CA2755472C - Analogues de la temporine-sha et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux peptides antimicrobiens, des compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides et leurs utilisations, notamment en tant que médicaments antimicrobiens, désinfectants, pesticides ou conservateurs. La présente invention concerne également une plante transgénique exprimant ces nouveaux peptides.

Description

Analogues de la temporine-SHa et leurs utilisations La présente invention se rapporte à de nouveaux peptides antimicrobiens, aux compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides et à leurs utilisations, notamment en tant que médicament ou désinfectant. La présente invention se rapporte en outre à une plante transgénique exprimant ces nouveaux peptides.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
L'évolution et la progression de la résistance bactérienne aux antibiotiques apparaît aujourd'hui comme un problème majeur de santé publique, notamment en milieu hospitalier avec l'apparition de souches multi-résistantes.
D'importants efforts de recherche ont permis de développer de nouveaux antibiotiques efficaces sur ces souches résistantes. Néanmoins, à force d'utilisation, des mécanismes de résistance vis-à-vis de ces molécules apparaissent et diminuent leur efficacité.
Face à ce phénomène, les peptides antimicrobiens (PAM) sont apparus comme très prometteurs pour concevoir de nouveaux agents thérapeutiques. Les peptides antimicrobiens cationiques sont considérés comme l'un des éléments clefs du système immunitaire inné qui assure la première ligne de défense des organismes multicellulaires contre les pathogènes. L'intérêt de ces peptides vient d'une part de leur très large spectre d'activité permettant notamment leur utilisation dans le cadre de traitement d'infections par des souches multi-résistantes. D'autre part, leur mode d'action repose sur une perméabilisation ou une fragmentation rapide des membranes des microorganismes et est donc peu susceptible de générer l'apparition de mécanismes de résistance.
Des peptides antimicrobiens ont été identifiés aussi bien chez les plantes, les insectes, les batraciens ou les mammifères. La peau des batraciens est une source importante de peptides antimicrobiens et chaque espèce de grenouille dispose de son propre répertoire peptidique constitué généralement de 10 à 15 PAM.
Les grenouilles de la famille des Ranidae sont très nombreuses et cette famille comporte à l'heure actuelle 16 genres et 338 espèces. Ces grenouilles synthétisent et sécrètent une remarquable diversité de PAM qui ont été classés en 13 familles (Conlon et al., 2008 et 2009). L'une de ces familles, les temporines, comprend des PAM
de

2 petite taille (généralement entre 10 et 14 résidus) dont les séquences sont très variables suivant les espèces. Plus de 60 membres appartenant à la famille des temporines ont été
identifiés. Ces temporines ont été isolées à partir de plusieurs espèces de Rana comme par exemple, Rana temporaria (Simmaco et al., 1996), Rana esculenta (Simmaco et al., 1990), Rana japonica (Isaacson et al., 2002), Rana ornativentris (Kim et al., 2001) et Pelophylax (Rana) saharica (Abbassi et al., 2008).
Contrairement aux 12 autres familles de peptides de Ranidae, les temporines sont dépourvues, du motif Rafla box , un motif heptapeptidique cyclisé par un pont disulfure en C-terminal (Mangoni, 2006). De plus, la plupart des temporines contiennent un seul résidu basique qui leur confère une charge nette de +2 à
pH
physiologique.
Les temporines sont en général particulièrement actives contre les bactéries Gram-positif et les levures mais elles possèdent également des propriétés antifongiques (Rollins-Smith et al., 2003) et pour certaines des propriétés antivirales (Chinchar et al., 2004).
Des études récentes menées sur les temporines A, B (Mangoni et al., 2006) et SHa (Abbassi et al., 2008), ont indiqué que ces peptides possèdent une action antiparasitaire sur des protozoaires du genre Leishmania, agents responsables des leishmanioses. En dehors de ces temporines, très peu de PAM possèdent une activité
antiparasitaire : les dermaseptines et le polypeptide YY (également isolés de la peau de grenouille) ; l'indolicidine (isolée de granules de neutrophiles bovins) ; la gomésine (isolée de l'araignée Acanthoscurria gomesiana) ; les hybrides cécropine-mélittine (obtenus à partir de molécules d'insectes).
Les leishmanioses sont des affections extrêmement répandues dans le monde, essentiellement en Inde, en Amérique du sud, en Afrique et sur le pourtour méditerranéen. Plusieurs millions de personnes sont infectées chaque année par ce parasite. Selon l'espèce de Leishmania, les leishmanioses peuvent être des affections cutanées, muco-cutanées ou viscérales. Par exemple, la forme viscérale, la plus grave et potentiellement mortelle en absence de traitement, est due à deux espèces de Leishmania : Leishmania infantum et Leishmania donovani. Les Leishmania présentent au cours de leur cycle de développement deux stades morphologiques successifs : le stade promastigote (forme libre dans le tube digestif de l'insecte vecteur, le phlébotome) =

3 et le stade amastigote (forme intracellulaire infectant les phagocytes mononuclés de l'hôte mammifère).
Le traitement de première intention des leishmanioses consiste en l'utilisation des dérivés de l'antimoine, tels que l'antimoniate de méglumine (Glucantime ) ou le stibogluconate de sodium (Pentostame). Cependant, l'efficacité de l'antimoine diminue avec l'émergence d'une importante résistance pouvant aller jusqu'à 60% selon la localisation géographique. Malgré la disponibilité de médicaments alternatifs comme l'amphotéricine B
(Ambisome ) ou la miltéfosine (Impavide), il y a un réel besoin de trouver de nouvelles molécules permettant de lutter contre cette maladie.
RESUME DE L'INVENTION
L'objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux peptides antimicrobiens, analogues de la temporine-SHa et présentant une activité antimicrobienne accrue, notamment vis-à-vis des bactéries et du parasite Leishmania. De préférence, ces nouveaux peptides ont également une activité hémolytique diminuée par rapport à la temporine-SHa.
Selon un aspect, la présente invention concerne un peptide d'une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la séquence F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F, où Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué
de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où, lorsque Xi est S, au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et les dérivés fonctionnels et les sels pharmaceutiquement acceptables dudit peptide. De préférence, Xi est un acide aminé
sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et X2, X3 et X4 sont G. De préférence, Xi est K, et X2, X3 et X4 sont G.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention.
La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention.
La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention.

3a Selon un aspect, la présente invention concerne un peptide d'une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antibactérienne, antifongique ou antiparasitaire vis-à-vis d'un parasite appartenant au genre Leishmania, et comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F, où X1 est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de R, H
et K, et dérivés fonctionnels et sels pharmaceutiquement acceptables dudit peptide, lesdits dérivés fonctionnels étant des rétro peptides, des rétro-inverso peptides ou des peptides comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F raccourcie de 1 ou 2 acides aminés en son extrémité C-terminale et/ou N-terminale.

