병원체들을 포함한다: 알터나리아 알터나타, 아스퍼길러스 푸미가터스, 아스퍼길러스 니게르, 아스퍼길러스 플라버스, 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길러스 파라시티커스(Aspergillus paraciticus), 캔디다 알비칸스, 캔디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 캔디다 파마타(Candida famata), 캔디다 글라브라타(Candida glabrata), 캔디다 귈리에르몬디이(Candida guilliermondii), 캔디다 해물로니이(Candida haemulonii), 캔디다 케피르(Candida kefyr), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 루시타니애(Candida lusitaniae), 캔디다 노르베겐시스(Candida norvegensis), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 비스와나티이(Candida viswanathii), 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 솔라니, 푸사리움 모노리포름(Fusarium monoliforme), 트리코파이톤 루브룸(Trycophyton rubrum), 트리코파이톤 멘타글로파이테스(Trycophyton mentagrophytes), 트리코파이톤 인터디지탈레스(Trycophyton interdigitales), 트리코파이톤 톤수란스(Trycophyton tonsurans), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티이(Cryptococcus gattii), 크립토코커스 그루비이(Cryptococcus grubii), 마이크로스포룸 캐니스(Microsporum canis), 마이크로스포룸 깁세움(Microsporum gypseum), 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei), 트리코스포론 베이겔리이(Tricosporon beigelii), 트리코스포론 아사히이(Trichosporon asahii), 트리코스포론 인킨(Trichosporon inkin), 트리코스포론 아스테로이데스(Trichosporon asteroides), 트리코스포론 쿠타네움(Trichosporon cutaneum), 트리코스포론 도메스티쿰(Trichosporon domesticum), 트리코스포론 뮤코이데스(Trichosporon mucoides), 트리코스포론 오보이데스(Trichosporon ovoides), 트리코스포론 풀룰란스(Trichosporon pullulans), 트리코스포론 로우비에리(Trichosporon loubieri), 트리코스포론 자포니쿰(Trichosporon japonicum), 세도스포리움 아피오스퍼뭄(Scedosporium apiospermum), 세도스포리움 프롤리피칸스(Scedosporium prolificans), 패실로마이세스 배리오티이(Paecilomyces variotii), 패실로마이세스 릴라시너스(Paecilomyces lilacinus), 아크레모니움 스트릭쿰(Acremonium stricutm), 클라도피알로포라 반티아나(Cladophialophora bantiana), 완기엘라 데르마티티디스(Wangiella dermatitidis), 라미클로리디움 오보보이데움(Ramichloridium obovoideum), 캐토미움 아트로브룬네움(Chaetomium atrobrunneum), 닥틀라리아 갈로파붐(Dactlaria gallopavum), 비폴라리스(Bipolaris) 종, 엑세로힐룸 로스트라툼(Exserohilum rostratum) 및 앱시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 아포파이소마이세스 엘레간스(Apophysomyces elegans), 뮤코르 인디커스(Mucor indicus), 리조뮤코르 푸실러스(Rhizomucor pusillus), 리조퍼스 오리재, 컨닝하멜라 버쏠레티애(Cunninghamella bertholletiae), 코케로마이세스 레쿠르바터스(Cokeromyces recurvatus), 삭세내아 바시포르미스(Saksenaea vasiformis), 신세팔라스트룸 라세모숨(Syncephalastrum racemosum), 바시디오볼러스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 코니디오볼러스 코로나터스(Conidiobolus coronatus)/코니디오볼러스 인콘그루어스(Conidiobolus incongruus), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii), 히스토플라스마 캡술라툼(Histoplasma capsulatum), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 슈달레스케리아 보이디이(Pseudallescheria boydii) 및 스포로쓰릭스 스켄키이(Sporothrix schenckii).
"진균"의 언급은 오오마이세트(oomycete), 예컨대, 파이티움 종 및 파이토프쏘라 종도 포함한다. 용어 "진균"은 녹균도 포괄한다.
세균 병원체는 잔토모나스(Xanthomonas) 종 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 다른 미생물은 파이토플라스마(Phytoplasma) 종 및 스피로플라스마(Spiroplasma) 종을 포함한다. 다른 병원체는 바이러스, 선충 및 원생동물을 포함한다. 곤충 병원체는 디아트래아 그란디오셀라(Diatraea grandiosella), 오스트리니아 누비알리스(Ostrinia nubialis), 로팔로시품(Rhopalosiphum) 종, 헬리코버파(Helicoverpa) 종, 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 및 라이거스(Lygus) 종을 포함한다.
본원은 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 핵산은 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 핵산은 서열번호 84에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
따라서, 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자로서, 이때 상기 인공적으로 생성된 데펜신이 항병원체 활성 루프 1B를 나타내는 것인 단리된 핵산 분자가 제공된다:
(i) 클래스 II 가지과 데펜신으로부터 유래된 또는 클래스 II 가지과 데펜신에 상응하는 아미노산 골격; 및
(ii) (a) 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실, 및/또는 (b) 또 다른 데펜신의 루프 1B 또는 이의 변경된 형태에 의한 전부 또는 일부의 교체, 및 임의적으로 (c) 상기 골격 상의 루프 1B 영역 외부의 또 다른 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실 중 하나 이상에 의해 변경된 상기 골격 상의 루프 1B 또는 이의 등가물.
본원에서 교시된 또 다른 양태는 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자이고, 이때 상기 루프 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있다.
한 양태에서, 상기 루프 영역은 루프 1B이다. 또 다른 양태는 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이고, 이때 상기 루프 1B 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 인공적으로 발생시키고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, X1X2X3X4X5X6은 하기 아미노산 잔기들로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함한다: X1은 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2는 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3은 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5는 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6은 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이다.
또 다른 양태는 서열번호 52에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 성숙 도메인의 C-말단 아미노산 서열을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이고, 이때 상기 루프 1B 영역은 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 인공적으로 발생시키고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다.
또 다른 양태는 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시켜 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 인공적으로 발생시키도록 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경된 루프 1B 영역 또는 이의 등가물을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스 데펜신으로부터 유래된 골격 아미노산 서열을 갖는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자이고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6은 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 니코티아나 수아베올렌스에 대한 데펜신의 예로는 NsD1 및 NsD2가 있다.
또 다른 양태는 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하는 영역을 발생시켜 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 인공적으로 발생시키도록 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경된 루프 1B 영역 또는 이의 등가물을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스 데펜신으로부터 유래된 골격 아미노산 서열을 갖는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하고, 이때 X1 내지 X6 각각은 아미노산 잔기이고, X1은 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2는 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3은 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4는 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5는 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6은 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6은 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는다. 니코티아나 수아베올렌스에 대한 데펜신의 예로는 NsD1 및 NsD2가 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 분자는 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로 구성된 목록으로부터 선택된 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하고, 이때 클래스 II 가지과 데펜신 골격 상의 상기 루프 1B 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 NaD2(HRFKGP), Zea2(QHHSFP), PsD1(DTYRGV)), MsDef1(DKYRGP), SoD2(KTFKGI) 및 DmAMP1(KTWSGN)로 구성된 목록으로부터 선택된 데펜신의 루프 1B 영역, 또는 서열번호 67 내지 79로부터 선택된 루프 1B 서열로 교체되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "유사성"은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 비교된 서열들 사이의 정확한 동일성을 포함한다. 뉴클레오티드 수준에서 비-동일성이 존재하는 경우, "유사성"은 구조적, 기능적, 생화학적 및/또는 입체구조적 수준에서 서로 관련되어 있는 상이한 아미노산을 발생시키는 서열들 사이의 차이점을 포함한다. 아미노산 수준에서 비-동일성이 존재하는 경우, "유사성"은 구조적, 기능적, 생화학적 및/또는 입체구조적 수준에서 서로 관련되어 있는 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 및 서열 비교는 유사성보다는 동일성 수준에서 수행된다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 관계를 기술하는 데에 사용된 용어는 "기준 서열", "비교 창", "서열 유사성", "서열 동일성", "서열 유사성의 백분율", "서열 동일성의 백분율", "실질적으로 유사한" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"의 길이는 12개 이상의, 그러나 빈번하게는 15개 내지 18개의, 종종 25개 이상의, 예컨대, 30개의 단량체 유닛(뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함함)이다. 2개의 폴리뉴클레오티드들이 (1) 상기 2개의 폴리뉴클레오티드들 사이에 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 단지 일부), 및 (2) 상기 2개의 폴리뉴클레오티드들 사이에 상이한 서열을 각각 포함할 수 있기 때문에, 2개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드들 사이의 서열 비교는 전형적으로 "비교 창"에 걸쳐 상기 2개의 폴리뉴클레오티드들의 서열들을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. "비교 창"은 기준 서열과 비교되는 전형적으로 12개의 인접 잔기들로 구성된 개념적 절편을 지칭한다. 비교 창은 2개의 서열들의 최적 정렬을 위해 기준 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 약 20% 이하의 추가 또는 결실(즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 비교 창을 정렬하기 위한 서열들의 최적 정렬은 알고리즘(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 릴리스(Wisconsin Genetics Software Package Release) 7.0의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재)의 전산화된 실행 또는 검사에 의해 수행될 수 있고, 가장 우수한 정렬(즉, 비교 창에 걸쳐 가장 높은 백분율 상동성을 야기함)이 선택된 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 발생될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25: 3389)에 개시된 BLAST 패밀리의 프로그램도 언급될 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 문헌(Ausubel et al. (1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. 1994-1998)의 유닛 19.3에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "서열 유사성" 및 "서열 동일성"은 서열들이 비교 창에 걸쳐 뉴클레오티드별 비교 또는 아미노산별 비교에 기초할 때 동일하거나 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도를 지칭한다. 따라서, 예를 들면, "서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들면, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열들에서 존재하는 위치의 수를 확인하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 창 내의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 개시내용의 목적을 위해, "서열 동일성"은 소프트웨어에 첨부된 기준 매뉴얼에서 사용된 표준 디폴트를 사용하여 DNASIS 컴퓨터 프로그램(윈도우의 경우 버전 2.5; 히타치 소프트웨어 엔지니어링 컴퍼니 리미티드(Hitachi Software engineering Co., Ltd.), 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)으로 계산한 "일치 백분율"을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 유사한 설명이 서열 유사성과 관련하여 적용된다. "70% 이상"은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 의미한다.
본 개시내용은 낮은 엄격성 조건 하에서 변경된 데펜신을 코딩하는 핵산 분자에 혼성화하는 핵산 분자에 관한 것이다.
엄격성 조건은 예를 들면, 예비혼성화 및 혼성화 용액 중의 염 또는 포름아미드의 농도 또는 혼성화 온도에 의해 정의될 수 있고, 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 엄격성은 상세히 후술되는 바와 같이 염 농도의 감소, 포름아미드 농도의 증가, 혼성화 온도의 상승 또는 혼성화 시간의 변경에 의해 증가할 수 있다. 대안적 양태에서, 본 개시내용의 핵산은 다양한 엄격성(예를 들면, 높은, 중간 및 낮은) 조건 하에서 그들의 혼성화 능력에 의해 정의된다.
본원에서 "낮은 엄격성"의 언급은 혼성화를 위한 약 0%(v/v) 이상 내지 약 15%(v/v) 이상의 포름 아미드 및 약 1 M 이상 내지 약 2 M 이상의 염, 및 세척 조건을 위한 약 1 M 이상 내지 약 2 M 이상의 염을 포함하고 포괄한다. 일반적으로, 낮은 엄격성 조건은 약 25℃-30℃ 내지 약 42℃이다. 온도는 변경될 수 있고, 보다 더 높은 온도는 포름아미드 대신에 이용될 수 있고/있거나 대안적 엄격성 조건을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 대안적 엄격성 조건, 예컨대, 혼성화를 위한 약 16%(v/v) 이상 내지 약 30%(v/v) 이상의 포름아미드 및 약 0.5 M 이상 내지 약 0.9 M 이상의 염, 및 세척 조건을 위한 약 0.5 M 이상 내지 약 0.9 M 이상의 염을 포함하고 포괄하는 "중간 엄격성", 또는 혼성화를 위한 약 31%(v/v) 이상 내지 약 50%(v/v) 이상의 포름아미드 및 약 0.01 M 이상 내지 약 0.15 M 이상의 염, 및 세척 조건을 위한 약 0.01 M 이상 내지 약 0.15 M 이상의 염을 포함하고 포괄하는 "높은 엄격성"은 필요한 경우 적용될 수 있다. 일반적으로 세척은 Tm = 69.3 + 0.41(G+C)%에서 수행된다(Marmur and Doty (1962) J Mol Biol 5:109-118). 그러나, 이중체 핵산 분자의 Tm은 불일치 염기쌍의 수가 1% 증가할 때마다 1℃만큼 감소한다(Bonner and Laskey (1974) Eur J Biochem 46:83-88). 포름아미드는 이들 혼성화 조건들에서 임의적인 성분이다. 따라서, 엄격성의 특히 바람직한 수준은 다음과 같이 정의된다: 낮은 엄격성은 25℃ 내지 42℃에서 6 x SSC 완충제 및 0.1%(w/v) SDS이고; 중간 엄격성은 20℃ 내지 65℃ 범위 내의 온도에서 2 x SSC 완충제 및 0.1%(w/v) SDS이고; 높은 엄격성은 65℃ 이상의 온도에서 0.1 x SSC 완충제 및 0.1%(w/v) SDS이다.
본원에서 사용된 용어 "서열 유사성" 및 "서열 동일성"은 서열들이 뉴클레오티드별 비교 또는 아미노산별 비교에 기초할 때 비교 창에 걸쳐 동일하거나 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도를 지칭한다. 따라서, 예를 들면, "서열 동일성의 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들면, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열들에서 존재하는 위치의 수를 확인하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 창 내의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 개시내용의 목적을 위해, "서열 동일성"은 소프트웨어에 첨부된 기준 매뉴얼에서 사용된 표준 디폴트를 사용하여 DNASIS 컴퓨터 프로그램(윈도우의 경우 버전 2.5; 히타치 소프트웨어 엔지니어링 컴퍼니 리미티드, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)으로 계산한 "일치 백분율"을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 유사한 설명이 서열 유사성과 관련하여 적용된다.
본원에서 교시된 핵산 분자는 다른 유전 분자에 혼성화할 수도 있다. 본원에서 "혼성화한다"의 언급은 핵산 가닥이 염기쌍 형성을 통해 상보적인 가닥과 연결되는 과정을 지칭한다. 혼성화 반응은 관심 있는 특정 서열이 낮은 농도로 존재하는 샘플에서 조차도 확인될 수 있을 정도로 민감하고 선택적일 수 있다. 엄격성 조건은 예를 들면, 예비혼성화 및 혼성화 용액 중의 염 또는 포름아미드의 농도 또는 혼성화 온도에 의해 정의될 수 있고, 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 엄격성은 상세히 후술되는 바와 같이 염 농도의 감소, 포름아미드 농도의 증가, 혼성화 온도의 상승 또는 혼성화 시간의 변경에 의해 증가할 수 있다. 대안적 양태에서, 본 핵산은 다양한 엄격성(예를 들면, 높은, 중간 및 낮은) 조건 하에서 그들의 혼성화 능력에 의해 정의된다.
단리된 핵산 분자는 식물 세포, 미생물 세포 및 비-인간 동물 세포에서 사용되기에 적합한 발현 또는 전달 벡터를 포함하는 벡터 내에 존재할 수도 있다. "벡터"의 언급은 예컨대, 국제 특허출원 제PCT/AU02/00123호에 기재된 바와 같은 다중유전자 발현 벡터(MGEV)를 포함한다.
후자 양태에 따라, 2개 내지 8개의 도메인 절편을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다중유전자 발현 비히클(MGEV)이 제공되고, 이때 각각의 도메인은 기능성 단백질을 코딩하고, 각각의 도메인은 링커 절편에 의해 선형 서열로 다음 도메인에 연결되어 있고, 상기 도메인 및 절편은 모두 동일한 판독 프레임(reading frame) 내에 존재하고, 상기 도메인들 중 하나 이상은 본원에 기재된 변경된 클래스 II 가지과 데펜신이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 다른 도메인은 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 도메인은 본원에서 고려되는 변경된 클래스 II 가지과 데펜신이고, 하나 이상의 도메인은 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태이다. "단백질분해효소 억제제"는 세린 단백질분해효소 억제제 및 시스테인 단백질분해효소 억제제를 포함한다.
변경된 데펜신을 코딩하는 핵산 서열은 적합한 조절 서열(프로모터, 종결부위, 수송 펩티드 등)과 함께 DNA 구축물 또는 벡터 내로 도입될 수 있다. 상기 핵산은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수도 있다. 몇몇 응용의 경우, 변경된 데펜신을 코딩하는 핵산 서열은 또 다른 단백질을 발현하는 코딩 영역 내로 삽입되어 데펜신 융합 단백질을 형성할 수 있거나 단백질의 한 도메인 대신에 사용되어 상기 단백질에 항병원체 활성을 부여할 수 있다. 핵산 서열은 항시성 또는 유도성 프로모터(예를 들면, 환경 조건, 병원체의 존재 또는 화학물질의 존재에 의해 자극됨)일 수 있는 동종 또는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있을 수 있다. 수송 펩티드는 변경된 데펜신에 대한 동종성 또는 이종성 펩티드일 수 있고 원하는 세포소기관(organelle) 또는 세포외 공간으로의 분비를 보장하도록 선택된다. 수송 펩티드는 특정 데펜신과 천연적으로 연결되어 있을 수 있다. 이러한 DNA 구축물은 코딩된 변경된 데펜신 또는 상기 데펜신의 활성 부분의 발현을 허용하는 생물학적 시스템 내로 클로닝될 수 있거나 형질전환될 수 있다. 적합한 생물학적 시스템은 미생물(예를 들면, 피키아 파스토리스 발현 시스템, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 내생식물(endophyte), 예컨대, 클라비박터 자일리 하위종 사이노돈티스(Clavibacter xyli subsp. cynodontis)(Cxc); 효모; 바이러스; 박테리오파지 등), 배양된 세포(예컨대, 곤충 세포, 포유동물 세포) 및 식물을 포함한다. 몇몇 경우, 발현된 데펜신은 사용을 위해 후속적으로 추출되고 단리된다.
본원에서 교시된 변경된 데펜신은 식물 및 동물(포유동물, 예컨대, 인간을 포함함)에서 병원체 질환에 대항하는 데에 유용하다. 따라서, 변경된 클래스 II 가지과 데펜신은 원예 및 농업에서 유용할 뿐만 아니라 포유동물, 예컨대, 인간을 포함하는 동물에서 사용될 약제로서 유용하다. 추가로, 병원체를 본원에 기재된 변경된 데펜신에 노출시킴으로써 상기 병원체에 대항하는 방법이 제공된다. 변경된 데펜신은 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 변경된 데펜신은 단독으로 사용될 수 있거나, 화학 살균제, 항병원체 단백질 및/또는 II형 세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태와 함께 사용될 수 있다.
