FR2839311A1

FR2839311A1 - Peptides antibacteriens, genes codant les peptides, vecteurs, organismes transformes, leurs preparations et les compositions les contenant

Info

Publication number: FR2839311A1
Application number: FR0205643A
Authority: FR
Inventors: Michele Legrain; Marc Guenneugues
Original assignee: Entomed AB
Current assignee: Entomed AB
Priority date: 2002-05-06
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2003-11-07
Also published as: AU2003260539A1; WO2003097680A2; WO2003097680A3

Abstract

La présente invention a pour objets des peptides présentant des propriétés anti-bactériennes, en particulier contre les bactéries à Gram positif pharmacorésistantes, des polynucléotides codant lesdits peptides, des gènes chimères, des vecteurs contenant lesdits polynucléotides ou lesdits gènes et des organismes transformés. L'invention concerne également la préparation des peptides et les compositions les contenant utilisables en thérapie humaine et animale, en agriculture ainsi que dans l'industrie agroalimentaire et phytosanitaire.

Description

PEPTIDES ANTI-BACTERIENS, GENES CODANT LES PEPTIDES, VECTEURS, ORGANISMES TRANSFORMES, LEURS PREPARATIONS ET LES COMPOSITIONS LES CONTENANT.

Tant en santé humaine et animale qu'en santé végétale, le besoin de nouvelles molécules permettant de lutter contre les infections d'origine bactérienne est grandissant. En santé humaine notamment, les infections nosocomiales constituent des infections graves qui affectent les patients hospitalisés. Elles s'avèrent particulièrement redoutables pour les patients dont le système immunitaire est fragilisé suite à des traitements comme la corticothérapie ou la chimiothérapie, des interventions comme des transplantations ou des maladies affectant le système immunitaire telles le Syndrome d'Immunodéficience Acquise. La croissance de la fréquence et de la sévérité des infections nosocomiales coïncide avec l'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques classiques. A titre d'exemples de bactéries à Gram positif présentant un phénomène de pharmacorésistance, on peut notamment citer les bactéries de genre Staphylococcus en particulier Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, les bactéries de genre

Streptococcus en particulier Streptococcus pneumoniae, les bactéries de genre Enterococcus en particulier Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium et les bactéries de genre Mycobacterium en particulier Mycobacterium tuberculosis. L'exemple le plus préoccupant est celui de Staphylococcus aureus. Plus de 95% des souches bactériennes Staphylococcus aureus sont résistantes à la pénicilline et plus de 60% sont également devenues résistantes à son dérivé, la méthicilline (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnology, Vol 17 December 1999). Des souches présentant une sensibilité réduite à la vancomycine ont également été caractérisées (Infection control programmes to contain antimicrobial résistance, Lindsay E. Nicolle, 14-15, WHO 2001). Ces antibiotiques agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé, le taux de souches Staphylococcus aureus méthicilline-résistantes devenues résistantes à la mipirocine, un antibiotique inhibant la synthèse protéique, a progressé de 2,7% à 65% en l'espace de 3 ans (Infection control programmes to contain antimicrobial résistance, Lindsay E. Nicolle, 14-15, WHO 2001). L'action des analogues d'antibiotiques conventionnels est rapidement contrée par des mécanismes de résistances multiples élaborés par les bactéries. On a notamment observé des souches bactériennes ayant une perméabilité membranaire réduite ce qui empêche l'entrée de l'antibiotique. D'autres souches bactériennes au contraire, relarguent rapidement la molécule antibiotique via des pompes d'efflux. D'autres voies de résistance proviennent de la séquestration de la molécule antibiotique, de l'inactivation de la molécule antibiotique par des enzymes bactériennes, de la perte d'efficacité de la molécule antibiotique par production accrue de sa cible ou de la modification de la cible de la

molécule antibiotique. Le phénomène de pharmaco-résistance est d'autant plus inquiétant qu'il n'est plus confiné au secteur hospitalier mais tend à se disséminer au sein de la communauté. Une publication récente fait notamment état de la prévalence des infections causées par Staphylococcus aureus chez les personnes de 65 ans et plus. La proportion d'infections bactériennes, pneumonies, endocardites, infections bactériennes ostéoarticulaires ou urinaires développées par les personnes âgées et liées à Staphylococcus aureus, est préocupante (Staphylococcus aureus infections and antibiotic résistance in older adults, Bradley S.F., Clinical Infectious Diseases, 2002 ; 34 :211-216).

Il existe donc un besoin grandissant de caractériser de nouvelles classes de molécules anti-bactériennes, plus particulièrement actives contre les bactéries à Gram positif touchées par le phénomène de pharmaco-résistance qui progresse dangereusement en milieu hospitalier et se propage au sein de la communauté. Par anti-bactériens , on entend selon la présente invention, toutes molécules présentant des propriétés bactériostatiques ou bactéricides.

Il est connu que les peptides anti-bactériens et plus généralement les peptides anti-microbiens présentent un mécanisme d'action qui diffère radicalement de ceux des antibiotiques classiques. Les peptides anti-microbiens majoritairement cationiques ont pour cible la membrane bactérienne. Un modèle présentant le mécanisme d'action de la plupart des peptides anti-microbiens est le modèle Shai-Matsuzaki-Huang (Cationic peptides with antimicrobial activity - The new generation of antibiotics ?, Rautenbach M. and Hastings J. W., Chimica oggi/ Chemistry today, NovDec 1999, 81-89). Des peptides présentant des propriétés anti-microbiennes sont produits par une grande variété

d'espèces tant animales que végétales, chez lesquels ils participent à des mécanismes non spécifiques de défense contre les infections (Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Zasloff M., Nature Vol.415, Jan 2002, 389-395).

Les insectes ont notamment développé un système de défense efficace contre les microorganismes. Cette réponse immunitaire s'appuie pour une large part sur la synthèse rapide et transitoire de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité (Antimicrobial peptides in insects ; structure and function, Bulet P. and al., Dev. Comp.

Immunol. 23,1999, 329-344). Les peptides anti-microbiens d'insectes peuvent être classé en quatre familles distinctes: - Des peptides cationiques de 4 kDa, formant des hélices a amphipathiques. Dans cette famille, on répertorie notamment les cécropines (2 hélices a) qui sont actives contre les bactéries à Gram positif et négatif.

- Des peptides cationiques de 2 à 5 kDa comprenant des ponts disulfures intra-moléculaires. Cette famille est elle-même subdivisée en 2 sous-familles. Une première sous-famille est formée par des peptides qui présentent une structure tridimensionnelle du type comportant une hélice a et un feuillet antiparallèle reliés par des ponts disulfure. Ces peptides communément appelés peptides cs[alpha]ss sont notamment représentés par les défensines d'insectes (3 ponts disulfure) qui sont actives contre les bactéries à
Gram positif, la drosomycine (4 ponts disulfure) et l'héliomicine (3 ponts disulfure) qui présentent des propriétés antifongiques. Une seconde sous-famille est formée par des peptides qui présentent une structure tridimentionnelle de type comportant un feuillet anti-parallèle et des ponts disulfure. Ces peptides

appelés peptides hairpin-like sont notamment représentés par la thanatine (1 pont disulfure) qui présente un large spectre d'activité puisque dirigée aussi bien contre les champignons qu'envers les bactéries à Gram positif et négatif.

- Des peptides cationiques riches en proline, de 2 kDa à 4 kDa qui peuvent être glycosylés, comme la drosocine, la pyrrhocoricine, et les lébocines, ou non glycosylés comme les apidaecines et les métalnikowines. Ces peptides sont pour la plupart actifs contre les bactéries à Gram négatif.

- Des polypeptides hétérogènes de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en glycine.

Dans ce groupe, on classe notamment les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines, la coléoptéricine, l'hyménoptéricine, l'hémiptéricine, l'holotricine et les gloverines qui sont essentiellement actifs contre les bactéries à Gram négatif .

Parmi les peptides anti-bactériens d'insectes isolés à ce jour, les cécropines, les défensines et la thanatine se sont révélées actives contre les bactéries à Gram positif (Antibacterial peptides isolated from insects, Otvos L Jr., J. Pept. Sci. 2000 Oct. ; 6(10) :497-511 ; Structure-activity analysis of thanatin, a 21-residue inducible insect défense peptide with séquence homology to frog skin antimicrobial peptides, Fehlbaum P., Bulet P. and al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.93, 1221-1225, Feb.