4 Dans un autre aspect, la présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention.
La présente invention concerne également un anticorps se liant spécifiquement à
un peptide selon l'invention.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide selon l'invention, et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également un peptide selon l'invention, en tant que médicament. De préférence, le médicament est destiné au traitement d'une infection par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite. De préférence, le parasite appartient au genre Leishmania.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention en tant que désinfectant, conservateur ou pesticide.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un appareillage médical ou un implant comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou incluant un peptide selon l'invention.
Dans un dernier aspect, la présente invention concerne une plante transgénique comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention, et susceptible d'exprimer ou exprimant un peptide selon l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente une projection de Schiffer-Edmunson de l'hélice a de la temporine-SHa. Les résidus 4, 11, 7, 3 et 10 constituent la face polaire de l'hélice. Les résidus 8, 1, 12, 5, 9, 2, 13 et 6 constituent la face apolaire de l'hélice.
La figure 2 présente un graphe représentant l'activité de la temporine-SHa ( a ) et de l'analogue [KItemporine-SHa (#) sur les amastigotes axéniques (A) et les promastigotes (B) de Leishmania infantum. Le pourcentage de croissance des amastigotes et des promastigotes est représenté en fonction de la concentration en peptide.
La figure 3 présente un graphe représentant l'activité cytotoxique de la temporine-SHa ( a ) et de l'analogue [KItemporine-SHa (#) sur les monocytes.
Le pourcentage de croissance des monocytes est représenté en fonction de la concentration en peptide.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La temporine-SHa, anciennement appelée temporine-lSa, a été isolée à partir de

5 la peau de la grenouille nord-africaine Pelophylax saharica (Abbassi et al., 2008).
Cette temporine est obtenue par la maturation post-traductionnelle d'un précurseur de 50 résidus (numéro d'entrée dans la base de données GenBank : CA077282). Ce précurseur présente un domaine N-terminal très conservé contenant le peptide signal et une région riche en résidus acides, ainsi qu'un domaine C-terminal hypervariable contenant la séquence progénitrice de la temporine-SHa. In vivo, la forme mature de la temporine est obtenue après i) clivage protéolytique au niveau du doublet KR
qui précède la séquence progénitrice, ii) élimination du résidu K en C-terminal de la séquence progénitrice par une carboxypeptidase et iii) amidation du résidu C-terminal de la temporine grâce au résidu G en C-terminal de la séquence progénitrice qui sert de donneur de la fonction amide (substrat de la peptidyl-glycine a-amidating monooxygenase). La protéine mature est un peptide d'une longueur de 13 résidus d'acide aminé et présentant la séquence suivante F-L-S-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F
(SEQ
ID No.1). Les temporines ne sont pas structurées en solution aqueuse mais se structurent en hélice a dans des environnements membrano-mimétiques.
Ce peptide possède une activité antimicrobienne vis-à-vis des bactéries Gram-positif et Gram-négatif, des levures et du parasite Leishmania infantum (Abbassi et al., 2008). L'action antiparasitaire de la temporine-SHa s'exerce aussi bien sur les formes promastigotes que sur les formes amastigotes axéniques du parasite avec respectivement une CI50 de 18,1 ILLM et de 22,8 ILLM.
L'activité antimicrobienne des peptides antimicrobiens (PAM), ainsi que leurs activités cytolytiques vis-à-vis des cellules de mammifères, sont le reflet d'un subtil équilibre entre plusieurs paramètres, comme la charge nette, l'hydrophobie, l'hélicité et l'amphipathie (Giangaspero et al., 2001 ; Yeaman et al., 2003 ; Dennison et al., 2005).
Ces paramètres sont très étroitement liés et la simple substitution d'un résidu d'acide aminé peut induire la modification simultanée de plusieurs propriétés physico-chimiques du peptide.

6 Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la substitution d'un ou plusieurs acides aminés de la face polaire de l'hélice a de la temporine-SHa par un acide aminé basique permettait d'obtenir un analogue de cette temporine présentant une activité antimicrobienne accrue ainsi qu'une toxicité diminuée.
Dans le présent document, les termes peptide , oligopeptide , polypeptide ou protéine sont utilisés indifféremment et se réfèrent à
une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d'acide aminé constituant cette chaîne.
Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C :
cystéine; D :
acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H :
histidine; I :
isoleucine; K: lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P :
proline ; Q :
glutamine ; R: arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V: valine ; W:
tryptophane et Y:
tyrosine.
Le terme microbe ou microbien tel qu'utilisé dans ce document se réfère à
des bactéries, des champignons, des levures, des virus et/ou des parasites.
Le terme infection microbienne tel qu'utilisé dans ce document se réfère à
une infection causée par des bactéries, des champignons, des levures, des virus et/ou des parasites.
Le terme activité antimicrobienne tel qu'utilisé dans ce document se réfère à
une activité antibactérienne, antivirale, antifongique et/ou antiparasitaire.
Cette activité
peut être évaluée au travers de la mesure de différents paramètres tels que la CI50, la CMI ou encore la CMB. La CI50 ou concentration inhibitrice 50 correspond à la concentration nécessaire d'un composé pour réduire de 50% la croissance in vitro d'une population de microorganismes. La CMI ou concentration minimale inhibitrice correspond à la concentration minimale de composé permettant d'inhiber totalement la croissance microbienne, après 18 heures d'incubation, en général à 37 C, en présence dudit composé. La CMB ou concentration minimale bactéricide est la concentration minimale de composé permettant de détruire 99,9% des microorganismes après 18 à 24 heures de contact avec ledit composé.
Le terme concentration létale 50 ou CL50 tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à la concentration de composé causant la mort de 50 % d'une population

7 cellulaire. La CL50 est un indicateur quantitatif de la toxicité d'un composé.
La CL50 est notamment utilisée dans ce document pour évaluer l'activité hémolytique des PAM et correspond dans ce cas à la concentration de peptide induisant l'hémolyse de 50% des globules rouges.
La présente invention concerne tout d'abord un peptide analogue de la temporine-SHa dans lequel un ou plusieurs acides aminés de la face polaire de l'hélice a sont substitués par des acides aminés basiques. Selon la projection de Schiffer-Edmunson de l'hélice a de la temporine-SHa représentée sur la figure 1, les acides aminés constituant la face polaire de cette hélice sont les résidus 4, 11, 7, 3 et 10 de la temporine-SHa, notamment telle que présentée dans la SEQ ID No.1 .
La présente invention concerne donc un peptide analogue de la temporine-SHa, doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la séquence F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.18), où X1 est un acide aminé sélectionné dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où lorsque X1 est S au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué
de R, H et K.
Selon un mode de réalisation, le peptide de la présente invention comprend une séquence sélectionnée parmi le groupe consistant en F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.2) ;
F-L-S-X2-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .3);
F-L-S-G-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .4);
F-L-S-G-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No .5);
F-L-X1-X2-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .6);
F-L-X1-G-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .7);
F-L-X1-G-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No .8);
F-L-S-X2-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .9);
F-L-S-X2-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.10);
F-L-S-G-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.11);
F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.12);
F-L-X1-X2-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.13);
F-L-X1-G-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.14);