본원에 기재된 변경된 데펜신은 병원체 감염, 생장, 유지 또는 확산으로부터 식물을 보호하는 데에 유용하지만, 변경된 데펜신은 포유동물, 예컨대, 인간을 포함하는 동물과 같은 비-식물을 위한 약제(국소 약제를 포함함)로서도 유용하다.
따라서, 본원에서 교시된 또 다른 양태는 하나 이상의 약학적으로, 수의학적으로 또는 원예학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및/또는 하나 이상의 다른 항병원체 물질, 예컨대, 화학 살균제, 단백질성 항병원체 물질 및/또는 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태와 함께 본원에 기재된 변경된 데펜신을 포함하는 조성물이다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 분무제, 연무제, 마이크로입자 또는 나노입자, 수용액, 분말, 크림, 연고, 겔, 함침된 붕대, 액체, 제제, 페인트 또는 다른 적합한 분산 매질(조성물의 경구 제형을 포함함)의 형태로 존재한다.
약학적 응용의 경우, 변경된 데펜신(이로부터 유도된 임의의 생성물을 포함함)은 살균제 또는 병원체생장정지제(pathogenostat)로서 사용되어 포유동물 감염을 치료할 수 있다(예를 들면, 효묘, 예컨대, 캔디다에 대항할 수 있다).
본 개시내용에 따른 변경된 데펜신(이로부터 유도된 임의의 생성물을 포함함)은 방부제(예를 들면, 식품 첨가제)로서, 또는 토양 또는 생장 배지 제조 프로그램의 일부로서 사용될 수도 있다.
농업 응용의 경우, 변경된 데펜신은 식물의 수명 동안에 또는 수확 후 작물 보호를 위해 작물의 질환 저항성 또는 질환 내성을 개선하는 데에 사용될 수 있다. 상기 펩티드에 노출된 병원체는 억제된다. 변경된 데펜신은 식물 상에 이미 확립된 병원체를 박멸할 수 있거나 향후 병원체 공격으로부터 식물을 보호할 수 있다. 상기 펩티드의 박멸제 효과가 특히 유리하다. "식물"의 언급은 작물 식물, 예컨대, 수수, 밀, 보리, 메이즈(maize), 목화, 벼, 캐놀라, 옥수수, 아바카, 자주개자리, 아몬드, 사과, 아스파라거스, 바나나, 팥속 콩류, 블랙베리, 잠두(broad bean), 캐슈(cashew), 카사바, 병아리콩(chick pea), 시트러스, 코코넛, 커피, 무화과, 아마, 포도, 낙화생(groundnut), 대마, 라벤더, 버섯, 올리브, 양파, 완두콩, 땅콩, 배, 당피(pearl millet), 감자, 평지씨, 독보리, 대두, 딸기, 사탕무우, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 토란, 차, 담배, 토마토, 라이밀(triticale), 송로 버섯(truffle) 및 참마(yam)를 포함한다.
식물 병원체를 변경된 데펜신에 노출시키는 것은 다양한 방식, 예를 들면, 하기 (a) 내지 (c)의 방식으로 달성될 수 있다:
(a) 표준 농업 기법(예컨대, 분무)을 이용하여 변경된 데펜신을 식물 부분, 토양 또는 식물의 뿌리를 둘러싸는 다른 생장 배지, 또는 파종되기 전 식물의 종자에 처리할 수 있다. 데펜신은 화학적으로 합성될 수 있거나, 상기 단백질을 발현하도록 유전적으로 변경된 미생물 또는 식물로부터 추출될 수 있다. 상기 단백질은 고체 또는 액체 희석제 및 임의적으로 다양한 보조제, 예컨대, 표면활성제와의 혼합물로 데펜신을 포함하는 조성물의 형태로 식물 또는 식물 생장 배지에 처리될 수 있다. 고체 조성물은 분산가능한 분말, 과립 또는 입자의 형태로 존재할 수 있다.
(b) 항병원체 데펜신을 발현하도록 유전적으로 변경된 미생물을 포함하는 조성물을 식물, 또는 식물이 생장하는 토양에 처리할 수 있다.
(c) 항병원체 데펜신을 발현하도록 유전적으로 변경된 내생식물을 (예를 들면, 종자 처리 과정을 통해) 식물 조직 내로 도입할 수 있다. 내생식물은 식물 숙주와 비-병원성 내부공생 관계로 들어가는 능력을 갖는 미생물로서 정의된다. 내생식물에 의해 향상된 식물 보호 방법은 크랍 제네틱스 인터네이셔날 코포레이션(Crop Genetics International Corporation)에 의한 일련의 특허출원들(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제W090/13224호, 유럽 특허 공개 제EP-125468-B1호, 국제 특허출원 공개 제W091/10363호, 국제 특허출원 공개 제W087/03303호)에 기재되어 있다. 내생식물은 농약을 생성하도록 유전적으로 변경될 수 있다. 국제 특허출원 공개 제W094/16076호(제네카 리미티드(ZENECA Limited))는 식물 유래의 항진균 펩티드를 발현하도록 유전적으로 변경되어 있는 내생식물의 용도를 기술한다.
(d) 항병원체 데펜신을 코딩하는 DNA를 식물 게놈 내로 도입하여 상기 펩티드를 식물체 내에서 발현시킬 수 있다(상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 또는 표준 핵산 합성기의 이용에 의해 제조된 DNA일 수 있다).
본원에 기재된 변경된 데펜신을 포함하는 조성물은 일반적으로 담체, 부형제, 희석제, 방부제, 안정화제 및/또는 고체 또는 액체 첨가제를 포함한다. 임의적으로, 또 다른 항병원성 물질도 포함된다.
상기 조성물은 의도된 투여 방법에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로(그러나, 배타적인 것은 아님), 국소 조성물이 식물 및 동물용으로 사용된다. 상기 조성물의 제조에 있어서, 통상적인 매질, 예컨대, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 방부제 및/또는 착색제가 사용될 수 있다. 상기 조성물은 액체 제제, 예를 들면, 현탁액, 엘릭시르 및 용액의 형태를 취할 수 있다. 담체, 예컨대, 전분, 당, 미세결정성 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등도 사용될 수 있다. 상기 조성물은 산제, 캡슐제 및 정제의 형태로 존재할 수도 있다.
본원의 변경된 데펜신은 식물 또는 이의 부분; 뿌리 시스템, 또는 뿌리 시스템을 둘러싸는 토양 또는 배지; 또는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함하는 동물의 피부, 모발 또는 털에 직접적으로 투여될 수 있다.
에어로졸 또는 분무제에 의해 투여될 때, 조성물은 농업 및 약학 제제화의 분야에서 잘 공지된 기법에 따라 제조되고, 벤질 알코올 또는 다른 적합한 방부제, 생체이용률을 향상시키는 흡수 촉진제, 불화탄소 및/또는 상기 분야에서 공지된 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중의 용액으로서 제조될 수 있다.
변경된 데펜신의 유효 투여량은 사용된 구체적인 데펜신, 투여 모드, 치료되는 병원체 및 병원체 감염의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 변경된 데펜신을 사용하는 투약 요법은 식물 또는 대상체의 종류, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료되는 상태의 중증도; 투여 경로; 및 사용된 구체적인 데펜신을 포함하는 다양한 요인에 따라 선택된다. 통상의 기술을 가진 원예가, 의사, 임상의 또는 수의사는 병원체 감염을 예방하거나 병원체 감염에 대항하거나 병원체 감염의 진행을 정지시키는 데에 요구되는 데펜신의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있다. 서방출 제제도 본원에서 고려된다.
적합한 코팅물을 갖는 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 임의적으로 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료가 식별을 위해 또는 활성 화합물 투여량의 상이한 조합을 특징규명하기 위해 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가될 수 있다.
데펜신 제제는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 가소제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 연질 밀폐된 캡슐을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐은 충전제, 예컨대, 락토스, 결합제, 예컨대, 전분 및/또는 윤활제, 예컨대, 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의적으로 안정화제와의 혼합물로 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예컨대, 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해될 수 있거나 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 첨가될 수 있다.
변경된 데펜신 조성물 또는 이를 코딩하는 발현 벡터는 또 다른 항병원체 물질, 예컨대, 또 다른 데펜신 또는 항병원체 단백질 또는 펩티드, 또는 화학 살균제 또는 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태도 포함할 수 있다.
본원에서 교시된 또 다른 양태는 병원체로 감염된 식물을 치료하거나 예방하는 프로토콜 또는 방법으로서, 본원에 기재된 변경된 데펜신을 단독으로 또는 또 다른 항병원체 물질과 함께 포함하는 조성물의 항병원체 유효량을 식물 또는 이의 부분, 또는 토양 또는 식물 주변의 생장 지지 배지에 처리하는 단계를 포함하는 프로토콜 또는 방법을 포함한다.
또 다른 양태는 병원체로 감염되거나 오염된 포유동물, 예컨대, 인간 대상체를 포함하는 동물을 치료하거나 예방하는 프로토콜 또는 방법으로서, 본원에 기재된 변경된 데펜신을 포함하는 조성물의 항병원체 유효량을 상기 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 프로토콜 또는 방법을 제공한다.
용어 "처리"는 접촉 및 노출을 포함한다. 변경된 데펜신은 단독으로 사용될 수 있거나, 다른 항병원체 물질, 또는 변경된 데펜신이 병원체에 접근하는 것을 용이하게 하는 물질과 함께 사용될 수 있다.
추가 실시양태에서, 식물 세포는 다양한 공지된 방법(아그로박테리움(Agrobacterium) Ti 플라스미드, 전기천공, 미세주입, 미세투사 총 등)에 따라 재조합 DNA 구축물로 형질전환될 수 있다. 형질전환된 세포는 적합한 경우 새로운 핵 물질이 게놈 내로 안정하게 도입되어 있는 온전한 식물로 재생될 수 있다. 형질전환된 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 둘다가 이러한 방식으로 수득될 수 있지만, 쌍자엽 식물이 통상적으로 보다 더 용이하게 재생된다. 이들 일차 형질전환체들의 자손들 중 일부는 항병원체 데펜신을 코딩하는 재조합 DNA를 유전한다.
본 개시내용은 병원체에 대한 개선된 저항성을 갖고 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 발현하는 재조합 DNA를 함유하는 식물을 추가로 제공한다. 이러한 식물은 진균을 포함하는 병원체 저항성을 갖는 혼성체 및 계통을 발생시키기 위한 표준 식물 육종 교배에서 모체로서 사용될 수 있다.
재조합 DNA는 형질전환에 의해 식물 또는 이의 모체식물(ancestor) 내로 도입되는 DNA(일반적으로 이종성 DNA)이다. 재조합 DNA는 병원체 공격 부위(예컨대, 잎)로의 전달을 위해 발현된 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 코딩한다.
본 변경된 데펜신이 형질전환 식물 또는 이의 자손 내에서 발현되는 경우, 병원체는 식물 상의 병원체 공격 부위 또는 이 공격 부위로부터 떨어져 있는 부위에서 데펜신에 노출된다. 특히, 적절한 유전자 조절 서열을 사용하여 데펜신이 가장 효과적일 때 및 장소에서 데펜신을 생체내에서 생성할 수 있다. 예를 들면, 데펜신이 일정한 양으로 정상적으로 발현되지 않지만 질환 저항성이 중요한 식물의 부분(예컨대, 잎) 내에서 데펜신을 생성할 수 있다.
생산될 수 있는 유전적으로 변경된 식물의 예로는 농작물, 곡류, 과일 및 야채, 예컨대, 옥수수, 대두, 수수, 밀, 보리, 메이즈, 목화, 캐놀라, 벼, 아바카, 자주개자리, 아몬드, 사과, 아스파라거스, 바나나, 팥속 콩류, 블랙베리, 잠두, 캐놀라, 캐슈, 카사바, 병아리콩, 시트러스, 코코넛, 커피, 무화과, 아마, 포도, 낙화생, 대마, 라벤더, 버섯, 올리브, 양파, 완두콩, 땅콩, 배, 당피, 감자, 평지씨, 독보리, 딸기, 사탕무우, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 토란, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 송로 버섯 및 참마가 있다.
병원체는 식물 상에서, 내에서 또는 근처에서 생장하는 임의의 병원체일 수 있다. 이와 관련하여, 저항성은 야생형 식물과 비교될 때 병원체에 대한 향상된 내성을 포함한다. 저항성은 병원체의 효과에 대한 내성의 악간의 증가(병원체가 부분적으로 억제되는 경우)부터 식물이 병원체의 존재에 의해 영향을 받지 않을 정도의 전체적인 저항성(병원체가 철저히 억제되거나 사멸되는 경우)까지 다양할 수 있다. 특정 병원체에 대한 증가한 저항성 수준 또는 보다 더 넓은 범위의 병원체들에 대한 저항성 둘다가 저항성의 개선을 구성할 수 있다. 개선된 저항성을 보이는 형질전환 식물(또는 이로부터 유래된 식물)은 식물 형질전환 또는 후속 교배 후에 선택된다.
본 개시내용은 항병원체 활성을 나타내는 유전적으로 변경된 식물 또는 이의 자손을 발생시키는 방법으로서, 변경된 데펜신이 식물 병원체로부터의 보호 효과를 나타내기에 충분한 발현 수준으로 본원에서 교시된 변경된 데펜신을 코딩하는 핵산을 발현하는 세포를 포함하는 식물을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 변경된 데펜신은 단독으로 사용될 수 있거나 임의의 데펜신 군으로부터 선택된 하나 이상의 데펜신과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본원은 항병원체 성질을 나타내는 식물을 발생시키는 방법으로서, 또 다른 데펜신과 함께 본원에서 교시된 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 발현하는 세포를 포함하는 유전적으로 변경된 식물 또는 이의 자손을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 식물은 병원체에 의한 내성을 촉진할 위험이 감소되어 있다. "상승작용"의 언급은 2종 이상의 데펜신을 사용함으로써 단일 데펜신에 대한 내성을 방지하는 것을 포함한다.
본 변경된 데펜신은 예를 들면, 펩티드 또는 단백질 합성기를 이용하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 표준 단계적 추가를 이용함으로써 그의 아미노산 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 변경된 데펜신은 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 변경된 데펜신은 세포에 의해 제공되든 아니면 국소 또는 전신 처리되든 관계없이 단독으로 사용될 수 있거나 다른 항병원체 물질과 함께 사용될 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 변경된 데펜신은 개선된 또는 향상된 항병원체 활성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 병원체는 진균 병원체이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 항진균 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경된 골격 상의 루프 1B 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신 골격을 포함하는 인공적으로 생성된 클래스 II 가지과 데펜신이 제공되고, 이때 상기 골격은 임의적으로 골격 상의 임의의 위치에서, 예컨대, C-말단 CTPP에서 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 추가로, 본 개시내용은 항병원체 약제의 제조에 있어서 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 1B 영역 또는 이의 등가물 루프를 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신의 용도를 고려하고, 이때 상기 루프 1B 영역은 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있다.
나아가, 또 다른 양태는 변경된 루프 1B 영역을 포함하고 항병원체 활성을 나타내는 인공적으로 생성된 데펜신의 제조에 있어서 서열번호 52에 대해 약 70% 이상의 유사성을 갖는 C-말단 영역을 포함하는 클래스 II 가지과 데펜신의 용도이다.
추가로, 본원은 식물 상에서 또는 내에서, 또는 식물 또는 이의 뿌리를 둘러싸는 토양 내에서 병원체 감염을 감소시키거나 제어하는 방법으로서, 본 개시내용의 변경된 데펜신을 상기 식물 또는 식물 뿌리, 또는 상기 토양에 국소 처리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 상기 방법은 변경된 데펜신을 발현하는 유전적으로 변경된 식물, 및 변경된 데펜신을 함유하는 변경된 식물의 자손을 발생시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태는 동물 상에서 또는 내에서 병원체 감염을 감소시키거나 제어하는 방법으로서, 본 발명의 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 상기 동물 상의 잠재적으로 감염된 표면 영역에 국소 처리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 동물은 인간을 포함하는 포유동물이다. 따라서, 동물, 특히 포유동물, 예컨대, 인간 항병원체 약제가 본원에서 고려된다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 분말, 분무제, 분사제, 나노입자, 겔, 페이스트, 함침된 붕대, 페인트, 에어로졸, 물약(drench) 또는 다른 액체의 형태로 존재한다. 항병원체 제제는 서방출 조성물일 수도 있다. 상기 제제는 감염된 대상체를 치료하는 데에 사용될 수 있거나 방부제로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포함하는"은 "비롯한", "함유하는" 또는 "을 특징으로 하는"과 동의어이고 포괄적이거나 제한이 없고 추가 비-언급된 구성요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "로 구성된"은 특허청구범위 구성요소에서 특정되지 않은 임의의 구성요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "로 본질적으로 구성된"은 특허청구범위의 기본 특징 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서, 특히 조성물의 성분의 설명 또는 디바이스의 구성요소의 설명에서 용어 "포함하는"의 임의의 언급은 언급된 성분들 또는 구성요소들로 본질적으로 구성된 조성물 및 방법, 및 언급된 성분들 또는 구성요소들로 구성된 조성물 및 방법을 포괄하는 것으로 이해된다. 본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용은 적절하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성요소 또는 구성요소들, 한계 또는 한계들의 부재 하에서 실시될 수 있다.
치환기 군이 본원에 개시되어 있는 경우, 군 구성원의 임의의 이성질체 및 거울상이성질체, 및 치환기의 사용에 의해 형성될 수 있는 클래스의 화합물을 포함하는 군 및 모든 하위군의 모든 개별 구성원들이 별도로 개시된다는 것을 이해한다. 화합물이 청구되는 경우, 본원에 개시된 참고문헌에 개시된 화합물을 포함하는 당분야에서 공지된 화합물은 포함되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 마쿠쉬(Markush) 군 또는 다른 분류가 본원에서 이용되는 경우, 군의 모든 개별 구성원들 및 군의 모든 가능한 조합 및 하위조합은 본 개시내용에 개별적으로 포함된다.
본원에서 범위가 언급되는 경우, 명시된 범위 내의 모든 하위범위들 및 명시된 범위 내의 모든 정수 값들은 각각의 하위범위 및 정수 값이 언급된 것처럼 의도되기 위한 것이다.
다양한 양태들이 본 명세서에 의해 포괄된다. 이들 양태들은 하기 양태들을 포함한다:
1. 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신으로서, 이때 상기 루프 영역은 항병원체 활성을 갖는 데펜신을 발생시키도록 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변경되어 있는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
2. 제1양태에서, 루프 영역이 루프 1B인 인공적으로 생성된 데펜신.
