FR2850656A1 - Peptide antifongique, polypeptide comprenant ledit peptide, gene codant ledit peptide, vecteur, organisme transforme et composition le contenant - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un peptide isolé caractérisé en ce qu'il répond à la séquence suivante : C I K N G N G C Q P N G S Q G N C C S G Y C H K Q P G W V A G Y C R R K (SEQ ID NO :1), ses dérivés et ses fragments. L'invention concerne également un polypeptide comprenant ledit peptide, un polynucléotide codant ledit peptide, un gène chimère, un vecteur contenant ledit polynucléotide ou ledit gène chimère et un organisme transformé. L'invention concerne également une composition antifongique contenant ledit peptide de l'invention utilisable en thérapie humaine et animale, en agriculture ainsi que dans l'industrie agroalimentaire et phytosanitaire.

Description

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PEPTIDE ANTIFONGIQUE, POLYPEPTIDE COMPRENANT LEDIT PEPTIDE, GENE CODANT LEDIT PEPTIDE, VECTEUR, ORGANISME TRANSFORME ET
COMPOSITION LE CONTENANT.

La présente invention a pour objet un nouveau peptide présentant des propriétés antifongiques, un polypeptide comprenant ledit peptide, un polynucléotide codant ledit peptide, un gène chimère, un vecteur contenant ledit polynucléotide ou ledit gène chimère et un organisme transformé. L'invention concerne également une composition antifongique contenant ledit peptide utilisable en thérapie humaine et animale, en agriculture ainsi que dans l'industrie agroalimentaire et phytosanitaire.

Tant en santé humaine et animale qu'en santé végétale, le besoin de nouvelles molécules permettant de lutter contre les infections d'origine fongique est grandissant. En santé humaine, les infections nosocomiales d'origine fongique constituent des infections graves qui affectent les patients hospitalisés. Elles s'avèrent particulièrement redoutables pour les patients dont le système immunitaire est fragilisé suite à des traitements comme la corticothérapie ou la chimiothérapie, des interventions comme des transplantations ou des maladies affectant le système immunitaire telles le Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise. Le programme de surveillance des infections du sang liées aux levures de genre Candida (SENTRY) mené sur le territoire des Etats-Unis, du Canada, de l'Amérique latine et de l'Europe entre 1997 et 1999 fait état de la prédominance des levures d'espèce Candida albicans et Candida glabrata dans le développement de ces infections. Au niveau mondial, 55% des infections du sang sont causées par les levures Candida albicans, immédiatement suivies par Candida glabrata (15%). Sur le

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territoire seul des Etats-Unis, la proportion de candidoses dues à des levures d'espèce Candida glabrata augmente dangereusement et représente, selon les données du programme SENTRY, 21% des candidoses répertoriées dans le pays (International surveillance of bloodstream infections due to Candida species : Frequency of occurrence and in vitro susceptibilities to fluconazole, ravuconazole, and vorticelle of isolates collected from 1997 through 1999 in the SENTRY antimicrobial surveillance programme, M. a.

Pfaller and al., J. Clin. Microb., Sept 2001, Vol. 39, No.

9, p. 3254-3259). Candida glabrata est également la cause majeure d'apparition d'infections du tractus urinaire et de vulvovaginites après C. albicans (Antifungal résistance in non-albicans Candida species ; Collin B. and al., Dru g Résistance Updates (1999) 2,9-14). Selon les données d'une autre étude rétrospective investie sur des patients hospitalisés atteints de candidoses causées par Candida albicans ou Candida glabrata, le taux de mortalité constaté est respectivement de 60% et 41,5% (Outcome in critically ill patients with candidal fungaemia : Candida albicans vs. Candida glabrata, Blot S., Vandewoude E. and al., J. of Hospital Infection (2001) 47 : 308-313). Les infections causées par Candida albicans et Candida glabrata sont particulièrement difficiles à traiter. 37% et 47% des souches Candida albicans sont à ce jour respectivement résistantes au fluconazole et à l'itraconazole (Epidemiology of clinical isolates of Candida albicans and their susceptibility to triazoles, Wroblewsa MM., SwobodaKopec E. and al., Int. J. Antimicrob. Agents 2002 ; 20 (6) : 472-475). Quant à Candida glabrata, 15% et 46% des souches sont respectivement résistantes au fluconazole et à l'itraconazole. Des souches Candida albicans et Candida glabrata présentant une sensibilité réduite à l'amphotéricine B ont également été caractérisées

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(Isolation and characterization of fluconazole- and amphotericin B-resistant Candida albicans from blood of two patients with leukemia, Nolte F.S., Parkinson T. and al., Antimicrob Agent Chemother 41 :196-199 ; Practice guidelines for the treatment of Candidiasis, J. H. Rex and al., C1. Infec. Dis., 2000 ; 30 : 662-678).

Il existe donc un besoin grandissant de caractériser de nouvelles classes de molécules antifongiques pour suppléer au phénomène de résistance que les levures notamment des levures du genre Candida développent envers les antifongiques classiques. Par antifongique , on entend selon la présente invention, toute molécule présentant des propriétés fongistatiques ou fongicides.

