NO333073B1

NO333073B1 - Cytotoksiske peptider modifisert med en eller flere ikke-genetiske, voluminose og/eller lipofile aminosyrer.

Info

Publication number: NO333073B1
Application number: NO20010995A
Authority: NO
Inventors: John Sigurd Svendsen; Oystein Rekdal; Baldur Sveinbjornsson; Lars Vorland
Original assignee: Lytix Biopharma As
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 2001-02-27
Publication date: 2013-02-25
Also published as: GB9818938D0; JP2002523517A; US20080287346A1; NO20010995D0; US6890902B2; AU5526899A; AU5526799A; EP1109831A2; DE69943130D1; JP5475937B2; EP1109831B1; ES2359616T3; US20030148936A1; CA2340326A1; EP1109827B1; CA2341037C; CA2341037A1; WO2000012541A3; US20030022821A1; EP1109827A2

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et cytotoksisk 7- til 25- mert peptid med tre eller flere kationiske rester som har en eller flere ikke- genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer, samt esters, amider, salter og sykliske derivater derav, samt fremgangsmåter for fremstilling av peptidene, de farmasøytiske preparatene som inneholder dem, og deres anvendelse som medikamenter, særlig som antibakterioner eller antitumormidler.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører bioaktive peptider, nærmere bestemt peptider som er blitt modifisert for å øke deres cytotoksiske aktivitet.

Mange forskjellige organismer anvender peptider som del av deres vertsforsvars-mekanisme, hos virveldyr supplerer dette det svært spesifikke cellemedierte immunsystem [Mor, A., Hani, K. og Nicolas, P. (1994), J. Biol. Chem. 269, 31635-31641. Boman, H.G. (1996), Scand. J. Immunol. 43,475-482]. Antimikrobielle peptider er blitt isolert fra så forskjellige arter som bakterier og pattedyr [Lehrer, R.I., Lichtenstein, A.K. og Ganz, T. (1993), Ann. Rev. Immunol. 11, 105-128]. Generelt har disse antibiotiske peptidene en netto positiv ladning og en tilbøyelighet til å danne amfifile a-heliks- eller p-arkstrukturer etter interaksjon med det utvendige fosfolipiddobbeltlag i bakteriecellemembraner [Besalle, R., Gorea, A., Shalit, J., Metger, J.W., Dass, C, Desiderio, D.M. og Fridkin, M. (1993), J. Med. Chem. 36,1203-1209]. I de fleste tilfeller er de detaljerte molekylære mekanismene for den antibiotiske virkning ukjent, selv om noen peptider kategorisert som klasse L-peptider (lytiske), antas å reagere med bakteriecellemembraner, sannsynligvis ved å danne ionekanaler eller porer [Ludtke, S.J., He, K., Heller, W.T., Harroun, T.A., Yang, L. og Huang, H.W. (1996), Biochemistry 35, 13723-13728] som fører til permeabilitetsendringer og følgelig cellelyse.

Magaininer er antibakterielle peptider fra huden til frosken Xenopus laeris og er klassifisert som klasse L-antibiotika fordi de spesifikt lyserer bakterier; andre peptider, slik som mastroparaner, en bigift, mangler denne spesifisitet ettersom de lyserer både eukaryotiske og prokaryotiske celler og kalles klasse L-gifter [Tytler, E.M., Anantharamaiah, G.M., Walker, D.E., Mishra, V.K., Palgunachari, M.N. og Segrest, J.P. (1955), Biochemistry 34,4393-4401]. Antibiotisk resistens som oppvises av disse infeksiøse mikroorganismer, er et økende problem, og det er alltid et behov for nye antibiotika. Antibakterielle peptider, slik som klasse L-peptidene, er kjent og flere blir oppdaget, med det formål å finne et peptid som er svært cytotoksisk og fortrinnsvis spesifikt for prokaryotiske celler. Det er forskjeller i strukturen og sammensetningen av lipid-dobbeltlagene mellom eukaryoter og prokaryoter, og blant prokaryoter selv, noe som betyr at forskjellige peptider vil ha svært avvikende spesifisiteter.

På samme måte som magaininer og mastroparaner er vertsforsvarspeptider blitt isolert fra møll og fluer (cecropiner) og fra hesteskokrabbe. Den direkte virkning av disse vertsforsvarspeptider for avvisning av rovdyr, f.eks. gift, er klar. Letingen etter peptider som oppviser antibiotiske effekter, har ført til identifikasjonen av andre proteiner/peptider som ikke ville forventes å ha cytotoksiske egenskaper. Ett av disse er laktoferrin, en jerntransportør som også oppviser en svak antibakteriell virkning.

I tillegg til leting etter nye antimikrobielle peptider er det i den senere tid blitt forsøkt å øke aktiviteten av proteiner eller peptider med kjente antimikrobielle egenskaper. Dette er blitt gjort i tilfellet med bovint laktoferrin ved å fordøye det naturlig forekommende protein med magepepsin for å fremstille et peptid, laktoferricin B (LFB), som er mye mer aktivt enn det naturlig forekommende bovine lactoferrin. LFB er et 25-resters peptid som tilsvarer restene 17-41 i bovint laktoferrin. [Bellamy et al. (1992), Biochem. Biophys. Acta. 1121, s. 130 et seq.]. Strukturaktivitetsundersøkelser er blitt utført på magaininer, og det er f.eks. blitt påvist at økning av heliksdannelse og av den kationiske ladning fører til høyere antibakteriell aktivitet [Chen, Y.H., Brown, J.H., Morell, J.L. og Huang, CM. (1988), FEBS Letters 236, 462-466]. Slike sekvensmodifikasjoner resulterer imidlertid ofte i høyere hemolytisk aktivitet. Det er således et formål ved foreliggende oppfinnelse å fremstille peptider og/eller peptidderivater som har signifikant antibakteriell aktivitet, men som fortrinnsvis har lav toksisitet, dvs. liten effekt på normale eukaryotiske celler, f.eks. lav hemolytisk aktivitet. Selv om røde blodlegemer ikke er typiske eukaryotiske celler, gir de en bekvem måte for analysering med hensyn på toksisitet, og i alle tilfeller er de en type celle som ikke burde bli lysert i et betydelig omfang av terapeutiske, bioaktive peptider. WO 93/24138 fra Magainin Pharmaceuticals vedrører biologisk aktive peptider som har N-terminale substitusjoner. Hwang et al (Biochem., 1998, 37, s. 4288-98) vedrører en tredimensjonal struktur av laktoferrin B i løsning. Laktoferrin B er et antimikrobielt peptid avledet fra bovint laktoferrin. Ferrari et al (J. Antibiotika, 1996,49, s. 150-4) er relatert til strukturkarakterisering av antibiotika A21459 A og B som er nye hemmere av bakteriell proteinsyntese. Kang et al (Int. J. Peptide & Protein Res., 1996, 48, s. 357-63) vedrører relasjoner mellom struktur og biologisk aktivitet av et 11-rester svært basisk peptidsegment av storfe laktoferrin. Lawyer et al (FEBS Lett., 1996, 390, s. 95-8) vedrører den antimikrobielle aktiviteten til et 13 aminosyrer tryptofan-rikt peptid avledet fra et antatt griseforløperprotein av en ny familie av antibakterielle peptider. US 5792831 vedrører analoger av magainin peptider inneholdende D-aminosyrer

Det er blitt funnet at ved å øke massen eller den lipofile natur til et peptid, kan dets bioaktivitet økes, særlig dets cytotoksisitet. Fortrinnsvis økes massen og lipofilisiteten til én eller flere aminosyrerester.

Foreliggende oppfinnelse gjelder et cytotoksisk 7- til 15-mert peptid med tre eller flere kationiske rester, som er i stand til å danne en amfipatisk a-heliks og der cytotoksisiteten er forbedret ved innføring av én eller flere ikke-genetiske, voluminøse og/eller lipofile aminosyrer hvor R-gruppen i den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre har minst 9 atomer som ikke er hydrogen og har to lukkede ringer med 5 eller 6 atomer, samt estere, amider, salter og sykliske derivater derav, for anvendelse ved behandling av en bakterieinfeksjon eller tumor i en pasient.