1996). Parmi ces derniers peptides les défensines d'insectes présentent une spéficité d'action envers les bactéries à Gram positif pharmaco-résistantes. Le procédé communément utilisé pour obtenir et isoler de nouveaux peptides anti-bactériens et plus généralement antimicrobiens est long et contraignant. Notamment, l'utilisateur doit induire la synthèse biologique des

peptides anti-microbiens dans l'hémolymphe d'insectes vivants qu'il aura préalablement collecté ou cultivé en quantité suffisante. Cette synthèse est induite par une blessure septique ou par injection d'une faible dose de bactéries à chacun des insectes. L'utilisateur doit ensuite procéder à l'extraction des peptides antimicrobiens par mise en contact d'un broyat des insectes ou de l'hémolymphe préalablement recueillie avec un milieu acide à neutre avant de purifier les peptides en vue de leur caractérisation structurale. Un autre procédé communément utilisé pour préparer des nouveaux peptides est la mutagenèse dirigée. Ce procédé présente toutefois des limites. Notamment, la génération de mutations qui affectent la structure tridimentionnelle des peptides conduit à des peptides mutants non fonctionnels. Le temps requis pour la préparation de chaque peptide mutant peut limiter quant à lui le nombre de positions explorées.

Le problème technique posé par la présente invention consiste à préparer de nouveaux peptides anti-bactériens dérivés de peptides d'insectes, plus particulièrement actifs contre les bactéries à Gram positif pharmacorésistantes, en s'affranchissant des contraintes précédemment décrites.

La présente invention s'intéresse plus particulièrement aux défensines d'insectes. Ces peptides sélectivement actifs contre les bactéries à Gram positif ont une structure tridimentionnelle bien définie comportant une hélice a et un feuillet (3 constitué de 2 brins antiparallèles, reliés par trois ponts disulfures (motif CSa(3). Les ponts disulfures de type recouvrant sont établis entre les cystéines 1 et 4, 2 et 5 et 3 et 6 dans l'ordre de leur position relative au sein de la séquence peptidique. L'analyse de l'alignement des séquences

peptidiques de 40 défensines d'insectes dont certaines sont décrites dans la littérature et d'autres nouvellement isolées par la demanderesse (notifiées (*), Figure 1) , a permis de révéler la présence de 3 régions variables séparées (en caractères gras, figure 1) par des régions substantiellement conservées. On entend par régions substantiellement conservées selon la présente invention, 40 sous-séquences peptidiques de défensines d'insectes ayant au moins 60% et de préférence 85% à 95% des résidus d'acides aminés qui sont identiques lorsque ces sousséquences sont alignées pour le maximum de correspondance.

Les régions variables nommées région variable n 1, région variable n 2 et région variable n 3 correspondent respectivement à la boucle N-terminale, à la boucle située entre l'hélice a et le premier brin ss, et à la boucle Cterminale située entre les 2 brins (3 des défensines d'insectes comme l'expose la figure 2 en annexe.

La demanderesse a maintenant préparé une banque de polynucléotides doubles brins recombinés et les défensines d'insectes hybrides pour lesquelles ils codent par mise en #uvre d'un procédé innovant qui permet d'associer de façon aléatoire des séquences définies correspondant aux différentes régions variables et substantiellement conservées des défensines d'insectes. Le procédé développé par la demanderesse pour préparer la banque de polynucléotides doubles brins recombinés et les défensines d'insectes hybrides pour lesquelles ils codent une comprend les étapes suivantes: a) l'assemblage de séquences nucléotidiques simples brins chevauchants qui couvrent la séquence de tout ou partie de polynucléotides codant une population de départ de défensines d'insectes, pour obtenir des polynucléotides doubles brins recombinés, lesdits polynucléotides doubles brins recombinés comprenant éventuellement à l'une au moins de leurs

extrémités une séquence de régulation de l'expression d'un gène ou une partie 3' ou 5' de cette séquence de régulation, b) l'introduction aux extrémités 3' et/ou 5' de chacun des polynucléotides doubles brins recombinés obtenus à l'étape (a) de séquences nucléotidiques complémentaires d'une séquence nucléotidique d'un vecteur de clonage et/ou d'expression.

L'une au moins des extrémités dudit vecteur de clonage et/ou d'expression linéarisé peut correspondre à la partie 3' ou 5' de séquence(s) de régulation de l'expression d'un gène dont la partie 3' ou 5' complémentaire correspond à l'une des extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés obtenus à l'étape (b) du procédé. On entend par séquence(s) de régulation de l'expression d'un gène selon la présente invention, des séquences régulatrices de la transcription, de la traduction et/ou de la maturation de peptides, en particulier de défensines d'insectes telles qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou de transit (séquences pré, séquence pro), une séquence codant pour une endoprotéase, ou un terminateur. L'ensemble de ces séquences de régulation est connu de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction des organismes hôte dans lesquels les peptides codés par les polynucléotides doubles brins recombinés obtenus par le procédé de l'invention sont exprimés.

A l'étape (a) du procédé, les polynucléotides doubles brins recombinés comprennent à l'une au moins de leurs extrémités tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène, qui est apportée auxdits polynucléotides doubles brins recombinés par des séquences nucléotidiques simples brins supplémentaires présentes :

i) soit à l'une des extrémités des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants constituant les extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a), ii) soit, lors de l'assemblage (a), sous la forme d'un ou plusieurs acides nucléiques simples brins, chacun constitué d'une première et d'une seconde région nucléique, dont : - un premier groupe est constitué de premières régions complémentaires des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants constituant l'un au moins des extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a), et les secondes régions de ce premier groupe correspondent à tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène, - le second groupe, s'il est présent, est constitué de premières régions et secondes régions, pour une part complémentaires des secondes régions du premier groupe et pour une seconde part complémentaires les unes des autres, de façon à former ladite séquence de régulation de l'expression d'un gène ou une partie de celle-ci, iii) soit par la combinaison de (i) et (ii).

Chacune des séquences nucléotidiques simples brins utilisées à l'étape a) du procédé est constituée ou comprend : - un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables d'une défensine d'insecte de la population de départ, ledit segment nucléotidique variable étant flanqué - en 5' par un segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de tout ou partie de l'une quelconque des régions substantiellement conservées

des défensines d'insectes de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité N terminale d'une région variable, ledit segment nucléotidique étant lui-même éventuellement flanqué en 5' d'une séquence nucléotidique simple brin supplémentaire correspondant à tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène, - en 3' par un segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de tout ou partie de l'une quelconque des régions substantiellement conservées des défensiens d'insectes de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité C terminale d'une région variable, ledit segment nucléotidique étant lui-même éventuellement flanqué en 3' d'une séquence nucléotidique simple brin supplémentaire correspondant à tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène.

Les étapes (a) et (b) sont réalisées par polymérisation de préférence par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR).

La polymérisation de l'étape (a) comprend plusieurs cycles de dénaturation, hybridation, extension en présence d'une polymérase, dans des conditions telles que chaque séquence nucléotidique simple brin et acide nucléique simple brin s'il est présent, sert de matrice pour l'élongation d'une autre séquence nucléotidique simple brin ou acide nucléique simple brin s'il est présent.

L'étape (b) de polymérisation est réalisée avec des amorces comprenant des séquences nucléotidiques complémentaires d'une séquence nucléotidique d'un vecteur d'expression.

L'utilisation de séquences nucléotidiques simples brins telles que précédemment définies, dans l'étape (a) du procédé permet de préserver l'intégrité des motifs

structuraux élémentaires des défensines d'insectes. Le repliement global des chaînes peptidiques et par voie de conséquence la fonctionnalité des défensines d'insectes hybrides ne sont pas altérés.

L'utilisation d'acides nucléiques simples brins tels que précédemment définis, dans l'étape (a) du procédé et d'amorces comprenant des séquences nucléotidiques complémentaires d'une séquence nucléotidique d'un vecteur de clonage ou d'expression dans l'étape (b) du procédé permettent quant à eux de construire la banque de polynucléotides doubles brins recombinés codant les défensines d'insectes hybrides, capables de s'insérer directement dans un vecteur d'expression, par recombinaison homologue à l'intérieur d'un organisme hôte et d'exprimer et sécréter directement les défensines d'insectes hybrides. L'étape d'amplification dans une bactérie, notamment E. coli étant désormais inutile, l'utilisateur gagne non seulement du temps mais évite aussi la perte éventuelle de séquences qui seraient toxiques dans la bactérie.