Des peptides présentant des propriétés antifongiques sont produits par une grande variété d'espèces tant animales que végétales, chez lesquelles ils participent à des mécanismes non spécifiques de défense contre les infections (Antifungal peptides : Novel therapeutic compounds against emergency pathogens, De Lucca A. J. and Walsh T.J., Antimicrob. Agents and Chemother., Jan 1999, Vol.43, No.l, p.1-11 ; Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Zasloff M., Nature Vol.415, Jan 2002,389-395).

Les insectes ont notamment développé un système de défense efficace contre les microorganismes. Cette réponse immunitaire s'appuie pour une large part sur la synthèse rapide et transitoire de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité (Antimicrobial peptides in insects ; structure and function, Bulet P. and al., Dev. Comp.

Immunol. 23,1999, 329-344). Parmi les peptides d'insectes présentant des propriétés antifongiques, on répertorie notamment la drosomycine, l'héliomicine et la thanatine. La

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drosomycine est un peptide isolé à partir du diptère Drosophila melanogaster (famille des Drosophilidae) qui présente une structure tridimensionnelle de type CSa(3 comportant une hélice a et trois brins (3 antiparallèles, reliés par quatre ponts disulfures. La drosomycine présente une sélectivité d'action envers les champignons filamenteux et notamment envers Fusarium oxysporum (Michaut L. et al., Détermination of the disulfide array of the first inducible peptide from insects : drosomycin from Drosophila melanogaster, FEBS Letter 1996 Oct.14;395(1):6-10 ; WO 99/02717). L'héliomicine est un peptide isolé à partir du lépidoptère Héliothis virescens (famille des Noctuidae) qui présente une structure tridimensionnelle de type CS[alpha]ss comportant une hélice a et deux brins ss antiparallèles, reliés par trois ponts disulfure. Le spectre d'action de l'héliomicine couvre les champignons filamenteux et les levures, notamment de genre Crytococcus et Candida à l'exception de l'espèce Candida glabrata (WO 99/53053). La thanatine est un peptide isolé à partir de l'hémiptère Podisus maculiventris (famille des Pentatomidae) qui présente une structure tridimensionnelle du type ss hairpinlike comportant deux brins (Et antiparallèles reliés par un pont disulfure. La thanatine présente une sélectivité d'action envers les champignons filamenteux (WO 99/24594).

Le mécanisme de défense des plantes implique également la synthèse de plusieurs familles de peptides présentant des propriétés antifongiques (Broekert W. F. et al., Antimicrobial peptides from plants, Critical Reviews in Plant Sciences, 16(3) :297-323 (1997) ; Garcia-Olmedo F. et al., Plant defense peptides, Biopolymers (Peptide Science), Vol.47,479-491 (1998)). Parmi les peptides de plantes présentant des propriétés antifongiques, on

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répertorie les thionines, les défensines de plantes, les peptides dits de transport de lipides, les peptides heveinlike et les peptides knottin-like. Les thionines présentent une structure tridimensionnelle de type comportant deux hélices a antiparallèles et deux brins (3 antiparallèles, reliés par deux à quatre ponts disulfure (Bohlmann H., The role of thionins in plant protection, Crit. Rev. Plant Sci.

(1984) 13 : 1-16). Les défensines de plantes présentent une structure tridimensionnelle de type comportant trois brins (3 antiparallèles et une hélice a, reliés par quatre ponts disulfure (Broekert W. F. et al., Plant defensins : novel antimicrobial peptide as component of the host defense system, Plant Physiol. (1995) 108 :1353-1358). Les peptides dits de transport de lipides présentent une structure tridimensionnelle de type comportant un paquet de quatre hélices a reliées par quatre ponts disulfure (Molina A. et al., Lipid transfert proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens, FEBS Letter (1993b) 316 :119-122). Les peptides hevein-like présentent une structure tridimensionnelle de type comportant trois brins ss antiparallèles et une hélice a courte, reliés par trois ponts disulfure (Broakert W. F. et al., Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with séquence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitinbinding proteins Biochemistry (1992) 31 :4308-4314; W094/11511). Les peptides knottin-like présentent une structure tridimensionnelle de type comportant trois brins ss avec une longue boucle faisant la liaison entre le

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premier et le second brin ss, les brins (3 étant reliés entre eux par trois ponts disulfure (Cammue B. P. A. et al., Isolation and characterisation of a novel class of plant antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L. seeds, The Journal of Biological Chemistry (1992) Vol.267, No4, Febr. 2228-2233 ; WO 92/15691 ; Feng Shao et al., A new antifungal peptide from seeds of Phytolacca americana : characterisation, amino acid séquence and cDNA cloning, Biochimica et Biophysica Acta 1430 (1999) 262-268). Parmi les peptides knottin-like de plantes, on répertorie notamment les peptides Mj-AMP1 et Mj-AMP2 de Mirabilis americana, le peptide PAFP de Phytolacca americana et le peptide AMP1 de Mesembryanthemum crystallinum. Les peptides Mj-AMP1 et Mj-AMP2 isolés à partir de graines de Mirabilis americana sont des peptides dimériques. Mj-AMP1 consiste en 2 sous-unités de 37 résidus d'acides aminés chacune et d'une masse moléculaire de 4000 Da chacune. Mj-AMP2 consiste en 2 sous-unités de 36 résidus d'acides aminés chacune et d'une masse moléculaire de 3500 Da chacune. MjAMP1 et Mj-AMP2 présentent une activité antifongique à large spectre envers les champignons phytopathogènes et une activité antibactérienne, en particulier contre les bactéries à Gram positif (Cammue B. P. A. et al., Isolation and characterisation of a novel class of plant antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L. seeds, The Journal of Biological Chemistry (1992) Vol.267, No4, Febr.