8 F-L-S-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.15); et F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.16), dans lesquels Xi, X2, X3 et/ou X4 sont des acides aminé basiques sélectionnés dans le groupe constitué de R, H et K. De préférence, X1, X2, X3 et/ou X4 sont K.
Dans un mode de réalisation particulier, Xi est K dans les SEQ ID Nos.2 à 16.
Selon un mode de réalisation, le peptide a une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, de préférence entre 13 et 30, 35, 40, 45 ou 50 acides aminés.
Selon un autre mode de réalisation, le peptide a une taille comprise entre 13 et 15, 20 ou 25 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide a une taille de 13 acides aminés.
Le peptide selon l'invention peut être un précurseur d'un peptide antimicrobien mature. Ce précurseur subit alors des modifications post-traductionnelles permettant d'obtenir la forme mature du PAM. Il peut ainsi comprendre une séquence signal de translocation et des sites de reconnaissance et/ou de clivage lui permettant de subir ces modifications post-traductionnelles. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide est un précurseur d'un peptide antimicrobien mature et comprend la séquence F-L-G-T-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F-G-K (SEQ ID No.17), où X1 est un acide aminé sélectionné
dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où
lorsque X1 est S au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué
de R, H et K.
Les acides aminés constituant le peptide selon l'invention peuvent être de configuration L ou D, de préférence de configuration L.
Le peptide selon l'invention peut présenter une modification post-traductionnelle et/ou une modification chimique en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation ou une méthylation.
Afin d'augmenter la biodisponibilité du peptide en améliorant sa résistance aux peptidases, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C-et/ou N-terminale. Par exemple, le groupement protecteur à l'extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l'extrémité C-terminale peut être une amidation ou une estérification. L'action des protéases peut également être contrecarrée par l'utilisation d'acides aminés de configuration D, la cyclisation du

9 peptide par formation de ponts disulfures, d'anneaux lactames ou de liaisons entre les extrémités N- et C-terminales. Le peptide de l'invention peut également comprendre des liaisons pseudo-peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques classiques CONH et conférant une résistance accrue aux peptidases, telles que CHOH-CH2, NHCO, CH2-0, CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S. De préférence, le peptide selon l'invention présente une amidation de son extrémité C-terminale.
Le peptide selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs acides aminés qui sont des acides aminés rares notamment l'hydroxypro line, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine, l'acide aminobutyrique ; ou des acides aminés synthétiques notamment l'ornithine, la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine.
L'invention couvre également les dérivés fonctionnels d'un peptide selon l'invention tel que décrit ci-dessus. Le terme dérivé fonctionnel tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à des peptides ayant substantiellement la même séquence d'acides aminés, substantiellement la même structure hélicoïdale et substantiellement la même activité antimicrobienne. Ces dérivés fonctionnels peuvent être, par exemple, des rétro peptides, des rétro-inverso peptides, des peptides présentant des substitutions conservatives et les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité
antimicrobienne du peptide de l'invention. Le terme substitution conservative tel qu'utilisé
dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). A
titre d'exemple, l'isoleucine, la leucine, l'alanine, la valine, la phénylalanine, la proline et la glycine peuvent être substitués mutuellement de façon conservative, de même que la lysine, l'histidine et l'arginine ou la sérine, la tyrosine et la thréonine ou la cystéine et la méthionine ou l'asparagine, la glutamine et le tryptophane ou l'acide aspartique et l'acide glutamique. Le terme de dérivé fonctionnel se réfère également à un peptide selon l'invention dont la séquence est raccourcie de 1, 2, 3 ou 4 acides aminés en son extrémité C-terminale et/ou N-terminale.
L'invention couvre également les sels pharmaceutiquement acceptables d'un peptide selon l'invention. Les sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ;
les sels avec des acides organiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales pharmaceutiquement acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifiable, couramment utilisés dans la technique pharmaceutique. Les méthodes de préparation de ces sels sont bien connues de l'homme du métier.
Le peptide selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique classique (en

10 phase solide ou en phase homogène liquide) ou par synthèse enzymatique (Kullman et al., 1987). Il peut également être obtenu par la méthode consistant à cultiver une cellule hôte, telle que décrite ci-après, comprenant un transgène codant pour le peptide et exprimant ledit peptide, et à extraire ledit peptide à partir de ces cellules hôtes ou du milieu de culture dans lequel le peptide a été sécrété.
Le peptide selon l'invention est doté d'une activité antimicrobienne.
Avantageusement, cette activité est supérieure à celle de la temporine-SHa vis-à-vis d'au moins une souche bactérienne, virale, fongique ou parasitaire. Selon un mode de réalisation, le peptide selon l'invention a une activité antimicrobienne supérieure à la temporine-SHa vis-à-vis des bactéries et plus particulièrement vis-à-vis des bactéries Gram-négatif telles qu'Escherichia cou i ou Pseudomonas aeruginosa. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CMI vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa inférieure à 10 uM. Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention a une activité antimicrobienne supérieure à la temporine-SHa vis-à-vis des parasites, notamment vis-à-vis des parasites Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania panamensis, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis et/ou Leishmania peruviana, plus particulièrement vis-à-vis des parasites Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica et/ou Leishmania braziliensis, et de manière tout particulièrement préférée vis-à-vis du parasite Leishmania infantum. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CI50 inférieure à 15 ILLM vis-à-vis de la forme promastigote du parasite Leishmania infantum.

11 Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention a une activité
hémolytique inférieure à celle de la temporine-SHa. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CL50 vis-à-vis des érythrocytes supérieure à 30 itM.
La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention.
Au sens de l'invention, on entend par acide nucléique toute molécule à
base d'ADN ou d'ARN. Il peut s'agir de molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs, modifiées chimiquement, comprenant des bases non-naturelles ou des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié.
L'acide nucléique selon l'invention peut être sous la forme d'ADN et/ou d'ARN, simple brin ou double brin. Selon un mode de réalisation préférée, l'acide nucléique est une molécule d'ADN isolée, synthétisée par des techniques recombinantes bien connues de l'homme du métier.
L'acide nucléique selon l'invention peut être déduit de la séquence du peptide selon l'invention et l'usage des codons peut être adapté selon la cellule hôte dans laquelle l'acide nucléique doit être transcrit. Ces étapes peuvent être réalisées selon des méthodes bien connues de l'homme du métier et dont certaines sont décrites dans le manuel de référence Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001).
La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'invention lié de manière opérationnelle aux séquences nécessaires à son expression. Notamment, l'acide nucléique peut être sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans une cellule hôte. De manière générale, une cassette d'expression est constituée de ou comprend un promoteur permettant d'initier la transcription, un acide nucléique selon l'invention, et un terminateur de transcription. Le terme cassette d'expression désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de manière opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante (le gène

12 d'intérêt) et/ou le ciblage du peptide codé soient sous contrôle du promoteur transcriptionnel et/ou du peptide de transit. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec le contrôle de l'expression. De même, la séquence du peptide de transit est généralement fusionnée en amont de la séquence du gène d'intérêt, et en phase avec celui-ci, et en aval de tout promoteur. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les éléments régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression et/ou le ciblage.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d'expression comprend au moins une séquence activatrice enhancer liée de manière opérationnelle au promoteur.
La présente invention concerne en outre un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon l'invention. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l'expression de l'acide nucléique selon l'invention dans ladite cellule.
Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double-brin. Il est avantageusement choisi parmi un plasmide, un phage, un phagemide, un virus, un cosmide et un chromosome artificiel.
Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs permettant l'expression de l'acide nucléique selon l'invention. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle l'expression est souhaitée, sont bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans la cellule hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome de la cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Lorsque la cellule hôte à transformer est une cellule végétale, le vecteur d'expression est de préférence un vecteur de plante. Des exemples de vecteurs de plantes sont décrits dans la littérature, parmi lesquels on peut citer notamment les plasmides T-DNA de A. tumefaciens pBIN19 (Bevan, 1984), pPZP100 (Hajdukewicz et al., 1994), la série pCAMBIA (R. Jefferson, CAMBIA, Australie). Les vecteurs de

13 l'invention peuvent comprendre, en outre, une origine de réplication et/ou un gène de sélection et/ou une séquence de recombinaison végétale.
Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur d'expression selon l'invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et l'acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique.
La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte est un microorganisme, de préférence une bactérie ou une levure.
Selon un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule animale, par exemple une cellule de mammifère telle que les cellules COS ou CHO (US
4,889,803 ;
US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire.
Selon encore un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule végétale. Le terme cellule végétale tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, et des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plante, des plantes ou des semences.
La présente invention concerne également une méthode de production d'un peptide antimicrobien selon l'invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur d'expression selon l'invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ;
et la récolte du peptide produit par ladite cellule. Les méthodes de production de peptides recombinants sont bien connues de l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans WO 01/70968 pour une production dans une lignée cellulaire immortalisée humaine, WO 2005/123928 pour une production dans une plante et US 2005-229261 pour une production dans le lait d'un animal transgénique.