De genetisk kodede standardaminosyrer kan grupperes i henhold til deres karakteristika, særlig polaritet og ladning. Passende grupperinger er glysin og alanin, serin, treonin, asparagin, glutamin og cystein, lysin, arginin og histidin, asparaginsyre og glutaminsyre, og valin, leucin, isoleucin, metionin, fenylalanin, tryptofan og tyrosin. Av de 20 standard (genetiske) aminosyrene er valin, leucin, isoleucin, metionin, tyrosin, tryptofan og fenylalanin ment å være dekket av uttrykket "voluminøs og/eller lipofil" aminosyre, idet isoleucin, tryptofan og fenylalanin er foretrukket. I denne beskrivelsen er den mye brukte og forståtte trebokstavs- og enbokstavskode for de 20 standardaminosyrene blitt brukt. Erstatning av en aminosyre fra én gruppe med en annen aminosyre i den samme gruppe henvises passende til som en "konservativ substitusjon". Slike substitusjoner påvirker ikke generelt materielt egenskapene til peptidene ifølge oppfinnelsen, og når et peptid atskiller seg fra et annet bare ved slike substitusjoner, dersom ett peptid er et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse, så vil vanligvis det andre peptidet også være et peptid ifølge oppfinnelsen.

Peptider som omfatter en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre, vil fortrinnsvis utvise en forøkt cytotoksisk effekt mot bakterie- eller tumorceller, mens toksisiteten til peptidene, f.eks. den hemolytiske aktivitet, reduseres eller bare økes moderat sammenlignet med det naturlig forekommende eller originale peptid.

Det er overraskende blitt funnet at aminosyrer eller deres derivater med en viss størrelse kan brukes til å tilveiebringe modifiserte peptider som er særlig egnet for anvendelse som cytotoksiske peptider. Ifølge oppfinnelsen er det således med "ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre" ment hvilken som helst aminosyre eller hvilket som helst aminosyrederivat som kan være naturlig forekommende, men ikke én av de 20 standard genetisk kodede aminosyrer, hvis R-gruppe (a-sidekjede) fortrinnsvis er uladet og har minst 9 ikke-hydrogenatomer. Særlig foretrukne ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer vil ha minst 12, fortrinnsvis minst 18 ikke-hydrogenatomer i R-gruppen. Uttrykket "ikke-hydrogen" brukes til å angi at hydrogenatomene ikke er inkludert når man teller antallet atomer som er til stede i en gruppe eller et molekyl.

Fortrinnsvis vil R-gruppen i den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre ha minst 9 ikke-hydrogenatomer, f.eks. karbonatomer, og ha minst 2 lukkede ringer med 5 eller 6 atomer, og passende er disse to ringene kondensert eller danner bro. Ringene er dannet av karbonatomer, eventuelt også inkludert nitrogen-, oksygen- eller svovelatomer. Særlig foretrukne aminosyrer omfatter en substituert eller usubstituert indol. Gruppen bør fortrinnsvis være tredimensjonal. Foretrukne ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer omfatter adamantylalanin, 3-benzotienylalanin, 4,4'-bifenylalanin, 3,3-difenylalanin, 2,6-diklorbenzyl-tyrosin, sykloheksyltyrosin, 7-benzyloksytryptofan, tri-tert.-butyltryptofan, homotryptofan, 3-(-antracenyl)-L-alanin, L-tyroksin og 3,3',5-trijod-L-tyronin.

Et lipofilt molekyl er ett som inngår forbindelse med sin egen type i en vandig oppløsning, ikke nødvendigvis fordi interaksjonene mellom de lipofile molekylene er sterkere enn mellom det lipofile molekylet og vann, men fordi interaksjonene mellom et lipofilt molekyl og vann ville ødelegge de mye sterkere interaksjonene mellom vannmolekylene selv. Det er derfor foretrukket at R-gruppen i den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre ikke bør inneholde mange polare funksjonelle grupper, f.eks. ikke mer enn 4, fortrinnsvis 2 eller færre. Slike grupper vil øke bindingsinteraksjonen mellom de vandige omgivelser og følgelig senke lipofilisiteten til molekylet. Svært lipofile grupper er således foretrukket. For eksempel vil en fenylgruppe som en komponent i en voluminøs og lipofil gruppe være foretrukket fremfor en pyridylgruppe, selv om de har det samme antall ikke-hydrogenatomer og er av en lignende total størrelse.

Egnede voluminøse og lipofile aminosyrerester vil derfor omfatte naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende aminosyrer som har en R-gruppe som tidligere definert, f.eks. adamantylalanin eller hvilken som helst aminosyre, inkludert genetisk kodede aminosyrer, hvis R-grupper er blitt modifisert til å gi en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre som definert tidligere.

Ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer i denne andre kategorien omfatter modifiserte tryptofan- og fenylalaninrester, særlig tryptofanrester som er blitt substituert i 1-, 2-, 5- og/eller 7-stillingen i indolringen, idet 1- eller 2-stillingene er foretrukket. Mange forskjellige andre aminosyrederivater med en voluminøs og lipofil karakter er kjent for fagfolk innen teknikken og er ment å være omfattet innenfor uttrykket "ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre".

Egnede aminosyrer omfatter tyroksin og de følgende kommersielt tilgjengelige aminosyrene og deres derivater: L-3-benzotienylalanin, CAS = 72120-71-9 (Synthetech), D-3-benzotienylalanin, CAS = 111139-55-0 (Synthetech), L-4,4'-bifenylalanin (Synthetech), D-4,4'-bifenylalanin (Synthetech), L-3,3-difenylalanin (Synthetech), D-3,3-difenylalanin (Synthetech), L-homofenylalanin, CAS = 943-73-7 (Synthetech), D-homofenylalanin, CAS = 82795-51-5 (Synthetech), L-2-indanylglysin (Synthetech), D-2-indanylglysin (Synthetech), L-l-naftylalanin, CAS = 55516-54-6 (Synthetech), D-l-naftylalanin, CAS = 78306-92-0 (Synthetech), L-2-naftylalanin, CAS = 58438-03-2 (Synthetech), D-2-naftylalanin, CAS = 76985-09-6 (Synthetech), 2,6-diklorbenzyl-tyrosin, CAS = 40298-71-3 (Senn Chemicals), benzyltyrosin Fmoc (Senn Chemicals), sykloheksyltyrosin Fmoc (Senn Chemicals), N-acetylhomotryptofan (Toronto Research), 7-benzyloksytryptofan (Toronto Research), homotryptofan (Toronto Research), 3-(-antracenyl)-L-alanin-Boc (eller -Fmoc) (Peninsula Laboratories), 3-(2-kinoyl)-L-alanin-Boc (eller -Fmoc) (Peninsula Laboratories), 3-(2-kinoyl)-D-alanin-Boc (eller -Fmoc) (Peninsula Laboratories), 2-indanyl-L-glysin-Boc (Peninsula Laboratories), 2-indanyl-D-glysin-Boc (Peninsula Laboratories), L-p(Trt-tiometyl)fenylalanin-Fmoc (RSP), L-p-benzoylfenylalanin (Advanced ChemTech), D-p-benzoylfenylalanin (Advanced ChemTech), L-p-l-naftylalanin (Advanced ChemTech), D-p-l-naftylalanin (Advanced ChemTech), L-tyroksin-Na, CAS = 6106-07-6 (Novabiochem), 3,3',5-trijod-L-tyronin-Na, CAS = 55-06-1 (Novabiochem).

Overraskende er det blitt funnet at standard kjemiske beskyttelsesgrupper kan, når de bindes til en R-gruppe og således øker massen og lipofilisiteten til resten, øke den biologiske aktivitet til peptider. Slike beskyttelsesgrupper er velkjente innenfor fagområdet. Egnede beskyttelsesgrupper som signifikant kan øke antibakteriell aktivitet, omfatter Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl), Mtr (4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl) og Pbf (2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofuransulfonyl) som passende kan øke massen og lipofilisiteten til de aromatiske aminosyrene, f.eks. Phe, Trp og Tyr. Tert.-butylgruppen er dessuten en vanlig beskyttelsesgruppe for en lang rekke aminosyrer og er i stand til å gi ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer som beskrevet her, særlig når den modifiserer aromatiske rester. Z- gruppen (karboksybenzyl) er en ytterligere beskyttelsesgruppe som kan anvendes til å øke massen og lipofilisiteten til en aminosyre for å tilveiebringe et peptid i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Selv om den initielle observasjon av økt biologisk aktivitet var som et resultat av en tilfeldig heldig overføring av beskyttelsesgruppen Pmc innenfor peptidet fra guanidino-gruppen i arginin til tryptofan, kan slike aminosyrer som Trp, som bærer beskyttelsesgruppen, syntetiseres direkte og inkorporeres i peptidet.