3. 제2양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신 상의 루프 1B가 서열 X1X2X3X4X5X6을 발생시키도록 변경되어 있고, 이때 X가 아미노산 잔기이고, X1이 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X2가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X3이 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X4가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X5가 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고/이거나; X6이 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V, 또는 이의 천연 발생 변경된 형태이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6이 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
4. 제3양태에서, 클래스 II 가지과 데펜신 상의 루프 1B가 서열 X1X2X3X4X5X6을 발생시키도록 변경되어 있고, 이때 X가 아미노산 잔기이고, X1이 N, G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 또는 R이고/이거나; X2가 K, R, G, H, L, N, F, I, S, T 또는 Y이고/이거나; X3이 W, Y, H, L, G, F 또는 P이고/이거나; X4가 P, K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 또는 G이고/이거나; X5가 S, K, Y, F, G 또는 H이고/이거나; X6이 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I 또는 Y이고, 상기 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6이 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
5. 제4양태에 있어서, 루프 1B가 서열 X1X2X3X4X5X6을 포함하고, 이때 X1이 N, H, Q, D, K 또는 E이고/이거나; X2가 R, H, T, K 또는 G이고/이거나; X3이 F, H, Y 또는 W이고/이거나; X4가 P, K, S 또는 R이고/이거나; X5가 G 또는 F이고/이거나; X6이 P, V, I 또는 N인 인공적으로 생성된 데펜신.
6. 제3양태에 있어서, X1이 L, F, S, I, A, H, Y, Q, D, K 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X2가 S, V, F, I, K, L, A, P, N, T, R, H 및 G로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X3이 A, F, W, N, I, S, Y, P, L 및 H로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X4가 K, G, E, R, A, P, F, Q, V 및 S로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X5가 M, G, K, D, S, Y, P, E, N 및 F로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산이고; X6이 V, T, M, S, W, A, P, G, E, K, L, H, I 및 N으로 구성된 목록으로부터 선택된 아미노산인 인공적으로 생성된 데펜신.
7. 제3양태, 제4양태, 제5양태 또는 제6양태에 있어서, 클래스 II 가지과 데펜신 상의 루프 1B가 아미노산 서열 HRFKGP(NaD2), QHHSFP(Zea2), DTYRGV(PsD1), DKYRGP(MsDef1), KTFKGI(SoD2) 또는 KTWSGN(DmAMP1), 또는 서열번호 67 내지 79에 의해 정의된 루프 1B로 변경되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
8. 제1양태 내지 제7양태 중 어느 한 양태에 있어서, 클래스 II 가지과 데펜신이 최적 정렬 후 서열번호 52에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 성숙 도메인의 C-말단 영역을 포함하는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
9. 제8양태에 있어서, 클래스 II 가지과 데펜신이 NaD1, NsD1, NsD2, PhD1, PhD2, TPP3, FST, NeThio1, NeThio2, NpThio1, Na-gth, Cc-gth, C20 및 SL549로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
10. 제9양태에 있어서, 클래스 II 가지과 데펜신이 NaD1인 인공적으로 생성된 데펜신.
11. 제9양태에 있어서, 클래스 II 가지과 데펜신이 NsD1 및 NsD2로부터 선택된 니코티아나 수아베올렌스(Nicotiana suaveolens)의 데펜신인 인공적으로 생성된 데펜신.
12. 제2양태에 있어서, 도 2에 나열된 비-클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B가 클래스 II 가지과 데펜신 상의 루프 1B를 대체하는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
13. 제7양태에 있어서, 루프 1B가 NaD1의 NTFPGI의 변경된 형태이고, 이때 상기 변경이 하기 변경들 중 하나 이상을 포함하고, 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6이 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는 것인 인공적으로 생성된 데펜신:
N은 A, R, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나;
T는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나;
F는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나;
P는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나;
G는 A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환되고/되거나;
I는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로부터 선택된 아미노산 잔기 또는 이의 천연 발생 변경된 형태로 치환된다.
14. 제13양태에 있어서, 루프 1B가 NaD1의 NTFPGI의 변경된 형태이고, 이때 상기 변경이 하기 변경들 중 하나 이상을 포함하고, 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6이 변경 전 클래스 II 가지과 데펜신의 루프 1B 영역의 아미노산 서열에 상응하지 않는 것인 인공적으로 생성된 데펜신:
N은 G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S 및 R로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고/되거나;
T는 K, R, G, H, L, N, F, I, S 및 Y로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고/되거나;
F는 W, Y, H, L, G 및 P로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고/되거나;
P는 K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D 및 G로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고/되거나;
G는 S, K, Y, F 및 H로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고/되거나;
I는 P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H 및 Y로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환된다.
15. 제1양태 내지 제14양태 중 어느 한 양태에 있어서, 골격 클래스 II 가지과 데펜신이 상기 루프 영역 외부의 골격 상에서 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 추가로 포함하는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
16. 제15양태에 있어서, 추가 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실이 C-말단 꼬리에서 하나 이상의 아미노산의 치환인 인공적으로 생성된 데펜신.
17. 제1양태 내지 제16양태 중 어느 한 양태에 있어서, 골격 클래스 II 가지과 데펜신에 비해 상대적으로 더 넓은 범위의 항병원체 활성, 증가한 항병원체 활성, 보다 더 큰 안정성 및/또는 보다 더 큰 투과능으로부터 선택된 향상된 항병원체 활성을 갖는 인공적으로 생성된 데펜신.
18. 제17양태에 있어서, 항병원체 활성이 진균에 대한 활성의 수준인 인공적으로 생성된 데펜신.
19. 제17양태에 있어서, 항병원체 활성이 곤충에 대한 활성의 수준인 인공적으로 생성된 데펜신.
20. 제18양태에 있어서, 진균이 식물 진균 병원체인 인공적으로 생성된 데펜신.
21. 제20양태에 있어서, 진균이 포유동물 진균 병원체인 인공적으로 생성된 데펜신.
22. 제21양태에 있어서, 진균이 인간 진균 병원체인 인공적으로 생성된 데펜신.
23. 제20양태에 있어서, 진균이 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 디플로디아 메이디스, 푸사리움 그라미네아룸 및 푸사리움 버티실로이데스로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
24. 제20양태에 있어서, 진균이 하기 진균들로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신: 옥수수: 지베렐라 제애(푸사리움 그라미네아룸), 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 스테노카펠라 메이디(디플로디아 메이디스), 푸사리움 모닐리포름 변종 서브굴루티난스, 푸사리움 버티실로이데스, 비폴라리스 메이디스 O, T(코클리오볼리스 헤테로스트로퍼스), 엑세리오힐룸 투르시쿰 I, II 및 III, 서코스포라 제애-메이디스, 파이티움 이레굴라레, 파이티움 데바리아눔, 파이티움 그라미니콜라, 파이티움 스플렌덴스, 파이티움 울티뭄, 파이티움 아파니데르마툼, 아스퍼길러스 종, 아스퍼길러스 플라버스, 헬민쏘스포리움 카보눔 I, II 및 III(코클리오볼러스 카보눔), 헬민쏘스포리움 페디셀라툼, 파이소데르마 메이디스, 파일로스틱타 메이디스, 카바티엘라 메이디스, 서코스포라 소르기, 우스틸라고 메이디스, 우스틸라고 제애, 푹시니아 소르기, 푹시니아 폴리소라, 마크로포미나 파세올리나, 페니실리움 옥살리쿰, 니그로스포라 오리재, 클라도스포리움 허바리움, 쿠르불라리아 루나타, 쿠르불라리아 이내쿠알리스, 쿠르불라리아 펠레센스, 트리코데르마 비리데, 클라비셉스 소르기, 디플로디아 마크로스포라, 스클레로프쏘라 마크로스포라, 페로노스클레로스포라 소르기, 페로노스클레로스포라 필리피넨시스, 페로노스클레로스포라 메이디스, 페로노스클레로스포라 사카리, 스파셀로테카 레일리아나, 파이소펠라 제애, 세팔로스포룸 메이디스, 세팔로스포룸 아크레모니움; 대두: 푸사리움 비르굴리포름, 푸사리움 솔라니, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 투쿠마니애, 파콥소라 파키리지, 파이토프쏘라 메가스페르마 품종 글리시네아, 파이토프쏘라 소재, 마크로포미나 파세올리나, 리족토니아 솔라니, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 디아포르테 파세올로룸 변종 소재(포몹시스 소재), 디아포르테 파세올로룸 변종 카울리보라, 스클레로티움 롤프시이, 서코스포라 키쿠치이, 서코스포라 소지나, 페로노스포라 만슈리카, 콜레토트리쿰 데마티움(콜레토트리쿰 트룬카툼), 코리네스포라 카스시이콜라, 셉토리아 글리시네스, 파일로스틱타 소지콜라, 알터나리아 알터나타, 마이크로스패라 디푸사, 푸사리움 세미텍툼, 피알로포라 그레가타, 글로메렐라 글리시네스, 파이티움 아파니데르마툼, 파이티움 울티뭄, 파이티움 데바리아눔; 캐놀라: 알부고 캔디다, 알터나리아 브라스시캐, 렙토스패리아 마쿨란스, 리족토니아 솔라니, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 마이코스패렐라 브라스시시콜라, 파이티움 울티뭄, 페로노스포라 파라시티카, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 아베나세움, 푸사리움 로세움, 알터나리아 알터나타; 목화: 푸사리움 옥시스포룸 품종 바신펙툼, 버티실리움 달리아, 티엘라비옵시스 바시콜라, 알터나리아 마크로스포라, 서코스포라 고시피나, 포마 엑시구아(아스코카이타 고시피이), 파이티움 종 리족토니아 솔라니, 푹시니아 스케다르디이, 푹시니아 카카바타, 파이마토트리콥시스 옴니보레; 캐놀라: 렙토스패리아 마쿨란스, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 알터나리아 브라스시캐, 알터나리아 브라시시콜라, 플라스모디오포라 브라스시캐, 리족토니아 솔라니, 푸라시움 종, 파이티움 종, 파이토프쏘라 종, 알터나리아 종, 페로노스포라 파라시티카, 마이코스패렐라 캡셀래(슈도서코스포렐라 캡셀래), 알부고 캔디다, 파이토프토호라 메가스페르마 변종 메가스페르마, 보트리티스 시네레아, 에리시페 크루시페라룸; 밀: 코클리오볼러스 사티버스, 드레크슬레라 위르레가넨시스, 마이코스패렐라 그라미니콜라, 패오스패리아 아베나리아 품종 트리티세아, 패오스패리아 노도룸, 블루메리아 그라미니스 품종 트리티시, 우로시스티스 아그로파이리, 알터나리아 알터나타, 클라도스포리움 허바룸, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 아베나세움, 푸사리움 쿨모룸, 푸사리움 슈도그라미네아룸, 우스틸라고 트리티시, 아스코카이타 트리티시, 세팔로스포리움 그라미네움, 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 에리시페 그라미니스 품종 트리티시, 푹시니아 그라미니스 품종 트리티시, 푹시니아 레콘디타 품종 트리티시, 푹시니아 스트리이포르미스), 푹시니아 트리티시나, 스클레로프쏘라 마크로스포라, 우로시스티스 아그로파이리, 파이레노포라 트리티시-레펜티스, 파이레노포라 세메니페르다, 패오스패리아 노도룸, 셉토리아 노도룸, 셉토리아 트리티시, 셉토리아 아베내, 슈도서코스포렐라 허포트리코이데스, 리족토니아 솔라니, 리족토니아 세레알리스, 개우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시, 파이티움 종, 파이티움 아파니데르마툼, 파이티움 아르레노만네스, 파이티움 그라미콜라, 파이티움 울티뭄, 비폴라리스 소로키니아나, 클라비셉스 푸르푸레아, 타페시아 얄룬대, 틸레티아 트리티시, 틸레티아 래비스, 틸레티아 카리에스, 틸레티아 인디카, 우스틸라고 트리티시, 워노위시아 그라미니스, 코클리오볼러스 사티버스; 수수: 엑세로힐룸 투르시쿰, 콜레토트리쿰 수블리네올룸, 서코스포라 소르기, 글로에오서코스포라 소르기, 아스코카이타 소르기나, 푹시니아 푸르푸레아, 마크로포미나 파세올리나, 퍼코니아 서시나타, 푸사리움 모닐리포름, 알터나리아 알터나타, 비폴라리스 소르기콜라, 헬민쏘스포리움 소르기콜라, 쿠르불라리아 루나타, 포마 인시디오사, 라물리스포라 소르기, 라물리스포라 소르기콜라, 파일라카라 삭카리, 스포리소리움 레일리아눔(스파셀로테카 레일리아나), 스파셀로테카 크루엔타, 스포리소리움 소르기, 클라비셉스 소르기, 리족토니아 솔라니, 아크레모니움 스트릭툼, 스클레로프쏘나 마크로스포라, 페로노스클레로스포라 소르기, 페로노스클레로스포라 필립피넨시스, 스클레로스포라 그라미니콜라), 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 옥시스포룸, 파이티움 아르레노마네스, 파이티움 그라미니콜라; 해바라기: 플라스모파라 할스테디이, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 셉토리아 헬리안티, 포몹시스 헬리안티, 알터나리아 헬리안티, 알터나리아 진니애, 보트리티스 시네레아, 포마 맥도날디이, 마크로포미나 파세올리나, 에리시페 시코라세아룸, 리조퍼스 오리재, 리조퍼스 아르리저스, 리조퍼스 스톨로니퍼, 푹시니아 헬리안테, 버티실리움 달리아, 세팔로스포룸 아크레모니움, 파이토프쏘라 크립토게아, 알부고 트라고포고니스; 자주개자리: 파이티움 울티뭄, 파이티움 이레굴라레, 파이티움 스플렌덴스, 파이티움 데바리아눔, 파이티움 아파니데르마툼, 파이토프쏘라 메가스페르마, 페로노스포라 트리폴리오룸, 포마 메디카기니스 변종 메디카기니스, 서코스포라 메디카기니스, 슈도페지자 메디카기니스, 렙토트로킬라 메디카기니스, 푸사리움 옥시스포룸, 버티실리움 알보-아트룸, 아파노마이세스 유테이케스, 스템파일리움 허바룸, 스템파일리움 알팔패, 콜레토트리쿰 트리폴리이, 렙토스패룰리나 브리오시아나, 우로마이세스 스트리아터스, 스클레로티니아 트리폴리오룸, 스타고노스포라 멜리로티, 스템파일리움 보트리오숨 및 렙토트리킬라 메디카기니스.
25. 제24양태에 있어서, 진균이 푸사리움 그라미네아룸, 콜레토트리쿰 그라미니콜라, 스테노카펠라 메이디스, 푸사리움 버티실로이데스, 코클리오볼리스 헤테로스트로퍼스, 엑세로힐룸 투르시쿰, 서코스포라 제애-메이디스, 푸사리움 비르굴리포름, 푸사리움 솔라니, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 투쿠마니애 및 파콥소라 파키리지로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
26. 제24양태에 있어서, 진균이 푸사리움 비르굴리포름, 푸사리움 솔라니, 스클레로티니아 스클레로티오룸, 푸사리움 옥시스포룸 및 푸사리움 투쿠마니애로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
27. 제20양태에 있어서, 진균이 녹균인 인공적으로 생성된 데펜신.
28. 제21양태에 있어서, 진균이 알터나리아 종, 아스퍼길러스 종, 캔디다 종, 푸사리움 종, 트리코파이톤 종, 크립토코커스 종, 마이크로스포룸 종, 페니실리움 종, 트리코스포론 종, 세도스포리움 종, 패실리오마이세스 종, 아크레모니움 종 및 데르마티아세오우스 곰팡이로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
29. 제24양태에 있어서, 진균이 하기 진균들로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신: 알터나리아 알터나타, 아스퍼길러스 푸미가터스, 아스퍼길러스 니게르, 아스퍼길러스 플라버스, 아스퍼길러스 니둘란스, 아스퍼길러스 파라시티커스, 캔디다 알비칸스, 캔디다 두블리니엔시스, 캔디다 파마타, 캔디다 글라브라타, 캔디다 귈리에르몬디이, 캔디다 해물로니이, 캔디다 케피르, 캔디다 크루세이, 캔디다 루시타니애, 캔디다 노르베겐시스, 캔디다 파랍실로시스, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 비스와나티이, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 솔라니, 푸사리움 모노리포름, 트리코파이톤 루브룸, 트리코파이톤 멘타글로파이테스, 트리코파이톤 인터디지탈레스, 트리코파이톤 톤수란스, 크립토코커스 네오포르만스, 크립토코커스 가티이, 크립토코커스 그루비이, 마이크로스포룸 캐니스, 마이크로스포룸 깁세움, 페니실리움 마르네페이, 트리코스포론 베이겔리이, 트리코스포론 아사히이, 트리코스포론 인킨, 트리코스포론 아스테로이데스, 트리코스포론 쿠타네움, 트리코스포론 도메스티쿰, 트리코스포론 뮤코이데스, 트리코스포론 오보이데스, 트리코스포론 풀룰란스, 트리코스포론 로우비에리, 트리코스포론 자포니쿰, 세도스포리움 아피오스퍼뭄, 세도스포리움 프롤리피칸스, 패실로마이세스 배리오티이, 패실로마이세스 릴라시너스, 아크레모니움 스트릭쿰, 클라도피알로포라 반티아나, 완기엘라 데르마티티디스, 라미클로리디움 오보보이데움, 캐토미움 아트로브룬네움, 닥틀라리아 갈로파붐, 비폴라리스 종, 엑세로힐룸 로스트라툼 및 앱시디아 코림비페라, 아포파이소마이세스 엘레간스, 뮤코르 인디커스, 리조뮤코르 푸실러스, 리조퍼스 오리재, 컨닝하멜라 버쏠레티애, 코케로마이세스 레쿠르바터스, 삭세내아 바시포르미스, 신세팔라스트룸 라세모숨, 바시디오볼러스 라나룸, 코니디오볼러스 코로나터스/코니디오볼러스 인콘그루어스, 블라스토마이세스 데르마티티디스, 콕시디오이데스 이미티스, 콕시디오이데스 포사다시이, 히스토플라스마 캡술라툼, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 슈달레스케리아 보이디이 및 스포로쓰릭스 스켄키이.
30. 제19양태에 있어서, 곤충이 디아트래아 그란디오셀라, 오스트리니아 누비알리스, 로팔로시품 종, 헬리코버파 종, 플루텔라 자일로스텔라 및 라이거스 종으로부터 선택되는 것인 인공적으로 생성된 데펜신.
31. 제1양태 내지 제30양태 중 어느 한 양태의 인공적으로 생성된 데펜신을 포함하고 임의적으로 화학 또는 단백질성 살균제 및/또는 세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태를 추가로 포함하는 조성물.