La demanderesse a ensuite co-transformé un organisme hôte par le vecteur d'expression linéarisé en présence des polynucléotides doubles brins recombinés présentant des extrémités complémentaires de celles du vecteur d'expression, obtenus à l'étape (b) du procédé . Les défensines d'insectes hybrides codées par les polynucléotides doubles brins recombinés exprimées et sécrétées dans l'organisme hôte sont criblées ou sélectionnées pour des propriétés anti-bactériennes contre des bactéries à Gram positif pharmaco-résistantes.

Dans les séquences rapportées ci-après, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature ci-dessous :
A Ala alanine

C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met methionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine
R Arg arginine
S Ser sérine
T Thr thréonine
V Val valine
W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine
La présente invention a pour principal objet un peptide isolé caractérisé en ce qu'il répond à la formule (I) suivante:
Cl V1 C2 V2 C3 V3 (I) dans laquelle, - Cl, V1, C2, V2, C3 et V3 représentent des séquences d'acides aminés, - Cl est la séquence d'acides aminés de formule (II) suivante :
X1X2X3X4X5X6X7 (II) dans laquelle, - X1 est la valine, l'isoleucine, la phénylalanine ou l'alanine, - X2 est la sérine ou la thréonine, - X3 est la cystéine,

- X4 est l'acide aspartique, - X5 est la valine, la leucine, l'isoleucine ou l'alanine, - X6 est la leucine, la phénylalanine ou l'alanine, - X7 est la sérine ou la glycine, - V1 est une séquence d'acides aminés de 7, 8 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 112 à 143, -C2 est la séquence d'acides aminés de formule (III) suivante :
Y1Y2Y3Y4Y5Y6 (III) dans laquelle, - Y1 est la leucine, la valine, la glycine ou l'alanine, - Y2 est la cystéine, - Y3 est l'alanine, - Y4 est la leucine, l'isoleucine, la glycine ou l'alanine, - Y5 est l'histidine ou l'asparagine, - Y6 est la cystéine, - V2 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 156 à 184, -C3 est la séquence d'acides aminés de formule (IV) suivante :
Z1Z2Z3Z4Z5 (IV) dans laquelle, - Z1 est la valine, la sérine, la thréonine, la lysine, l'arginine ou l'alanine, - Z2 est la glycine, - Z3 est la glycine, - Z4 est la tyrosine, la sérine, la glutamine, la lysine, l'arginine ou l'histidine, - Z5 est la cystéine,

- V3 est une séquence d'acides aminés de 9,10 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 205 à 236.

Un groupe préféré de peptides selon l'invention est celui dans lequel : - Cl est une séquence d'acides aminés de 7 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 99 à 111, - V1 est une séquence d'acides aminés de
7,8 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 112 à 143, - C2 est une séquence d'acides aminés de 6 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 144 à 155, - V2 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 156 à 184, - C3 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 185 à 204, - V3 est une séquence d'acides aminés de
9,10 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 205 à 236.

Un sous-groupe préféré de peptides selon l'invention est celui dans lequel : - Cl est la séquence d'acides aminés SEQ
ID NO : 104, - V1 est une séquence d'acides aminés de 7 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 117 à 128, - C2 est la séquence d'acides aminés SEQ
ID NO : 150,

- V2 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 156 à 184, - C3 est la séquence d'acides aminés SEQ
ID NO : 191, - V3 est une séquence d'acides aminés de
10 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 211 à 225.

Des peptides préférés selon l'invention sont définis par les peptides de séquence suivante :
ETD-P1255 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 245 est la suivante :
ATCDLASGFGVGDSLCAAHCLLRGNRGGYCNSKKVCVCRN
ETD-P1263 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 246 est la suivante :
ATCDLASIFNVNHALCAAHCIARRYRGGYCNSKAVCVCRN
ETD-P1268 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 247 est la suivante :
ATCDLASKWNWNHTLCAAHCIAKGFRGGYCNGKAVCVCRN
ETD-P1354 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 248 est la suivante :
ATCDLASKWNWNHTLCAAHCLAMRRRGGYCNGKGVCVCRN - ETD-P1364 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 249 est la suivante :
ATCDLASKWNWNHTLCAAHCIAIGRRGGYCNGKGVCVCRN - ETD-P1377 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 250 est la suivante :
ATCDLASMWNVNHSLCAAHCLAMRRRGGYCNGKGVCVCRN

- ETD-P1447 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 251 est la suivante :
ATCDLASKWNWNHTLCAAHCILRGKRGGYCTGKGICVCRN - ETD-P1449 dont la séquence en acides aminés représentée dans la liste de séquence sous le numéro SEQ ID
NO : 252 est la suivante :
ATCDLASGFGVGSSLCAAHCILRGKRGGYCNSKAVCVCRN
Les peptides de l'invention présentent avantageusement une structure tridimensionnelle de type cs(xp comportant une hélice a et deux brins (3 antiparallèles reliés par trois ponts disulfures. Les ponts disulfures de type recouvrant sont avantageusement établis entre les cystéines 1 et 4, 2 et 5 et 3 et 6 dans l'ordre de leur position relative au sein de la séquence peptidique.

L'invention concerne également des dérivés des peptides de l'invention. A titre de dérivés des peptides de l'invention, on peut citer les peptides qui présentent une modification post-traductionnelle et/ou modification chimique en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation, une méthylation ainsi que les peptides qui portent un groupement protecteur. On entend par groupement protecteur selon la présente invention, tout groupement permettant d'éviter la dégradation desdits peptides.

Les dérivés des peptides de l'invention peuvent également être ceux dont un ou plusieurs acides aminés sont des énantiomères, des diastéréoisomères, des acides aminés naturels de conformation D, des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine,

la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique et les acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline, la cyclohexyl-alanine et les oméga-acides aminés. L'invention couvre également les rétropeptides et les rétro-inversopeptides, de même que les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité anti-bactérienne des peptides de l'invention.

L'invention concerne aussi des polypeptides constitués par ou comprenant un peptide de l'invention. Ainsi, l'invention envisage un peptide de l'invention comprenant à l'une et/ou l'autre de ses extrémités, un résidu d'acide aminé nécessaire, par exemple à son expression et/ou au ciblage dans un organisme hôte.

Les peptides de l'invention peuvent aussi être préparés par synthèse chimique selon des méthodes conventionnelles.

L'invention concerne également un polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il code pour un peptide de l'invention. On entend par polynucléotide selon la présente invention, une séquence nucléique de type ADN ou ARN, de préférence ADN, notamment double brin.

Selon une forme préférée de l'invention, le polynucléotide isolé codant pour un peptide de l'invention comprend une séquence nucléotidique choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 237 à 244 comme exposés dans la liste de séquence.

L'invention concerne également les polynucléotides isolés qui comprennent des modifications au niveau d'un ou plusieurs nucléotides résultant de la dégénérescence du

code génétique et qui codent pour une même séquence d'acides aminés des peptides de l'invention.

L'invention couvre également les polynucléotides isolés codant pour les peptides de l'invention et capables de s'hybrider dans des conditions stringentes à un des peptides de l'invention. On entend par condition stringentes selon la présente invention, les conditions enseignées par Sambrook et al. (Molecular cloning, 1989, Noland C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) .

L'invention couvre également les séquences nucléotidiques complémentaires des polynucléotides isolés définis ci-dessus ainsi que les ARN correspondants.

L'invention concerne également un gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend au moins, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur constitutif ou inductible fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour un peptide de l'invention et un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte. On entend par liés entre eux de façon opérationnelle selon l'invention, des éléments liés entre eux de façon à ce que le fonctionnement d'un des éléments est affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de façon opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de cette dernière.

L'ensemble des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des peptides que le gène chimère peut comprendre est connu de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction de l'organisme hôte. Le gène chimère peut notamment comprendre à titre d'élément régulateur additionnel, des séquences codant pour un peptide signal ou de transit de façon à diriger la sécrétion des peptides de l'invention dans l'organisme hôte. Lorsque l'organisme

hôte est une levure, ces séquences sont préférentiellement les séquences pré de BGL2 et pro de MF[alpha]1 qui permettent la sécrétion des peptides de l'invention directement dans le milieu de culture. Le gène chimère peut en outre comprendre des séquences codant pour une endoprotéase pour augmenter l'activité protéolytique dans l'organisme hôte durant le processus de sécrétion. Lorsque l'organisme hôte est une levure, ces séquences sont préférentiellement les séquences du gène KEX2 codant pour l'endoprotéase yscf qui permet de cliver la séquence pro du pré-pro-peptide de l'invention durant le processus de sécrétion.