Denne observasjonen av overføringen av Pmc fra Arg til Trp er blitt iakttatt av

Stierandova et al. i Int. J. of Peptide Science (1994) 43, 31-38. Peptider i overensstemmelse med oppfinnelsen kan lages ved å benytte denne overføringen av beskyttelsesgruppen fra Arg til Trp. Når disse to aminosyrene atskilles av 1-3 aminosyrer, er overføringen av Pmc mest virkningsfull. Peptider ifølge oppfinnelsen kan således passende omfatte en aminosyre som bærer en beskyttelsesgruppe, f.eks. Trp med Pmc bundet i 2-stillingen i indolringen. Pmc-gruppen kan bindes til en Trp som er blitt addert, eller til en Trp-rest som er til stede i det opprinnelige peptid. Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen vil peptider inkorporere én eller flere ytterligere tryptofanrester som så kan modifiseres til ytterligere å øke dens masse og lipofile karakter, og således gi et peptid ifølge oppfinnelsen.

I foreliggende oppfinnelses sammenheng henviser "sykliske derivater" til peptider som er sykliske som et resultat av én eller flere disulfidbroer. For noen peptider som omfatter to eller flere cysteinrester, vil dette være den naturlig forekommende form, og fremstilling av et lineært peptid vil kreve modifikasjon av cysteinrestene.

Den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre kan være til stede i tillegg til aminosyrene i den opprinnelige sekvens, som i seg selv kan være et naturlig forekommende peptid eller fragment derav, eller inkorporere andre modifikasjoner i et naturlig forekommende peptid eller fragment, eller være fullstendig syntetisk. Alternativt og fortrinnsvis kan den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre være i stedet for en av aminosyrene i den opprinnelige sekvens. Når aminosyren er "addert", er alle opprinnelige aminosyrer i peptidet fortsatt til stede. Når den ekstra aminosyre er "substituert", erstatter den en av de opprinnelige aminosyrene selv om en erstatning kan omfatte modifikasjon av den eksisterende rest slik at man får en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre som tidligere definert.

Den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre er fortrinnsvis til stede i stedet for en annen, naturlig forekommende, ikke-essensiell aminosyre. Med "ikke-essensiell" er det ment en aminosyre hvis tilstedeværelse ikke er påkrevet for peptidet som et hele for å oppvise cytotoksisk aktivitet. Vanligvis vil peptidet før inkorporering av en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre utvise en viss cytotoksisk aktivitet, idet denne aktiviteten økes ved inkorporeringen av en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre.

Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen vil den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre være til stede ved siden av eller fortrinnsvis i stedet for en genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre som er til stede i det opprinnelige peptid. Med andre ord gjøres en allerede voluminøs og lipofil aminosyre mer voluminøs og lipofil. Dette kan oppnås ved modifikasjon av R-gruppen i den opprinnelige aminosyre eller ved å erstatte den aminosyren med en ikke-genetisk aminosyre. De genetisk kodede aminosyrer som kan anses som voluminøse og/eller lipofile, er definert tidligere. Ved en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse vil således peptidene omfatte en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre i form av f.eks. en modifisert tryptofanrest (f.eks. Trp-Pmc), eller f.eks. tributyl-tryptofanrest f.eks. i stedet for tryptofan eller fenylalanin.

Peptidene ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis omfatte mellom 1 og 5, f.eks. 2 eller 3 ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer som definert her.

For ethvert bestemt cytotoksisk peptid kan egnede stillinger for inkorporering av ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer for å øke cytotoksisiteten identifiseres på en rekke måter. Som omtalt ovenfor, kan "inkorporering" omfatte modifikasjon av en eksisterende rest. En alaninskanning (som omfatter sekvensvis substitusjon av aminosyrene med alanin) kan anvendes til å identifisere ikke-essensielle aminosyrer som kan byttes ut med en voluminøs og lipofil aminosyre eller modifiseres til å øke sin masse og lipofilisitet. Alternativt kan et kandidat-peptid som danner en amfipatisk a-heliks, representeres som et "helisk hjul" av rester og de kationiske restene identifiseres. Disse kationiske restene vil danne positivt ladede domener eller regioner innenfor den tredimensjonale heliske peptidstruktur, og egnede stillinger for inkorporering av eller modifikasjon for å tilveiebringe ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer er generelt ved siden av eller mellom slike kationiske domener når man betrakter dem langs aksen til det heliske hjul.

Det er til og med blitt funnet at peptider med forøkt antibakteriell og/eller antitumoral aktivitet og fortrinnsvis redusert toksisitet kan fremstilles ved å flytte en voluminøs og lipofil aminosyre fra dens stilling i den opprinnelige/naturlig forekommende sekvens til en region ved siden av den kationiske sektor, og således forblir den totale aminosyresammen-setningen til peptidet uendret. Slike 7- til 25-mer-peptider som har 3 eller flere kationiske rester, og som er i stand til å danne en amfipatisk a-heliks, og som har en ekstra voluminøs og lipofil aminosyre ved siden av den kationiske sektor, hvor den ekstra voluminøse og lipofile aminosyre er tatt fra en annen, ikke-foretrukket stilling i sekvensen, omtales. I stedet for den voluminøse og lipofile aminosyre kan resten fra nabolaget til den kationiske sektor plasseres, som den volum-inøse og lipofile aminosyre erstatter, eller hvilken som helst annen mindre voluminøs og lipofil aminosyre. Egnede voluminøse og lipofile aminosyrer i ikke-foretrukne stillinger som kan flyttes inn i regionen ved siden av den kationiske sektor (foretrukket stilling), kan identifiseres f.eks. ved hjelp av en alaninskanning som identifiserer ikke-essensielle aminosyrer, eller ved å undersøke et arrangement av helisk hjul, idet ikke-foretrukne stillinger vanligvis er på motsatt side i forhold til et kationisk domene.

Det er også blitt funnet at peptider med redusert toksisitet, men som fortsatt har rimelig antibakteriell eller antitumoral aktivitet (dvs. har forøkt selektivitet), kan fremstilles ved å erstatte en ikke-essensiell, svært voluminøs og lipofil aminosyre, slik som tryptofan eller fenylalanin, med en mindre voluminøs og lipofil aminosyre, f.eks. isoleucin eller leucin, eller til og med alanin eller lysin. Generelt vil en "ikke-essensiell", voluminøs og lipofil aminosyre være plassert på motsatt side av heliksen fra den kationiske sektor, og slike ikke-essensielle, voluminøse og lipofile aminosyrer kan identifiseres ved å anvende et diagram over et helisk hjul, eller ved hjelp av en alaninskanning. Disse peptidene bør uansett bibeholde minst 3 voluminøse og lipofile aminosyrer som definert her. Modifiserte, cytotoksiske peptider med 7-25 aminosyrer, minst 3 kationiske rester og minst 3 voluminøse og lipofile aminosyrer, og som er i stand til å danne en amfipatisk a-heliks, hvor én ikke-essensiell tryptofan- eller fenylalaninrest i den opprinnelige/naturlig forekommende sekvens er erstattet med en mindre voluminøs og lipofil rest, f.eks. isoleucin eller alanin, omtales. Indolicin er et naturlig forekommende tryptofanrikt peptid som kan passende modifiseres på denne måte for å redusere dets toksisitet.

Andre egnede seter for inkorporering av en voluminøs og lipofil aminosyre er stillinger ved eller nær, fortrinnsvis ved siden av, en eksisterende lipofil aminosyre. Nærhet be-dømmes på grunnlag av sekundærstrukturen og ikke primærstrukturen til peptidet. Teknikker som er involvert i utførelse av en alaninskanning og i konstruksjon av de heliske hjuldia-grammer, er velkjente innenfor fagområdet.

I tilfellet med LFB (17-31) (et 15-aminosyrers fragment av LFB som mangler de ti C-terminale restene) var ikke-essensielle aminosyrer bestemt ved å anvende en alaninskanning Cys(3), Gln(7) og Gly(14), hvor nummereringen er absolutt i forhold til selve peptidet. Analoger av LFB (17-31) hvor disse aminosyrene er erstattet med ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer, kan være særlig effektive. For modifikasjoner i magaininpeptider, slik som magainin 2, kan inkorporering av ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer i stillingene Phe(61) og Glu(19) være særlig effektive.