14 La présente invention concerne également une méthode de production d'un peptide antimicrobien selon l'invention comprenant l'insertion d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur d'expression selon l'invention dans un système d'expression in vitro également appelé acellulaire et la récolte du peptide produit par ledit système. De nombreux systèmes d'expression in vitro ou acellulaires sont disponibles dans le commerce et l'utilisation de ces systèmes est bien connue de l'homme du métier.
La présente invention concerne en outre un peptide selon l'invention en tant que médicament, en particulier en tant que médicament destiné au traitement d'une infection microbienne, à savoir une infection par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite. Elle concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention en tant que médicament. Le médicament peut être destiné à un usage pharmaceutique ou vétérinaire.
Selon un mode de réalisation particulier, l'infection est une infection par un parasite, de préférence du genre Leishmania. L'infection par un parasite peut être une leishmaniose cutanée, une leishmaniose muco-cutanée ou une leishmaniose viscérale.
Le parasite peut être choisi parmi le groupe constitué de Leishmania aethiopica, Leishmania amazonensis, Leishmania arabica, Leishmania aristedes, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania colombiensis, Leishmania deanei, Leishmania donovani, Leishmania enriettii, Leishmania equatorensis, Leishmania forattinii, Leishmania garnhami, Leishmania gerbili, Leishmania guyanensis, Leishmania herreri, Leishmania hertigi, Leishmania lainsoni, Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania naiffi, Leishmania panamensis, Leishmania peruviana, Leishmania pifanoi, Leishmania shawi, Leishmania turanica, Leishmania tropica et Leishmania venezuelensis. De préférence, le parasite est choisi parmi le groupe constitué de Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania guyanensis, Leishmania panamensis et Leishmania peruviana.
De manière particulièrement préférée, le parasite est choisi parmi le groupe constitué de Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica et Leishmania braziliensis. De manière tout particulièrement préférée, l'infection est une infection par le parasite Leishmania infantum.
L'infection peut également être une infection par un parasite du genre Trypanosoma. Le parasite peut être choisi parmi le groupe constitué de Trypanosoma 5 avium, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma con golense, Trypanosoma equinum, Trypanosoma equiperdum, Trypanosoma evansi, Trypanosoma lewisi, Trypanosoma melophagium, Trypanosoma percae, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma rotatorium, Trypanosoma simiae, Trypanosoma suis, Trypanosoma theileri, Trypanosoma triglae et Trypanosoma vivax. De préférence, le parasite est 10 choisi parmi le groupe constitué de Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi et Trypanosoma con golense.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention en tant qu'agent antimicrobien. La présente invention concerne également un acide nucléique, une

15 cassette ou un vecteur selon l'invention en tant qu'agent antimicrobien.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention en tant qu'agent stimulateur du système immunitaire, notamment lors d'une infection microbienne. La présente invention concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention en tant qu'agent stimulateur du système immunitaire. Selon un mode particulier de l'invention, le peptide selon l'invention possède des propriétés chimiotactiques. Le peptide induit le recrutement de cellules immunitaires sur le lieu de l'infection et augmente l'efficacité de la réponse immunitaire aux infections.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un peptide selon l'invention et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique, cassette ou vecteur selon l'invention et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients et supports pharmaceutiquement acceptables susceptibles d'être utilisés dans la composition selon la présente invention sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and

16 Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press[2000]) et comprennent notamment les solutions physiologiques salées et les tampons phosphates.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être appropriée pour une administration orale, sublinguale, cutanée, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire ou intra-auriculaire. De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention est appropriée pour une administration cutanée, orale, intramusculaire, intraveineuse, transdermique ou sous-cutanée. Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention est appropriée pour une administration topique. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme de comprimés, capsules, gélules, granulats, suspensions, émulsions, solutions, gels, pates, onguents, crèmes, emplâtres, potions, suppositoires, lavements, injectables, implants, patches, sprays ou aérosols.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend de 1 à
2000 mg de peptide selon l'invention. De préférence, la composition selon l'invention comprend de 50 à 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000 ou 1500 mg de peptide selon l'invention.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre des substances actives additionnelles, telles que d'autres agents antimicrobiens, notamment des peptides antimicrobiens ou des antibiotiques. La composition peut également comprendre en outre des substances susceptibles de potentialiser l'activité du peptide selon l'invention.
La présente invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une infection microbienne. La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné
au traitement d'une infection microbienne.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une infection microbienne. La présente invention concerne également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une infection microbienne.

17 Le traitement peut être curatif ou préventif.
Le sujet à traiter est un animal, de préférence un mammifère. Selon un mode de réalisation particulier, le sujet à traiter est un humain.
La présente invention concerne également une méthode de traitement d'une infection microbienne comprenant l'administration d'une dose thérapeutiquement efficace d'un peptide, d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur selon l'invention.
Le terme dose thérapeutiquement efficace tel qu'utilisé ici se réfère à la quantité de peptide, d'acide nucléique, de cassette ou de vecteur selon l'invention nécessaire pour observer une activité antimicrobienne sur la bactérie, le virus, le champignon ou le parasite responsable de l'infection. La quantité de peptide, d'acide nucléique, de cassette ou de vecteur selon l'invention à administrer ainsi que la durée du traitement sont évalués par l'homme du métier selon l'état physiologique du sujet à
traiter, l'agent pathogène et l'activité antimicrobienne du peptide vis-à-vis dudit agent pathogène.
Dans un mode de réalisation particulier, l'infection microbienne à traiter est une leishmanio se.
Une dose efficace de peptide selon la présente invention peut comprendre, sans y être limitée, entre environ 1 et 40 mg/kg de poids corporel. La fréquence d'administration peut être par exemple toutes les 4 à 24 heures, de préférence toutes les 8 à 12 heures. La durée du traitement peut être par exemple de 1 à 30 jours, de préférence de 10 à 20 jours, et de manière tout particulièrement préférée de 5 à 10 jours.
La présente invention concerne également l'utilisation du peptide selon l'invention en tant que conservateur, désinfectant ou pesticide.
Les produits alimentaires peuvent être traités par un peptide selon l'invention afin d'éliminer ou de prévenir le risque d'infection par des micro-organismes et ainsi améliorer leur conservation. Le peptide est utilisé dans ce cas comme conservateur.
Le peptide selon l'invention peut être utilisé en tant que pesticide. Le peptide est alors utilisé afin de prévenir ou de traiter les infections des plantes par des phytopathogènes.