32. 제1양태 내지 제30양태 중 어느 한 양태의 인공적으로 생성된 데펜신을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
33. 제32양태의 단리된 핵산 분자를 포함하는 유전 구축물.
34. 제1양태 내지 제30양태 중 어느 한 양태의 인공적으로 생성된 데펜신을 생성하는 유전적으로 변경된 식물 또는 상기 식물의 자손.
35. 제34양태에 있어서, 제32양태의 핵산 분자 또는 제33양태의 유전 구축물, 또는 이의 자손 또는 증식 물질을 포함하는 유전적으로 변경된 식물 또는 상기 식물의 자손.
36. 제34양태 또는 제35양태에 있어서, 옥수수, 대두, 목화, 수수, 밀, 보리, 메이즈, 캐놀라, 아바카, 자주개자리, 아몬드, 사과, 아스파라거스, 바나나, 팥속 콩류, 블랙베리, 잠두, 캐슈, 카사바, 병아리콩, 시트러스, 코코넛, 커피, 무화과, 아마, 포도, 낙화생, 대마, 라벤더, 버섯, 올리브, 양파, 완두콩, 땅콩, 배, 당피, 감자, 평지씨, 독보리, 딸기, 사탕무우, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 토란, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 송로 버섯 및 참마로부터 선택된 유전적으로 변경된 식물 또는 상기 식물의 자손.
37. 향상된 항병원체 활성을 나타내는 유전적으로 변경된 식물 또는 이의 자손을 발생시키는 방법으로서, 변경된 데펜신이 식물 병원체로부터의 보호 효과를 나타내기에 충분한 발현 수준으로 식물 또는 이의 자손 내에서 제1양태 내지 제30양태 중 어느 한 양태의 변경된 클래스 II 가지과 데펜신을 코딩하는 핵산을 발현하는 세포를 포함하는 식물을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
38. 식물 상의 병원체 감염을 제어하는 방법으로서, 제31양태의 조성물을 상기 식물, 이의 뿌리 또는 상기 식물을 둘러싸는 토양에 국소 처리하는 단계를 포함하는 방법.
39. 동물 대상체 상의 병원체 감염을 제어하는 방법으로서, 제31양태의 조성물을 상기 병원체에 의해 잠재적으로 감염된 동물 상의 표면에 국소 처리하는 단계를 포함하는 방법.
40. 제37양태 또는 제38양태에 있어서, 화학 살균제, 단백질성 살균제, 또는 세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태를 추가로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
41. 제39양태에 있어서, 동물이 포유동물인 방법.
42. 제31양태에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
43. 항병원체 약제의 제조에 있어서, 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 영역을 갖는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 인공적으로 생성된 데펜신의 용도로서, 이때 상기 루프 영역이 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 및/또는 추가에 의해 변경되어 있는 것인 용도.
44. 제43양태에 있어서, 루프 영역이 루프 1B인 용도.
45. 제43양태 또는 제44양태에 있어서, 병원체가 진균인 용도.
46. 제43양태, 제44양태 또는 제45양태에 있어서, 화학 살균제, 단백질성 살균제, 또는 세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제 또는 이의 전구체 형태의 용도를 추가로 포함하는 용도.
47. 서열번호 49[NsD1]에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신.
48. 서열번호 51[NsD2]에 기재된 아미노산 서열 또는 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 니코티아나 수아베올렌스로부터 단리된 데펜신.
49. 제47양태 또는 제48양태의 데펜신을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
50. 제49양태에 있어서, 서열번호 48; 서열번호 50; 중간 엄격성 조건 하에서 서열번호 48 또는 50에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열; 및 최적 정렬 후 서열번호 46 또는 48에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
51. 변경된 루프 1B 영역을 포함하고 항병원체 활성을 나타내는 인공적으로 생성된 데펜신의 제조에 있어서 서열번호 52에 대해 약 70% 이상의 유사성을 갖는 그의 성숙 도메인의 C-말단 영역을 포함하는 클래스 II 가지과 데펜신의 용도.
52. 제32양태의 핵산 및 단백질분해효소 억제제를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전 구축물.
실시예
양태는 하기 비-한정적 실시예에 의해 더 기재된다. 이들 실시예에서 이용된 방법은 후술되어 있다.
가지과 꽃으로부터 데펜신의 정제
클래스 II 데펜신을 이들의 천연 공급원으로부터 단리하기 위해, 개화의 꽃잎 착색 단계까지의 전체 니코티아나 알라타(NaD1, NaD2) 또는 니코티아나 수아베올렌스(NsD1, NsD2) 꽃을 이전에 기재된 바와 같이(상기 문헌((Lay et al. 2003)) 미세한 분말로 분쇄하고 묽은 황산에서 추출하였다. 요약하건대, 꽃(760 g 습윤 중량)을 액체 질소에서 동결시키고 막자사발 및 막자에서 미세한 분말로 분쇄하고 울트라-투르락스(Ultra-Turrax) 균질화기를 이용하여 50 mM 황산(g 생 중량 당 3 ㎖)에서 5분 동안 균질화하였다. 4℃에서 1시간 동안 교반한 후, 미라클로쓰(Miracloth)(칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 통해 여과하고 원심분리하여(25,000 x g, 15분, 4℃)하여 세포 데브리스를 제거하였다. 그 다음, 10 M NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조절하였고, 추출물을 4℃에서 1시간 동안 교반한 후 원심분리하여(25,000 x g, 15분, 4℃) 침전된 단백질을 제거하였다. 상청액(1.8 ℓ)을 10 mM 인산나트륨 완충제로 예비평형화된 SP 세파로스(상표명) 패스트 플로우(Fast Flow)(지이 헬쓰케어 바이오사이언스(GE Healthcare Bio-Sciences)) 컬럼(2.5 cm x 2.5 cm)에 가하였다. 20 컬럼 부피의 10 mM 인산나트륨 완충제(pH 6.0)로 세척하여 비-결합된 단백질을 제거하였고, 500 mM NaCl을 함유하는 10 mM 인산나트륨 완충제(pH 6.0)를 사용하여 결합된 단백질을 3 x 10 ㎖ 분획으로 용출하였다. SP 세파로스 컬럼으로부터의 분획에 대해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 수행하였다.
피키아 파스토리스로부터 NaD1 의 정제
피키아 파스토리스 발현 시스템은 잘 공지되어 있고 인비트로겐(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재; pPIC9 발현 벡터의 서열을 개시하는 공급자의 피키아 발현 매뉴얼 참조)으로부터 상업적으로 입수가능하다.
단일 pPIC9-NaD1 피키아 파스토리스 GS115 콜로니를 사용하여 100 ㎖ 플라스크 내의 10 ㎖ BMG 배지(인비트로겐 피키아 발현 매뉴얼에 기재되어 있음)를 접종하고 30℃ 진탕 항온처리기(140 rpm) 내에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 배양물을 사용하여 2 ℓ 칸막이(baffled) 플라스크 내의 500 ㎖ BMG를 접종하였고 상기 플라스크를 30℃ 진탕 항온처리기(140 rpm) 내에 넣어 두었다. 일단 OD600이 2.0에 도달하면(약 18시간), 세포를 원심분리(2,500 x g, 10분)로 수거하고 5 ℓ 칸막이 플라스크 내의 1 ℓ BMM 배지(OD600 = 1.0) 내로 재현탁하고 28℃ 진탕 항온처리기 내에서 3일 동안 항온처리하였다. 원심분리((4750 rpm, 20분)하여 발현 배지를 세포로부터 분리하고 동등한 부피의 20 mM 인산칼륨 완충제(pH 6.0)로 희석하였다. NaOH를 사용하여 상기 배지를 pH 6.0으로 조절한 후 10 mM 인산칼륨 완충제(pH 6.0)로 예비평형화된 SP 세파로스 컬럼(1 cm x 1 cm, 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))에 가하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 100 ㎖의 10 mM 인산칼륨 완충제(pH 6.0)로 세척하였고, 결합된 단백질을 500 mM NaCl을 함유하는 10 ㎖의 10 mM 인산칼륨 완충제로 용출하였다. 용출된 단백질에 대해 본원에 후술된 바와 같이 40분 선형 구배를 이용하는 RP-HPLC를 수행하였다. 단백질 피크를 수집하고 SDS-PAGE 및 항-NaD1 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. NaD1을 함유하는 분획을 동결건조하고 멸균 밀리 Q 초순수 물에 재현탁하였다. 소 혈청 알부민(BSA)을 단백질 표준물로서 사용하는 비신코닌산(BCA) 단백질 어세이(피어스 케미칼 컴파니(Pierce Chemical Co.))를 이용하여 피키아에 의해 발현된 NaD1의 단백질 농도를 측정하였다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피
검출기(모델 166, 벡크만(Beckman))에 커플링된 시스템 골드(System Gold) HPLC(벡크만) 상에서 부착된 가드(guard) 컬럼과 함께 분취 C8 컬럼(22 x 250 mm, Vydac)을 이용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 수행하였다. 완충제 A(0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산) 중의 단백질 샘플을 적재하고 0% 내지 100%(v/v) 완충제 B(0.089%(v/v) 트리플루오로아세트산 중의 60%(v/v) 아세토니트릴)의 선형 구배를 이용하여 40분에 걸쳐 10 ㎖/분의 유속으로 용출하였다. 215 nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 단백질을 검출하였다. 단백질 피크를 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다.
NaD1 정제의 각각의 단계로부터 수득된 샘플들(30 ㎕)을 NuPAGE(등록상표) LDS 샘플 적재 완충제(10 ㎕, 인비트로겐)에 첨가하고 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 다음, 상기 샘플들을 NuPAGE(등록상표) 조립 4% 내지 12%(w/v) 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐) 상에 적재하였고, 200 V에서 작동된 엑스셀-슈어록(XCell-Surelock) 전기영동 장치(인비트로겐)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 단백질을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색으로 가시화하고 항-NaD1 항체를 사용하는 면역블롯팅을 위해 니트로셀룰로스 상으로 옮겼다.
rNaD1의 원편광이색 스펙트럼
피키아 파스토리스로부터 정제된 NaD1(rNaD1)이 정확하게 폴딩되었는지를 조사하기 위해, 그의 원자외선 원편광이색(CD) 스펙트럼을 기록하고 천연 NaD1의 원자외선 원편광이색(CD) 스펙트럼과 비교하였다. 상기 2개의 스펙트럼의 유사성은 rNaD의 구조가 천연 NaD1에 비해 유의하게 변경되지 않았다는 것을 표시한다.
NaD1의 PCR 돌연변이유발
푸젼(Phusion)(등록상표) 부위-지정된 돌연변이유발 키트(핀자임스(Finnzymes))를 이용하여 NaD1의 부위-지정된 돌연변이유발을 수행하였다. 5' 말단에서 인산화된 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 원하는 돌연변이를 도입하도록 디자인하였다. 전체 주형 플라스미드(pPIC9-NaD1)를 72℃의 10분 최종 연장 주기와 함께 하기 온도 프로파일을 이용하는 30 주기의 PCR 반응에서 증폭하였다: 98℃, 30초; 55℃, 20초; 72℃, 4분. 그 다음, 실온에서 5분 동안 T4 DNA 퀵 연결효소(Quick Ligase)를 사용하여 선형 PCR 생성물을 환형화하고 제조자의 지시에 따라 화학적 형질전환능(competent) TOP10 세포 내로 형질전환시켰다. AOX3' 프라이머를 사용하여 구축물을 서열분석하여 돌연변이가 정확히 도입되었는지를 확인하였다.
전기형질전환능 피키아 파스토리스의 제조
전기형질전환능 피키아 파스토리스 GS115 세포(인비트로겐)를 문헌(Chang et al. (2005) Mol Biol Cell 16(10):4941-4953)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 요약하건대, YPD(1%(w/v) 박토 효모 추출물, 2%(w/v) 박토 펩톤 추출물 및 2%(w/v) 덱스트로스)에서 하룻밤 동안 생장된 세포를 수거하고, 진탕하면서 30℃에서 15분 동안 10 mM DTT 및 25 mM HEPES를 함유하는 YPD(pH 8)로 처리하였다. 세포를 물로 2회 세척하고 빙냉 1 M 소르비톨로 1회 세척한 후, 1 M 소르비톨에 재현탁하고 -80℃에서 저장하기 위해 80 ㎕ 분취액으로 나누었다.
pPIC9 구축물을 사용한 피키아 파스토리스 GS115 의 형질전환
각각의 pPIC9 구축물로 형질전환된 단일 이. 콜라이 TOP10 콜로니를 사용하여, 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 10 ㎖의 LB를 접종하고 진탕 항온처리기 내에서 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 퀴아프렙(Qiaprep)(등록상표) 미니프렙 키트(퀴아젠)를 이용하여 플라스미드 DNA를 단리하고 제한효소 SalI을 사용하여 하룻밤 동안 선형화하였다. 형질전환능 피키아 파스토리스 GS115 세포(80 ㎕)를 얼음 상에서 해동시켰고, 1 ㎍의 선형화된 DNA를 0.2 cm 갭을 갖는 빙냉 진 펄서(Gene Pulser)(등록상표) 전기천공 큐벳에 첨가하였다. 1.5 kV, 25 μF 및 400 Ω(진 펄서, 바이오-라드 레이보레이토리스(Bio-Rad Laboratories))에서 전기천공하여 DNA를 도입하였다. 빙냉 1 M 소르비톨(1 ㎖)을 세포에 첨가한 후 상기 세포를 MD 플레이트(1.34%(w/v) 효모 질소 염기, 아미노산을 갖지 않고 황산암모늄을 가짐[유에스 바이올로지칼(US Biological), YNB], 4 x 10-5%(w/v) 바이오틴, 2%(w/v) 덱스트로스) 상에 플레이팅하고 30℃에서 5일 동안 항온처리하였다. 그 다음, 양성 콜로니를 선택하고 새로운 MD 플레이트 상에 다시 플레이팅하였다.
rNaD1 의 특징규명
도 6a 내지 6d는 꽃으로부터 단리된 rNaD1의 면역블롯, 역상 HPLC 기록 및 구조, 및 균사 생장에 대한 rNaD1의 활성을 보여준다.
아미노산 서열 비교
도 3a 및 3b는 NaD1을 포함하는 다양한 클래스 II 가지과 데펜신들의 아미노산 서열들의 표시를 제공한다. 도 4는 클래스 I 데펜신 및 클래스 II 데펜신을 보여준다. 이들 정렬에서 루프 1B 영역은 도 3에서 아미노산 10 내지 15를 포함하고 도 4에서 아미노산 9 내지 14를 포함한다. 본 개시내용은 NaD1(서열번호 52)의 아미노산 32 내지 51에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 20개의 C-말단 인접 아미노산 잔기를 갖는 데펜신에 대한 것이다. 예는 표 4에 제공되어 있다.
벡터 맵
도 11은 pHEX138에 대한 벡터 맵을 보여준다.
식물내 연구를 위한 바이오어세이 방법:
콜레토트리쿰 그라미니콜라 접종물의 제조:
콜레토트리쿰 그라미니콜라(미국 단리물 캐롤(Carroll)-1A-99))를 제아(Zea) 메이즈로부터 단리하였다(파이오니아 하이-브레드 인터네이셔날 인코포레이티드(Pioneer Hi-Bred International, Inc), 미국 아이오와주 존스톤 소재). 포자를 V8 한천 상에서 생장된 포자형성 배양물로부터 대략 2주 내지 3주 동안 단리하였다. 플레이트의 표면을 멸균수 내로 긁어내고 미용 티슈를 통한 여과로 균사체로부터 포자를 분리함으로써 콜레토트리쿰 그라미니콜라 포자를 수집하였다. 여과액 중의 포자의 농도를 혈구계를 이용하여 측정하였다.
푸사리움 그라미네아룸 접종물의 제조:
푸사리움 그라미네아룸 단리물(73B1A)을 제아 메이즈(파이오니아 하이-브레드 인터네이셔날 인코포레이티드, 미국 아이오와주 존스톤 소재)로부터 단리하였다. 포자를 SNP 한천 상에서 생장된 포자형성 배양물로부터 대략 2주 내지 3주 동안 단리하였다. 플레이트의 표면을 멸균수 내로 긁어냄으로써 푸사리움 그라미네아룸 포자를 수집하였다. 포자의 농도를 혈구계를 이용하여 측정하였다.
메이즈 식물의 접종:
바이오어세이용 식물을 플라스크로부터 꺼낸 후 온실에서 대략 9주 내지 10주 동안 생장시켰다.
콜레토트리쿰 그라미니콜라 접종
메이즈 잎집의 대향하는 면 상에서 길이 2.0 mm의 2개의 상처를 만든 후 1 x 106개의 콜레토트리쿰 그라미니콜라 포자/㎖로 덮어씌웠다. 그 다음, 상처를 글래드 프레슨 밀폐제(Glad Pressn' Seal)로 3일 동안 밀폐시켰다. 감염 면적을 접종 후 10일째 날에 디지털 사진촬영으로 측정하였다.
푸사리움 그라미네아룸 접종
메이즈 잎집의 대향하는 면 상에서 길이 2.0 mm의 2개의 상처를 만들었다. 상처를 1 x 106개의 푸사리움 그라미네아룸 포자/㎖에 침지된 6 mm 직경 종이 원반으로 덮어씌웠다. 그 다음, 상처를 글래드 프레슨 밀폐제로 3일 동안 밀폐시켰다. 감염 면적을 접종 후 10일째 날에 디지털 사진촬영으로 측정하였다.
ELISA 방법
단백질 추출물: 온실에서 생장된 식물로부터 잎집을 절개하였다. 조직(50 mg)을 액체 질소에서 동결시키고 주파수 30 s-1에서 2 x 15초 동안 혼합 분쇄기(렛슈(Retsch) MM300) 내에서 분쇄하였다. 450 ㎕의 2% 불용성 PVPP(폴리클라(Polyclar))/PBS/0.05% 트윈 20을 첨가하고 20초 동안 볼텍싱하여 단백질 추출물을 만들었다. 샘플을 10분 동안 원심분리하였고 상청액을 수집하였다.
ELISA 플레이트(넌크 맥시소르프(Nunc Maxisorp) #442404)를 PBS 중의 100 ㎕/웰의 일차 항체(100 ng/웰의 항-NaD1(니코티아나 알라타의 꽃으로부터 정제된 NaD1에 대한 다중클론 항체를 표준 방법으로 제조하였음))와 함께 항온처리하였다. 플레이트를 습한 상자 내에서 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 플레이트를 PBS/0.05%(v/v) 트윈 20으로 2분 동안 4회 세척하였다. 플레이트를 PBS 중의 200 ㎕/웰 3%(w/v) BSA(시그마 A-7030: 98% ELISA 등급)로 차단하고 25℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 PBS/0.05%(v/v) 트윈 20으로 2분 동안 4회 세척하였다.