L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide ou un gène chimère selon l'invention pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier un peptide de l'invention. Le vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus en particulier un baculovirus. Le vecteur est avantageusement un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans l'organisme hôte comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans l'organisme hôte comme par exemple un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection qui assurent la complémentation avec le gène respectif délèté au niveau du génome de l'organisme hôte. Le vecteur peut également être un vecteur navette comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans chacun des organismes hôte et des éléments permettant sa sélection dans chacun des organismes hôte. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

L'invention concerne également un organisme hôte caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur de l'invention. Par organisme hôte selon la présente invention, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel un polynucléotide ou un gène chimère de l'invention est introduit pour la production d'un peptide de l'invention.

Selon une forme préférée de l'invention, l'organisme hôte est un microorganisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon. La transformation de tels microorganismes permet de produire les peptides de l'invention à échelle semi-industrielle ou industrielle. A titre de bactérie, l'invention envisage plus particulièrement la bactérie de l'espèce Escherichia coli. A titre de levure, l'invention envisage plus particulièrement une levure de genre Saccharomyces de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, de genre Kluyveromyces de préference de l'espèce Kluyveromyces lactis, de genre Hansenula de préférence de l'espèce Hansenula polymorpha, de genre Pichia de préférence de l'espèce Pichia pastoris ou de genre Schizosaccharomyces de préférence de l'espèce Schizosaccharomyces pombe. A titre de champignon, l'invention envisage plus particulièrement le champignon filamenteux de l'espèce Aspergillus nidulans.

Selon une autre forme de l'invention, l'organisme hôte est une animale, en particulier une cellule d'arthropode (par exemple une cellule de Spodoptera frugiperda ou de Trichoplusia ni) ou une cellule de mammifère.

Selon une autre forme de l'invention, l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante. Par cellule de plante on entend selon la présente invention, toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de

plantes, des plantes ou des semences. Par plante on entend selon 1' invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine.

Les peptides de l'invention sont également utiles pour conférer aux plantes un caractère de résistance aux maladies bactériennes, plus particulièrement dues à des bactéries à Gram positif. L'invention concerne donc également une cellule végétale ou une plante résistante aux maladies bactériennes comprenant un polynucléotide ou un gène chimère de l'invention et exprimant un peptide de l'invention.

L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés anti-bactériennes des peptides de l'invention pour prévenir et/ou traiter les infections bactériennes, en particulier contre les bactéries à Gram positif tant chez l'homme et l'animal que chez les plantes. L'invention concerne donc avantageusement l'utilisation des peptides de l'invention à titre de médicament en thérapie humaine et animale. Elle concerne également l'utilisation des peptides de l'invention pour le traitement des plantes contre les infections bactériennes, en appliquant le ou les peptides de l'invention directement sur les plantes.

L'invention concerne aussi une composition antibactérienne comprenant au moins un peptide de l'invention avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. La composition agit plus particulièrement contre les bactéries à Gram positif. Lorsque la composition est appliquée à la thérapie humaine, les bactéries Gram positif sont de préférence de genre Staphylococcus en particulier Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, de genre Streptococcus en

particulier Streptococcus pneumoniae, de genre Enterococcus en particulier Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium ou de genre Mycobacterium en particulier Mycobacterium tuberculosis. Par véhicule , on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée au (x) de l'invention pour favoriser le transport du ou des peptides, éviter leur dégradation substantielle dans ladite composition et préserver leurs propriétés anti-bactériennes. Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition.

Notamment, lorsque la composition est appliquée à un usage pharmaceutique en santé humaine et animale, le véhicule est un véhicule pharmaceutiquement acceptable adapté à une administration du ou des peptides de l'invention par voie topique, per os ou par injection. Lorsque la composition est appliquée à un usage cosmétique, le véhicule est un véhicule cosmétiquement acceptable adapté à une administration sur la peau ou les phanères. Lorsque la composition est appliquée à un usage agrochimique, le véhicule est un véhicule agrochimiquement acceptable adapté à une administration sur les plantes ou à proximité des plantes sans les dégrader.

Les peptides ou la composition de l'invention présentent également un intérêt dans l'industrie agroalimentaire. Leur utilisation permet notamment d'empêcher la contamination par les germes bactériens, en particulier à Gram positif pendant leur fabrication et après leur fabrication pour leur conservation.

Dans l'industrie phytosanitaire, les peptides ou la composition de l'invention peuvent également être utilisé pour la fabrication des produits phytosanitaires en lieu et place des produits usuels.

Les défensines d'insectes hybrides de la présente invention présentent l'avantage d'être préparés rapidement

tout en conservant la conformation native de type cs[alpha]ss caractéristique des défensines d'insectes dont ells sont issues. Les étapes de culture et/ou collecte d'insectes, d'induction de synthèse biologique de peptides antimicrobiens par blessure septique ou injection à chacun d'eux d'une faible dose de bactérie et d'extraction étant désormais inutiles, l'utilisateur gagne d'autant plus de temps que le procédé développé par la demanderesse lui permet aussi d'accélérer l'évolution artificielle des gènes codant les défensines d'insectes.

L'analyse de l'état de la technique dans le domaine des peptides anti-microbiens d'insectes ne permettait pas quant à elle de déduire que les défensines d'insectes hybrides de l'invention présenteraient un spectre d'activité semblable à celui des défensines d'insectes à partir desquelles elles sont issues. L'état de l'art antérieur enseigne au contraire que des peptides structuralement proches peuvent présenter un spectre d'activité différent. Notamment, les défensines d'insectes et l'héliomicine qui sont tous les 2 des peptides présentant une structure tridimentionnelle de type CSap et qui comprennent 3 ponts disulfures intramoléculaires, présentent un spectre d'action totalement divergent. L'héliomicine présente en effet essentiellement des propriétés antifongiques (W099/53053) alors que les défensines d'insectes ont une action spécifiquement dirigée contre les bactéries à Gram positif.

D'autres avantages et caractéristiques du procédé de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de défensines d'insectes hydrides présentant des propriétés anti-bactériennes et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :

-La figure 1 représente l'alignement des séquences peptidiques de 40 défensines d'insectes ; -La figure 2 représente la modélisation de la structure tridimensionnelle de la défensine du diptère Anopheles gambiae ; -La figure 3 représente la liste des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants utilisées à l'étape (a) d'assemblage; -La figure 4 représente la construction d'une banque de défensines d'insectes hybrides; -La figure 5 représente le vecteur d'expression de levure S. cerevisiae pEM105 ; -La figure 6 représente les activités in vitro (IC90 g/ml) des défensines d'insectes hybrides contre Staphylococcus aureus ; -La figure 7 représente l'efficacité in vivo (pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection) des défensines d'insectes hybrides ETD-P1255, ETD-P1263 et ETD-P1268 dans le modèle murin de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline-sensible avec administration par voie intra-péritonéale; -La figure 8 représente l'efficacité in vivo (pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection) des défensines d'insectes hybrides ETD-P1255, ETD-P1263 et ETD-P1268 dans le modèle murin de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline-sensible avec administration par voie intra-veineuse; -La figure 9 représente l'efficacité in vivo (pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection) de la défensine

d'insecte hybride ETD-P1263 dans le modèle murin de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline- résistant avec administration par voie intra- péritonéale.

Exemple 1 : Préparation d'une banque de défensines d'insectes hybrides présentant des propriétés antibactériennes améliorées.

A) Construction de la banque de défensines d'insectes hybrides.

1) Choix des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants et des acides nucléiques simples brins utilisés dans l'étape (a) du procédé.

La figure 1 en annexe représente l'alignement des séquences peptidiques de 40 défensines d'insectes (31 décrites dans la littérature et 9 nouvellement isolées par la demanderesse selon un procédé conventionnel connu de l'homme du métier, notifiées (*) ) issues de 6 ordres d'insectes différents. L'analyse de l'alignement a permis de révéler la présence de 3 régions variables (en caractères gras, figure 1) séparées par des régions substantiellement conservées. 32 séquences différentes ont été identifiées pour la région variable n 1, 28 pour la région variable n 2 et 33 pour la région variable n 3.