18 Le peptide selon l'invention peut également être utilisé en tant que désinfectant.
Le terme désinfectant se réfère à une activité antimicrobienne du peptide sur une surface (par exemple, murs, portes, matériel médical), un liquide (par exemple, de l'eau) ou un gaz (par exemple, un gaz anesthésiant).
Les biofilms sont responsables de près de 60% des infections nososomiales. Ils sont essentiellement dus à la colonisation microbienne de biomatériaux implantés.
L'éradication d'un biofilm bactérien est un problème clinique majeur étant donné que l'antibiothérapie habituellement active sur les bactéries à l'état planctonique, se révèle souvent bien moins efficace sur des structures organisées en biofilm. L'effet des peptides antimicrobiens sur ce type de biofilm a été démontré dans de précédentes études réalisées sur la temporine-A (Cirioni et al., 2003).
Selon un mode de réalisation, le peptide selon l'invention est utilisé pour l'élimination de biofilms bactériens. Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention est notamment utilisé pour la désinfection du matériel chirurgical ou prothétique.
La présente invention concerne également un appareillage médical ou implant comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou incluant un peptide selon l'invention. Notamment, la surface peut être couverte d'un peptide à une densité
de 0,4 à 300 mg/cm2. Le peptide peut être combiné à une autre molécule active, de préférence un antibiotique. L'implant peut être un implant vasculaire.
La présente invention concerne également une méthode de préparation d'un appareil médical ou implant comprenant l'application d'une couche de peptide selon l'invention, ou la mise en contact avec celui-ci, sur au moins une surface de l'appareil ou implant. Ce type d'appareil médical ou implant ainsi que ses utilisations et méthodes de préparation sont par exemple décrite dans la demande de brevet WO
2005/006938.
La présente invention concerne une composition alimentaire comprenant au moins un peptide selon l'invention.
La présente invention concerne également une composition agrochimique comprenant au moins un peptide selon l'invention.

19 La présente invention concerne une plante transgénique comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention, et susceptible d'exprimer ou exprimant un peptide selon l'invention.
L'introduction des acides nucléiques, des cassettes ou des vecteurs d'expression de l'invention dans une cellule ou un tissu végétal, y compris une graine ou plante, peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Les techniques de transgenèse végétale sont bien connues dans le domaine, et comprennent par exemple l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens (Hooykaa and Schilperoort, 1992), l'électroporation, le transfert conjugatif, des techniques biolistiques (Russel et al., 1992) ou la microinjection dans des embryons ou protoplastes végétaux.
D'autres techniques de transgenèse végétale sont bien connues, ou d'autres protocoles mettant en oeuvre les techniques ci-dessus sont décrits dans l'art antérieur (Siemens and Schieder, 1996) et peuvent être appliqués à la présente invention. La plante transgénique selon l'invention peut notamment être obtenue selon la méthode décrite dans la demande de brevet WO 00/055337.
La plante transgénique peut appartenir à toute espèce végétale. Elle peut être monocotylédone ou dicotylédone. Plus particulièrement, la plante transgénique de l'invention est une plante de culture destinée ou non à l'alimentation animale ou humaine ou sur laquelle les phlébotomes, les insectes vecteurs des leishmanies, viennent se nourrir tels que le maïs, le blé, le colza, le soja, la luzerne, le lin, le riz, la canne à
sucre, la betterave, le tabac, le coton, le tournesol, la tomate, le chou, la carotte, la pomme de terre, ou des arbres fruitiers tels que le citronnier, le pommier, l'abricotier, le pêcher ou le noisetier, ou les plantes identifiées, à ce jour, comme sources de repas sucré pour les phlébotomes tels Ricinus comm unis, Capparis spinosa, Solanum jasminoides, Solanum luteum ou Bougainvillea glabra.
Selon un mode de réalisation, l'expression du peptide selon l'invention permet à
la plante transgénique de présenter une résistance accrue aux pathogènes, et plus particulièrement aux phytopathogènes. L'utilisation d'une telle plante transgénique permet de réduire de manière considérable la pulvérisation ou l'application de pesticides sur les cultures, et ainsi de limiter les effets néfastes de ces produits sur l'environnement.
Selon un autre mode de réalisation, la plante transgénique exprime un peptide selon l'invention qui est administré à un animal y compris les phlébotomes ou un humain par ingestion de ladite plante ou de ses sucs. Dans ce cas, le peptide n'a pas nécessairement un effet sur les phytopathogènes mais présente une activité
antimicrobienne vis-à-vis d'un ou plusieurs pathogènes de l'animal y compris les leishmanies présentes dans le tractus digestif des phlébotomes vecteurs des leishmanioses humaines et animales ou l'humain auquel il est administré. Les plantes transgéniques sur lesquelles les phlébotomes prennent leur repas sucré, délivrent directement dans le tractus digestif de l'insecte vecteur, un peptide antimicrobien de l'invention qui tue directement le parasite éventuellement présent chez l'insecte vecteur ou en bloquant son développement en tuant les bactéries de la flore intestinale de l'insecte vecteur, nécessaires à la différenciation et à la multiplication parasitaire. Les plantes transgéniques constituent de fait un moyen efficace de contrôle indirect de la transmission des leishmanioses.
La présente invention concerne un anticorps spécifique du peptide selon l'invention. Le terme anticorps tel qu'utilisé dans la présente invention se réfère notamment à des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des fragments de ceux-ci (par exemple les fragments F (ab) '2, F (ab)), des anticorps simple-chaîne ou minibody ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le peptide selon l'invention, notamment les CDR (régions déterminant la

20 complémentarité). On peut citer par exemple les anticorps chimériques, humanisés ou humains. Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Les différentes techniques de préparation des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour détecter un peptide selon l'invention. Elle concerne également l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour effectuer des mesures quantitatives d'un peptide selon l'invention, notamment par des dosages immunologiques. Ces mesures peuvent notamment permettre d'évaluer l'expression du peptide selon l'invention dans une cellule hôte ou une plante transgénique selon l'invention.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.

cA 02755472 2016-06-21

21 EXEMPLES
Matériel et méthodes Synthèse peptidique en phase solide La synthèse peptidique en phase solide a été réalisée à l'aide d'un synthétiseur de peptides automatique (Applied Biosystems 433A) selon le protocole décrit dans Vanhoye et al. (Vanhoye et al., 2004), et en utilisant des acides aminés protégés par Fmoc (Novabiochem, Suisse) et une résine Rink amide MBHA (Serin Chemicals, Suisse).
La purification des peptides synthétisés a été réalisée par RP-HPLC sur une colonne semipréparative C18 (Waters RCM compact preparative Cartridge module, Å, 25 x 100 mm), en utilisant un gradient 0-60% acétonitrile (1%/min) à un débit de 8 mi/min. L'homogénéité et l'identité des peptides synthétiques ont été évaluées par RP-HPLC analytique (colonne Syrnmetry.C18, 5 jun, 4,6 x 250 mm, Waters ¨ débit :
0,75 ml/min) et spectrométrie de masse MALDI-TOF (Voyager DE-PRO, Applied Biosystems).
Tests d'activité antibactérienne Les souches suivantes ont été utilisées pour les testa antibactériens : Esche richia colt (ATCC 25922 et ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Bacillus megaterium et Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
Pour chaque souche, un inoculum standard de 103 à 106 bactéries/tnL (phase exponentielle de croissance) a été préparé. Pour cela, une colonie isolée sur une gélose LB préalablement ensemencée par une des souches, a été mise en culture dans 10 mL de milieu LB. Les cultures en milieu liquide ont ensuite été incubées pendant 2 à
3 h sous agitation à 37 C pour que les bactéries soient en phase exponentielle de croissance.
Chaque suspension bactérienne a été diluée dans du milieu LB de manière à
obtenir une DO à 630 mn de 0,01 qui correspond à une concentration de 105-106 cfu/mL (cfu : unité
formant une colonie).