I tillegg til tilstedeværelsen av én eller flere ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer kan peptidene ifølge oppfinnelsen med fordel omfatte ytterligere modifikasjoner. Særlig kan økning av den totale positive ladning til peptidet, for eksempel med å erstatte én eller flere naturlig forekommende aminosyrer, særlig ikke-essensielle aminosyrer, med én eller flere positivt ladede rester slik som lysin eller arginin, ytterligere øke aktiviteten til peptidet. "Positivt ladet" henviser til sidekjeden (R-gruppen) til aminosyreresten som har en netto positiv ladning ved pH 7,0.1 tilfellet med peptider for anvendelse som antitumormidler, hvor peptidet med fordel kan være i stand til å danne a-heliks, kan substitusjoner innenfor peptidsekvensen som tjener til å minske vinkelen som er motstående til den kationiske sektor, dvs. vinkelen til den positivt ladede overflate av heliksen, ytterligere øke aktivitet. Faktisk kan minsking av den motstående vinkel ha større innvirkning på aktivitet enn den netto positive ladning som sådan. Andre rester kan med fordel erstattes av alanin. Ytterligere "genetiske", voluminøse og/eller lipofile aminosyrer som definert her, f.eks. Trp eller Phe, kan også med fordel inkorporeres.

Egnede peptider som kan modifiseres til å gi peptider i overensstemmelse med oppfinnelsen, omfatter alle peptider, slik som magaininene, PGLa-analogene, cecropinene, defensinene, melittin og laktoferrin, og klasse (L) lytiske peptider generelt etc. som er kjent i sin umodifiserte form for å utvise cytotoksisk, særlig antimikrobiell aktivitet. Ytterligere egnede peptider omfatter de som ikke er naturlig forekommende, men som har blitt syntetisert og utviser cytotoksisk aktivitet, slike peptider omfatter modelinene. I denne sammenheng omfatter "umodifisert" fragmenter erholdt ved fordøyelse av naturlig forekommende proteiner eller peptider. Nye antibakterielle proteiner og peptider oppdages stadig, og det antas at teknikkene ifølge foreliggende oppfinnelse har generell anvendbarhet og kan anvendes på en enkel måte, og med en rimelig sjanse for suksess på peptider som fortsatt er uidentifiserte, men som senere karakteriseres som cytotoksiske, særlig som antimikrobielle.

Særlig foretrukne peptider ifølge foreliggende oppfinnelse er de som er basert på fragmenter av laktoferrin, særlig de som er basert på bovint laktoferrin (LFB) eller fragmenter (f.eks. LFB 17-31) derav, eller ekvivalentfragmentet av laktoferrin fra andre dyr.

En særlig fordel ved peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er deres lille størrelse, idet peptider med 15 eller færre aminosyrer er foretrukket, passende med 9 eller 10 aminosyrer eller færre. Ett slikt effektivt lite peptid er LFB (17-27) hvor Lys28, Leu29, Gly30 og Ala31 fra den C-terminale ende av LFB (17-31) er blitt utelatt. Peptidene kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst kjent fremgangsmåte, passende ved hjelp av enzymatisk fordøyelse eller kjemisk spalting av naturlig forekommende peptider, og etterfølgende modifikasjon, eller ved direkte syntese fra aminosyren som bygger blokker. Dess kortere det ønskede peptid er, dess bedre for fremstillingen, særlig for direkte syntese som er den foretrukne fremstillingsfremgangs-måte, ettersom dette begrenser problemene forbundet med kiralitet hos aminosyrene. I tillegg er korte peptider gode for biologisk avlevering. Det er et økende behov for antibiotika som kan administreres uten behov for en injeksjon, slik som ved inhalasjon og absorpsjon over hårrørs-blodårene i nesepassasjen. Et 10-mert peptid kan lett administreres på denne måte, men peptider som er mer enn 25 aminosyrer lange, kan ikke avleveres ved inhalasjon.

Det ville også være ønskelig å øke halveringstiden til peptidet i blodomløpet, og dette vil kunne oppnås ved ytterligere å modifisere peptidene ifølge oppfinnelsen til å omfatte kunstige aminosyrer ettersom de er resistente overfor enzymatisk nedbrytning. Lange peptider er ømfintlige for nedbrytning ved hjelp av endopeptidaser som spalter internt i peptidet, kortere peptider ville være mindre sårbare for spalting ved hjelp av endopeptidaser, og nedbrytning ved hjelp av eksopeptidaser som angriper endene av et peptid, ville kunne reduseres ved å acetylere N-enden og ellers blokkere C-enden.

Det er også blitt observert at inkorporeringen av enantio-aminosyrer signifikant kan øke den biologiske aktivitet til peptidene, og slike peptider utgjør en ytterligere foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. Utmerket antimikrobiell aktivitet er blitt påvist for enantio-peptider som er det nøyaktige speilbilde av det naturlig forekommende peptid, og retro-enantio-peptider som inntar den samme a-heliske konfirmasjon som det naturlig forekommende peptid, bortsett fra amidbindingene, peker i motsatte retninger. Ifølge oppfinnelsen vil slike peptider også omfatte en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre som tidligere definert.

Enantio-aminosyrer er også resistente overfor enzymatisk nedbrytning, og den resulterende økning i halveringstiden til peptidene kan i en viss utstrekning forklare den forøkte antibakterielle aktivitet. Enantio-aminosyrer er kostbare, og dette er en ytterligere grunn til at de forholdsvis korte peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig fordelaktige.

Ytterligere foretrukne peptider ifølge oppfinnelsen omfatter derfor en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre som tidligere definert, og omfatter også én eller flere D-aminosyrer, f.eks. 1/3 eller halvparten eller 2/3 av aminosyrene er i D-formen, og disse kan være ordnet på hvilken som helst måte i sekvensen, f.eks. alternerende med L-aminosyrer.

Med uttrykket "i stand til" å danne en amfipatisk a-heliks er det ment at peptidet under visse omstendigheter kan danne en a-heliks. Peptider behøver ikke nødvendigvis å ha a-heliksen som sin naturlige konfigurasjon i vandige medier, men er i stand til, f.eks. i nærvær av en heliks som gir slike stoffer som natriumdodecylsulfat (SDS), 2,2,2-trifluoretanol (TFE), 1,1,1,3,3,3-heksafluorisopropanol (HFIP) eller andre miceller enn SDS, og cellemembraner (kunstige og naturlige), hvorved det dannes en a-heliks- eller i det vesentlige a-helisk struktur. Sirkulærdikroisme kan passende brukes til å teste med hensyn på tilstedeværelsen av en a-heliks.

Av større viktighet enn dannelsen av en a-heliks er det faktum at peptidene er amfipatiske, dvs. at 2°-strukturen til peptidet er amfipatisk uansett om det er a-helisk eller ikke. Dette bevises av den gode aktiviteten til enantio-peptider som ikke danner en a-heliks i noe som helst miljø, og peptider som inkorporerer én eller flere D-aminosyrer.

Ikke-peptidforbindelser som oppviser den samme cytotoksiske aktivitet som deres proteinmotparter omtales. Slike peptidomimetika eller "småmolekyler" som er i stand til å etterligne aktiviteten til et protein eller peptid, er sannsynligvis bedre egnet for f.eks. oral avlevering på grunn av deres økte kjemiske stabilitet. Slike forbindelser vil omfatte en del som tilsvarer den "ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre" som tidligere definert. Nærmere bestemt vil de omfatte en gruppe som tilsvarer R-gruppen i den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre, dvs. den har minst 7, fortrinnsvis minst 9, ikke-hydrogenatomer i ekvivalenten til R-gruppen, hvor denne gruppen er uladet og fortrinnsvis omfatter fem polare grupper.

Det er nå vanlig innenfor fagområdet å erstatte peptid- eller proteinbaserte, aktive midler, f.eks. terapeutiske peptider, med slike peptidomimetika som har funksjonelt ekvivalent aktivitet. Forskjellige molekylbiblioteker og kombinatoriske kjemiteknikker foreligger og er tilgjengelige for å lette identifikasjonen, utvelgelsen og/eller syntesen av slike forbindelser under anvendelse av standardteknikker (Kieber-Emons, T. et al., Current Opinion in Biotechnology 1997 5:435-441). Slike standardteknikker kan anvendes til å oppnå de peptidomimetiske forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, nemlig peptidomimetiske, organiske forbindelser som oppviser i det vesentlige lik eller den samme cytotoksiske aktivitet som peptidene ifølge oppfinnelsen, f.eks. som beskrevet her i eksemplene.

Beskrivelsen omtaler også biomimetiske, organiske forbindelser basert på peptidene ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at forbindelsene utviser cytotoksisk, f.eks. antibakteriell eller antitumoral aktivitet, minst på det nivået som utvises av peptidene ifølge oppfinnelsen.