2228-2233 ; W092/15691). Le peptide PAFP isolé à partir de graines de Phytolacca americana est un peptide de 38 résidus d'acides aminés et de masse moléculaire de 3929 Da.

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PAFP présente une activité antifongique avec une sélectivité envers les champignons phytopathogènes de genre Fusari um et de genre Alternia (Feng Shao et al., A new antifungal peptide from seeds of Phytolacca americana : characterisation, amino acid séquence and cDNA cloning, Biochimica et Biophysica Acta 1430 (1999) 262-268).

Le problème technique posé par la présente invention consiste à caractériser de nouveaux composés présentant des propriétés antifongiques pour traiter et/ou prévenir les infections causées par les levures.

Dans les séquences peptidiques rapportées ciaprès, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre, mais ils peuvent être aussi représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous.

A Ala alanine
C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met méthionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine

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R Arg arginine
S Ser sérine
T Thr thréonine
V Val valine
W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine
La Demanderesse a maintenant isolé, purifié et caractérisé un nouveau peptide présentant des propriétés antifongiques à partir de l'hémolymphe de larves d'insectes immunisées d'Acrocinus longimanus appartenant à la famille des Cerambycidae. Les insectes membres de la famille des Cerambycidae se caractérisent essentiellement par la présence de longues antennes pouvant atteindre jusqu'à 4 fois la longueur du corps (Figure 1). De nombreuses espèces appartenant à cette famille s'attaquent au bois ouvragé, aux fruits et aux arbres ornementaux.

Le peptide isolé par la Demanderesse à partir de l'hémolymphe de larves immunisées d'Acrocinus longimanus répond à la séquence suivante : CIKNGNGCQPNGSQGNCCSGYCHKQPGWVA G Y C R R K (SEQ ID NO ::1)
La présente invention a donc pour principal objet un peptide isolé répondant à la séquence suivante : CIKNGNGCQPNGSQGNCCSGYCHKQPGWVA G Y C R R K (SEQ ID NO ::1) , ses dérivés et ses fragments.

Le peptide de séquence SEQ ID NO :1 de la présente invention sera ci-après appelé ETD-P1397.

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A titre de dérivés du peptide de l' invention, on peut citer les peptides qui présentent une modification post-traductionnelle et/ou une modification chimique en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation, une méthylation ainsi que les peptides qui portent un groupement protecteur. On entend par groupement protecteur selon la présente invention, tout groupement permettant d'éviter la dégradation du peptide de l'invention.

Les dérivés du peptide de l'invention peuvent également être ceux dont un ou plusieurs acides aminés sont des énantiomères, des diastéréoisomères, des acides aminés naturels de conformation D, des acides aminés rares notamment l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N méthylysine, la N-éthylglycine, la Nméthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique et les acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline, la cyclohexyl-alanine et les oméga-acides aminés. L'invention couvre également les rétropeptides et les rétroinversopeptides, de même que les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité antifongique du peptide de l'invention.

A titre de fragments du peptide de l'invention, on entend des fragments d'au moins 7 acides aminés qui présentent une activité antifongique. L'activité antifongique des dérivés et des fragments du peptide de l'invention peut être mise en évidence grâce aux tests in vitro décrits ci-après dans l'exemple 4.

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L'invention concerne aussi un polypeptide isolé comprenant le peptide de l'invention. L'invention envisage plus particulièrement un polypeptide comprenant le peptide de l'invention dont l'une et/ou l'autre des extrémités dudit peptide comprend un ou plusieurs acides aminés nécessaires à son expression et/ou son ciblage dans un organisme hôte.

L'invention concerne également un polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour le peptide ou un polypeptide de l'invention. On entend par polynucléotide selon la présente invention, une séquence nucléique de type ADN ou ARN, de préférence ADN, notamment double brin.

L'invention concerne également les polynucléotides isolés qui comprennent des modifications au niveau d'un ou plusieurs nucléotides résultant de la dégénérescence du code génétique et qui codent pour une même séquence d'acides aminés du peptide de l'invention.

L'invention couvre également les polynucléotides isolés codant pour le peptide ou un polypeptide de l'invention et capables de s'hybrider dans des conditions stringentes audit peptide ou auxdits polypeptides. On entend par conditions stringentes selon la présente invention, les conditions enseignées par Sambrook et al. (Molecular cloning, 1989, Noland C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press).

L'invention couvre également les séquences nucléotidiques complémentaires des polynucléotides isolés définis ci-dessus ainsi que les ARN correspondants.