22 La concentration minimale inhibitrice (CMI) de chaque peptide a été déterminée par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. La CMI est définie comme étant la plus faible concentration de peptide capable d'inhiber la croissance de la souche bactérienne testée, après une incubation de 18 h à 37 C. Le test a été
effectué dans une plaque de microtitration stérile contenant 96 puits. Une gamme de concentrations croissantes de chaque peptide (1 à 400 nM) a été préalablement préparée dans de l'eau milliQ stérile contenant 5% de diméthyl sulfoxide (DMSO). Le DMSO facilite la solubilisation des peptides et ne présente aucune activité antimicrobienne à
la concentration utilisée. Dans chaque puits, 50 nt, de peptide ont été incubés avec 50 nt, de suspension bactérienne (105-106 cfu/mL). La microplaque a ensuite été
incubée à
37 C pendant 18 h, sous agitation. La croissance bactérienne a été déterminée par mesure de la DO à 630 nm (turbidité) à l'aide d'un lecteur de plaques. Les tests ont été
réalisés en triplets pour chaque concentration de peptide.
Le témoin négatif d'inhibition de croissance a été obtenu en remplaçant la solution contenant le peptide par 50 nI_, d'eau milliQ stérile contenant 5% de DMSO. Le témoin positif permettant d'inhiber totalement la croissance des souches bactériennes a été obtenu en remplaçant la solution contenant le peptide par 50 nI_, de formaldéhyde à
0,7%.
Tests d'activité antifongique Les trois souches de levures suivantes ont été utilisées : Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans (ATCC 90028), Candida parapsilosis (ATCC 22019).
Ces souches ont été préalablement cultivées sur gélose YPD pendant 48 h minimum.
Des suspensions de levures ont ensuite été préparées, exactement comme pour les bactéries, et ajustées à 105-106 cfu/mL dans du milieu YPD liquide.
Le test antifongique correspond au test d'inhibition de croissance en milieu liquide utilisé pour les bactéries (cf ci-dessus) dans lequel le milieu LB a été remplacé
par un milieu de culture YPD. Les souches fongiques ont été incubées à 30 C.
Tests hémolytiques L'activité hémolytique des peptides antimicrobiens a été mise en évidence en utilisant des globules rouges humains de donneurs sains. L'hémolyse des globules

23 rouges se traduit par la libération d'hémoglobine dans le milieu réactionnel dont la concentration est déterminée par spectrophotométrie à 450 nm.
Les globules rouges ont été séparés du plasma et des globules blancs par centrifugation du sang humain (900 g, 10 min). Le culot contenant les globules rouges a été lavé 3 fois avec du tampon PBS, pH 7,4. Après comptage à l'aide d'une cellule de Malassez, une solution mère de 2.107 hématie,s/mL a été préparée dans le même tampon, ainsi qu'une gamme de concentrations des peptides à tester (1 à 200 M).
Le test a été effectué de la manière suivante : 100 kiL des différentes concentrations de peptide ont été ajoutés à 100 1.1 de la suspension de globules rouges.
Après 1 h d'incubation à 37 C, puis centrifugation (12 000g, 15 sec), l'absorbance du surnageant a été mesurée à 450 nm. Le témoin négatif pour ce test (0%
d'hémolyse) contenait 100 ILL de tampon PBS à la place de la solution contenant le peptide et le témoin positif (100% d'hémolyse) contenait 100 L de Tritone0,1% à la place de la même solution.
La valeur LC50 obtenue résulte de la moyenne de trois expériences réalisées en triplets et correspond à la concentration de peptide induisant 50% d'hémolyse.
Tests d'activité anti-Leishmania L'activité antiparasitaire des peptides a été évaluée sur les deux formes du parasite Leishmania infantum, la forme promastigote et la forme amastigote.
Les tests d'activité anti-Leishmania ont été réalisés avec une lignée aNEO-aLUC
de Leishmania infantum. Cette lignée a été obtenue en transformant la souche MHOM/MA/67/1114AP-263 de Leishmania infantum avec le vecteur pGM aNEO-aLUC contenant le gène rapporteur de la luciférase (LUC) et le gène de résistance à la néomycine (NEO) tel que décrit dans Roy et a/. (2000). Elle est maintenue en culture sous ses deux formes, promastigotes et amastigotes.
Culture des parasites :
Les promastigotes de Leishmania infantum ont été maintenus à 26 C par un à
deux passages hebdomadaires selon le nombre de parasites dans l'inoculum, dans du milieu SDM 79, supplémenté avec 10% à 20% de sérum de veau foetal décomplérnenté
et de 5 mg/mL d'hêmine de porc et en présence de 100 UhnL de pénicilline et