Uttrykket "cytotoksisk" er ment å henvise ikke bare til en aktivitet mot prokaryote celler, men også mot eukaryote celler. Selv om det under visse omstendigheter er ønskelig å ha et peptid som har en god antibakteriell aktivitet, men som ikke lyserer eller på annen måte ødelegger cellene til pasienten, er peptider innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse blitt påvist å ha en antitumoral aktivitet. Den antitumorale aktivitet til disse peptidene og medika-mentene som inneholder dem, utgjør ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse. Antitumoral aktivitet omfatter ødeleggelse eller reduksjon i størrelse eller antall av godartede eller ondartede tumorer, og forhindring eller reduksjon av metastase.

Generelt vil laktoferirnavledede peptider ifølge oppfinnelsen som ikke har noen

genetiske aminosyrer, og som har en god aktivitet mot tumorceller, ha 25-10, fortrinnsvis 12-20, f.eks. 18 aminosyrer. Peptider med en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil gruppe og som har god antitumoral aktivitet, vil generelt være kortere med 7-20, fortrinnsvis 10-20, mer foretrukket 10-15 aminosyrer. Som eksempel krever LFB 17-27 A7, M3, R2, 11W4,10, Y1-NH2PMC og LFB 18-24 RI,7 W2,3,6 -NH2PMC bare hhv. 50 og 38 ug/ml for å drepe 50 % av Meth A-celler

Generelt vil peptider med god aktivitet mot tumorer være lenger enn de som utviser god antibakteriell aktivitet. Antibakterielle peptider vil vanligvis ha 7-15, fortrinnsvis 7-14, f.eks. 8 eller 9 aminosyrer.

Den antitumorale aktivitet av de modifiserte peptidene er mye bedre enn det som

kunne forutsies kun ut fra det faktum at peptidene synes å ha en lytisk effekt på bakterielle celler. Den observerte lytiske effekt på tumorceller in vitro er sterk, og tumorregresjon hos mus er svært hurtig, idet den inntrer innen 3-6 dager. Det synes som om det er induksjon av en immunologisk hukommelse ettersom inokulasjon av tumorceller hos mus etter behandling og regresjon av den opprinnelige tumor ikke gir opphav til noen sekundær tumorvekst.

Det er viktig at vi har demonstrert regresjon av etablerte tumorer, selv med umodifisert LFB. I denne sammenheng henviser "umodifisert" også til fragmenter av LFB som utviser denne antitumorale aktivitet, f.eks. LFB (17-31). Peptidet kan være syklisk eller lineært, fortrinnsvis syklisk. Evnen til å behandle faste tumorer er særlig nyttig når en tumor ikke lar seg skjære bort. En ytterligere fordel er at den observerte cytolytiske effekt i tumorer ikke er arts-spesifikk, og således har peptidene utnyttbarhet ved behandling av humantumorer.

Egnede doser for behandling av tumorer med bioaktive peptider vil være kjent for fagfolk innen teknikken, og doser som brukes i dyreforsøkene som er beskrevet her, kan anvendes til å beregne en passende dose for andre dyre- og menneskepasienter. Administrering av et peptid kan være daglig, mer vanlig på alternerende dager eller på hver tredje eller fjerde dag. 1-10, vanligvis 2-5 administreringer kan resultere i vellykket behandling. Lignende behandlingsprotokoller vil bli brukt for behandling av bakterie- eller virusinfeksjoner.

Peptider ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis være minst like cytotoksiske som LFB (17-31). Noen peptider ifølge oppfinnelsen vil være mer aktive i noen henseender (f.eks. antitumorale) enn LFB (17-31), men mindre aktive i andre henseender, f.eks. mot E. coli. Noen peptider kan være mindre aktive, men andre egenskaper, f.eks. en lav hemolytisk aktivitet, vil gjøre dem nyttige i visse applikasjoner.

Den antibakterielle aktivitet til peptidene ifølge oppfinnelsen kan manifestere seg på en rekke forskjellige måter. Visse modifikasjoner kan resultere i peptider som er bakterio-statiske, og andre i peptider som er bakteriocidale. På fordelaktig måte er hovedparten av peptidene ifølge oppfinnelsen bakteriocidale. Oppfinnelsen tilveiebringer således også blant annet en fremgangsmåte for inhibering av veksten av bakterier, som omfatter å bringe bakteriene i kontakt med en inhiberende effektiv mengde av et cytotoksisk peptid ifølge oppfinnelsen.

Uttrykket "å bringe i kontakt" henviser til eksponering av bakteriene for et peptid, slik at det effektivt kan inhibere, drepe eller lysere bakterier, binde endotoksin (LPS) eller permeabilisere gramnegative bakterieyttermembraner. Kontaktbringelse kan være in vitro, f.eks. ved å tilsette peptidet til en bakteriekultur for å teste med hensyn på mottakelighet hos bakteriene for peptidet. Kontaktbringelse kan være in vivo, f.eks. ved å administrere peptidet til et individ med en bakteriell forstyrrelse, slik som septisk sjokk. "Inhiberende" eller "inhiberende effektiv mengde" henviser til den mengden av peptid som er påkrevet for å forårsake en bakteriostatisk eller bakteriocidal effekt. Eksempler på bakterier som kan inhiberes, omfatter E. coli, P. aeruginosa, E. cloacae, S. typhimurium og S. aureus. Fremgangsmåten for inhibering av veksten til bakterier kan videre omfatte tilsetningen av antibiotika for kombinasjons- eller synergisme-terapi. Det passende antibiotikum som administreres, vil vanligvis avhenge av mottakeligheten til bakteriene, slik som hvorvidt bakteriene er gramnegative eller grampositive, og vil lett la seg fastslå av fagfolk innen teknikken.

I tillegg kan forskjellige modifikasjoner øke den antibakterielle aktivitet mot visse typer av bakterier mer enn mot andre typer. For eksempel er S. aureus særlig mottakelig for svært store, voluminøse og lipofile grupper, vanligvis de som har minst 12 eller 18 ikke-hydrogenatomer i R-gruppen, f.eks. de peptidene som inkorporerer en Pmc-modifisert tryptofanrest. I tillegg har R-grupper som er i det vesentlige plane, god aktivitet mot E. coli, mens en mer tredimensjonal gruppe med sammenlignbar lipofilisitet er foretrukket for å gi god aktivitet mot S. aureus.

Selv om teknikken for å øke aktivitet ved å innføre en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre, som omtalt ovenfor, er av generell anvendbarhet for en lang rekke cytotoksiske peptider, særlig for klasse L (lytiske) peptider, er pattedyravledede peptider, særlig peptider avledet fra laktoferrin, spesielt laktoferricin, av særlig interesse. Det er blitt funnet at sekvensen til bovint laktoferricin (LFB 17-41) kan reduseres med opp til ca. 10 rester i den C-terminale ende, f.eks. til LFB (17-31), uten signifikant tap av antibakteriell aktivitet. LFB 17-31 = FKCRRWQWRMKKLGA. Så vel som bovine laktoferriciner, har vi identifisert de regionene som tilsvarer LFB 17-31 hos mennesker, LFH = TKCFQWQRNMRKVRG, geit, LFC = SKCYQWQRRMRKLGA, mus, LFM = EKCLRWQNEMRKVGG og griser, LFP = SKCRQWQSKIRRTNP, og slike regioner er også egnet for manipulasjon ifølge oppfinnelsen.

En variant av effektene av en økning i lipofilisitet hos visse peptider omtalt ovenfor, er blitt observert, og et cytotoksisk peptid med 15 aminosyrer eller mindre som er kjennetegnet ved at det har en ytterligere voluminøs/lipofil gruppe i én ende omtales. Den voluminøse/lipofile gruppen omfatter slike organiske grupper som beskyttelsesgrupper, spesielt Fmoc, Boe eller andre standard N-terminale beskyttelsesgrupper, eller forgrenede, lineære eller sykliske alkylgrupper med formel CH3(CH2)n, hvor n er mellom 5 og 20, fortrinnsvis mellom 8 og 14, og mest foretrukket 10-12, eller forgrenede, rettkjedede eller sykliske acylgrupper med mellom 6 og 21, fortrinnsvis 9 og 15, og mest foretrukket 11-13 karbonatomer. For eksempel hadde et LFB (17-31)-peptid med en CH3(CH2)n-alkylgruppe i den N-terminale ende en opp til 10 ganger økning i antibakteriell aktivitet. Gruppene er bundet til N- eller C-enden eller nært, fortrinnsvis nabostilt til N- eller C-enderestene. Disse gruppene kan være bundet til naturlig forekommende aminosyrerester, eller ikke-native aminosyrer som bærer den voluminøse/lipofile gruppe, kan være inkorporert i peptidet. Den passende definisjon for "cytotoksisk peptid" er som omtalt ovenfor.

Peptider kan således, i tillegg til inkorporering av ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre som tidligere definert, derfor være modifisert i N- og/eller C-enden.