Comme l'expose la figure 2 en annexe, les régions variables n 1, n 2 et n 3 correspondent respectivement à la boucle N-terminale, à la boucle située entre l'hélice a et le premier brin (3 et à la boucle C-terminale située entre les 2 brins (3 des défensines d'insectes.

Afin de préparer une banque de mutants associant ces différentes régions, la demanderesse a désigné et synthétisé 94 séquences nucléotidiques simples brins

chevauchants qui couvrent la séquence de tout ou partie de polynucléotides codant une population de départ de défensines d'insectes (les résidus d'acides aminés entre parenthèses sur la figure 1 n'étant pas couverts par les séquences nucléotidiques simples brins chevauchants), pour obtenir à l'issu de l'étape (a) des polynucléotides doubles brins recombinés qui comprennent à leurs extrémités 5' (brin codant) la fin de la séquence pro du facteur MF[alpha]1 de S.cerevisiae et à leurs extrémités 3' (brin codant) le début de la séquence du terminateur de transcription du gène PGK1. Chacune de ces séquences nucléotidiques simples brins est constituée ou comprend : - un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables d'une des défensines d'insectes de la population de départ, ledit segment nucléotidique variable étant flanqué - en 5' par un segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de la région substantiellement conservée de la défensine du diptère Anopheles gambiae de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité N terminale de la région variable, - en 3' par un segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de la région substantiellement conservée de la défensine du diptère Anophèles gambiae de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité C terminale de la région variable, ledit segment nucléotidique étant lui-même éventuellement flanqué en 3' d'une séquence nucléotidique simple brin supplémentaire correspondant au début de la séquence du terminateur de transcription du gène PGK1.

Les séquences nucléotidiques simples brins chevauchants qui comprennent une séquence nucléotidique simple brin supplémentaire correspondant au début de la séquence du terminateur de transcription du gène PGK1 sont les séquences nucléotidiques simples brins chevauchants

constituant les extrémités 3' (brin codant) des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a) c'est-à-dire celles qui sont constituées ou comprennent des segments nucléotidiques internes codant la séquence en acides aminés d'une des régions variables n 3 des défensines d'insectes de la population de départ.

La listes des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants est exposée sur la figure 3. Les séquences nucléotidiques simples brins chevauchants sont décrites dans la liste de séquence sous les identificateurs de séquences SEQ ID NO : 1 à 94.

3 séries d'acides nucléiques simples brins ont également été synthétisés : EM363 (SEQ ID NO : 95), EM351 (SEQ ID NO : 96) et EM357 (SEQ ID NO : 97).

L'acide nucléique simple brin EM363 est constitué d'une première région qui est complémentaire de la séquence du segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de la région substantiellement conservée de la défensine du diptère Anopheles gambiae de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité N terminale de la région variable n 1 codée par le segment nucléotidique interne, des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants constituant l'extrémité 3' (brin codant) des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a). L'acide nucléique simple brin EM363 est également constitué d'une seconde région qui correspond à une première partie de la fin de la séquence pro du facteur MF(Xl de S.cerevisiae.

L'acide nucléique simple brin EM351 est constitué d'une première région qui est complémentaire de la seconde région de l'acide nucléique EM363 et d'une seconde région qui correspond au reste de la fin de la séquence pro du facteur MF[alpha]1 de S. cerevisiae.

L'acide nucléique simple brin EM357 est constitué d'une première région qui est complémentaire de la

séquence correspondant au début du terminateur de transcription du gène PGK1 des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants constituant les extrémités 3' (brin codant) des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a). L'acide nucléique simple brin EM357 est également constitué d'une seconde région qui correspond au reste du début du terminateur de transcription du gène PGK1.

Les acides nucléiques simples brins EM351, EM357 et EM363 sont utilisés pour reconstituer des séquences permettant l'insertion des séquences nucléidiques simples brins assemblées dans l'étape (a) du procédé, dans le vecteur d'expression et de sécrétion de levure S. cerevisiae pEM105. L'acide nucléique simple brin EM357 est également utilisé en tant qu'amorce dans l'étape (b) du procédé.

2) Etape d'assemblage (a) du procédé.

L'étape (a) d'assemblage est réalisée par PCR comme l'expose la figure 4 en annexe. Les acides nucléiques simples brins EM351, EM357 et EM363 sont utilisés à une concentration de 10 picomoles dans un volume réactionnel final de 60 l. Des mélanges de séquences nucléotidiques simples brins chevauchants sont utilisés à raison de 10 picomoles pour chacune des séries de séquences nucléotidiques simples brins suivantes : picomoles par séquence nucléotidique simple brin constituée ou comportant un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables n 1 d'une des défensines d'insectes de la population de départ ; 0,36 picomoles par séquence nucléotidique simple brin constituée ou comportant un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables n 2 d'une des défensines d'insectes de la population de départ et 0,30 picomoles par séquence

nucléotidique simple brin constituée ou comportant un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables n 3 d'une des défensines d'insectes de la population de départ.

La réaction de PCR d'assemblage débute par la dénaturation à une température de 94 C pendant 3 minutes. Les étapes suivantes sont répétées 5 fois : i) dénaturation à une température de 94 C pendant 45 secondes, ii) hybridation à une température de 50 C pendant 45 secondes, iii) extension en présence d'une polymérase à une température de 72 C pendant 45 secondes.

La réaction PCR s'achève par une étape d'extension en présence d'une polymérase à une température de 72 C pendant 10 minutes.

A l'issu de l'étape (a), on obtient des polynucléotides doubles brins recombinés qui comprennent à leurs extrémités 5' (brin codant) la fin de la séquence pro du facteur MF[alpha]1 de S.cerevisiae et à leurs extrémités 3' (brin codant) le début de la séquence du terminateur de transcription du gène PGK1.

3) Etape (b) du procédé.

Les polynucléotides doubles brins recombinés issus de l'étape (a) d'assemblage sont ensuite amplifiés en présence de 2 des amorces EM349 (SEQ ID NO : 98) et EM357 (SEQ ID NO : 97) (Figure 4). Ces deux amorces comprennent une séquence complémentaire respectivement de chacune des extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés issus de l'étape (a) et une séquence de 30 nucléotides complémentaires des extrémités du vecteur d'expression de levure S. cerevisiae pEM105 linéarisé.

L'étape (b) du procédé de l'invention débute par la dénaturation à une température de 94 C pendant 3 minutes.

Les étapes suivantes sont répétées 25 fois : i) dénaturation à une température de 94 C pendant 45 secondes, ii) hybridation à une température de 60 C pendant 45 secondes, iii) extension en présence d'une polymérase à une température de 72 C pendant 45 secondes.

La réaction d'amplification s'achève par une étape d'extension en présence d'une polymérase à une température de 72 C pendant 10 minutes.

L'étape (b) du procédé conduit à la génération de polynucléotides doubles brins recombinés présentant des extensions capables de s'hybrider avec les extrémités du vecteur d'expression de levure S. cerevisiae pEM105 linéarisé.

4) Construction de la banque d'expression par cotransformation d'une souche de levure S. cerevisiae.