24 iag/mL de streptomycine (Brun & Shonenberger, 1979). A partir d'un inoculum de cellules/mL en phase de croissance logarithmique, les promastigotes ont atteint une densité cellulaire de 2 à 3x108 parasites/mL en phase stationnaire, après 7 jours de culture dans des flacons de culture de 25 cm2. Les densités cellulaires ont été
déterminées par comptage en cytométrie de flux, en présence d'iodure de propidium sur un compteur Facscan (Excalibur, Becton-Dickinson, Ivry, France).
Les amastigotes axéniques ont été obtenus par différenciation des promastigotes à 37 C 0,1 C (saturation en H20, 5% CO2), en culture dans le milieu MAA, supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal décomplémenté et de 12,5 mg/mL
d'hêmine de porc, en présence de 100 U/mL de pénicilline et 100 iag/mL de streptomycine (Sereno et Lemesre, 1997). A partir d'un inoculum de 5x105 cellules/mL
en phase de croissance logarithmique, les amastigotes ont atteint une densité
cellulaire de 2 à 3x108 parasites/mL en phase stationnaire, après 7 jours de culture dans des flacons de culture de 25 cm2. L'observation microscopique des amastigotes axéniques montre des formes homogènes (rondes à ovoïdes) sans flagelle apparent et immobiles.
Les amastigotes axéniques des diverses espèces de Leishmania présentent les mêmes propriétés ultrastructurales, biologiques, biochimiques et immunologiques que les amastigotes intracellulaires. Les densités cellulaires ont aussi été
déterminées par comptage en cytométrie de flux selon la même procédure et les mêmes paramètres utilisés pour les promastigotes.
Tests d'activité anti-Leishmania sur les amastigotes axéniques :
Une suspension d'amastigotes axéniques de la lignée de Leishmania infantum transfectée par la cassette aNEO-aLUC en phase exponentielle de croissance et avec un pourcentage de viabilité supérieur à 90%, a été ajustée à une densité de 1,25x106 parasites/mL dans du milieu MAA/20. Des solutions de peptides antimicrobiens cinq fois concentrées ont également été préparées dans ce milieu (300 à 4,7 tM).
Pour le test, la suspension d'amastigotes axéniques est répartie dans une microplaque de culture sous un volume de 80 iaL par puits (soit 105 parasites/puits) dans lesquels sont ajoutés 20 iaL de chaque solution de peptide (60 à 0,94 iaM
final) (soit une densité parasitaire finale de 106 parasites/mL). La plaque est ensuite incubée à 37 C
pendant 72 h. Pour le contrôle négatif, la solution de peptide a été remplacée par 20 iaL
de milieu MAA/20. Le contrôle positif a été réalisé avec 20 iaL de la solution contenant la plus forte concentration de peptide. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide. Après 72 heures, 50 4 de tampon de lyse (Steady GL0e, Promega) ont été ajoutés dans chaque puits. Après incubation durant 5 min à
température ambiante, la lyse cellulaire a été vérifiée au microscope.
5 La luminescence émise a été mesurée par un lecteur de luminescence (Victor, PerkinElmer). Elle est proportionnelle au nombre de parasites vivants dans le milieu.
Le pourcentage de croissance a été calculé selon la formule suivante :
% croissance [(L moy ¨ bc1f)peptide x 100] / (L moy ¨ beccensie avec L moy: Luminescence moyenne et bdf : bruit de fond.
10 La concentration inhibant de 50% la croissance des amastigotes (CI50) a été
déterminée.
Tests d'activité anti-Leishmania sur les promastigotes Comme pour les tests sur amastigotes, 804 de suspension de promastigotes (105 15 parasites/puits) ont été mélangés à 20 4 de solution de peptide (60 à 0,94 itM final) dans chaque puits d'une plaque de microtitration. Les contrôles négatifs et positifs ont été réalisés selon le même protocole que pour les tests d'activité anti-Leishmania sur les amastigotes. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide.
20 Après 72 heures d'incubation à 26 C, 50 L par puits de tampon de lyse Steady Glo (Pmmega) ont été ajoutés et, après incubation durant 5 min à température ambiante, la lyse cellulaire a été vérifiée au microscope. La luminescence émise a été
mesurée et le pourcentage de croissance a été calculé selon la méthode décrite ci-dessus.
La concentration inhibant de 50% la croissance des promastigotes (C150) a été
déterminée.
Tests de cytotoxicité sur les monocytes :
L'activité cytotoxique des peptides antimicrobiens a été déterminée vis-à-vis d'une lignée de monocytes humains THP-1. Les cellules ont été maintenues en culture dans du milieu RPMI (10% SVF, 100 U/mL pénicilline, 100 p.g/mL streptomycine) jusqu'à obtenir une phase exponentielle de croissance. Après comptage sur cellule de Thoma, la densité cellulaire a été ajustée à 6,25x105 cellules/mL dans du milieu RPMI
1640. Des solutions peptidiques 5 fois concentrées ont été préparées dans du milieu RPMI (300 à 4,7 M).

Les monocytes sont répartis sous un volume de 80 iaL de suspension cellulaire par puits (soit 5x104 monocytes/puits ou 5x105 cellules/mL final) et mélangés à 20 iaL de solution de peptide (60 à 0,94 1.M final). Les contrôles négatifs et positifs ont été
réalisés selon le même protocole que pour les tests d'activité anti-Leishmania. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide.
Les cellules sont incubées à 37 C, sous 5% de CO2, pendant 72h.
Après 72 heures, le nombre de cellules THP-1 viables a été indirectement évalué
par le test MTT (Mosmann, 1983). Le MTT (ou 3-(4,5-diméthylthiazol-2-y1)-2,5-diphényl-tétrazolium bromide), de couleur jaune, est réduit en bleu formazan sous l'action de la succinate-tétrazolium réductase qui est présente dans la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules métaboliquement actives. Ce bleu formazan est détectable par spectrophotométrie (570 nm).
Une solution de MTT dissous dans le tampon PBS (pH 7,4) à la concentration de 10 mg/mL, filtrée sur 0,45 iam, est ainsi répartie à raison de 10 iaL par puits. Les plaques sont ensuite incubées pendant 4 h à 37 C. La réaction enzymatique est stoppée par l'addition de 100 iaL d'un mélange isopropanol 50% / SDS 10% et les microplaques sont ensuite incubées à température ambiante durant 30 min, sous agitation. La DO à
570 nm de chaque puits a ensuite été mesurée (lecteur Victor, PerkinElmer) afin de déterminer la CI50.
Résultats Activités antibactérienne, antifongique et hémolytique de la temporine-SHa et de l'analogue [K3]temporine-SHa L'activité antimicrobienne de la temporine-SHa (SEQ ID No.1) et de l'analogue [KItemporine-SHa (SEQ ID No.19) a été évaluée sur différentes souches bactériennes de référence Gram-positif et Gram-négatif, ainsi que sur des souches fongiques.
L'activité hémolytique de ces deux peptides a également été évaluée. Les valeurs des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations létales 50 (CL50) sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Activités antimicrobiennes et hémolytiques de la temporine-SHa et de l'analogue [10temporine-SHa CMI ( 1\1) Temp-SHa [K3]
Temp-SHa Gram-négatif Escherichia cou i (ATCC 25922) 10 3 Escherichia coli (ATCC 35218) 10 3 Escherichia cou i ML-35p 6,25 3 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 31,25 3 Gram-positif Staphylococcus aureus (ATCC 25923) 3 3 Enterococcus faecalis (ATCC 29212) 10 10 Bacillus megaterium 2,5 1,5 Levures Candida albicans (ATCC 90028) 15 12,5 Candida parapsilosis (ATCC 22019) 31,25 12,5-6,25 Saccharomyces cerevisiae 7,9 6,25 CL50 érythrocytes ( 1\1) 25 50 Ces résultats démontrent que l'activité antimicrobienne de l'analogue [10temporine-SHa est remarquablement plus importante que celle de la temporine-SHa, notamment à l'encontre des souches Gram-négatif (CMI de 3 iuM pour toutes les souches testées) et des levures.
A noter que l'activité antibactérienne de l'analogue [10temporine-SHa est 10 fois plus importante à l'encontre de Pseudomonas aeruginosa que celle de la temporine-SHa. Ce résultat est particulièrement intéressant étant donné que cette souche est résistante à la plupart des temporines.
De plus, l'augmentation du pouvoir antimicrobien de l'analogue [10temporine-SHa s'accompagne d'une diminution d'un facteur 2 de l'activité hémolytique par rapport à celle de la temporine-SHa.

Activité anti-Leishmania de la temporine-SHa et de l'analogue [K3]temporine-SHa L'activité anti-Leishmania des deux temporines a été évaluée sur le parasite Leishmania infantum, agent responsable essentiellement de la leishmaniose viscérale humaine dans le pourtour du bassin méditerranéen et en Amérique latine.
Des cultures des formes promastigotes et amastigotes axéniques de Leishmania infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-236) exprimant le gène de la luciférase ont été
utilisées. L'évaluation de l'activité métabolique des parasites est basée sur l'oxydation de la luciférine par la luciférase en présence d'ATP. Ce processus aboutit à
l'émission de photons qui est proportionnelle à la concentration des parasites non lysés.
Les résultats de ces tests anti-Leishmania ont démontré que la temporine-SHa et l'analogue [KItemporine-SHa sont actifs contre les deux formes du parasite Leishmania infantum (Figure 2 A et B). Cependant, l'analogue [KItemporine-SHa présente une meilleure activité antiparasitaire vis-à-vis des promastigotes par rapport à
la temporine-SHa. L'analogue [KItemporine-SHa agit sur la forme promastigote du parasite avec une CI50 de l'ordre de 10 uM, alors que la temporine-SHa a une CI50 de l'ordre de 20 uM (figure 2 B).
Les effets cytotoxiques de la temporine-SHa et de l'analogue [KItemporine-SHa ont été évalués sur la lignée de monocytes humains THP-1. Les monocytes représentent la forme non différenciée des macrophages qui sont les cellules hôtes des parasites Leishmania. Les résultats obtenus (Figure 3) démontrent que la temporine-SHa et l'analogue [KItemporine-SHa ne sont pas cytotoxiques aux doses antimicrobiennes.
Conclusion La substitution de la sérine sur la face polaire de l'hélice a de la temporine-SHa par une lysine a permis de générer un analogue [KItemporine-SHa présentant une activité
antimicrobienne plus importante que celle de la temporine-SHa, notamment à
l'encontre des souches Gram-négatif et des levures. Cet analogue présente en outre une meilleure activité antiparasitaire vis-à-vis du parasite Leishmania infantum, notamment vis-à-vis des promastigotes.