L'invention concerne également un gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend au moins, liés entre eux

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de façon opérationnelle, un promoteur constitutif ou inductible fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant le peptide ou un polypeptide de l'invention et un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte. On entend par liés entre eux de façon opérationnelle selon l'invention, des éléments liés entre eux de façon à ce que le fonctionnement d'un des éléments soit affecté par celui d'un autre. A titre d' exemple , un promoteur est lié de façon opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de cette dernière. Les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des peptides que le gène chimère peut comprendre sont connus de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction de l'organisme hôte. Le gène chimère peut notamment comprendre à titre d'élément régulateur additionnel, des séquences codant pour un peptide signal ou de transit de façon à diriger la sécrétion du peptide ou polypeptide de l'invention dans l'organisme hôte. Lorsque l'organisme hôte est une levure, ces séquences sont préférentiellement les séquences pré de BGL2 et pro de MF[alpha]1 qui permettent la sécrétion du peptide ou polypeptide de l'invention directement dans le milieu de culture. Le gène chimère peut en outre comprendre des séquences codant pour une endoprotéase pour augmenter l'activité protéolytique dans l'organisme hôte durant le processus de sécrétion. Lorsque l'organisme hôte est une levure, ces séquences sont préférentiellement les séquences du gène KEX2 codant pour l'endoprotéase yscf qui permet de cliver la séquence pro du pré-pro-peptide de l'invention durant le processus de sécrétion.

L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient

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un polynucléotide ou un gène chimère selon l'invention pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier le peptide ou un polypeptide de l'invention. Le vecteur peut être choisi parmi un plasmide, un cosmide, un bactériophage et un virus en particulier un baculovirus. Le vecteur est avantageusement un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans l'organisme hôte comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans l'organisme hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection qui assurent la complémentation avec le gène respectif délété au niveau du génome de l'organisme hôte. Le vecteur peut également être un vecteur navette comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans chacun des organismes hôte et des éléments permettant sa sélection dans chacun des organismes hôte. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

L'invention concerne également un organisme hôte caractérisé en ce qu'il est transformé à l'aide d'un vecteur de l'invention. Par organisme hôte selon la présente invention, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel un polynucléotide ou un gène chimère de l'invention est introduit pour la production du peptide de l'invention.

Selon une forme préférée de l'invention, l'organisme hôte est un microorganisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon. La transformation de tels microorganismes permet de produire le peptide de l'invention à échelle semi-industrielle ou industrielle. A titre de bactérie, l'invention envisage plus particulièrement la bactérie de

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l'espèce Escherichia coli. A titre de levure, l'invention envisage plus particulièrement une levure de genre Saccharomyces, de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae ; de genre Kluyveromyces, de préference de l'espèce Kluyveromyces lactis ; de genre Hansenula, de préférence de l'espèce Hansenula polymorpha ; de genre Pichia, de préférence de l'espèce Pichia pastoris ou de genre Schizosaccharomyces, de préférence de l'espèce Schizosaccharomyces pombe. A titre de champignon, l'invention envisage plus particulièrement le champignon filamenteux de l'espèce Aspergillus nidulans.

Selon une autre forme de l'invention, l'organisme hôte est une cellule animale, en particulier une cellule d'arthropode (par exemple une cellule de Spodoptera frugiperda ou de Trichoplusia ni) ou une cellule de mammifère.

Selon une autre forme de l'invention, l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante. Par cellule de plante on entend, selon la présente invention, toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences. Par plante on entend selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine.

Le peptide de l'invention est également utile pour conférer aux plantes un caractère de résistance aux maladies fongiques. L'invention concerne donc également une cellule végétale ou une plante résistante aux maladies fongiques comprenant un polynucléotide ou un gène chimère

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de l'invention et exprimant le peptide ou un polypeptide de l'invention.

Le peptide ou les polypeptides de l'invention peuvent aussi être synthétisés chimiquement selon des techniques connues de l'homme du métier.

Le peptide ETD-P1397 isolé de l'invention a été testé pour ses activités antimicrobiennes à l'issu de la première étape de purification décrite dans l'exemple I 4) ci-après. Ces tests ont montré que le peptide ETD-P1397 présente des propriétés exclusivement antifongiques. La table 1 ci-après expose les activités antifongiques in vitro (CMI g/ml) du peptide ETD-1397 de l'invention isolé et purifié comparativement à celles du peptide knottin-like de plante AMP isolé à partir de Mirabilis jalapa (Broekaert and al., Antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa and Amaranthus caudatus : expression, processing, localization and biological activity in transgenic tabacco, Plant Mol.

Biol. 31 : 993-1008, 1996).

Table 1

<tb>
<tb> CMI <SEP> g/ml <SEP> Levures <SEP> Champignons
<tb> filamenteux
<tb> Candida <SEP> Candida <SEP> Aspergillus
<tb> albicans <SEP> glabrata <SEP> fumigatus
<tb> ATCC <SEP> 36082 <SEP> ATCC <SEP> 90030 <SEP> ATCC <SEP> 204305
<tb> 24h <SEP> 48h <SEP> 24h <SEP> 48h <SEP> 48h
<tb> ETD-P1397 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 16 <SEP> >64
<tb> AMP <SEP> 32 <SEP> 64 <SEP> 16 <SEP> 64 <SEP> >64
<tb>

Les données décrites dans la table 1 montrent que le peptide ETD-P1397 de l'invention présente une

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sélectivité d'action envers les levures versus les champignons filamenteux.