그 다음, 옥수수 잎집 단백질 추출물(PBS/0.05%(v/v) 트윈 20 중에 희석된 100 ㎕/웰)을 상기 플레이트에 가한 후 상기 플레이트를 25℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 PBS/0.05%(v/v) 트윈 20으로 2분 동안 4회 세척한 후, PBS 중의 100 ㎕/웰의 이차 항체(75 ng/웰의 바이오틴-표지된 NaD1 항체)를 가하였다. 상기 바이오틴-표지된 항체는 EZ-링크 설포-NHS-LC-바이오티닐화 키트(피어스(Pierce))를 사용하여 제조하였고, 2 ㎖의 단백질 A-정제된 항체 및 2 mg의 바이오틴 시약을 사용하였다. 플레이트를 25℃에서 1시간 동안 항온처리한 후 PBS/0.05%(v/v) 트윈 20으로 2분 동안 4회 세척하였고, PBS 중의 100 ㎕/웰의 뉴트리아비딘(NeutriAvidin) HRP-접합체(피어스 #31001; 1:1000 희석; 0.1 ㎕/웰)를 가하였다. 상기 플레이트를 25℃에서 1시간 동안 항온처리하고, 이어서 PBS/0.05%(v/v) 트윈 20으로 2분 동안 2회 세척한 후, H2O로 2분 동안 2회 세척하였다. 1개의 이뮤노퓨어(ImmunoPure) OPD 정제(피어스 #34006)를 9 ㎖ H2O에 용해시킨 후 1 ㎖의 안정한 과산화물 완충제(10X, 피어스 #34062)를 첨가함으로써 사용 직전에 기질을 제조하였다. 상기 기질을 100 ㎕/웰의 농도로 가하였고, 발색될 때까지 플레이트를 25℃에서 항온처리하였다. 50 ㎕의 2.5 M 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 490 nm에서의 흡광도를 플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 내에서 측정하였다.
면역블롯 분석
온실에서 생장된 식물로부터 잎집을 절개하였다. 잎집 조직(50 mg)을 액체 질소에서 동결시키고 주파수 30 s-1에서 2 x 15초 동안 혼합 분쇄기(렛슈 MM300) 내에서 미세한 분말로 분쇄하였다. 2%(w/v) 불용성 PVPP(폴리클라)/PBS/0.05%(v/v) 트윈 20(75 ㎕)을 첨가하고 볼텍싱하여 샘플을 추출하였다. 그 다음, 샘플을 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고 상청액을 보유하였다. 상기 상청액(21 ㎕)에 노벡스(Novex) NuPAGE 4X LDS 샘플 완충제(7.5 ㎕) 및 β-머캡토에탄올(1.5 ㎕)을 첨가하고 70℃에서 10분 동안 가열하였다.
추출된 잎집 단백질을 노벡스 엑스셀 II 미니-세포 전기영동 장치 내의 미리 형성된 4% 내지 12%(w/v) 폴리아크릴아미드 구배 겔(노벡스, NuPAGE 비스-트리스, MES 완충제) 상에서 200 V에서 35분 동안 SDS-PAGE로 분리하였다. 미리 염색된 분자량 마커(노벡스 시블루 플러스(SeeBlue Plus) 2)가 표준물로서 포함되었다. 10%(v/v) 메탄올을 갖는 NuPAGE 전달 완충제에서 노벡스 엑스셀 II 미니-세포 전기영동 장치를 이용하여 30 V에서 60분 동안 단백질을 니트로셀룰로스 막(오스모닉스(Osmonics) 0.22 마이크론 니트로바인드(NitroBind))으로 옮겼다. 전달 후, 막을 이소프로판올에서 1분 동안 항온처리한 후 TBS로 5분 동안 세척하였다.
상기 막을 실온에서 3%(w/v) BSA로 1시간 동안 차단한 후 실온에서 일차 항체(1 mg/㎖ 저장액이 TBS/1%(w/v) BSA에 1:1000으로 희석된 성숙 NaD1 또는 HvCPI6 항체)와 함께 하룻밤 동안 항온처리하였다. 상기 막을 TBST로 10분 동안 5회 세척한 후 호스라디쉬 퍼록시다제와 접합된 염소 항-토끼 IgG(피어스, TBS 중의 1:50,000 희석물)와 함께 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. 10분 동안의 TBST 세척을 추가 5회 수행한 후, 상기 막을 제조자의 지시에 따라 수퍼시그날 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 화학발광 기질(피어스)과 함께 항온처리하였다. 막을 ECL 하이퍼필름(아머샴)에 노출시켰다.
[표 4]
Figure 112013078531563-pct00008
실시예 1
클래스 I 데펜신의 항진균 활성
3종의 클래스 I 데펜신들을 그들의 천연 공급원으로부터 정제하였거나(NaD2) 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템을 사용하여 발현시켰다(γ-제아티오닌2, γ-호르도티오닌). 상기 펩티드들의 항진균 활성을 본질적으로 문헌(Broekaert et al. (1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-60, 1990)에 기재된 바와 같이 푸사리움 그라미네아룸에 대해 평가하고 2종의 가지과 클래스 II 데펜신(NaD1 및 NsD1)의 항진균 활성과 비교하였다. 멸균 모슬린을 통한 여과를 이용하여 절반 강도 감자 덱스트로스 브로쓰(PDB)에서 생장하는 포자형성 배양물로부터 포자를 단리하였다. 혈구계를 이용하여 포자 농도를 측정하고 ½ x PDB 중의 5 x 104개 포자/㎖로 조절하였다. 20 ㎕의 필터-멸균된(0.22 ㎛ 주사기 필터; 밀리포어(Millipore)) 단백질 또는 물과 함께 포자 현탁액(80 ㎕)을 멸균 96웰 평저 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하여 0 μM 내지 10 μM의 최종 단백질 농도를 제공하였다. 상기 플레이트를 짧게 진탕하고, 25℃에서 진탕하지 않으면서 암실 내에 28시간 동안 넣어 두었다. 마이크로타이터 플레이트 판독기(스펙트라맥스 프로(SpectraMax Pro) M5e; 몰레큘라 디바이시스)를 이용하여 595 nm에서 광학 밀도를 측정하여 균사 생장을 평가하였다. 각각의 시험을 삼중으로 수행하였다. 결과(도 7)는 시험된 클래스 I 데펜신이 낮은 항진균 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다.
실시예 2
클래스 II 가지과 데펜신 상의 NaD1 루프 1B 영역에 대한 변경
본 실시예의 제1 양태는 클래스 II 가지과 데펜신의 선택이다. 데펜신을 스크리닝하여, 서열번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 최적 정렬 후 이에 대해 70% 이상의 유사성을 갖는 C-말단 부분을 갖는 데펜신을 확인한다(표 4). 도 3은 정렬의 종류를 보여준다. 서열번호 50은 가장 C-말단에 있는 불변 시스테인 잔기를 포함하는 말단 20개의 인접 아미노산을 나타낸다. NaD1, NsD1, PhD2, NeThio1 및 NeThio2는 서열번호 52에 대해 100%의 유사성을 갖는 데펜신의 예이다.
NaD1은 클래스 II 가지과 데펜신 골격으로서 선택된다. 이 데펜신은 아미노산 서열 NTFPGI(서열번호 12)을 갖는 루프 1B를 포함한다.
아미노산 잔기 NTFPGI 중 하나 이상을 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킨다. 모든 6개의 잔기를 변경시킬 수 있거나, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기를 변경시킬 수 있다. 이것은 단일 아미노산 치환 또는 루프 1B 교환을 포함한다. 변경의 예로는 (가로 내의 공급원과 함께) 하기 서열들이 있다: HRFKGP(NaD2)[서열번호 29]; QHHSFP(Zea2)[서열번호 30]; DTYRGV(PsD1)[서열번호 31]; PTWEGI(PsD2)[서열번호 32]; DKYRGP(MsDeF1)[서열번호 33]; KTFKGI(SoD2)[서열번호 34]; KTWSGN(DmAMP1)[서열번호 35]; EGWXGK(VrD1)[서열번호 36]; GTWSGV(RsAFP2)[서열번호 37]; 및 AGFKGP(g1-H)[서열번호 38].
다른 예로는 서열번호 67 내지 79로부터 선택된 아미노산 서열의 선택이 있다.
실시예 3
NaD1의 루프 변이체의 존재 하에서 푸사리움 그라미네아룸의 생장의 억제
재조합 NaD1 및 루프 변이체 HXP4, HXP34 및 HXP35를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 푸사리움 그라미네아룸에 대한 상기 펩티드들의 항진균 활성을 본질적으로 문헌(Broekaert et al. (1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-60)에 기재된 바와 같이 평가하였다. 멸균 모슬린을 통한 여과를 이용하여 절반 강도 감자 덱스트로스 브로쓰(PDB)에서 생장하는 포자형성 배양물로부터 포자를 단리하였다. 혈구계를 이용하여 포자 농도를 측정하고 ½ x PDB 중의 5 x 104개 포자/㎖로 조절하였다. 20 ㎕의 필터-멸균된(0.22 ㎛ 주사기 필터; 밀리포어) 단백질 또는 물과 함께 포자 현탁액(80 ㎕)을 멸균 96웰 평저 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하여 0 μM 내지 10 μM의 최종 단백질 농도를 제공하였다. 상기 플레이트를 짧게 진탕하고, 25℃에서 진탕하지 않으면서 암실 내에 28시간 동안 넣어 두었다. 마이크로타이터 플레이트 판독기(스펙트라맥스 프로 M5e; 몰레큘라 디바이시스)를 이용하여 595 nm에서 광학 밀도를 측정하여 균사 생장을 평가하였다. 각각의 시험을 삼중으로 수행하였다.
결과
도 8은 푸사리움 그라미네아룸(Fgr)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체 HXP4, HXP34 및 HXP35의 상대적 항진균 활성을 보여준다. 0.825 ppm에서, HXP4, HXP34 및 HXP35는 NaD1보다 각각 41.7%, 14.6% 또는 34.5% 더 많이 푸사리움 그라미네아룸의 생장을 억제하였다. 1.65 ppm에서, 모든 3개의 루프 변이체들은 NaD1보다 약 70% 더 많이 푸사리움 그라미네아룸의 생장을 억제하였다.
실시예 4
NaD1의 루프 변이체의 존재 하에서 푸사리움 버티실로이데스의 생장의 억제
재조합 NaD1 및 루프 변이체 HXP4, HXP34 및 HXP35를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 푸사리움 버티실로이데스에 대한 상기 펩티드들의 항진균 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가하였다.
결과
도 9는 푸사리움 버티실로이데스(Fve)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체 HXP4, HXP34 및 HXP35의 상대적 항진균 활성을 보여준다. 3.25 ppm에서, HXP4, HXP34 및 HXP35는 NaD1보다 각각 40.9%, 29.4% 또는 5.1% 더 많이 푸사리움 버티실로이데스의 생장을 억제하였다. 6.5 ppm에서, 모든 3개의 루프 변이체들은 NaD1보다 67% 이상 더 많이 푸사리움 버티실로이데스의 생장을 억제하였다.
실시예 5
NaD1 의 루프 변이체의 존재 하에서 콜레토트리쿰 그라미니콜라의 생장의 억제
재조합 NaD1 및 루프 변이체 HXP4, HXP34 및 HXP35를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 콜레토트리쿰 그라미니콜라에 대한 상기 펩티드들의 항진균 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가하였다.
결과
도 10은 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Cgr)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체 HXP4, HXP34 및 HXP35의 상대적 항진균 활성을 보여준다. 13 ppm에서, HXP4, HXP34 및 HXP35는 NaD1보다 각각 61.3%, 21.8% 또는 83.2% 더 많이 콜레토트리쿰 그라미니콜라의 생장을 억제하였다.
실시예 6
형질전환 식물의 생산
HXP4를 발현하는 형질전환 캐놀라(브라스시카 나퍼스, cv RI64)를 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환으로 생산하였다. 이 형질전환을 위해 사용된 DNA 이원 벡터는 도 11에 기재되어 있다. 상기 이원 벡터를 전기천공으로 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 전달하였고, 플라스미드의 존재를 겔 전기영동으로 확인하였다. 아그로박테리움의 배양물을 사용하여 캐놀라의 배축 부분을 감염시켰다. 형질전환 싹을 25 mg/ℓ의 항생제 가나마이신 상에서 선택하였다. ELISA를 이용하여 잎으로부터 추출된 가용성 단백질을 검출하여 HXP4를 발현하는 형질전환 식물을 선택하였다.
3개의 형질전환 실험들(CAT93, CAT94 및 CAT96)로부터 7개의 식물(6회 사건)이 검출가능한 수준의 HXP4를 가졌다(표 5). HXP4 단백질의 수준은 0.3 ppm 내지 2.1 ppm이었다(ng HXP4/mg 잎 조직의 생중량).
[표 5]
Figure 112013078531563-pct00009
렙토스패리아 마쿨란스를 사용한 온실 바이오어세이
병원체 렙토스패리아 마쿨란스를 실온에서 10%(v/v) V8 한천 플레이트 상에서 1주 내지 2주 동안 생장시킨다. 상기 플레이트를 멸균된 물(5 ㎖)로 덮고 한천의 표면을 긁어내어 포자를 탈착시킴으로써 분포자(Pycnidiospore)를 단리한다. 멸균 티슈를 통한 여과를 이용하여 균사체로부터 포자를 분리한다. 혈구계를 이용하여 여과액 중의 포자의 농도를 측정하고, 물을 사용하여 최종 농도를 1 x 106개 내지 1 x 107개/㎖의 분포자로 조절한다.
22℃에서 온실 내의 작은 식재 트레이에서 묘목을 생장시킨다. 파종 후 대략 10일째 날, 각각의 묘목의 2개 자엽을 26 게이지 바늘로 2회(2개의 엽 각각에서 각각 1회) 천공하고, 상처난 영역을 포자의 소적(5 ㎕)으로 접종한다. 대조군을 물로 접종한다. 식물을 고습 조건 하에서 3일 동안 유지하여 포자 발아를 용이하게 한다.
질환 증상을 접종 후 20일까지 평가한다. 디지털 영상의 컴퓨터 소프트웨어 분석(이미지제이(ImageJ))을 이용하여 병소 크기를 ㎟ 단위로 정량한다. 비-모수 방법을 이용하여 평균 평소 크기를 통계적으로 분석한다.
실시예 7
HXP4 를 발현하는 형질전환 옥수수 식물의 생산
표준 프로토콜, 예컨대, 미국 특허 제5,981,840호, 미국 특허 제7,528,293호, 미국 특허 제7,589,176호, 미국 특허 제7,785,828호 및 문헌(Frame et al. (2002) Plant Physiology 129:13-22)에 기재된 표준 프로토콜을 이용하여 아그로박테리움-매개된 형질전환 또는 입자 충격(bombardment)으로 형질전환 옥수수 식물을 생산한다. 선택 마커로서 GAT, 항시성 발현을 위한 유비퀴틴 프로모터 및 항시성 유비퀴틴 프로모터의 조절 하에서 HXP4 또는 NaD1을 코딩하는 코돈 최적화된 서열뿐만 아니라 선택 마커로서 GAT를 코딩하는 서열을 함유하는 이원 벡터를 전기천공으로 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 내로 전달하였다. 미성숙 옥수수 배아를 아그로박테리움의 현탁액에 함침시킨 후 고체 배지 상에서 일정 기간 동안 공-배양(co-culture)함으로써 감염시켰다. 그 다음, 상기 배아가 아그로박테리움의 생장을 억제하는 하나 이상의 항생제의 존재 하에서 항온처리되는 시간 동안 상기 배아를 임의적으로 "휴식 상태"에 있게 하였다. 다음으로, 비-형질전환된 세포의 생장을 억제하는 글리포스페이트를 함유하는 고체 배지 상에서 감염된 배아를 배양시킴으로써 형질전환된 가피를 수득하였다. 그 다음, 표준 방법을 이용하여 형질전환된 가피를 식물로 재생시킬 수 있었다.
PCR 양성 식물에서 HXP4 및 NaD1 발현의 수준을 예를 들면, ELISA 스크리닝으로 측정하였다. 방법 단락에 기재된 바이오어세이를 이용하여, 10 ppm 초과의 HXP4 또는 NaD1을 발현하는 식물을 콜레토트리쿰 그라미니콜라에 대한 증가한 내성에 대해 평가하였다.
결과
10 ppm 초과의 HXP4를 발현하는 식물은 빈 벡터로 형질전환된 식물과 비교되었을 때 병소 면적의 26% 감소를 보였다. 10 ppm 초과의 NaD1을 발현하는 식물은 빈 벡터 대조군에 비해 병소 면적의 감소를 전혀 보이지 않았다(표 8).
실시예 8
HXP4를 발현하는 형질전환 대두 식물의 생산
HXP4를 발현하는 형질전환 대두 식물을 아그로박테리움-매개된 형질전환, 입자 충격 또는 다른 표준 프로토콜, 예컨대, 미국 특허 제7,589,176호, 미국 특허 제7,528,293호 및 미국 특허 제7,785,828호에 기재된 표준 프로토콜로 생산한다.
HXP4에 대한 PCR 양성을 나타내는 재생된 대두 식물을 예를 들면, ELISA 스크리닝으로 HXP4 발현 수준에 대해 평가한다. 생식능력이 있는 형질전환 식물을 유전자 카피 수에 대해 평가할 수 있고, 선택된 계통을 온실 바이오어세이에서 대두 진균 병원체에 대한 저항성에 대해 시험한다.
그 다음, 대두 진균 및 녹균 병원체, 및 곤충 병원체에 대한 증가한 내성을 나타내는 계통을 감염된 토양에서의 포장 시험, 또는 대두 식물이 인공적으로 표적 진균, 곤충 또는 녹균 병원체로 감염되는 시험에서 평가한다.
실시예 9
HXP4를 발현하는 형질전환 밀의 생산
HXP4를 발현하는 형질전환 밀 식물을 아그로박테리움-매개된 형질전환, 입자 충격 또는 다른 표준 프로토콜, 예컨대, 미국 특허 제7,785,828호에 기재된 표준 프로토콜로 생산한다. HXP4에 대한 PCR 양성을 나타내는 재생된 밀 식물을 예를 들면, ELISA 스크리닝으로 HXP4 발현 수준에 대해 평가한다. 생식능력이 있는 형질전환 식물을 유전자 카피 수에 대해 평가할 수 있고, 선택된 계통을 온실 바이오어세이에서 밀 진균 병원체에 대한 저항성에 대해 시험한다.
그 다음, 밀 진균 병원체에 대한 증가한 내성을 나타내는 계통을 감염된 토양에서의 포장 시험, 또는 밀 식물이 인공적으로 표적 진균 병원체로 감염되는 시험에서 평가한다.