Nærmere bestemt er det blitt funnet at peptider med antibakteriell og/eller antitumoral aktivitet, men en lav toksisitet, kan lages ved å inkorporere N-terminale modifikasjoner som omfatter en syklisk gruppe, fortrinnsvis en 5- eller 6-ring som kan være alkyl eller aryl. Mer foretrukket omfatter gruppen som omfatter den N-terminale modifikasjon, to eller flere kondenserte ringer hvorav én eller flere kan være en 5-ring, f.eks. adamantyl eller Fmoc. Det er overraskende blitt funnet at grupper som er tredimensjonale av natur, slik som de som omfatter et kondensert ringsystem som ikke ligger i enkeltplanet, har særlig fordelaktige egenskaper.

Egnede molekyler som vil kunne anvendes til å modifisere N-enden, omfatter: cis-bisyklo[3.3.0]oktan-2-karboksylsyre, [18209-43-3] (Aldrich); abietinsyre, [514-10-3]

(Aldrich); ursolsyre, [77-52-1] (Aldrich); (l,2-metanofulleren-C6o)-61-karboksylsyre, [155116-19-1] (Fluka); dimetylkuban-l,4-dikarboksylat, [29412-62-2] (Fluka); 2-norbornaneddiksyre, [1007-01-8] (Aldrich); 4-pentylbisyklo[2.2.2]oktan-l-karboksylsyre, [73152-70-2] (Aldrich); 3-noradamantankarboksylsyre, [16200-53-6] (Aldrich); 9-fluoreneddiksyre, [6284-80-6] (Aldrich); cis-dekahydro-l-naftol, [36159-47-4] (Aldrich); 9-etylbisyklo[3.3.1]nonan-9-ol, [21915-33-3]

(Aldrich); 3-kinuklidinol, [1619-34-7] (Aldrich); [[(lS)-endo]-(-)-borneol, [464-45-9] (Aldrich); (lR,2R,3R,5S)-(-)-isopinokamfeol, [25465-65-0] (Aldrich); dehydroabietylamin [1446-61-3]

(Aldrich); (±)-3-aminokinuklidin [6530-09-2] (Aldrich); (R)-(+)-bornylamin, [32511-34-5]

(Aldrich); l,3,3-trimetyl-6-azabisyklo[3.2.1]oktan [53460-46-1] (Aldrich); 1-adamantylamin, [768-94-5] (Aldrich); 9-aminofluoren, [5978-75-6] (Aldrich); (lR)-(-)-10-kamfersulfonsyre, [35963-20-3] (Aldrich); 5-isokinolinsulfonsyre, [27655-40-9] (Aldrich); 2-kinolintiol, [2637-37-8] (Aldrich); 8-merkaptomenton, [38462-22-5] (Aldrich).

N-terminale modifikasjoner vil derfor vanligvis omfatte en voluminøs og lipofil gruppe R som kan være bundet direkte til det N-terminale amin slik at det dannes et mono-, di- og muligens kationisk, trialkylert, N-terminalt amin. Alternativt kan R-gruppen være bundet via en bindingsrest, f.eks. en karbonylgruppe (RCO), f.eks. adamantyl eller benzyl, karbamat (ROCO), f.eks. Fmoc, eller en linker som danner urea (RNHCO) eller (R2NCO), eller ved hjelp av en linker som danner et sulfonamid, boramid eller fosfonamid. Sulfonamiddannende linkere kan være særlig anvendbare når et mer stabilt peptid er påkrevet. Den voluminøse og lipofile gruppe R omfatter en fortrinnsvis mettet, syklisk gruppe, mer foretrukket en polysyklisk gruppe, hvor de sykliske gruppene er kondensert eller bundet sammen med en bro.

Peptider som omfatter slike N-terminale modifikasjoner, er særlig effektive som antitumorpeptider, og overraskende gir tilstedeværelsen av en syklisk, fortrinnsvis flersyklisk, N-terminal gruppe peptider med en evne til å drepe tumorceller, f.eks. Meth A-celler (fra et fibrosarkom), men har liten cytotoksisk aktivitet mot normale celler, f.eks. røde blodlegemer eller normale fibroblastceller. Denne selektiviteten er selvsagt svært ønskelig ved den in vivo behandling av etablerte tumorer. For eksempel drepte sykloheksyl-LFB 17-31 ved en konsentrasjon på 46 ug/ml 50 % av Meth A-celler (murin sarkomcellelinje), men drepte ikke 50 % av røde blodlegemer fra fibroblaster, selv ved en konsentrasjon på 1 000 ug/ml.

Særlig effektive C-terminale modifikasjoner er også blitt undersøkt. Amidering av C-enden for å manipulere totalladningen til et peptid er kjent, men det er nå blitt funnet at større C-terminale modifikasjoner, inkludert dannelsen av estere, inkludert tioestere eller substituerte, primære og sekundære amider, resulterer i peptider med forøkt cytotoksisk aktivitet. De C-terminale modifiserende grupper vil fordelaktig inneholde mer enn 4, fortrinnsvis 6, mer foretrukket 8 eller 10, eller flere ikke-hydrogenatomer og danner f.eks. en benzylester eller et benzylamid. Andre C-terminale grupper omfatter naftylamin, substituerte, aromatiske aminer, slik som fenyletylamin, mono-, di- eller triaminoalkylgrupper, etc, idet grupper som omfatter en syklisk gruppe er foretrukket. Standard C-endebeskyttelsesgrupper er også egnet som aktivitets-økende modifikasjoner. C-terminale modifikasjoner vil derfor vanligvis omfatte en voluminøs og lipofil gruppe R som kan være bundet direkte til den C-terminale karboksygruppe slik at det dannes et keton. Alternativt kan R-gruppen være bundet via en sammenbindende rest, f.eks. (OR) som danner en ester i C-enden, (NH-R) eller (NR2, hvor de to R-gruppene ikke behøver å være de samme) som danner henholdsvis primære og sekundære amidgrupper i C-enden, eller grupper (B-(OR)2) som danner borsyreestere eller fosforanaloger. Den voluminøse og lipofile gruppe R omfatter fortrinnsvis minst 4 ikke-hydrogenatomer.

Vanligvis kan C-terminale modifkasjoner representeres ved den følgende formel:

hvor X = et peptid som er 7-25 aminosyrer langt, og som omfatter tre kationiske rester;

R = OR1, SR1 ellerR<1>;og

R<1>= alkyl, sykloalkyl, aminoalkyl eller aryl

og som eventuelt er substituert med hydroksy-, alkoksy-, acyloksy-, alkoksykarbonyloksy-, amino-, okso- eller fluorgrupper, og som eventuelt er avbrutt av oksygen-, nitrogen-, svovel-eller fosforatomer.

De substituerte R<1->gruppene kan være mono- eller polysubstituerte. Uttrykket "acyl" omfatter, slik det her er brukt, både karboksylat- og karbonatgrupper.

Slik det her er brukt, omfatter uttrykket "alkyl" en lang- eller kortkjedet, rettkjedet eller forgrenet alifatisk, mettet eller umettet hydrokarbongruppe. R<1>kan inneholde opp til 40 ikke-hydrogenatomer, fortrinnsvis mellom 4 og 12, mer foretrukket 6-10 slike atomer.

Peptider kan omfatte alle tre typer av voluminøse og lipofile grupper, men vil fortrinnsvis omfatte to slike grupper.

Også omtalt er en fremgangsmåte for fremstilling av et peptid med forøkt cytotoksisk aktivitet og/eller forbedret selektivitet for målcelletyper, som omfatter inkorporering av en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre i et 7- til 15-mert peptid med tre eller flere kationiske rester, som er i stand til å danne en amfipatisk a-heliks.

Også omtalt er en fremgangsmåte for økning av cytotoksisiteten eller selektiviteten til et 7- til 15-mert peptid med tre eller flere katoniske rester ved inkorporering deri av en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre.

En definisjon av ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre er gitt tidligere. Som tidligere omtalt, kan "som inkorporerer" omfatte modifikasjon av en eksisterende rest eller innføring av en slik rest i peptidet ved addisjon eller substitusjon, fortrinnsvis substitusjon. En syntetisk fremgangsmåte kan anvendes, hvorved den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre inkluderes i rekkefølge i det voksende peptid, slik at det ikke er nødvendig med noen bearbeidelse etter peptiddannelsen.