L'invention vise donc en outre la mise à profit des propriétés antifongiques du peptide de l'invention pour prévenir et/ou traiter les infections fongiques tant chez l'homme et l'animal que chez les plantes. L'invention concerne donc avantageusement l'utilisation du peptide de l'invention à titre de médicament en thérapie humaine et animale. Elle concerne également l'utilisation du peptide de l' invention pour le traitement des plantes contre les infections fongiques, en appliquant ledit peptide directement sur les plantes.

L'invention concerne aussi une composition antifongique comprenant à titre d'agent actif le peptide de l'invention ou un polypeptide de l'invention avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. La composition agit plus particulièrement contre les levures. Lorsque la composition est appliquée à la thérapie humaine, les levures sont de préférence de genre Candida et plus particulièrement d'espèce Candida albicans ou Candida glabrata. La composition antifongique peut en outre comprendre un autre agent antifongique. Selon la présente invention, l'agent antifongique est de préférence choisi parmi les dérivés polyènes et plus particulièrement l'amphotéricine B, nystatine et pimaricine; les dérivés azolés et plus particulièrement le ketoconazole, clotrimazole, miconazole, econazole, butoconazole, oxiconazole, sulconazole, tioconazole, terconazole, fluconazole et itraconazole; les allyliques-thiocarbamates et plus particulièrement le tolnaftate, naftifine et terbinafine; 5-fluorocytosine; echinocandins; griseofulvine ; ciclopirox ; et haloprogine.

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Par véhicule , on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée au peptide de l'invention pour favoriser le transport du peptide, éviter sa dégradation substantielle dans ladite composition et préserver ses propriétés antifongiques. Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition.

Notamment, lorsque la composition est appliquée à un usage pharmaceutique en santé humaine et animale, le véhicule est un véhicule pharmaceutiquement acceptable adapté à une administration du peptide de l'invention par voie topique, per os ou par injection. Lorsque la composition est appliquée à un usage cosmétique, le véhicule est un véhicule cosmétiquement acceptable adapté à une administration sur la peau ou les phanères. Lorsque la composition est appliquée à un usage agrochimique, le véhicule est un véhicule agrochimiquement acceptable adapté à une administration sur les plantes ou à proximité des plantes sans les dégrader.

Le peptide ou la composition de l'invention présentent également un intérêt dans l'industrie agroalimentaire. Son utilisation permet notamment d'empêcher la contamination de produits agroalimentaires par les levures pendant leur fabrication et, après leur fabrication, pendant leur conservation.

Dans l'industrie phytosanitaire, le peptide ou la composition de l'invention peuvent également être utilisés pour la fabrication de produits phytosanitaires en lieu et place des produits usuels.

Le peptide ETD-P1397 isolé d'insectes de l'invention présente une structure tridimensionnelle similaire de celle des peptides knottin-like de plantes :

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trois brins (3 avec une longue boucle faisant la liaison entre le premier et le second brin ss, les brins (3 étant reliés entre eux par trois ponts disulfure (Figure 3). Les peptides de l'invention se distinguent des peptides knottin-like de plantes non seulement par leur séquence primaire mais également par leur spectre d'activité antimicrobien. Le peptide ETD-1397 de l'invention présente en effet une séquence en acides aminés distincte de celle des peptides knottin-like malgré la constance structurale imposée par les ponts disulfure (Figure 2). Le peptide de l'invention présente par ailleurs des propriétés exclusivement antifongiques avec de surcroît une sélectivité d'action envers les levures à la différence des peptides knottin-like de plantes (Table 1).

D'autres avantages et caractéristiques du peptide ETD-P1397 de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation du peptide et ses activités antifongiques et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente l'insecte Acrocinus longimanus (famille des Cerambycidae) à partir duquel le peptide ETD-P1397 de l'invention a été isolé ; - la figure 2 représente l'alignement des séquences peptidiques du peptide EDT-P1397 de l'invention et du peptide knottin-like de plante AMP (Mirabilis jalapa); - la figure 3 représente la modélisation de la structure tridimensionnelle du peptide EDT-P1397 de l'invention (F. Vovelle, C. Landon, F. Barbault, CBM Orléans).

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I. Exemple 1 Isolement et purification du peptide ETD-P1397 à partir de l'hémolymphe prélevée chez des larves immunisées d'insectes d'Acrocinus longimanus (famille des Cerambycidae).

1) Induction de la synthèse biologique de substances antimicrobiennes dans l'hémolymphe de larves d'Acrocinus longimanus.

Les larves matures de dernier stade du coléoptère Acrocinus longimanus de la famille des Cerambycidae ont été immunisées par injection d'une solution de PBS contenant des bactéries à Gram positif (Microccocus luteus et Staphylococcus aureus) et à Gram négatif (Pseudomonas aeruginosa), des spores de champignons filamenteux (Aspergillus fumigatus) et des levures (Candida albicans).

Les bactéries sont préparées à partir de cultures réalisées en milieu de Luria-Bertani durant 12 heures à 37 C. Les levures sont préparées à partir de cultures réalisées en milieu de Sabouraud durant 12 heures à 30 C. Les spores d'A. fumigatus sont prélevées d'un stock congelé à -80 C.

Les animaux ainsi infectés ont été conservés pendant 24 heures sur leur plante hôte, dans un espace ventilé. Avant le prélèvement de l'hémolymphe, les larves ont été refroidies sur de la glace.

2) Préparation du plasma.