Le vecteur d'expression de levure S . cerevisiae pEM105 (Figure 5) porteur du promoteur constitutif fort TDH3 (glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase) fusionné aux séquences codant pour les signaux de sécrétion pré de BGL2 (Béta-1,3 glucanase) et pro du facteur MF[alpha]1 de S.cerevisiae et du terminateur de transcription du gène PGK1 (phosphoglycérate kinase) a été construit. Il porte également des séquences permettant sa réplication et sa sélection dans la levure (2 ori et URA3) et dans E.coli (ColEl ori et Ampr) ainsi que le gène KEX2 codant pour l'endoprotéase Yscf qui clive la pro séquence durant le processus de sécrétion (expression de KEX2 génomique insuffisante). Ce vecteur porte 2 sites de restriction uniques NheI et Sali permettant sa

linéarisation. Le site Nhel est localisé dans la séquence codant pour le pro de MF[alpha]1 (mutation silencieuse introduite au niveau de la séquence codant pour les résidus 51 à 52 du pro de MFal) et le site Sali est en amont du terminateur PGK1. Une souche de levure YEM1 (MATa, ura3-5, pral,prbl,prcl,cpsl) a été co-transformée par le plasmide pEM105 digéré par Sali et NheI et le pool de polynucléotides doubles brins recombinés présentant des extensions obtenus après l'étape (b) du procédé (1 g de pEM105 digéré par NheI et SalI + 115ng de fragment PCR par transformation) . La transformation a été réalisée par la méthode à l'acétate de lithium connue de l'homme du métier. Les transformants ont été sélectionnés sur milieu sélectif YNBG supplémenté de 0,5% de casamino acides. En vue de vérifier la qualité de la banque, 100 transformants ont été analysés pour la production de peptide après croissance en milieu sélectif Kapeli (14,2g KH2P04 SDS 2370017 ; 4g MgS04 SDS 460012 ; l,6mL H3P04 ; 1mL d'une solution d'oligoéléments : 16g MnS04, H20, 0,4g CuS04, 5H2O, 15g ZnS04,7H20, 2,8g CoCl2, 6H20, 2,48g Na2Mo04, 7,5g H3B03, 0,2g Acide citrique, 1g KCl, 2,5g NiS04, 6H20, 25g Trisidium citrate 2H20, qsp 200mL ; 400mL glucose à 500g/L ; 1mL FeCl3/CaCl2 ; 500mL de Casaaminoacids à 200g/L ; lOmL d'une solution de vitamines : 0,2g Thiamine HC1, 0,5g Pyridoxine HC1, 0,8g Acide nicotinique, 0,005g D-Biotine, 1g Ca-D-Pantothénate, 8g Méso Inositol, qsp 200mL; qsp 5L) . Les surnageants de culture récoltés après 48 heures de croissance ont été analysés par électrophorèse sur gel d'acrylamide (gel Tris-tricine) et coloration des protéines au nitrate d'argent. Une production de peptides a été détectée dans 65% de ces clones. 45 clones produisant des défensines d'insectes hybrides ont été analysés par séquençage nucléotidique. 45 défensines d'insectes hybrides différentes ont pu être caractérisées : 22 séquences différentes parmi les 32

possibilités ont été identifiées pour la région variable n 1, 24 séquences différentes parmi les 28 possibilités ont été identifiées pour la région variable n 2 et 20 séquences différentes parmi les 33 possibilités ont été identifiées pour la région variable n 3.

B) Criblage et sélection des défensines d'insectes hybrides présentant une activité contre les bactéries à Gram positif Staphylococcus aureus.

1) Culture et isolement.

La banque de défensines d'insectes hybrides obtenue selon le protocole précédemment décrit dans la partie A, est étalée sur des boîtes de Pétri (YNBG casamino acides agar). Le nombre de clones par boîte est choisi de manière à former des colonies isolées. Ces colonies sont piquées et mises en culture automatiquement en microplaques 384 puits, dans 60 l de milieu (YNBG, casamino acides, 13% glycérol). Les plaques sont incubées à 30 C durant 72h, puis deux copies sont stockées à -80 C, et une autre copie est conservée à 4 C avant de servir à la suite du processus.

2) Culture et production.

A partir d'une plaque 384 puits, on ensemence 4 plaques 96 puits DeepWell contenant lml de milieu de culture Kapeli. Les plaques Deepwell sont couvertes d'une membrane perméable aux gaz et sont mises à incuber à 30 C sous agitation durant 96h. Au bout de 72h, on fait une adjonction de 100 pl de glucose à 500 g/1 par puits.

3) Purification.

On ajoute lml d'eau ultra pure stérile dans tous les puits des plaques 96 puits. Ces plaques sont ensuite centrifugées pendant 30 min à 4000 rpm et à 20 C. Le

surnageant est purifié sur des plaques Oasis HLB (WATERS) : 1.3ml de surnageant sont déposés sur chacune des 96 microcolonnes, soumises à un tirage sous vide pour faire passer le liquide. Un lavage avec 800 l par colonne d'eau supplémentée à 0,05% de TFA. L'élution est réalisé avec 500 ul d'acétonitrile à 60% supplémenté de Trifluoroacétate (TFA) à 0,05%. L'éluat est récupéré dans une plaque DeepWell 96 puits 1ml.

4) Evaporation du solvant.

Le solvant d'élution est ensuite évaporé sous vide (30 C, 9 mbars, 11h). Les plaques sont alors couvertes d'un film silicone autocollant et stockées à 4 C.

5) Analyse par Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) sur colonne de phase inverse : Contrôle de masse et quantification en vue des tests d'activité.

L'équivalent de 40 à 200 l de surnageant purifié selon la précédente étape, est analysé par CLHP (type Alliance, Waters Associates) couplée à la spectrométrie de masse (type ZQ 2000, Waters Associates), pilotée par le logiciel Masslynx (Waters Associates). Les échantillons sont injectés de manière automatique et séquentielle (injecteur 2790, Waters Associates) sur une colonne analytique de type Uptisphère de 250 x 4,6 mm, remplie de silice avec un greffage C18 (phase inverse) de granulométrie de 5p et de porosité de 300 A (Interchim).

L'élution est réalisée par un gradient d'acétonitrile dans le TFA 0,05% de 15 à 60 % en 30 min. avec un débit constant de 0,8 ml/min.

Le spectre UV (variation d'absorbance à 225 nm ; détecteur à barrette de diodes de type 996, Waters Associates) et le spectre de masse de chaque échantillon sont analysés individuellement. La masse correspondant à chaque pic du spectre UV est calculée par un logiciel de

déconvolution (logiciel Transform, Waters Associâtes). Lorsque la masse mesurée correspond à la masse théorique (gamme de 3500 à 5500 pour les défensines d'insectes), le pic d'intérêt est intégré par le logiciel Masslynx puis quantifié.

La quantification se fait par rapport à une courbe de calibration (aire du pic en fonction de la quantité d'échantillon) établie par injection de quantités connues de la défensine d'Anophèles gambiae dans les mêmes conditions d'analyse. La quantification des défensines hybrides (en g) est calculée par intégration individuelle du pic du chromatogramme correspondant à chaque défensine hybride.

6) Préparation de l'inoculum de Staphylococcus aureus.

Une préculture dans 4 ml de milieu LB, est obtenue par ensemencement d'une colonie de Staphylococcus aureus (souche clinique 21, sensible à : amoxicilline, pristinamycine, érythromycine, péfloxacine, sulfaméthoxazole, triméthoprime, kanamycine, acide fusidique, fosfomycine, gentamycine, amikacine, rifampicine, oxacilline, teicoplanine, chloramphénicol, imipénème, vancomycine et méthicilline;; Don de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) et incubée à 37 C sous agitation pendant 16h. 200 ul de cette préculture sont distribués dans 8 tubes de 4 ml de milieu LB, puis incubés 4h à 37 C sous agitation pour obtenir la solution primaire. Un inoculum est réalisé par dilution de cette solution primaire (environ au 1/100ème), de manière à obtenir une concentration en Staphylococcus aureus de 1,1.106 bactéries/ml. Les concentrations sont calculées par mesure de la DO à 600 nm de la solution primaire selon la formule : en Staphylococcus aureus = 5,25.108 x DO - 3.107 (pour des DO allant de 0,05 à 0,3 environ) et contrôlées par via une dilution en cascade

(10-1, 10-2, 10-3,... ) de la suspension à 2.106/ml et comptage des Unités Formant Colonies (UFC) après étalement de 100 L des dilutions 10-6, 10-5 et 10-4 sur des boîtes LB agar. Après incubation à 30 C pendant 16 à 18 heures, les colonies sont dénombrées (UFC/ml).

7) Criblage ou sélection des échantillons.

Les échantillons séchés sont repris dans 200pl d'eau et testés à 3 dilutions différentes : 40 l, 25 l et 16 l de ces échantillons sont distribués dans les plaques de test avant ajout de 180ul d'inoculum par puits. Les microplaques sont incubées à 30 C durant 16 à 18h, puis la densité optique (DO) des puits est mesurée à 595 nm. Les résultats sont interprétés en calculant le pourcentage de pousse pour chaque puits selon la formule : %Pousse=(DO puits - DO du TS)/(DO du TP - DO du TS)*100 où DO du TP= DO du témoin de pousse (inoculum seul), DO du TS= DO du témoin de stérilité (milieu de culture sans bactéries) et DO puits = DO du puits dont on souhaite calculer le pourcentage de pousse (inoculum + défensine d'insecte hybride). Les défensines d'insectes hybrides sont considérées comme actives lorsque le pourcentage de pousse est inférieur ou égal à 10.