Når vi her henviser til et peptid med "forøkt" cytotoksisk aktivitet, er det ment at peptidet som er blitt modifisert i overensstemmelse med oppfinnelsen, har forøkt cytotoksisitet mot én eller flere stammer av bakterier eller type av kreftceller sammenlignet med peptidet uten modifikasjonen. Med "forbedret selektivitet for målcelletyper" er det ment at forholdet mellom cytotoksisk aktivitet mot målceller sammenlignet med ikke-målcelletyper er økt. Med andre ord kan selektivitet forbedres dersom f.eks. den antibakterielle aktivitet til et peptid er den samme før og etter modifikasjon, men den hemolytiske aktivitet reduseres etter modifikasjon. Likeledes kan nyttige peptider ifølge oppfinnelsen lages selv når hemolytisk aktivitet øker, dersom den antibakterielle eller antitumorale aktivitet øker med en større mengde. Selektivitet kan også henvise til én type bakterier i forhold til en annen type.

Peptider, særlig de hvor den voluminøse og lipofile R-gruppe som definert her, er en modifisert sidekjede i en "genetisk" aminosyre, kan uttrykkes i prokaryote og eukaryote verter ved hjelp av ekspresjonssystemer som er velkjente for fagfolk innen teknikken. Metoder for isoleringen og rensingen av f.eks. mikrobielt uttrykte peptider, er også velkjente.

Dersom det velges en bakterievert for ekspresjon av et peptid, kan det være nødvendig å gjøre tiltak for å beskytte verten mot det uttrykte antibakterielle peptid. Slike teknikker er kjent innenfor fagområdet og omfatter bruken av en bakteriestamme som er resistent overfor det bestemte peptid som uttrykkes, eller ekspresjonen av et fusjonspeptid med avsnitt i én eller begge ender som gjør den antibiotiske aktivitet til peptidet ubrukbar; fusjonspeptidet kan så spaltes. I alle tilfeller kan aktiviteten til det uttrykte peptid være lav, bare forøkt til virkelige cytotoksiske nivåer ved hjelp av den ettersyntetiske modifikasjon for å tilveiebringe et peptid ifølge oppfinnelsen, f.eks. addisjon av Pmc.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres direkte på hvilken som helst passende måte. Generelt vil de reaktive gruppene som er til stede (f.eks. amino, tiol og/eller kar-boksyl) være beskyttet under totalsyntesen. Sluttrinnet i syntesen vil således være avbeskyttelsen av et beskyttet derivat ifølge oppfinnelsen. Som omtalt ovenfor, vil visse peptider ifølge oppfinnelsen være en "beskyttelsesgruppe" ettersom denne er ansvarlig for økt cytotoksisitet.

Ved oppbygning av peptidet kan man i prinsippet starte enten i C-enden eller N-enden, selv om den C-terminale utgangsfremgangsmåte er foretrukket. Den ikke-genetiske aminosyre kan inkorporeres på dette stadium ettersom sekvensen forlenges eller som et resultat av en post-syntetisk modifikasjon.

Fremgangsmåter for peptidsyntese er velkjent innenfor teknikken, men for foreliggende oppfinnelse kan det være særlig passende å utføre syntesen på en fastfasebærer, idet slike bærere er velkjente innenfor teknikken.

Et bredt utvalg av beskyttelsesgrupper for aminosyrer er kjent, og egnede amino-beskyttelsesgrupper kan omfatte karbobenzoksy (også betegnet Z), t-butoksykarbonyl (også betegnet Boe), 4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl (Mtr) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (også betegnet Fmoc). Det vil forstås at når peptidet er bygget opp fra den C-terminale ende, vil en aminbeskyttelsesgruppe være til stede på a-aminogruppen i hver nye rest som er addert, og vil behøve å måtte fjernes selektivt før det neste koblingstrinn.

Karboksylbeskyttelsesgrupper som f.eks. kan anvendes, omfatter lett spaltede estergrupper, slik som benzyl- (Bzl), p-nitrobenzyl- (ONb), pentaklorfenyl- (OPC1P), pentafluor-fenyl- (OPfp) eller t-butyl- (OtBu) grupper, samt koblingsgruppene på faste bærere, f.eks. metyl-grupper bundet til polystyren.

Tiolbeskyttelsesgrupper omfatter p-metoksybenzyl (Mob), trityl (Trt) og acet-amidometyl (Acm).

Et bredt spekter av fremgangsmåter foreligger for fjerning av amin- og karboksylbeskyttelsesgrupper. Disse må imidlertid være i overensstemmelse med den syntetiske strategi som anvendes. Sidekjedebeskyttelsesgruppene må være stabile overfor betingelsene som brukes for å fjerne den midlertidige a-aminobeskyttelsesgruppe før det neste koblingstrinn.

Aminbeskyttelsesgrupper, slik som Boe, og karboksylbeskyttelsesgrupper, slik som tBu, kan fjernes samtidig ved hjelp av syrebehandling, f.eks. med trifluoreddiksyre. Tiolbe skyttelsesgrupper, slik som Trt, kan fjernes selektivt ved å anvende et oksidasjonsmiddel, slik som jod.

Peptider ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av ufullstendig avbeskyttelse, hvorved det fås grupper som øker den cytotoksiske aktivitet til peptidene. Alternativt kan modifiserte R- og N- og C-terminale grupper fremstilles etter syntese av peptidet og ledsagende avbeskyttelse.

En særlig foretrukket fremgangsmåte omfatter syntese under anvendelse av aminosyrederivater med den følgende formel: Fmoc-aminosyre-OPfp.

Farmasøytiske preparater som inneholder peptidene ifølge oppfinnelsen som definert ovenfor, sammen med en fysiologisk akseptabel fortynner, bærer eller eksipiens er omtalt. Egnede fortynnere, eksipienser og bærere er kjent for fagfolk. Peptidene ifølge oppfinnelsen for anvendelse i fremgangsmåter for behandling, særlig ved behandling eller forhindring av bakterieinfeksjoner, eller som et antitumormiddel, både ved ødeleggelsen av eller reduksjon i størrelse eller antall av godartede eller ondartede tumorer som kan være ascites, og ved forhindring av metastase, omtales.

Preparatene for bruk ifølge oppfinnelsen kan presenteres f.eks. i en form som er egnet for oral, nasal, parenteral, intravenøs, intratumoral eller rektal administrering.

Slik det her er brukt, omfatter uttrykket "farmasøytisk" veterinærapplikasjoner av oppfinnelsen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan presenteres i de vanlige farmakologiske formene for administrering, slik som tabletter, belagte tabletter, nesesprayer, oppløsninger, emulsjoner, liposomer, pulvere, kapsler eller former med langvarig frigjørelse. Peptidene ifølge oppfinnelsen er særlig egnet for topisk administrering, f.eks. ved behandling av diabetiske magesår. Vanlige farmasøytiske eksipienser samt de vanlige fremstillingsfremgangsmåtene kan anvendes for fremstillingen av disse formene. Tabletter kan fremstilles f.eks. ved å blande den aktive bestanddel eller de aktive bestanddeler med kjente eksipienser, slik som f.eks. med fortynningsmidler, slik som kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller laktose, slike desintegrasjons - midler som maisstivelse eller alginsyre, slike bindemidler som stivelse eller gelatin, slike smøre-midler som magnesiumstearat eller talkum, og/eller midler for å oppnå langvarig frigjørelse, slik som karboksypolymetylen, karboksymetylcellulose, celluloseacetatftalat eller polyvinylacetat.

Tablettene kan, om ønsket, bestå av flere lag. Belagte tabletter kan fremstilles ved å belegge kjerner, oppnådd på en lignende måte som tablettene, med midler som vanligvis anvendes for tablettbelegning, f.eks. polyvinylpyrrolidon eller skjellakk, gummi arabicum, talkum, titandioksid eller sukker. For å oppnå langvarig frigjørelse eller for å unngå uforenlig-heter, kan kjernen også bestå av flere lag. Tablettbelegget kan også bestå av flere lag for å oppnå langvarig frigjørelse, i hvilket tilfelle eksipiensene som er nevnt ovenfor for tabletter, kan anvendes.

Organspesifikke bærersystemer kan også brukes.

Injeksjonsoppløsninger kan f.eks. fremstilles på den vanlige måte, slik som ved tilsetning av konserveringsmidler, slik som p-hydroksybenzoater, eller stabiliseringsmidler, slik som EDTA. Oppløsningene fylles så i injeksjonsglass eller -ampuller.

Nesesprayer som er en foretrukket fremgangsmåte for administrering, kan formuleres på lignende måte i vandig oppløsning og emballeres i spraybeholdere, enten med et aerosoldrivmiddel eller tilveiebrakt med midler for manuell komprimering. Kapsler som inneholder én eller flere aktive bestanddeler, kan fremstilles f.eks. ved å blande de aktive bestand-delene med inerte bærere, slik som laktose eller sorbitol, og fylle blandingen i gelatinkapsler.