L'hémolymphe des larves immunisées (30 ml) ainsi que de larves non immunisées (larves contrôles) a été collectée par piqûre latérale au niveau de la tête suivie d'une pression manuelle et recueillie dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 ml refroidis

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dans de la glace et contenant de l'aprotinine comme inhibiteur de protéases (20 pg/ml en concentration finale) et de la phénylthiourée comme inhibiteur de la mélanisation (concentration finale de 40 M). L'hémolymphe ainsi collectée à partir des larves immunisées et non immunisées a été centrifugée à 8 000 t.min-1 pendant 1 min à 4 C afin d'éliminer les hémocytes. Le surnageant de centrifugation a été alors centrifugé à 12000 t.min-1. L'hémolymphe dépourvue des cellules sanguines a été conservée à - 80 C jusqu'à son utilisation.

3) Acidification du plasma.

Après décongélation rapide, le plasma desdites larves immunisées et non immunisées a été respectivement acidifié à pH 3 avec une solution d'acide trifluoroacétique à 1% (volume à volume) contenant de l'aprotinine (20 jug/ml en concentration finale) et la phénylthiourée (concentration finale de 40 M). L'extraction en condition acide du peptide a été réalisée pendant 30 min sous agitation légère dans un bain d'eau glacée. L'extrait obtenu a été ensuite centrifugé à 4 C pendant 30 min à 10. 000 g.

4) Purification du peptide ETD-P1397. a) Prépurification par extraction en phase solide.

Une quantité d'extrait équivalente à 5 ml d'hémolymphe de larves immunisées et non immunisées d'Acrocinus longimanus a respectivement été déposée sur un support de 5 g de phase inverse, tel que commercialisé sous la forme de cartouche (Sep-PakTM C18, Waters Associates), équilibré avec de l'eau acidifiée (TFA 0,05 %). Les

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molécules hydrophiles ont été éliminées par un simple lavage avec de l'eau acidifiée. L'élution du peptide a été réalisée par une solution à 60% d'acétonitrile dans de l'eau contenant 0,05% de TFA. La fraction éluée avec 60% d'acétonitrile a été séchée sous vide dans le but d'éliminer l'acétonitrile et le TFA puis elle a été reconstituée dans de l'eau acidifiée (TFA 0,05%) stérile avant d'être soumise à la première étape de purification. b) Purification par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) sur colonne de phase inverse. première étape : l'élution 60% issue de l'extraction en phase solide décrite ci-dessus contenant le peptide a été fractionnée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse sur une colonne semi-préparative de marque BrownleeTM, de type Aquapore, de taille 220 x 10 mm, de porosité 300 A et de granulométrie 20 avec un greffage C8. Le fractionnement a été réalisé par un gradient d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA de 2% à 10% en 5 minutes, puis de 10 à 25% en 30 min, puis de 25 à 35% en 40 min, puis de 35 à 60% en 50 min, pour une durée totale de 125 min à un débit constant de 2,5 ml/min. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 225 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leurs activités antimicrobiennes. Les fractions notées 17 et 18 provenant d'hémolymphe de larves immunisées d'Acrocinus longimanus ont démontré des propriétés antifongiques.

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- seconde étape : les fractions notées 17 et 18 précédemment identifiées comme présentant des propriétés antifongiques et respectivement éluées à 18 et 19% d'acétonitrile, ont été purifiées de manière plus fine sur une colonne analytique de phase inverse de greffage C8 de type Aquapore (BrownleeTM, 220 x 4, 6 mm, 300 A , 7 ), en utilisant un gradient linéaire diphasique d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA de 1 à 14% en 10 min et de 14 à 22% en 45 min (fraction 17) et de 1 à 15% en 10 min et de 15 à 23% en 45 min (fraction 18), avec un débit constant de 0,8 ml/min. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 225 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leurs activités antifongiques. L'activité a été retrouvée dans les sous-fractions 9 et 11 de la fraction 17, ainsi que dans la sous-fraction 14 de la fraction 18, notées respectivement 17. 9, 17. 11 et 18.14.

- troisième étape : les sous-fractions décrites ci-dessus, contenant les peptides ont été purifiées jusqu'à homogénéité sur une colonne de phase inverse Narrowbore Delta-PakTM HPI C18 (Waters Associates, 150 x 2 mm) en utilisant un gradient linéaire diphasique d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA de 2% à 11% en 5 min et de 11 à 19% en 50 min (sous-fractions 17. 9 et 17. 11), de 2% à 13,5% en 5 min et de 13,5 à 21,5% en 50 min (sous-fraction 18. 14), avec un débit constant de 0,2 ml/ min à une température contrôlée de 30 C. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de

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l'absorbance à 225 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure filtrée et analysées pour leurs activités antifongiques.

II. Exemple 2 : Caractérisation structurale du peptide ETD-P1397.

1) Vérification de la pureté par Spectrométrie de masse Maldi-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).

Le contrôle de pureté a été effectué sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Biflex (Bremen, Allemagne) en mode linéaire positif (voir section 3 cidessous).

2) Réduction et S-pyridyléthylation en vue de déterminer le nombre des cystéines.

Le nombre de résidus cystéine a été déterminé sur les peptides natifs par réduction et S-pyridyléthylation.