실시예 10
인간 진균 병원체 아스퍼길러스 니게르에 대한 변경된 NaD1의 활성
재조합 NaD1 및 루프 변이체 HXP4를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 아스퍼길러스 니게르에 대한 상기 펩티드들의 항진균 활성을 전술된 바와 같이 평가하였다.
결과
도 12는 아스퍼길러스 니게르에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체 HXP4의 상대적 항진균 활성을 보여준다. 13 ppm에서, HXP4는 NaD1보다 20.6% 더 많이 아스퍼길러스 니게르의 생장을 억제하였다. 이것은 NaD1의 활성의 112% 초과의 활성을 갖는 HXP4로서 표현될 수 있다. 26 ppm 및 53 ppm에서, HXP4는 NaD1보다 10% 이상 더 많이 생장을 억제하였다.
실시예 11
크립토코커스 종에 대한 변경된 NaD1의 활성
재조합 NaD1 및 루프 변이체 HXP4를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 크립토코커스 네오포르만스의 2개 균주 및 크립토코커스 가티이의 1개 균주에 대한 상기 펩티드들의 항진균 활성을 전술된 바와 같이 평가하였다.
결과
도 13a는 크립토코커스 네오포르만스(C1065)에 대해 NaD1과 비교된 루프 변이체 HXP4의 상대적 항진균 활성을 보여준다. 13 ppm에서, HXP4는 상기 효모의 생장을 완전히 억제한 반면, NaD1은 단지 약 16.7%를 억제하였다. 따라서, HXP4는 NaD1의 활성의 596% 초과의 활성을 가졌다. 상기 단백질들 중 어느 것도 6.5 ppm에서 유의한 활성을 보이지 않았다. 도 13b는 크립토코커스 네오포르만스의 제2 균주(C2067)에 대한 NaD1 및 HXP4의 상대적 항진균 활성을 보여준다. 6.5 ppm에서, HXP4는 80% 초과의 수준으로 생장을 억제한 반면, NaD1은 단지 4% 미만의 수준으로 생장을 억제하였다. 크립토코커스 가티이에 대해(도 13c), HXP4는 13 ppm에서 NaD1보다 10% 더 많이 생장을 억제하였고 6.5 ppm에서 NaD1보다 38% 더 많이 생장을 억제하였다.
실시예 12
골격으로서의 클래스 II 가지과 데펜신 TPP3의 루프 1B 영역에 대한 변경
TPP3(서열번호 5)을 클래스 II 가지과 데펜신 골격으로서 선택한다. 이 데펜신은 아미노산 서열 QTFPGL(서열번호 15)을 갖는 루프 1B를 포함한다. 루프 1B 서열을 NaD2(HRFKGP)[서열번호 29]의 서열로 변경한다. 키메라 단백질(HXP107)을 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제한다. 푸사리움 그라미네아룸에 대한 상기 펩티드의 항진균 활성 및 항곤충 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가한다. HXP107의 아미노산 서열은 서열번호 85에 기재되어 있다.
결과
HXP107 단백질은 0.5 μM의 IC50으로 푸사리움 그라미네아룸(Fgr)에 대한 항진균 활성을 보유한다. 이것은 0.2 μM의 IC50을 갖는 모 단백질 TPP3의 활성과 유리하게 비교된다.
실시예 13
클래스 II 가지과 데펜신 NsD1, C20 및 SL549의 루프 1B 영역에 대한 변경
NsD1(서열번호 49), C20(캡시쿰으로부터 단리됨)(서열번호 58) 및 SL549(니코티아나로부터 단리됨)(서열번호 59)를 클래스 II 가지과 데펜신 골격으로서 선택한다. 이들 데펜신들은 각각 아미노산 서열 NTFPGI(서열번호 12), KYFKGL(서열번호 60) 및 NTFPGI(서열번호 12)를 갖는 루프 1B를 포함한다. 루프 1B 내의 아미노산 잔기들 중 하나 이상을 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킨다. 모든 6개의 잔기를 변경시킬 수 있거나, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기를 변경시킬 수 있다. 이것은 단일 아미노산 치환 또는 루프 1B 교환을 포함한다. 변경의 예로는 (가로 내의 공급원과 함께) 하기 서열들이 있다: HRFKGP(NaD2)[서열번호 29]; QHHSFP(Zea2)[서열번호 30]; DTYRGV(PsD1)[서열번호 31]; PTWEGI(PsD2)[서열번호 32]; DKYRGP(MsDeF1)[서열번호 33]; KTFKGI(SoD2)[서열번호 34]; KTWSGN(DmAMP1)[서열번호 35]; EGWXGK(VrD1)[서열번호 36]; GTWSGV(RsAFP2)[서열번호 37]; 및 AGFKGP(g1-H)[서열번호 38].
또 다른 실시양태에서, 루프 1B를 서열 번호 67 내지 79로부터 선택된 서열로 치환시킨다.
재조합 루프 변이체를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제한다. 진균 병원체, 예컨대, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 옥시스포룸, 콜레토트리쿰 그라미니콜라 및 푸사리움 버티실로이데스에 대한 상기 펩티드들의 항진균 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가한다.
실시예 14
푸사리움 그라미네아룸 및 콜레토트리쿰 그라미니콜라에 대한 HXP4와 단백질분해효소 억제제의 상승작용
보리 I형 억제제 CI-1B(서열번호 63), 니코티아나 알라타 I형 억제제 NaPin1A, 토마토 시스타틴 SlCys9(서열번호 64), 벼 시스타틴 Os1a(서열번호 65) 및 보리 시스타틴 HvCPI6(서열번호 66)의 성숙 도메인을 코딩하는 DNA를 진스크립트(Genscript)로부터 입수하였다. SacII 및 SacI을 사용하여 pUC57 벡터로부터 삽입물을 절개하고 퍼펙트프렙(Perfectprep) 키트(에펜도르프(Eppendorf))를 이용하여 아가로스 겔로부터 추출하고 pHUE 내로 라이게이션시킨 후, TOP10 이. 콜라이 세포를 형질전환시키는 데에 사용하였다. 그 다음, 플라스미드 DNA를 단리한 후 이. 콜라이 로세타-가미(Rosetta-Gami) B 세포를 형질전환시키는 데에 사용하였다.
이. 콜라이 로세타-가미 B의 단일 콜로니를 사용하여, 앰피실린(0.1 mg/㎖), 클로람페니콜(0.34 mg/㎖), 테트라사이클린(0.1 mg/㎖) 및 가나마이신(0.05 mg/㎖)을 함유하는 2YT 배지(10 ㎖, 16 g/ℓ 트립톤, 10 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl)를 접종하고 37℃에서 진탕하면서 하룻밤 동안 생장시켰다. 이 배양물을 사용하여, 앰피실린(0.1 mg/㎖), 클로람페니콜(0.34 mg/㎖), 테트라사이클린(0.1 mg/㎖) 및 가나마이신(0.05 mg/㎖)을 함유하는 2YT 배지(500 ㎖)를 접종한 후 약 1.0의 광학 밀도(600 nm)까지 4시간 동안 생장시켰다. 그 다음, IPTG를 첨가하였고(0.5 mM 최종 농도), 배양물을 16℃에서 추가 16시간 동안 생장시켰다. 세포를 원심분리(4℃에서 20분 동안 4,000 g)로 수거하고 천연 용해 완충제(세포 배양물 ℓ 당 20 ㎖, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0)에 재현탁하고 -80℃에서 동결시켰다. 그 다음, 세포를 해동시키고 4℃에서 20분 동안 라이소자임(25 ㎖의 재현탁된 세포 당 5 mg)으로 처리하였다. 그 다음, DNase I(125 ㎕, 20%(v/v) 글리세롤 중의 2 mg/㎖, 75 mM NaCl) 및 MgCl2(125 ㎕, 1 M)을 첨가하였고, 샘플을 진동 플랫폼(rocking platform) 상에서 40분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음, 상기 샘플을 얼음 상에서 30초 동안 2회 초음파처리하고(80%(w/v) 전력, 브랜슨(Branson) 초음파처리기 450) 원심분리하였다(4℃에서 30분 동안 20,000 g). 그 다음, 제조자의 지시에 따라 Ni-NTA 수지(1.5 ㎖ 내지 약 25 ㎖ 천연 단백질 추출물, 퀴아젠)를 사용하는 천연 조건 하에서 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 이용하여 단백질 추출물로부터 헥사히스티딘-태깅된(tagged) 유비퀴틴 융합 단백질(His6-Ub-NaCys1,2,3)을 정제하였다. 용출 완충제(250 mM 이미다졸, 200 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)를 사용하여 재조합 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질을 50 mM 트리스.Cl(100 mM NaCl, pH 8.0)로 평형화된 미리 팩킹된 세파덱스 G50 겔 여과 컬럼(PD-10, 아머샴(Amersham))에 가하여 이미다졸을 제거하였다.
탈유비퀴틸화 효소 6H.Usp2-cc(Catanzariti et al. (2004), Protein Science 13:1331-1339)를 사용하여 재조합 단백질로부터 헥사히스티딘-태깅된 유비퀴틴을 절단하였다. 탈유비퀴틸화된 단백질분해효소 억제제를 비-결합된 단백질로서 사용하여 IMAC를 또 한 차례 수행함으로써 절단된 태그를 제거하였다. 그 후, 이것을 역상 HPLC로 더 정제하였다.
재조합 CI-1B, SlCys9 및 Os1a를 H2O 중의 저장 용액(20 μM)으로서 제조하였다. 소 췌장으로부터의 트립신 억제제 I-P형(Anderson and Kingston (1983), Proc. Natl. Acad. USA 80:6838-6842)을 시그마(TO256)로부터 구입하여 H2O 중의 20 μM의 농도로 희석하였다.
세린 또는 시스테인 단백질분해효소 억제제와 함께 HXP4 및 NaD1이 푸사리움 그라미네아룸 또는 콜레토트리쿰 그라미니콜라의 생장에 대해 나타내는 억제 효과를 본질적으로 상기 문헌(Broekaert et al.)에 기재된 바와 같이 측정하였다. 합성 영양분 부족 한천(SNPB, 푸사리움 그라미네아룸) 또는 V8 한천(콜레토트리쿰 그라미니콜라) 상에서 생장하는 포자형성 배양물로부터 포자를 단리하고 혈구계를 이용하여 카운팅하였다.
항진균 어세이를 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 96웰 마이크로타이터 트레이에서 수행하였다. 웰을 10 ㎕의 필터-멸균된(0.22 ㎛ 주사기 필터, 밀리포어) 단배질분해효소 억제제 또는 물 및 80 ㎕의 ½ 강도 PDB 중의 5 x 104개 포자/㎖과 함께 10 ㎕의 필터-멸균된(0.22 ㎛ 주사기 필터, 밀리포어) NaD1(2.5 μM), HXP4(2.5 μM) 또는 물로 적재하였다. 상기 플레이트를 25℃에서 항온처리하였다. 마이크로타이터 플레이트 판독기(스펙트라맥스 프로 M2; 몰레큘라 디바이시스)를 이용하여 595 nm(A595)에서 광학 밀도를 측정함으로써 진균 생장을 분석하였다. 각각의 시험을 사중으로 수행하였다.
결과
동일한 농도에서 시험하였을 때, HXP4는 푸사리움 그라미네아룸에 대해 NaD1보다 더 높은 단백질분해효소 억제제와의 상승작용적 효과를 나타내었다. 또한, HXP4는 콜레토트리쿰 그라미니콜라에 대해서도 단백질분해효소 억제제와의 상승작용적 효과를 나타내었다. 상승작용 계산은 표 6 및 7에 제시되어 있고, 이때 Ee는 림펠(Limpel)의 식(Richer et al. Pestic Sci 19:309-315)에 따라 부가 반응으로부터 예측된 효과(% 억제로서 표현됨)이고, Io는 관찰된 % 억제이다. 상승작용, 즉 Ee 값보다 더 높은 Io 값은 모든 4종의 단백질분해효소 억제제를 사용한 경우에서 수득되었다.
실시예 15
푸사리움 그라미네아룸에 대한 HXP4와 HvCP16의 식물내 상승작용
HXP4, HvCPI6 또는 HXP4 + HvCPI6을 발현하는 형질전환 옥수수 식물을 실시예 7에 기재된 방법을 이용하여 생성하고 방법 단락에 기재된 바이오어세이를 이용하여 푸사리움 그라미네아룸에 대한 증가한 내성에 대해 평가한다.
도 15는 옥수수에서의 발현을 위한 HvCPI6 구축물을 제공하고, 도 16은 옥수수에서의 발현을 위한 HXP4+HvCP16 구축물을 제공한다.
결과
HXP4만을 발현하거나 HvCPI6만을 발현하는 식물은 빈 벡터로 형질전환된 식물에 비해 병소 면적의 감소를 보이지 않는다. HXP4 + HvCPI6을 발현하는 식물은 빈 벡터 대조군에 비해 병소 면적의 45% 감소를 보인다(표 9).
실시예 16
아시아 대두 녹균에 대한 HXP4 의 효과
니코티아나 알라타의 꽃으로부터 NaD1을 단리하였고, 루프 변이체 HXP4를 방법 단락에 기재된 바와 같이 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 발현시키고 정제하였다. 아시아 대두 녹균(파콥소라 파키리지)에 대한 HXP4의 효과를 시험하고 NaD1과 비교하였다. 물 중의 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm 및 0.1 ppm의 펩티드의 존재 또는 부재 하에서 한천 소적 상에 놓여 있는 셀로판 상에서 파콥소라 파키리지 여름포자를 생장시켰다. 발아, 부착기 형성, 및 후-부착기 구조체의 형성을 24시간 및 48시간에서 현미경관찰을 이용하여 평가하였다. 처리 당 3개의 막을 조사하였고, 막 당 50개의 단리된 발아체를 평가하였다.
결과
발아(24시간; 도 14a), 부착기 형성(24시간; 도 14b) 및 후-부착기 구조체의 형성(48시간; 도 14c)에 대한 효과를 모두 조사하였다. 10 ppm에서, HXP4는 NaD1보다 62% 더 효과적으로 발아를 억제한 반면, 부착기 형성 및 후-부착기 구조체의 형성은 NaD1보다 각각 65% 및 59% 더 많이 억제되었다.
실시예 17
신규 루프 1B 서열을 확인하기 위한 고속대량 스크리닝
푸젼(등록상표) 부위-지정된 돌연변이유발 키트(핀자임스)를 이용하여 NaD1의 부위-지정된 돌연변이유발을 수행하였다. 5' 말단에서 인산화된 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 루프 1B의 무작위 6개 아미노산 돌연변이를 도입하도록 디자인하였다.
루프 1B 변이체의 라이브러리의 발현을 위해 pHUE 시스템을 이용하였다. 48웰 플레이트에서 발현시키고 96웰 필터 플레이트에서 정제할 수 있도록 발현 및 정제를 실시예 14에 기재된 방법으로부터 약간 변경하였다. 66℃의 어닐링 온도 및 30초의 어닐링 시간을 이용하여 35 주기의 PCR 반응에서 전체 주형 플라스미드(pHUE-NaD1)를 증폭하였다. 그 다음, 16℃에서 T4 DNA 연결효소를 하룻밤 동안 사용하여 선형 PCR 생성물을 환형화하고 제조자의 지시에 따라 전기형질전환능 로세타-가미 B(DE3) 세포 내로 형질전환시켰다. 회수된 세포를, 앰피실린(0.1 mg/㎖), 클로람페니콜(0.34 mg/㎖), 테트라사이클린(0.1 mg/㎖) 및 가나마이신(0.015 mg/㎖)을 함유하는 2YT 한천 상에 플레이팅하고 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다.
단일 콜로니를 사용하여, 96웰 플레이트 내에서 앰피실린(0.1 mg/㎖), 클로람페니콜(0.34 mg/㎖), 테트라사이클린(0.1 mg/㎖) 및 가나마이신(0.015 mg/㎖)을 함유하는 150 ㎕의 2YT를 접종하였다. pHUE-NaD1로 형질전환된 로세타-가미 B(DE3)를 양성 대조군으로서 포함시켰다. 플레이트를 70% 습도에서 일정하게 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 50 ㎕의 각각의 웰 샘플을 2.5 ㎖의 2YT 항생제로 옮겼고, 발현 및 정제를 실시예 13에 기재된 바와 같이 수행하였다.
콜레토트리쿰 그라미니콜라에 대한 활성에 대해 단백질을 시험하였다. 15 ㎕의 단백질 용액을 105 ㎕의 포자 용액에 첨가하여, 0.5 mM CaCl2 및 25 mM KCl을 함유하는 ½ x 감자 덱스트로스 브로쓰 중의 2 x 104개 포자/㎖의 최종 농도를 제공하였다. 플레이트를 25℃에서 항온처리하였고, 마이크로타이터 플레이트 판독기(스펙트라맥스 프로 M5e; 몰레큘라 디바이시스)를 이용하여 595 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 40시간 후 진균 생장을 분석하였다. 발현을 위해 사용된 세균 콜로니의 플라스미드 DNA를 서열분석함으로써 NaD1 대조군과 동등하게 또는 NaD1 대조군보다 더 많이 진균 생장을 억제한 단백질을 확인하였다. 스크린에서 확인된 단일 콜로니는 NaD1의 루프 1B 서열과 동일한 루프 1B 서열을 갖는 것으로 발견되었다. 대규모 정제 및 시험을 위해 여러 개의 콜로니를 선택하였다. 단백질을 실시예 14에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 푸사리움 그라미니콜라 및 콜레토트리쿰 그라미니콜라에 대한 활성에 대해 시험하였다. 루프 1B 서열 식별기호는 표 10에 나열되어 있다.
[표 6]
Figure 112013078531563-pct00010
[표 7]
Figure 112013078531563-pct00011
[표 8]
Figure 112013078531563-pct00012
[표 9]
Figure 112013078531563-pct00013
[표 10]
Figure 112013078531563-pct00014
당업자는 본원에 기재된 개시내용이 구체적으로 기재된 변경 및 변형 이외의 변경 및 변형을 받을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 개시내용이 모든 이러한 변경 및 변형을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 본 개시내용은 본 명세서에서 개별적으로 또는 총체적으로 언급되거나 표시된 모든 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들, 및 이들 단계들 또는 특징들 중 임의의 둘 이상의 임의의 모든 조합도 포함한다.