C) Activités anti-bactériennes in vitro.

Les activités anti-bactériennes de chacune des défensines d'insectes hybrides (ETD-P) ont été évaluées par détermination de l'IC90 (Inhibition de Croissance > à 90%). Les activités de chacune des défensines hybrides sont comparées à celles de la défensine du 1) Isolement.

Les clones de défensines hybrides d'intérêt, identifiées selon le protocole précédemment décrit dans la

partie B), sont repris d'un des stocks de microplaques 384 puits conservées à -80 C (partie B), paragraphe 1)). Un ensemencement est réalisé sur une gélose YNBG Casamino acides agar et placée dans un incubateur à 30 C pendant 48 à 72 heures. Après observation de l'état de pousse des levures, une colonie est isolée, étalée sur une boîte YNBG Casamino acides agar et incubée pendant 24 à 48 heures à 30 C. L'expression est contrôlée par PCR.

2) Production.

Une préculture est préparée par mise en suspension d'une colonie dans 4mL de milieu Kapeli puis la préculture est incubée pendant 18 à 24 heures à 30 C sous agitation.

50mL de milieu Kapeli sont répartis dans des fioles de 500mL.

La DO des précultures est mesurée à une dilution au 1/100ème (990 L d'eau + 10 L de préculture homogénéisée) pour déterminer la DO de la préculture non diluée. La préculture est ensuite diluée de façon à obtenir une solution de DO=0.05 selon la formule : d=0.05/DO préculture non diluée. Un volume de la préculture, défini selon la formule V (préculture) =50/d, est ajouté aux 50mL de milieu Kapeli pour obtenir une solution de DO=0.05. Les fioles sont mises à incuber à 30 C pendant 48H sous agitation (250rpm/min).

3) Purification.

La culture obtenue est centrifugée dans des tubes coniques à centrifuger 50mL pendant 15min à 4000tr/min. Le surnageant est transvasé dans un autre tube 50mL et est purifié avec le Sep-pack , sur Oasis HLB lg de phase selon les étapes suivantes : Equilibrage de la phase avec 15mL de méthanol pur, lavage avec 15mL de mélange eau/TFA 0.05%, chargement du surnageant à purifier, lavage avec 15mL de mélange eau/TFA 0.05% et élution avec lOmL de

mélange eau/Acétonitrile 60%/TFA 0. 05%. Le mélange Acétonitrile/H20 est évaporé sous vide (30 C, 9 mbars, 24 heures) puis les échantillons sont repris dans 400uL d'eau et disposés sur un agitateur.

4) Quantification et contrôle de masse en vue des tests d'activité.

La quantification et le contrôle de masse est réalisé selon le protocole précédemment décrit dans la partie B), paragraphe 5).

5) Détermination des IC90.

La détermination des IC90 se fait par un test liquide en microplaques 96 puits. Le test est réalisé sur des souches bactériennes à Gram positif Staphylococcus aureus sensibles (souche clinique 21 ; de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) et résistantes (souche clinique 4 ; Don du Dr. Gilles Prevost, Institut de Bactériologie, Strasbourg) de façon à obtenir un inoculum selon le protocole décrit dans la partie B) paragraphe 6). 100 l d'échantillons à tester sont distribués en duplicats de façon à obtenir une gamme de concentration de 25 à 0,05 ug/ml dans les puits. Les échantillons sont ajoutés à de 100 l de suspension bactérienne à 2.106/ml dans chaque puits de façon à obtenir une concentration finale de 106/ml. Les plaques de microtitration sont incubées à 30 C pendant 16 à 18 heures. Les colonies sont dénombrées par comptage des UFC (Unités Formant Colonies) et le résultat est rapporté en UFC/ml. La densité optique des puits est mesurée à 600 nm et les résultats sont interprétés en calculant le pourcentage de pousse dans chaque puits selon la formule décrite partie B) paragraphe 7). Les inhibitions de croissance 90 (IC 90) sont les puits où le pourcentage de

pousse est inférieur ou égal à 10%. Les résultats sont exposés dans la figure 6 en annexe.

D) Efficacité in vivo.

1) Protocole - Modèle de péritonite à Staphylococcus aureus.

L'efficacité des différentes défensines d'insectes hybrides (ETD-P), de la défensine d'Anopheles gambiae (DefA) et des antibiotiques conventionnels (Imipénème, IMP et Vancomycine, Van) a été évaluée in vivo chez la souris dans un modèle de péritonite à Staphylococcus aureus. Les échantillons testés ont été produits et purifiés selon le protocole précédemment décrit. Les souches de Staphylococcus aureus méthicilline-sensibles (MSSA) (Souche clinique 21 ; Don de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) ou méthicilline- résistantes (MRSA) (Souche clinique 4 ; du Dr. Gilles Prevost, Institut de Bactériologie, Strasbourg) sont mises en culture une nuit à 37 C dans du milieu Müller-Hinton. Les bactéries sont lavées et reprises dans une solution de NaCl 0.9%. Après quantification par mesure de DO à 600 nm, les bactéries sont diluées pour obtenir une densité bactérienne de 2.109CFU/ml. La suspension bactérienne est ensuite diluée au demi avec une solution de NaCl 0.9% contenant 10% de mucin gastrique.

Des groupes de 6 souris mâles OF1 de 19-20 g sont infectées par voie intra-péritonéale avec 500 l de la suspension de S. aureus contenant 5.108 CFU dans du NaCl 0. 9%, 5% mucin. Les traitements par les échantillons sont réalisés une heure après l'infection par une seule injection par voie intra-péritonéale ou intra-veineuse dans le cas des défensines (ETD- et DefA) et de la Vancomycine (Vanco), ou par voie sous-cutanée dans le cas de l'Imipénème (IMP). Des expériences témoins (placebo)

sont réalisées systématiquement dans lesquelles les volumes d'échantillon sont remplacés par du NaCl 0,9%.

L'efficacité thérapeutique des traitements est évaluée par plusieurs critères : le pourcentage de survie au jour 7 après l'infection, l'évolution du poids corporel et du score de santé. Ce dernier paramètre, relatif à l'état de santé des souris, tient compte de l'état du pelage, de la mobilité, de l'état d'hydratation, de la présence ou non de diarrhée. Il est défini comme suit par une valeur de 0 à 5 : 0 = morte, 1 = moribonde, 2 = très malade, 3 = malade, 4 = légèrement malade et 5 = saine.

2) Comparaison de l'efficacité des défensines hybrides ETD-P1255, ETD-P1263 et ETD-P1268 avec celle de la défensine d'Anopheles gambiae (DefA) et de l'Imipénème (IMP) dans le modèle de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline-sensible (MSSA).

-Administration par voieintra-péritonéale.

La figure 7 en annexe représente le pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection. Dans cette expérience, la DefA et les 3 défensines hybrides administrées en dose unique de 3 mg/kg par voie intra-péritonéale, présentent une bonne efficacité thérapeutique dans un modèle où toutes les souris témoins traitées par le placebo (NaCl 0,9%) sont mortes 2 à 5 jours après l'infection. Seule 1 souris sur 6 est morte dans les groupes traités par la DefA, ETD-P1263 et ETD-P1268. Aucune mortalité n'a été observée dans le groupe traité par ETD-P1255. L'analyse des scores de santé et de l'évolution pondérale, montre qu'ETD-P1255 et ETDP1263 sont plus actifs que la DefA : les souris traitées par ETD-P1263 et ETD-P1255 récupèrent plus rapidement que les souris traitées par les autres défensines hybrides, avec un score de santé moyen de 4 à 5 dès le premier jour suivant l'infection.

-Administration par voie intra-veineuse.

La figure 8 en annexe représente le pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection. Dans cette expérience, la DefA et les 3 défensines hybrides administrées en dose unique de 3 mg/kg par voie intra-veineuse, présentent une efficacité thérapeutique plus faible comparativement à leur administration par voie intra-péritonéale. Alors que 50% des souris traitées par le placebo (NaCl 0,9%) sont mortes 3 jours après l'infection, seul le traitement par l'ETDP1263 est totalement efficace avec une reprise de poids dès le 2ème jour après l'infection et un score de santé maximal (5/5) au jour 5 après l'infection. ETD-P1255 présente une bonne efficacité en termes de survie avec 84 % de survie comparé à 67% pour les groupes traités par la DefA et les autres défensines hybrides. L'analyse des courbes de poids et des scores de santé montre toutefois qu'ETD-1255 est moins efficace que la DefA.