400 pmoles de peptide natif ont été réduites dans 40 l de tampon Tris/HCl 0,5 M, pH 7,5 contenant 2 mM d'EDTA et 6 M de chlorure de guanidinium en présence de 2 l de dithiothréitol 2,2 M. Le milieu réactionnel a été placé sous atmosphère d'azote. Après 60 min d'incubation à l'obscurité, 2 l de 4-vinylpyridine fraîchement distillée ont été ajoutés à la réaction qui a été alors incubée durant 10 min à 45 C à l'obscurité et sous atmosphère d'azote. Le peptide pyridyléthylé a été ensuite séparé des constituants du milieu réactionnel par chromatographie de phase inverse sur une colonne analytique de phase inverse Aquapore RP-300 C8 (BrownleeTM, 220 x 4,6 mm, 300 ), en

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utilisant un gradient linéaire d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA de 2 à 52% pendant 70 min.

3) Détermination de la masse du peptide natif, du peptide S-pyridyléthylé et des fragments de protéolyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).

Les mesures de masses ont été effectuées sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Biflex (Bremen, Allemagne) en mode linéaire positif. Les spectres de masse ont été calibrés de façon externe avec un mélange standard de peptides de m/z connues, respectivement 2199,5 Da, 3046,4 Da et 4890,5 Da. Les différents produits à analyser ont été déposés sur une fine couche de cristaux d'acide acyano-4-hydroxycinnamique obtenue par une évaporation rapide d'une solution saturée dans l'acétone. Après séchage sous un léger vide, les échantillons ont été lavés par une goutte d'acide trifluoroacétique à 0,1% avant d'être introduits dans le spectromètre de masse.

La différence de masse mesurée entre le peptide Spyridyléthylé et le peptide natif permet de déterminer le nombre de résidus cystéine présent dans le peptide.

4) Séquençage par dégradation d'Edman.

Le séquençage automatique par dégradation d'Edman du peptide natif ETD-P1397, du peptide S-pyridyléthylé correspondant et des différents fragments obtenus après les différents clivages protéolytiques et la détection des dérivés phénylthiohydantoines ont été réalisés sur un séquenceur de type ABI473A (PE Applied Biosystems division de Perkin Elmer).

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5) Clivages protéolytiques du peptide EDT-P1397.
Confirmation de la séquence peptidique dans la région C-terminale. 200 pmoles de peptide réduit et Spyridyléthylé ont été incubées en présence de 5 pmoles d'endoprotéinase-Lys-C (Acromobacter protease I, clivage spécifique des résidus lysine du côté C-terminal, Takara, Otsu) selon les conditions préconisées par le fournisseur (Tris HC1 10 mM pH 9 en présence de Tween 20 à 0,01%) pendant 5 heures. Après arrêt de la réaction avec du TFA 1%, les fragments peptidiques ont été séparés par CLHP en phase inverse sur une colonne (colonne de type Narrowbore Delta-PakTM HPIC18 Waters Associates, 150 x 2 mm pour le peptide ETD-P1397 ; colonne de marque Interchim de type Modulocart Uptisphère avec greffage C 18, granulométrie 3 Â, de taille 150 x 2 mm pour le peptide ETD-P1725) avec un gradient linéaire d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA de 2 à 60% en 80 min avec un débit de 0,2 ml/min et une température constante de 37 C. Les fragments obtenus ont été analysés par spectrométrie de masse MALDITOF et le peptide correspondant au fragment C-terminal a été séquence par dégradation d'Edman.

La séquence primaire du peptide ETD-P1397 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. La masse moléculaire du peptide ETDP1397 natif est de 3875,4 Da. La masse moléculaire du peptide ETD-P1397 S-pyridyléthylé est de 4415 Da. Le peptide ETD-P1397 contient 6 résidus cystéine.

III. Exemple 3 : Production du peptide ETD-P1397.

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Le peptide ETD-P1397 a été synthétisé chimiquement (Altergen).

IV. Exemple 4 : Tests d'activités antifongiques in vitro.

Les activités antifongiques du peptide ETD-P1397 de l'invention ont été évaluées in vitro par détermination de Concentration Minimale Inhibitrice (CMI).

Les tests ont été réalisés sur les souches de levures suivantes : Candida albicans (souche ATCC 36082) et Candida glabrata (souche ATCC 90030) ainsi que sur les champignons filamenteux suivants : Aspergillus fumigatus (souche ATCC 204305). Ces souches sont sensibles aux antifongiques communément utilisés en milieu hospitalier.

1) Préparation des suspensions fongiques. a) Préparation des suspensions de levures.

Une oese de levures prélevée à partir d'un stock de levures en suspension à 4 C a été étalée sur une boîte de gélose Sabouraud Agar. La boîte a été incubée à 30 C pendant 24 à 48h. Quelques colonies de levures ont été prélevées et mises en suspension dans 10 ml de milieu Sabouraud liquide. La suspension de levure obtenue qui doit être laiteuse a été diluée (1 ml qsp 10 ml de milieu Sabouraud). La concentration de la suspension a été évaluée par mesure de la densité optique à 600 nm suivant la relation 0,1 DO à 600 nm correspond 2,5.106 levures/ml. La concentration a été ajustée par dilution de façon à obtenir une suspension de 2,5.103/ml de concentration finale. La concentration de la suspension de levure a été contrôlée par dénombrement des Unités Formant Colonies (UFC). La suspension de levures à 2,5.103/ml a été diluée en cascade (10-1, 10-2, 10-3, ... 10-6) puis 100 l de chaque dilution ont été étalés sur des boîtes de gélose Sabouraud. Les boîtes

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ont été incubées à 30 C pendant 24h puis les UFC ont été dénombrées. b) Préparation des suspensions de champignons filamenteux.