참고문헌
Figure 112013078531563-pct00015
Figure 112013078531563-pct00016
SEQUENCE LISTING <110> HEXIMA LIMITED VAN DER WEERDEN, Nicole Louise (US ONLY) ANDERSON, Marilyn Anne (US ONLY) <120> ANTI-PATHOGENIC AGENTS <130> 35104419/EJH <150> US 61/440,309 <151> 2011-02-07 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Generic amino acid sequence of Loop 1B region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X1 = G, D, H, K, A, E, Q, T, P, L, M, S or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X2 = K, R, G, H, L, N, F, I, S, T or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X3 = W, Y, H, L, G, F or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X4 = K, S, R, H, T, E, V, N, Q, D, G or X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X5 = S, K, Y, F, G or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X6 = P, V, L, T, A, F, N, K, R, M, G, H, I or Y <400> 1 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 1 5 <210> 2 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of NaD1 (Nicotiana alata) containing Loop 1B <400> 2 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 3 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of PhD1 (Petunia hybrida) containing Loop 1B <400> 3 Ala Thr Cys Lys Ala Glu Cys Pro Thr Trp Asp Ser Val Cys Ile Asn 1 5 10 15 Lys Lys Pro Cys Val Ala Cys Cys Lys Lys Ala Lys Phe Ser Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Glu Cys 35 40 45 <210> 4 <211> 49 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of PhD2 (Petunia hybrida) containing Loop 1B <400> 4 Gly Thr Cys Lys Ala Glu Cys Pro Thr Trp Glu Gly Ile Cys Ile Asn 1 5 10 15 Lys Ala Pro Cys Val Lys Cys Cys Lys Ala Gln Pro Glu Lys Phe Thr 20 25 30 Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro 35 40 45 Cys <210> 5 <211> 48 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of TPP3 (Solanum lycopersicum) containing Loop 1B <400> 5 Gln Gln Ile Cys Lys Ala Pro Ser Gln Thr Phe Pro Gly Leu Cys Phe 1 5 10 15 Met Asp Ser Ser Cys Arg Lys Tyr Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Gly 20 25 30 Gly His Cys Ser Lys Leu Gln Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 6 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of FST (Nicotiana tabacum) containing Loop 1B <400> 6 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Leu Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 7 <211> 45 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of g-thionin (Nicotiana excelsior) containing Loop B1 [NeThio1] <400> 7 Arg Glu Cys Ala Arg Glu Ile Phe Thr Gly Leu Cys Ile Thr Asn Pro 1 5 10 15 Gln Cys Arg Lys Ala Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys 20 25 30 Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 8 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of g-thionin (Nicotiana excelsior) containing Loop 1B [NeThio2] <400> 8 Lys Asp Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 9 <211> 48 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of g-thionin (Nicotiana attenuata) containing Loop 1B [Na-gth] <400> 9 Lys Ser Thr Cys Lys Ala Glu Ser Asn Thr Phe Glu Gly Phe Cys Val 1 5 10 15 Thr Lys Pro Pro Cys Arg Arg Ala Cys Leu Lys Glu Lys Phe Thr Asp 20 25 30 Gly Lys Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Ile Cys Tyr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 10 <211> 48 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of g-thionin (Nicotiana paniculata) containing Loop 1B [NpThio1] <400> 10 Lys Ser Thr Cys Lys Ala Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Leu Cys Ile 1 5 10 15 Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Leu Ser Glu Lys Phe Thr Asp 20 25 30 Gly Lys Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Ile Cys Tyr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 11 <211> 50 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of portion of g-thionin (Capicum chinense) containing Loop 1B [Cc-gth] <400> 11 Gln Asn Asn Ile Cys Lys Thr Thr Ser Lys His Phe Lys Gly Leu Cys 1 5 10 15 Phe Ala Asp Ser Lys Cys Arg Lys Val Cys Ile Gln Glu Asp Lys Phe 20 25 30 Glu Asp Gly His Cys Ser Lys Leu Gln Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys 35 40 45 Asn Cys 50 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from NaD1 <400> 12 Asn Thr Phe Pro Gly Ile 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from PhD1 <400> 13 Pro Thr Trp Asp Ser Val 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from PhD2 <400> 14 Pro Thr Trp Glu Gly Ile 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B TPP3 <400> 15 Gln Thr Phe Pro Gly Leu 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B FST <400> 16 Asn Thr Phe Pro Gly Ile 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B g-thionin (N. excelsior) [NeThio1] <400> 17 Ile Ser Thr Gly Leu 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B g-thionin (N. excelsior) [NeThio2] <400> 18 Asn Thr Phe Pro Gly Ile 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B g-thionin (N. attenuata) [Na-gth] <400> 19 Asn Thr Phe Glu Gly Phe 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B g-thionin (N. paniculata) [NpThio1] <400> 20 Asn Thr Phe Pro Gly Leu 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B g-thionin (C. chinense) [Cc-gth] <400> 21 Lys His Phe Lys Gly Leu 1 5 <210> 22 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin NaD2 containing Loop 1B <400> 22 Arg Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ala Arg 1 5 10 15 Asp Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Arg Pro Cys 35 40 45 <210> 23 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin g1-H containing Loop 1B <400> 23 Arg Ile Cys Arg Arg Arg Ser Ala Gly Phe Lys Gly Pro Cys Val Ser 1 5 10 15 Asn Lys Asn Cys Ala Gln Val Cys Met Gln Glu Gly Trp Gly Gly Gly 20 25 30 Asn Cys Asp Gly Pro Leu Arg Arg Cys Lys Cys Met Arg Arg Cys 35 40 45 <210> 24 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin Psd1 containing Loop 1B <400> 24 Lys Thr Cys Glu His Leu Ala Asp Thr Tyr Arg Gly Val Cys Phe Thr 1 5 10 15 Asn Ala Ser Cys Asp Asp His Cys Lys Asn Lys Ala His Leu Ile Ser 20 25 30 Gly Thr Cys His Asn Trp Lys Cys Phe Cys Thr Gln Asn Cys 35 40 45 <210> 25 <211> 45 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin MsDef1 containing Loop 1B <400> 25 Arg Thr Cys Glu Asn Leu Ala Asp Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Ser 1 5 10 15 Gly Cys Asp Thr His Cys Thr Thr Lys Glu Asn Ala Val Ser Gly Arg 20 25 30 Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Trp Cys Thr Lys Arg Cys 35 40 45 <210> 26 <211> 50 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin DmAMP1 containing Loop 1B <400> 26 Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn 1 5 10 15 Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His 20 25 30 Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe 35 40 45 Asn Cys 50 <210> 27 <211> 51 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin RsAFP2 containing Loop 1B <400> 27 Gln Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly 1 5 10 15 Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg 20 25 30 His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr 35 40 45 Phe Pro Cys 50 <210> 28 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of defensin g-zeathionin2 (Zea2) containing Loop 1B <400> 28 Arg Val Cys Met Gly Lys Ser Gln His His Ser Phe Pro Cys Ile Ser 1 5 10 15 Asp Arg Leu Cys Ser Asn Glu Cys Val Lys Glu Asp Gly Gly Trp Thr 20 25 30 Ala Gly Tyr Cys His Leu Arg Tyr Cys Arg Cys Gln Lys Ala Cys 35 40 45 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from NaD2 <400> 29 His Arg Phe Lys Gly Pro 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from Zea2 <400> 30 Gln His His Ser Phe Pro 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from PsD1 <400> 31 Asp Thr Tyr Arg Gly Val 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from PsD2 <400> 32 Pro Thr Trp Glu Gly Ile 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from MsDef1 <400> 33 Asp Lys Tyr Arg Gly Pro 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from SoD2 <400> 34 Lys Thr Phe Lys Gly Ile 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from DmAMP1 <400> 35 Lys Thr Trp Ser Gly Asn 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from VrD1 <400> 36 Glu Gly Trp Gly Lys 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from RsAFP2 <400> 37 Gly Thr Trp Ser Gly Val 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from g1-H <400> 38 Ala Gly Phe Lys Gly Pro 1 5 <210> 39 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP4 (NaD2 Loop 1B [NaD2L1B] in NaD1) <400> 39 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 40 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP34 (Zea2 Loop 1B [Zea2L1B] in NaD1) <400> 40 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Gln His His Ser Phe Pro Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 41 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP35 (PsD1 Loop 1B [PsDL1B] in NaD1) <400> 41 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asp Thr Tyr Arg Gly Val Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 42 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP91 (MsDeF1 Loop 1B [MsDef1L1B] in NaD1) <400> 42 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asp Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 43 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP92 (SoD1 Loop 1B [SoD1L1B] in NaD1) <400> 43 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Lys Thr Phe Lys Gly Ile Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 44 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP58 (DmAMP1 Loop 1B [DMAMPL1B] in NaD1) <400> 44 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 45 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP37 (VrD1 Loop 1B [VrD1L1B] in NaD1) <400> 45 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Glu Gly Trp Gly Lys Cys Ile Thr Lys 1 5 10 15 Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His 20 25 30 Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 46 <211> 49 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP72 (NaD2 Loop 1B [NaD2L1B] in PhD2) <400> 46 Gly Thr Cys Lys Ala Glu Cys His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ile Asn 1 5 10 15 Lys Ala Pro Cys Val Lys Cys Cys Lys Ala Gln Pro Glu Lys Phe Thr 20 25 30 Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro 35 40 45 Cys <210> 47 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HXP95 (NaD2 Loop 1B [NaD2L1B] in NsD1 <400> 47 Lys Asp Cys Lys Arg Glu Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Leu Pro Cys Arg Arg Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Ala Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 48 <211> 141 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide sequence encoding defensin from Nicotiana suaveolens <400> 48 aaagattgca aaagagaaag caatacattc cctggaatat gcattaccaa accaccatgc 60 agaaaagctt gtatccgtga gaaatttact gatggtcatt gtagcaaaat cctcagaaga 120 tgtctatgca ctaagccatg t 141 <210> 49 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of NsD1 <400> 49 Lys Asp Cys Lys Arg Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Arg Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 50 <211> 141 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide sequence encoding NsD2 from Nicotiana suaveolens <400> 50 aaagattgca aaagagaaag caatacattc cctggaatat gcattaccaa actaccatgc 60 agaagagctt gtatcagtga gaaatttgct gatggtcatt gtagcaaaat cctcagaagg 120 tgtctatgca ctaagccatg t 141 <210> 51 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence encoding NsD2 <400> 51 Lys Asp Cys Lys Arg Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Leu Pro Cys Arg Arg Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Ala Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of C-terminal end amino acid sequence of NaD1 which ends and includes the most C-terminal invariant cysteine residue <400> 52 Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys 1 5 10 15 Thr Lys Pro Cys 20 <210> 53 <211> 33 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of NaD1 C-terminal tail <400> 53 Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp 20 25 30 Asn <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of variable region of Loop 1B region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa1 = NGDHKAEQTPLMSR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa2 = KRGHLNFISTY <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa3 = WYHLGFP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(3) <223> Xaa4 = PKSRHTEVNQDG <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(3) <223> Xaa5 = SKYFGH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa6 = PVLTAFNKRMGHIY <400> 54 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of variable region of Loop 1B region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa1 = NHQDKE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa2 = RHTKG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa3 = FHYW <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa4 = PKSR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa5 = GF <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa6 = PVIN <400> 55 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of variable region of Loop 1B region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa1 = LFSIAHYQDKG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa2 = SVFIKLAPNTRHG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa3 = AFWNISYPLH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa4 = KGERAPFQVS <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa5 = MGKDSYPENF <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa6 = VTMSWAPGEKLHIN <400> 56 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 1 5 <210> 57 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of NaD1 backbone having a Loop 1B defined by X1 through X6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa1 = LFSIAHYQDKG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa2 = SVFIKLAPNTRHG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa3 = AFWNISYPLH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa4 = KGERAPFQVS <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa5 = MGKDSYPENF <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa6 = VTMSWAPGEKLHIN <400> 57 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 58 <211> 49 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of C20 <400> 58 Gln Asn Ile Cys Lys Thr Thr Ser Lys Tyr Phe Lys Gly Leu Cys Ile 1 5 10 15 Thr Asp Ser Ser Cys Arg Lys Val Cys Ile Glu Lys Asp Lys Phe Glu 20 25 30 Asp Gly His Cys Ser Lys Leu Gln Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Leu 35 40 45 Cys <210> 59 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of SL549 <400> 59 Lys Asp Cys Lys Arg Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Leu Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of Loop 1B from C20 <400> 60 Lys Tyr Phe Lys Gly Leu 1 5 <210> 61 <211> 72 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of NaPin1A <400> 61 Gln Ser Gly Cys Pro Gly Val Thr Lys Glu Arg Trp Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Thr Pro Ala Lys Phe Ala Met Gln Ile Ile Gln Lys Glu Asn Pro 20 25 30 Lys Leu Thr Asn Val Gln Thr Ile Leu Asn Gly Arg Pro Val Thr Glu 35 40 45 Asp Leu Arg Cys Asn Arg Val Arg Leu Phe Val Asn Val Leu Asp Phe 50 55 60 Val Val Gln Thr Pro Gln Val Gly 65 70 <210> 62 <211> 65 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of BPTI <400> 62 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala Ile Gly Pro Trp Glu Asn 50 55 60 Leu 65 <210> 63 <211> 83 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of CI-1B <400> 63 Met Arg Ser Met Glu Gly Ser Val Pro Lys Tyr Pro Glu Pro Thr Glu 1 5 10 15 Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ala Lys Arg Ser Trp Pro Glu Val Val 20 25 30 Gly Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Ile Ile Leu Arg Asp Lys Pro 35 40 45 Asp Ala Gln Ile Glu Val Ile Pro Val Asp Ala Met Val Pro Leu Asp 50 55 60 Phe Asn Pro Asn Arg Ile Phe Ile Leu Val Ala Val Ala Arg Thr Pro 65 70 75 80 Thr Val Gly <210> 64 <211> 235 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HVCPI6 <400> 64 Met Arg Val Ile Arg Ser Arg Ala Ile Leu Ile Val Leu Phe Leu Val 1 5 10 15 Ser Ala Phe Gly Leu Ser Glu Gln Gly Lys Ser Gly Gly Phe Cys Ser 20 25 30 Glu Glu Met Ala Thr Leu Gly Gly Val His Asp Ser His Gly Ser Ser 35 40 45 Gln Asn Ser Asp Glu Ile His Ser Leu Ala Lys Phe Ala Val Asp Glu 50 55 60 His Asn Lys Lys Glu Asn Ala Met Ile Glu Leu Ala Arg Val Val Lys 65 70 75 80 Ala Gln Glu Gln Thr Val Ala Gly Lys Leu His His Leu Thr Leu Glu 85 90 95 Val Met Asp Ala Gly Lys Lys Lys Leu Tyr Glu Ala Lys Val Trp Val 100 105 110 Lys Pro Trp Leu Asn Phe Lys Glu Leu Gln Glu Phe Lys His Val Glu 115 120 125 Asp Val Pro Thr Phe Thr Ser Ser Asp Leu Gly Val Lys Gln Val Glu 130 135 140 Gln Asn Ser Gly Leu Lys Ser Val Pro Val His Asp Pro Val Val Glu 145 150 155 160 Glu Ala Ala Glu His Ala Ile Lys Thr Ile Gln Gln Arg Ser Asn Ser 165 170 175 Ile His Pro Tyr Lys Leu Gln Glu Ile Val His Ala Asn Ala Glu Met 180 185 190 Ala Asp Asp Ser Thr Lys Leu His Leu Val Ile Lys Thr Ser Arg Gly 195 200 205 Gly Lys Glu Glu Lys Phe Lys Val Gln Val Gln His Asn Asn Glu Gly 210 215 220 Ala Phe His Leu Asn Arg Met Glu Pro Asp Asn 225 230 235 <210> 65 <211> 102 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of S1Cys9 <400> 65 Met Ser Ser Asp Gly Gly Pro Val Leu Gly Gly Val Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Asn Glu Asn Asp Leu His Leu Val Asp Leu Ala Arg Phe Ala Val Thr 20 25 30 Glu His Asn Lys Lys Ala Asn Ser Leu Leu Glu Phe Glu Lys Leu Val 35 40 45 Ser Val Lys Gln Gln Val Val Ala Gly Thr Leu Tyr Tyr Phe Thr Ile 50 55 60 Glu Val Lys Glu Gly Asp Ala Lys Lys Leu Tyr Glu Ala Lys Val Trp 65 70 75 80 Glu Lys Pro Trp Met Asp Phe Lys Glu Leu Gln Glu Phe Lys Pro Val 85 90 95 Asp Ala Ser Ala Asn Ala 100 <210> 66 <211> 102 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of OsIa <400> 66 Ala Thr Ser Ala Leu Gly Arg Arg Gly Val Leu Leu Gly Gly Trp Ser 1 5 10 15 Pro Val Lys Asp Val Asn Asp Pro His Val Gln Glu Leu Gly Gly Trp 20 25 30 Ala Val Ala Gln His Ala Ser Leu Ala Lys Asp Gly Leu Leu Phe Arg 35 40 45 Arg Val Thr Arg Gly Glu Gln Gln Val Val Ser Gly Met Asn Tyr Arg 50 55 60 Leu Phe Val Val Ala Ala Asp Gly Ser Gly Lys Arg Val Thr Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Gln Ile Tyr Glu His Trp Ser