3) Comparaison de l'efficacité de la défensine hybride ETD-1263 avec celle de la défensine d'Anopheles gambiae (DefA) et de la Vancomycine (Van) dans le modèle de péritonite à Staphylococcus aureus méthicillinerésistante (MRSA) -Administration par voie intrapéritonéale.

La figure 9 en annexe représente le pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection. Dans un modèle où 100% des souris traitées par le placebo (NaCl 0,9%) sont mortes au jour 3 après l'infection, ETD-1263 présente une très bonne efficacité thérapeutique à une dose de 3 mg/kg administrée par voie intra-péritonéale. A l'exception d'une souris morte, toutes les souris traitées ont repris rapidement du poids et retrouvent un bon état de santé dès le 2èmejour après l'infection. L'efficacité d'ETD-P1263 à la dose de 3 mg/kg

est comparable à celle de la DefA à la dose de 10 mg/kg et de la Vancomycine à la dose de 10 ou 30 mg/kg, l'évolution du poids et des scores de santé étant très similaire pour ces quatre groupes de traitement.

Claims

l)Peptide isolé caractérisé en ce qu'il répond à la formule (I) suivante:

Cl V1 C2 V2 C3 V3 (I) dans laquelle, - Cl, V1, C2, V2, C3 et V3 représentent des séquences d'acides aminés, - Cl est la séquence d'acides aminés de formule (II) suivante : X1X2X3X4XSX6X7 (II) dans laquelle, - X1 est la valine, l'isoleucine, la phénylalanine ou l'alanine, - X2 est la sérine ou la thréonine, - X3 est la cystéine, - X4 est l'acide aspartique, - X5 est la valine, la leucine, l'isoleucine ou l'alanine,

X6 est la leucine, la phénylalanine ou l'alanine, - X7 est la sérine ou la glycine, - V1 est une séquence d'acides aminés de 7,8 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 112 à 143, -C2 est la séquence d'acides aminés de formule (III) suivante :

Y1Y2YY3Y4Y5Y6 (III) dans laquelle, - Y1 est la leucine, la valine, la glycine ou l'alanine, - Y2 est la cystéine, - Y3 est l'alanine,

<Desc/Clms Page number 43>

- Y4 est la leucine, l'isoleucine, la glycine ou l'alanine, - Y5 est l'histidine ou l'asparagine, - Y6 est la cystéine, - V2 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 156 à 184, -C3 est la séquence d'acides aminés de formule (IV) suivante :

Z1Z2Z3Z4Z5 (IV) dans laquelle, - Z1 est la valine, la sérine, la thréonine, la lysine, l'arginine ou l'alanine, - Z2 est la glycine, - Z3 est la glycine, - Z4 est la tyrosine, la sérine, la glutamine, la lysine, l'arginine ou l'histidine, - Z5 est la cystéine, - V3 est une séquence d'acides aminés de 9, 10 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 205 à 236.

2) Peptide isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce que : - Cl est une séquence d'acides aminés de 7 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 99 à 111, - VI est une séquence d'acides aminés de 7,

8 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 112 à 143, - C2 est une séquence d'acides aminés de 6 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 144 à 155,

<Desc/Clms Page number 44>

- V2 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 156 à 184, - C3 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 185 à 204, - V3 est une séquence d'acides aminés de 9,10 ou 11 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 205 à 236.

3) Peptide isolé selon la revendication 2, caractérisé en ce que : - Cl est la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 104, - VI est une séquence d'acides aminés de 7 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 117 à 128, - C2 est la séquence d'acides aminés SEQ ID NO :

150, - V2 est une séquence d'acides aminés de 5 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 156 à 184, - C3 est la séquence d'acides aminés SEQ ID NO :

191, - V3 est une séquence d'acides aminés de 10 résidus d'acides aminées choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 211 à 225.

4) Peptide isolé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des séquences suivantes :

ETD-P1255 ATCDLASGFGVGDSLCAAHCLLRGNRGGYCNSKKVCVCRN

ETD-P1263 ATCDLASIFNVNHALCAAHCIARRYRGGYCNSKAVCVCRN

ETD-P1268 ATCDLASKWNWNHTLCAAHCIAKGFRGGYCNGKAVCVCRN

<Desc/Clms Page number 45>

ETD-P1354 ATCDLASKWNWNHTLCAAHCLAMRRRGGYCNGKGVCVCRN

ETD-P1364 ATCDLASKWNWNHTLCAAHCIAIGRRGGYCNGKGVCVCRN

ETD-P1377 ATCDLASMWNVNHSLCAAHCLAMRRRGGYCNGKGVCVCRN

ETD-P1447 ATCDLASKWNWNHTLCAAHCILRGKRGGYCTGKGICVCRN

ETD-P1449 ATCDLASGFGVGSSLCAAHCILRGKRGGYCNSKAVCVCRN

5) Peptide isolé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une structure tridimensionnelle comportant une hélice a et deux brins (3 antiparallèles reliés par trois ponts disulfures.

6) Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications de 1 à 5.

7) Polynucléotide isolé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique décrite par l'un quelconque des identificateurs de séquences SEQ ID NO : 237 à 244.

8) Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il s'hybride à un polynucléotide selon la revendication 6 ou 7.

9) Gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend au moins, liés entre eux de façon opérationnelle : -un promoteur constitutif ou inductible fonctionnel dans un organisme hôte, -un polynucléotide codant pour un peptide selon l'une des revendications de 6 à 8, et -un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte.

<Desc/Clms Page number 46>

10) Gène chimère selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un peptide signal ou de transit fonctionnel dans ledit organisme hôte.

11) Vecteur d'expression et/ou de clonage caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide selon l'une des revendications de 6 à 8 ou un gène chimère selon la revendication 9 ou 10.

12) Vecteur d'expression et/ou de clonage selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est un plasmide, un cosmide ou un bactériophage.

13) Vecteur d'expression et/ou de clonage selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est un virus en particulier un baculovirus.

14) Organisme hôte caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur selon l'une des revendications de 11 à 13.

15) Organisme hôte selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est un microorganisme.

16) Organisme hôte selon la revendication 15, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure de genre Saccharomyces de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, de genre Kluyveromyces de préférence de l'espèce Kluyveromyces lactis, de genre Hansenula de préférence de l'espèce Hansenula polymorpha, de genre Pichia de préférence de l'espèce Pichia pastoris ou de genre Schizosaccharomyces de préférence de l'espèce Schizosaccharomyces pombe.

<Desc/Clms Page number 47>

17) Organisme hôte selon la revendication 15, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie, de préférence de l'espèce Escherichia coli.

18) Organisme hôte selon la revendication 15, caractérisé en ce que le microorganisme est un champignon de préférence de l'espèce Aspergillus nidulans.

19) Organisme hôte selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule d'arthropode de préférence de Spodoptera frugiperda ou de Trichoplusia ni.

20) Organisme hôte selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule de mammifère.

21) Organisme hôte selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante.

22) Cellule végétale ou plante résistante aux maladies bactériennes transformée à l'aide d'un polynucléotide selon l'une des revendications de 6 à 8 ou d'un gène chimère selon l'une des revendications 9 ou 10, et exprime un peptide selon l'une des revendications de 1 à 5.

23) Composition anti-bactérienne caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications de 1 à 5, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable.

<Desc/Clms Page number 48>

24) Composition selon la revendication 23, caractérisée en qu'elle agit plus particulièrement contre les bactéries à Gram positif.

25) Composition selon la revendication 24, caractérisée en que les bactéries à Gram positif sont de préférence de genre Staphylococcus en particulier Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, de genre Streptococcus en particulier Streptococcus pneumoniae, de genre Enterococcus en particulier Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium ou de genre Mycobacterium en particulier Mycobacterium tuberculosis.

26) Composition selon l'une quelconque des revendications de 23 à 25 pour être utilisée chez l'homme ou l'animal.

27) Composition selon l'une quelconque des revendications de 23 à 25 pour être utilisée chez les plantes.