Les champignons ont été ensemencés sur des boîtes de gélose de malt-agar qui ont été incubées 5 à 7 jours à 37 C. Les spores formées ont été récoltées et mises en suspension dans du milieu YPG. La concentration de la suspension a été évaluée par comptage d'un aliquot sur une lamelle de comptage (Coverslide). La concentration a été ajustée par dilution de façon à obtenir une suspension de 5.103/ml de concentration finale.

2) Détermination des CMI.

Les CMI ont été déterminées par un test liquide sur microplaques de 96 puits selon les protocoles M27-A et M38-P du National Committee for Clinical Standard (NCCLS) à la différence près que le milieu RPMI-1640 suggéré par le protocole NCCLS a été substitué par du milieu Sabouraud (Biomérieux) pour les tests sur les levures et par du milieu YPG (lg peptone, 1g d'extrait de levure, 3g glucose par litre) pour les tests sur les champignons filamenteux. Les activités des échantillons à tester ont été déterminées pour la gamme de concentrations finales 0,125 à 64 jug/ml. a) Détermination des CMI sur les levures.

La densité optique des microplaques a été mesurée à 600 nm avec un spectrophotomètre pour microplaques après 24 et 48h d'incubation pour les levures du genre Candida.

Le pourcentage de pousse (%pousse) a été calculé à partir des valeurs de densité optique (DO) mesurées selon la formule suivante : %pousse=((DO puits avec échantillon à tester - DO milieu seul)/(DO puits sans échantillon à tester - DO milieu seul))*100.

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Les CMI ont été définies selon les scores suivants - MIC 0 : %pousse # 10% ; - MIC 1 : 10% < %pousse s 20% ; - MIC 2 : 20% < %pousse #50% ; - MIC 3 : > 50%.

La CMI a été déterminée dans l'intervalle de score MIC 0 et MIC 2. b) Détermination des CMI sur les champignons filamenteux.

La MIC est déterminée par lecture à l'#il nu des microplaques après 48h d'incubation pour Aspergillus fumigatus.

Les CMI ont été définies selon les scores suivants - MIC 0 : pas de trace de champignons au fond du puits ; - MIC 1 : un point au fond du puits ; - MIC 2 : champignons sur la moitié de la surface du puits ; - MIC 3 : les trois quarts du puits sont occupés par les champignons ; - MIC 4 : ensemble du puits envahi de champignons.
La CMI a été déterminée dans l'intervalle de score MIC 0 et MIC 2.

Les résultats des activités antifongiques (CMI) sont présentés dans la table 1 exposée dans la description.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1) Peptide isolé caractérisé en ce qu'il répond à la séquence suivante : CIKNGNGCQPNGSQGNCCSGYCHKQPGWVA G Y C R R K (SEQ ID NO :1), ses dérivés et ses fragments.

2) Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend le peptide selon la revendication 1.

3) Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend le peptide selon la revendication 1 dont l'une et/ou l'autre des extrémités dudit peptide comprend un ou plusieurs acides aminés nécessaires à son expression et/ou à son ciblage dans un organisme hôte.

4) Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour le peptide selon la revendication 1 ou un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3.

5) Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il s'hybride à un polynucléotide selon la revendication 4.

6) Gène chimère caractérisé en ce qu'il comprend au moins, liés entre eux de façon opérationnelle : - un promoteur constitutif ou inductible fonctionnel dans un organisme hôte, - un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, et - un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte.

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7) Gène chimère selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un peptide signal ou de transit fonctionnel dans ledit organisme hôte.

8) Vecteur d'expression et/ou de clonage caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5 ou un gène chimère selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7.

9) Vecteur d'expression et/ou de clonage selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un plasmide, un cosmide, un bactériophage et un virus en particulier un baculovirus.

10) Organisme hôte caractérisé en ce qu'il est transformé à l'aide d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications de 8 ou 9.

11) Organisme hôte selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est un microorganisme choisi parmi une levure, une bactérie et un champignon.

12) Organisme hôte selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule animale.

13) Organisme hôte selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante.

14) Cellule végétale ou plante résistante aux maladies fongiques comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5 ou un gène chimère

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selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, et exprime le peptide selon la revendication 1 ou un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3.

15) Composition antifongique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif le peptide selon la revendication 1 ou un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, avantageusement associé dans ladite composition avec un véhicule acceptable.

16) Composition antifongique selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un autre agent antifongique choisi parmi amphotéricine B, nystatine, pimaricine, ketoconazole, clotrimazole, miconazole, econazole, butoconazole, oxiconazole, sulconazole, tioconazole, terconazole, fluconazole, itraconazole, tolnaftate, naftifine, terbinafine, 5-fluorocytosine, echinocandins, griseofulvine, ciclopirox ou haloprogine.

17) Composition selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 pour être utilisée chez l'homme ou l'animal.

18) Composition selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 pour être utilisée chez les plantes.