De plus, il a été démontré que cette augmentation du pouvoir antimicrobien s'accompagne d'une diminution d'un facteur 2 de l'activité hémolytique et que cet analogue n'était pas cytotoxique vis-à-vis des monocytes, cellules cibles du parasite de l'hôte vertébré, aux doses antimicrobiennes.
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LISTAGE DES SÉQUENCES EN FORMAT ÉLECTRONIQUE
En vertu de l'article 111(1) des Règles sur les brevets, la présente description contient une version électronique du listage des séquences en format texte ASCII
(fichier 11756-85 Seq 07-SEP-11 v 1 .txt).
Une copie du listage des séquences en format électronique est disponible au Bureau des brevets du Canada.
Les séquences comprises dans le listage des séquences en format électronique sont reproduites dans le tableau des séquences qui suit.
PAGE AMENDÉE

TABLEAU DES SÉQUENCES
<110> Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) Institut de Recherche pour le développement Centre National de la Recherche Scientifique <120> Analogues de la temporine-SHa et leurs utilisations <130> 11756-85 <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> PRT
<213> Pelophylax saharica <400> 1 Phe Leu Ser Gly Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 2 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3).7(3) <223> R, H ou K
<400> 2 Phe Leu Xaa Gly Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 3 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE

<222> (4)..(4) <223> R, H ou K
<400> 3 Phe Leu Ser Xaa Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 4 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<400> 4 Phe Leu Ser Gly Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 5 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)7.(10) <223> R, H ou K
<400> 5 Phe Leu Ser Gly Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 6 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4) <223> R, H ou K

=

<400> 6 Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 7 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(3) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<400> 7 Phe Leu Xaa Gly Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 8 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(3) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10) <223> R, H ou K
<400> 8 Phe Leu Xaa Gly Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 9 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4)..(4) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<400> 9 Phe Leu Ser Xaa Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 10 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4)..(4) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10) <223> R, H ou K
<400> 10 Phe Leu Ser Xaa Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 11 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE

<222> (10)..(10) <223> R, H ou K
<400> 11 Phe Leu Ser Gly Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 12 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<400> 12 Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe <210> 13 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10) <223> R, H ou K
<400> 13 Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 14 <211> 13 ..

<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
_ <222> (3)..(3) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
_ <222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
_ <222> (10)..(10) <223> R, H ou K
<400> 14 Phe Leu Xaa Gly Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 15 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4)..(4) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
_ <222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)7.(10) <223> R, H ou K
<400> 15 Phe Leu Ser Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 16 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7) <223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10) <223> R, H ou K
<400> 16 Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 17 <211> 50 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Précurseur d'un peptide antimicrobien mature <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (38)..(38) <223> S, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (39)..(39) <223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (42)..(42) <223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (45)..(45) <223> G, R, H ou K

<400> 17 Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys Glu Gin Glu Arg Asp Ala Asp Glu Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro Asn Glu Ser Asn Val Glu Val Glu Lys Arg Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe Gly Lys <210> 18 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa <220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(3) <223> S, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4).7(4) <223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7).7(7) <223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)7.(10) <223> G, R, H ou K
<400> 18 Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe <210> 19 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Analogue [K3]temporine-SHa <400> 19 Phe Leu Lys Gly Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe

Claims (24)

REVENDICATIONS

1. Peptide d'une taille comprise entre 13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antibactérienne, antifongique ou antiparasitaire vis-à-vis d'un parasite appartenant au genre Leishmania, et comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F, où X1 est un acide aminé
sélectionné
dans le groupe constitué de R, H et K, et dérivés fonctionnels et sels pharmaceutiquement acceptables dudit peptide, lesdits dérivés fonctionnels étant des rétro peptides, des rétro-inverso peptides ou des peptides comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F
raccourcie de 1 ou 2 acides aminés en son extrémité C-terminale et/ou N-terminale.

2. Peptide selon la revendication 1, dans lequel X1 est K.

3. Peptide selon la revendication 1, dans lequel X1 est H.

4. Peptide selon la revendication 1, dans lequel X1 est R.

5. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le peptide a une taille comprise entre 13 et 50 acides aminés.

6. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le peptide a une taille comprise entre 13 et 15 acides aminés.

7. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le peptide a une taille de 13 acides aminés.

8. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le dérivé fonctionnel est un rétro-peptide ou un rétro-inverso peptide.

9. Peptide selon la revendication 8, dans lequel le dérivé fonctionnel est un rétro-inverso peptide.

10. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le dérivé fonctionnel est un peptide comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F raccourcie de 1 ou 2 acides aminés en son extrémité C-terminale et/ou N-terminale.

11. Peptide selon la revendication 10, dans lequel le dérivé fonctionnel est un peptide comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F raccourcie de 1 ou 2 acides aminés en son extrémité
N-terminale.

12. Acide nucléique codant pour le peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

13. Cassette d'expression comprenant l'acide nucléique selon la revendication 12.

14. Vecteur d'expression comprenant l'acide nucléique selon la revendication 12 ou la cassette d'expression selon la revendication 13.

15. Cellule hôte comprenant l'acide nucléique selon la revendication 12, la cassette d'expression selon la revendication 13 ou le vecteur d'expression selon la revendication 14.

16. Composition pharmaceutique comprenant au moins le peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, et un support et/ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, ladite composition pharmaceutique étant appropriée pour une administration topique.

18. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour une utilisation en tant que médicament pour traiter une infection par une bactérie ou un champignon.

19. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour une utilisation en tant que médicament pour traiter une infection par un parasite appartenant au genre Leishmania.

20. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, acide nucléique selon la revendication 12, cassette d'expression selon la revendication 13 ou vecteur selon la revendication 14 pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une bactérie, un champignon ou un parasite appartenant au genre Leishmania.

21. Utilisation du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 en tant que désinfectant, conservateur ou pesticide.

22. Appareillage médical comprenant une surface couverte ou incluant le peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

23. Utilisation du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, de l'acide nucléique selon la revendication 12, de la cassette d'expression selon la revendication 13 ou du vecteur selon la revendication 14, pour traiter une infection par une bactérie, un champignon ou un parasite appartenant au genre Leishmania.

24. Utilisation du peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, de l'acide nucléique selon la revendication 12, de la cassette d'expression selon la revendication 13 ou du vecteur selon la revendication 14, pour la fabrication d'un médicament pour traiter une infection par une bactérie, un champignon ou un parasite appartenant au genre Leishmania.