Arg Thr Arg Lys Leu Thr Ser Phe 85 90 95 Lys Pro Ala Ala Gly Gly 100 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 67 Leu Ser Phe Lys Gly Thr 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 68 Leu Val Phe Gly Gly Met 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 69 Tyr Asn Pro Val Gly Leu 1 5 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 70 Leu Phe Trp Glu Lys Ser 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 71 Ser Pro Phe Val Gly Pro 1 5 <210> 72 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 72 Ser Ile Ile Ala Ser Ala 1 5 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 73 Ile Lys Ala Pro Gly Trp 1 5 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 74 Leu Thr Leu Ser Asn His 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 75 Leu Ile Ser Phe Tyr Pro 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 76 Ala Leu Phe Ala Gly Glu 1 5 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 77 Phe Leu Tyr Arg Glu Lys 1 5 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 78 Phe Ile Phe Arg Met Glu 1 5 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequece of replacement Loop 1B identified following high through put screen <400> 79 His Ala Phe Gln Lys Gly 1 5 <210> 80 <211> 381 <212> DNA <213> artificial <220> <223> HvCPI6 for expression in corn <400> 80 atggccaaca agcacctgtc cctctccctc ttcctcgtgc tcctcggcct ctccgcctcc 60 ctcgcctccg gagccacctc ggccctcggc cgccgcggcg tgcttctggg cgggtggagc 120 cccgtcaagg acgtgaacga cccgcacgtc caggagctag gcgggtgggc ggtggcccag 180 cacgccagcc tagccaagga cgggctgctc ttccgccggg tgacgcgcgg cgagcagcag 240 gtggtgtccg ggatgaacta ccgcctcttc gtggtcgcgg cggacggctc cggcaagagg 300 gtgacctatc tcgcgcagat ctacgagcac tggagcagga cccgcaagct cacgtccttc 360 aagccggctg ccggcggctg a 381 <210> 81 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HvCPI6 for expression in corn <400> 81 Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ser Ala Leu Gly Arg Arg 20 25 30 Gly Val Leu Leu Gly Gly Trp Ser Pro Val Lys Asp Val Asn Asp Pro 35 40 45 His Val Gln Glu Leu Gly Gly Trp Ala Val Ala Gln His Ala Ser Leu 50 55 60 Ala Lys Asp Gly Leu Leu Phe Arg Arg Val Thr Arg Gly Glu Gln Gln 65 70 75 80 Val Val Ser Gly Met Asn Tyr Arg Leu Phe Val Val Ala Ala Asp Gly 85 90 95 Ser Gly Lys Arg Val Thr Tyr Leu Ala Gln Ile Tyr Glu His Trp Ser 100 105 110 Arg Thr Arg Lys Leu Thr Ser Phe Lys Pro Ala Ala Gly Gly 115 120 125 <210> 82 <211> 636 <212> DNA <213> artificial <220> <223> HvCPI6-L-HXP4-CTPP <400> 82 atggccaaca agcacctgtc cctctccctc ttcctcgtgc tcctcggcct ctccgcctcc 60 ctcgcctccg gagccacctc ggccctcggc cgccgcggcg tgcttctggg cgggtggagc 120 cccgtcaagg acgtgaacga cccgcacgtc caggagctag gcgggtgggc ggtggcccag 180 cacgccagcc tagccaagga cgggctgctc ttccgccggg tgacgcgcgg cgagcagcag 240 gtggtgtccg ggatgaacta ccgcctcttc gtggtcgcgg cggacggctc cggcaagagg 300 gtgacctatc tcgcgcagat ctacgagcac tggagcagga cccgcaagct cacgtccttc 360 aagccggctg ccggcggcga ggagaagaag aacagggagt gcaaaacaga gagcaacacg 420 ttccctggca tctgcattac taagccaccg tgccgcaagg cctgcatctc cgaaaagttt 480 acagacgggc actgttccaa aatcctccgc aggtgcctct gcacgaagcc gtgcgttttc 540 gacgagaaga tgacgaagac tggggcggag attctcgctg aggaggccaa gactctggcg 600 gctgccctgc tggaagagga aattatggac aattga 636 <210> 83 <211> 211 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of HvCPI6-L-HXP4-CTPP <400> 83 Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ser Ala Leu Gly Arg Arg 20 25 30 Gly Val Leu Leu Gly Gly Trp Ser Pro Val Lys Asp Val Asn Asp Pro 35 40 45 His Val Gln Glu Leu Gly Gly Trp Ala Val Ala Gln His Ala Ser Leu 50 55 60 Ala Lys Asp Gly Leu Leu Phe Arg Arg Val Thr Arg Gly Glu Gln Gln 65 70 75 80 Val Val Ser Gly Met Asn Tyr Arg Leu Phe Val Val Ala Ala Asp Gly 85 90 95 Ser Gly Lys Arg Val Thr Tyr Leu Ala Gln Ile Tyr Glu His Trp Ser 100 105 110 Arg Thr Arg Lys Leu Thr Ser Phe Lys Pro Ala Ala Gly Gly Glu Glu 115 120 125 Lys Lys Asn Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Asn Thr Phe Pro Gly Ile 130 135 140 Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe 145 150 155 160 Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys 165 170 175 Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu 180 185 190 Ala Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile 195 200 205 Met Asp Asn 210 <210> 84 <211> 47 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Amino acid sequence of NaD1 backbone having a Loop 1B defined by X1 through X6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa1 = NHQDKE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa2 = RHTKG <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa3 = FHYW <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa4 = PKSR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa5 = GF <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa6 = PVIN <400> 84 Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Cys Ile Thr 1 5 10 15 Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly 20 25 30 His Cys Ser Lys Ile Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45 <210> 85 <211> 48 <212> PRT <213> artificial <220> <223> TPP3 backbone with NaD2 Loop 1B <400> 85 Gln Gln Ile Cys Lys Ala Pro Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Phe 1 5 10 15 Met Asp Ser Ser Cys Arg Lys Tyr Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Gly 20 25 30 Gly His Cys Ser Lys Leu Gln Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys 35 40 45

Claims (57)

  1. N-말단 부분에서 제1 β-가닥과 α-나선 사이에 루프 영역(루프 1B)을 포함하고 항진균 활성을 가진 단리된 인공적으로 변경된 가지과(solanaceous) 클래스 II 데펜신(defensin) 폴리펩티드로서, 상기 루프 1B가 서열번호 29 내지 38 및 서열번호 67 내지 79로 구성된 목록으로부터 선택된 외인성 루프 1B 아미노산 서열로 교체되어 있는 것인 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 단리된 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 루프 1B 아미노산 서열이 서열번호 29로 구성되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, HXP4(서열번호 39), HXP34(서열번호 40), HXP35(서열번호 41) 및 HXP107(서열번호 85)로부터 선택되는 단리된 폴리펩티드.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 진균 병원체가 식물 진균 병원체, 포유동물 진균 병원체 및 녹균(rust)으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 진균이 콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola), 디플로디아 메이디스(Diplodia maydis), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 버티실로이데스(Fusarium verticilloides), 푸사리움 비르굴리포름(Fusarium virguliforme), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 투쿠마니애(Fusarium tucumaniae)로 구성된 목록으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  7. 제5항에 있어서, 진균이 알터나리아속의 종(Alternaria spp), 아스퍼길러스속의 종(Aspergillus spp), 캔디다속의 종(Candida spp), 푸사리움속의 종(Fusarium spp), 트리코파이톤속의 종(Trychophyton spp), 크립토코커스속의 종(Cryptococcus spp), 마이크로스포룸속의 종(Microsporum spp), 페니실리움속의 종(Penicillium spp), 트리코스포론속의 종(Trichosporon spp), 세도스포리움속의 종(Scedosporium spp), 패실리오마이세스속의 종(Paeciliomyces spp), 아크레모니움속의 종(Acremonium spp) 및 데르마티아세오우스과(Dermatiaceous)의 곰팡이로 구성된 목록으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  8. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  9. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 생성하는 유전적으로 변경된 식물, 또는 상기 폴리펩티드를 생성하는 상기 식물의 자손.
  10. 제9항에 있어서, 옥수수, 대두, 목화, 수수, 밀, 보리, 메이즈(maize), 캐놀라, 아바카, 자주개자리(alfalfa), 아몬드, 사과, 아스파라거스, 바나나, 팥속 콩류(bean-phaseolus), 블랙베리, 잠두, 캐슈, 카사바, 병아리콩(chick pea), 시트러스, 코코넛, 커피, 무화과, 아마, 포도, 낙화생(groundnut), 대마, 라벤더, 버섯, 올리브, 양파, 완두콩, 땅콩, 배, 당피(pearl millet), 감자, 평지씨, 독보리, 딸기, 사탕무우, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 토란, 차, 담배, 토마토, 라이밀, 송로 버섯 및 참마로 구성된 목록으로부터 선택된 유전적으로 변경된 식물.
  11. 유전적 변경으로 인해 항진균 활성을 나타내는 유전적으로 변경된 식물 또는 이의 자손을 발생시키는 방법으로서, 식물 또는 이의 자손 내에서 변경된 데펜신이 식물 진균 병원체로부터의 보호 효과를 나타내기에 충분한 발현 수준으로 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현하는 세포를 포함하는 식물을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 클래스 II 가지과 데펜신의 N-말단 부분 상에서 β-가닥 1과 α-나선 사이에 루프 1B 영역을 포함하는 클래스 II 가지과 데펜신의 골격 아미노산 서열을 포함하는 데펜신을 발생시키는 방법으로서, 전체 루프 1B 영역을 외인성 루프 1B 서열로 아미노산 치환하여 루프 1B 영역을 변경시켜 항진균 활성을 갖는 데펜신 폴리펩티드를 발생시키는 단계를 포함하고, 상기 클래스 II 가지과 데펜신 상의 루프 1B가 서열번호 29 내지 38 및 서열번호 67 내지 79로 구성된 목록으로부터 선택된 외인성 루프 1B 아미노산 서열로 교체되어 있는 것인 방법.
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BR (1) BR112013020131A8 (ko)
CA (1) CA2825118C (ko)
ES (1) ES2660965T3 (ko)
MX (1) MX349741B (ko)
SG (1) SG192063A1 (ko)
WO (1) WO2012106759A1 (ko)
ZA (1) ZA201305275B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR075257A1 (es) 2008-02-01 2011-03-23 Hexima Ltd Sistema de proteccion de plantas contra la infeccion por agentes patogenos
JP6457945B2 (ja) * 2012-11-23 2019-01-23 ヘキシマ リミテッドＨｅｘｉｍａ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗病原体方法
CN103484469B (zh) * 2013-09-11 2014-12-17 华南农业大学 一种小菜蛾抗菌肽defensin及其制备方法与应用
CN106231899A (zh) * 2014-04-23 2016-12-14 赫希玛有限公司 用于处理病原体的试剂和方法
EP3134108A4 (en) 2014-04-24 2018-01-17 Hexima Limited Agents and methods of treatment
JP6760970B2 (ja) * 2015-05-29 2020-09-23 ヘキシマ リミテッドＨｅｘｉｍａ Ｌｉｍｉｔｅｄ インビボ治療の方法
US9894857B2 (en) 2015-07-31 2018-02-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Loci associated with charcoal rot drought complex tolerance in soybean
CA3222427A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Loci associated with charcoal rot drought complex tolerance in soybean
CN111690035A (zh) * 2020-06-05 2020-09-22 广州颜如玉生物科技有限公司 一种提高抗菌肽产量的方法
CN112625920B (zh) * 2020-12-25 2023-04-28 广西壮族自治区农业科学院 一株抗病虫内生真菌的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080109924A1 (en) 2004-06-30 2008-05-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of Protecting Plants from Pathogenic Fungi
WO2008128289A1 (en) 2007-04-20 2008-10-30 Hexima Limited Modified plant defensin
US20150158918A1 (en) 2011-10-19 2015-06-11 Hexima Limited Novel plant defensins and use in the treatment of proliferative diseases

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1213228A (en) 1983-04-13 1986-10-28 Peter S. Carlson Agricultural-chemical-producing endosymbiotic bacteria and method of preparing and using same
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
GB8429932D0 (en) 1984-11-27 1985-01-03 Pfizer Ltd Triazole antifungal agents
WO1987003303A1 (en) 1985-11-20 1987-06-04 Crop Genetics International, N.V. Agricultural-chemical-producing endosymbiotic microorganisms and method of preparing and using same
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
EP0470182A4 (en) 1989-04-28 1992-09-16 Crop Genetics International Corporation Method of endophyte-enhanced protection of plants
US6268546B1 (en) 1989-07-19 2001-07-31 Calgene Llc Ovary-tissue transcriptional factors
WO1991010363A1 (en) 1990-01-16 1991-07-25 Crop Genetics International Corporation Agricultural-chemical-producing endosymbiotic microorganisms
US5482928A (en) 1991-03-11 1996-01-09 Imperial Chemical Industries Plc Biocidal proteins
US5446127A (en) 1991-05-24 1995-08-29 Universidad Politecnica De Madrid Antipathogenic peptides and compositions containing the same
US6512166B1 (en) 1991-06-17 2003-01-28 Cornell Research Foundation, Inc. Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound
US5538525A (en) 1991-08-29 1996-07-23 Zeneca Limited Biocidal proteins
GB9118730D0 (en) 1991-09-02 1991-10-16 Ici Plc Biocidal proteins
JP3657980B2 (ja) 1992-12-16 2005-06-08 ヘキシマ・リミテッド プロテイナーゼインヒビター、その前駆体およびそれをコードする遺伝子配列
GB9300281D0 (en) 1993-01-08 1993-03-03 Zeneca Ltd Antimicrobial-protein-producing endosymbiotic micro-organisms
EP0712413A1 (en) 1993-08-04 1996-05-22 Zeneca Limited Antimicrobial proteins
EP1231274A3 (en) 1994-11-21 2002-10-09 The University Of Leeds Modified porteinase inhibitors
US6031153A (en) 1995-01-23 2000-02-29 Novartis Ag Method for protecting plants
GB9525474D0 (en) 1995-12-13 1996-02-14 Zeneca Ltd Antifungal proteins
BR9612011A (pt) 1995-12-13 1999-05-18 Zeneca Ltd Peptídeo antifungico sequencia de dna recombinante vetor sistema biológico planta composição antifúngica e processo para o combate a fungos ou a bacterias
US6909032B2 (en) 1996-01-31 2005-06-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation DNA encoding a macadamia integrifolia anti-microbial protein, constructs comprising the same and plant material comprising the constructs
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
GB9613753D0 (en) 1996-07-01 1996-09-04 Broekaert Willem F Plant protection method
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
AUPO427596A0 (en) 1996-12-20 1997-01-23 Cooperative Research Centre For Tropical Plant Pathology Anti-microbial protein
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
JPH10295380A (ja) * 1997-04-23 1998-11-10 Japan Tobacco Inc 塩ストレスにより誘導される新規チオニン遺伝子
GB9725556D0 (en) 1997-12-03 1998-02-04 Ciba Geigy Ag Organic compounds
CA2335379A1 (en) 1998-08-18 2000-03-02 Zeneca Limited Genetic method for the expression of polyproteins in plants
GB9818003D0 (en) 1998-08-18 1998-10-14 Zeneca Ltd Polynucleotide sequences
EP1177306A2 (en) 1999-05-07 2002-02-06 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant defensins
US6855865B2 (en) 1999-05-07 2005-02-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acids encoding plant defensins and methods of use thereof
US6677503B1 (en) 1999-06-23 2004-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses
GB9918155D0 (en) 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Proteins and peptides
GB9918156D0 (en) 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Synthetic peptides
US7592433B1 (en) 1999-11-05 2009-09-22 The University Of Queensland; Hexima Limited Polynucleotides encoding cyclotide-like structures
US6770750B2 (en) 1999-11-18 2004-08-03 Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. Small and cysteine rich antifungal defensin and thionin-like protein genes highly expressed in the incompatible interaction
WO2001062172A1 (en) 2000-02-23 2001-08-30 Ethicon, Inc. Apparatus and method for reconstructing a ligament
GB0006244D0 (en) 2000-03-15 2000-05-03 Zeneca Ltd Method for combating attack and spread of fungal pathogens in plants
AU2001266879A1 (en) 2000-06-15 2001-12-24 Eden Bioscience Corporation Methods of improving the effectiveness of transgenic plants
WO2002061043A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Cargill, Incorporated Fungal resistant transgenic plants
CN1496403B (zh) 2001-02-08 2010-12-08 赫希玛有限公司 植物来源分子、其编码遗传序列及其用途
EP2270188A3 (en) 2001-06-22 2011-09-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Defensin polynucleotides and methods of use
FR2839311A1 (fr) * 2002-05-06 2003-11-07 Entomed Peptides antibacteriens, genes codant les peptides, vecteurs, organismes transformes, leurs preparations et les compositions les contenant
US20050058689A1 (en) 2003-07-03 2005-03-17 Reactive Surfaces, Ltd. Antifungal paints and coatings
GB0229148D0 (en) 2002-12-16 2003-01-15 Leuven K U Res & Dev Anti-fungal screening tool
WO2004072239A2 (en) 2003-02-06 2004-08-26 Verdia, Inc. Novel polypeptides with antifungal activity
BRPI0409638A (pt) 2003-04-23 2006-04-25 Hexima Ltd molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula modificada geneticamente, quimiotripsina isolada de helicoveipa spp., antagonista, composição, planta geneticamente modificada, sementes ou outro material de reprodução, métodos para modular atividade de hpch5 ou um homólogo ou variante da mesma em um inseto, para modular expressão de hpf5 ou homólogo ou variante em um inseto, para isolar e separar isoformas individuais de quimiotripsina, para selecionar um antagonista de uma quimiotripsina insensìvel a napi de helicoverpa spp., e, inibidor isolado
MY140980A (en) 2003-09-23 2010-02-12 Unisem M Berhad Semiconductor package
US7728190B1 (en) * 2003-11-17 2010-06-01 Monsanto Technology Llc Amino acid sequence variant alfalfa antifungal protein and its use in plant disease control
US20070197474A1 (en) 2004-03-30 2007-08-23 Clinton William P Methods for controlling plants pathogens using N-phosphonomethylglycine
CA2594053A1 (en) 2004-12-24 2006-06-29 Anne Rae Vacuole targeting peptide and nucleic acid
WO2007087567A2 (en) 2006-01-25 2007-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antifungal polypeptides
WO2007110686A2 (en) 2006-03-28 2007-10-04 Council Of Scientific And Industrial Research A synergistic composition useful as bioinoculant
WO2007137329A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Hexima Limited Multi-gene expression vehicle
AR075257A1 (es) 2008-02-01 2011-03-23 Hexima Ltd Sistema de proteccion de plantas contra la infeccion por agentes patogenos
US20130269059A1 (en) 2008-08-05 2013-10-10 Hexima Limited Anti-Pathogen Systems
US9889184B2 (en) 2008-08-05 2018-02-13 Hexima Limited Anti-pathogen systems
CN102131393A (zh) 2008-08-05 2011-07-20 赫希玛有限公司 植物抗病原体系统
US20130263326A1 (en) 2008-08-05 2013-10-03 Robyn Louise Heath Anti-Pathogen Systems
AT508458B1 (de) * 2009-06-30 2011-06-15 Banny Reiter Ulrike Vorrichtung und verfahren zum reinigen von abwasserleitungen von unterdrucktoilettenanlagen
WO2011160174A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Balmoral Australia Pty Ltd Treatment of proliferative diseases
JP6457945B2 (ja) 2012-11-23 2019-01-23 ヘキシマ リミテッドＨｅｘｉｍａ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗病原体方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080109924A1 (en) 2004-06-30 2008-05-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of Protecting Plants from Pathogenic Fungi
WO2008128289A1 (en) 2007-04-20 2008-10-30 Hexima Limited Modified plant defensin
US20150158918A1 (en) 2011-10-19 2015-06-11 Hexima Limited Novel plant defensins and use in the treatment of proliferative diseases

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012214102B2 (en) 2014-08-07
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AU2014204445A1 (en) 2014-07-31
JP2014506461A (ja) 2014-03-17
BR112013020131A2 (pt) 2016-11-01
BR112013020131A8 (pt) 2018-01-09
EP2673365A4 (en) 2015-01-21
US20140130209A1 (en) 2014-05-08
SG192063A1 (en) 2013-08-30
AU2012214102A1 (en) 2013-04-11
US10174339B2 (en) 2019-01-08
CA2825118A1 (en) 2012-08-16

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US10357536B2 (en) Anti-pathogenic methods
Lay et al. Defensins-components of the innate immune system in plants
Tavares et al. Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers
US6372888B1 (en) Antifungal proteins
US5750504A (en) Antimicrobial proteins
JPH07502976A (ja) 殺生物性蛋白質
Kuanar et al. Biotechnological Approaches for Enhancing the Production of Vegetables–An Updated Overview
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Liu Transgenic plants

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