Egnede suppositorier kan f.eks. fremstilles ved å blande den aktive bestanddel eller blandinger av aktive bestanddeler med de vanlige bærerne som er anvist for dette formål, slik som naturlige fettstoffer eller polyetylenglykol, eller derivater derav.

Doseringsenheter som inneholder forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen, inneholder fortrinnsvis 0,1-10 mg, f.eks. 1-5 mg av peptidene ifølge oppfinnelsen. De farma-søytiske preparatene kan i tillegg omfatte ytterligere aktive bestanddeler, inkludert andre cytotoksiske midler, slik som andre antimikrobielle peptider. Andre aktive bestanddeler kan omfatte forskjellige typer av antibiotika, cytokiner, f.eks. IFN-y, TNF, CSF og vekstfaktorer, immunomodulatorer, kjemoterapeutika, f.eks. cisplatin eller antistoffer.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer den terapeutiske anvendelse av peptidene ifølge oppfinnelsen som definert ovenfor, dvs. peptidene for anvendelse som medikamenter, f.eks. antibakterioner eller antitumormidler. Videre omtales en fremgangsmåte for behandling eller forhindring av bakterieinfeksjoner hos en pasient, som omfatter administrering til pasienten av ett eller flere av peptidene ifølge oppfinnelsen, og en fremgangsmåte for behandling av tumorer hos en pasient, som omfatter administrering av ett eller flere av peptidene ifølge oppfinnelsen. Behandlingen av tumorer omfatter ødeleggelse eller reduksjon i størrelse eller antall av godartede eller ondartede tumorer som kan være ascites, og forhindring av metastase.

Nok et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelsen av ett eller flere av peptidene ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av et medikament for behandling av bakterieinfeksjoner eller tumorer.

Antibakterielle midler, slik som peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, har et bredt spekter av applikasjoner bortsett fra som farmasøytika. De kan anvendes f.eks. som steriliseringsmidler for materialer som er mottakelige for mikrobiell forurensning. Peptidene ifølge oppfinnelsen utviser bred antimikrobiell og antibiotisk aktivitet og er således også egnet som antivirus- og antisoppmidler som vil ha farmasøytiske og landbruksmessige applikasjoner, og som promoterer for sårheling eller som spermicider.

Peptidene er, når de anvendes i topiske preparater, generelt til stede i en mengde som er minst 0,1 vekt%. I de fleste tilfellene er det nødvendig å anvende peptidet i en mengde som er mer enn 1,0 vekt%.

Antitumorpeptider kan administreres i kombinasjon, eventuelt i synergistisk kombinasjon med andre aktive midler eller former for terapi, f.eks. kan administrering av et peptid ifølge oppfinnelsen kombineres med kjemoterapi, immunoterapi, kirurgi, strålingsterapi eller med administreringen av andre antitumorpeptider.

Ved anvendelse av slike preparater systemisk (intramuskulært, intravenøst, intraperitonealt) er det aktive peptid til stede i en slik mengde at det oppnås et serumnivå av peptidet som er minst ca. 5 ^ig/ml. Generelt behøver ikke serumnivået av peptid å overskride 500fig/ml. Et foretrukket serumnivå er ca. 100 (ig/ml. Slike serumnivåer kan oppnås ved å inkorporere peptidet i et preparat som skal administreres systemisk, ved en dose fra 1 til ca. 10 mg/kg. Generelt behøves ikke peptidet eller peptidene å administreres ved en dose som overskrider 100 mg/kg.

De peptidene som er eksemplifisert her, utgjør foretrukne peptider ifølge oppfinnelsen. Hvilket som helst peptid hvis spesifikke sekvens er beskrevet her, særlig de peptidene som er mer aktive mot bakterieceller enn LFB 17-31, utgjør et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse.

Noen av de foretrukne, ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrene som er inkorporert i peptidene ifølge oppfinnelsen, omfatter substituerte tryptofaner som gir en økning i masse og lipofilisitet, og en signifikant økning i biologisk aktivitet. Substitusjoner er blitt gjort i 1-stillingen (eller indol-N-stillingen) og i den tilgrensende 2-stilling, og disse nye forbindelsene som er beskrevet i eksempel 2, utgjør enda et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse. Nye 1-substituerte tryptofaner omfatter 1-benzyl- og 1-tosyltryptofan.

De følgende nye, 2-substituerte tryptofanrester er blitt laget: Z-Trp (2-nitrofenylsulfenylklorid)-OH og oksider derav, og Z-Trp(2-Pmc)-OH, hvor Z er en beskyttelsesgruppe, f.eks. Fmoc. Fremgangsmåte II ifølge eksempel 2E er en nylig anvist syntetisk vei som er egnet for fremstillingen av en rekke 2-sulfoner. Vi omtaler derfor videre en fremgangsmåte for fremstilling av tryptofanrester som er substituert i 2-stillingen i indolringen, som omfatter overføring av gruppen som tryptofanet vil bli substituert med, fra en guanidylholdig gruppe til et N-beskyttet tryptofan. Fortrinnsvis er den guanidylholdige gruppe en arylalkyl- eller alkyl-guanidylgruppe, mest foretrukket er den en fenyletylguanidylgruppe. Fortrinnsvis er N-beskyttelsesgruppen Fmoc, og fortrinnsvis er den tryptofansubstituerende gruppe Pmc.

LFB 17-41 hvis cysteinrester er blitt blokkert ved hjelp av pyridyletylering eller acetamidometylering, men som ikke omfatter noen ytterligere voluminøse og lipofile aminosyrer, er ikke i seg selv peptider ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet under henvisning til de følgende eksempler hvor: Figur 1 viser aminosyresekvensen og ladningen ved pH 7 for syntetiske laktoferriciner fra forskjellige arter. Figur 2 viser effektene av rettkjedet og syklisk laktoferricin B på en Meth A-fibrosarkomcellelinje in vitro etter 24 timers inkubasjon. Figur 3 viser effektene av forskjellige LFB-derivater på Meth A-celler in vitro eller 1/2 times inkubasjon, + = pmc-modifisert; - = umodifisert. Figur 4 viser effektene av forskjellige LFB-derivater på Meth A-celler in vitro etter 4 timers inkubasjon, + = pmc-modifisert; - = umodifisert. Figur 5 viser effektene av pmc-modifisert retro-LFB 17-31 (+), Fmoc-LFB 17-31 (A8) og LFB 17-31 på Meth A-celler in vitro etter 1/2 time. RPMI ble brukt som negativ kontroll og "Triton 100X" som positiv kontroll. Konsentrasjoner er i mg/ml. Figur 6 viser effektene av pmc-modifisert retro-LFB 17-31 (+), Fmoc LFB 17-31 (A8) og LFB 17-31 på Meth A-celler in vitro etter 4 timer. RPMI ble brukt som negativ kontroll og "Triton 100X" som positiv kontroll. Konsentrasjoner er i mg/ml. Figur 7 viser doseresponsen på human promyelotisk leukemicellelinje HL 60 etter 4 timer. HL 60-celler, 1 x IO<4>, ble inkubert med peptidene 50, 30,20, 10, 5,1^g, 1 000-20fig/ml i 2 timer og farget med MTT. Figur 8 viser inhibering av tumorvekst; Meth A-tumorceller (5 x IO<7>celler) ble inokulert på dag 1 og behandlet på dag 7 og dag 10 med 0,5 mg (1 mg Pl) av forskjellige peptider. Figur 9 viser effekten av D-LFB (17-31) A7 Pmc-NH2på Bl6F10 murint melanom. Figur 10 viser størrelsen på tumorer etablert i Balb/c-mus som reinokuleres med Meth A-celler etter vellykket behandling med cLFB. Musene ble ikke behandlet med cLFB eller andre peptider under undersøkelsen, det er således vist en slags form for adaptiv immunitet. Reinokulasjon av Meth A-celler 1 måned etter LFB-behandlingen av Meth A-tumorer.

Eksempel 1

Human-, bovin-, murin- og kaprinlaktoferrinavledede peptider

A) Tester for MIC (minimal inhibitor konsentrasjon)

Bakteriestammene som ble brukt, var: Escherichia coli ATCC 25922 og Staphylococcus aureus ATCC 25923. Alle stammene ble lagret ved -70 °C. Bakteriene ble dyrket i 2 % baktopeptonvann (Difco 1807-17-4). Alle testene ble utført med bakterier i midtlogaritmisk vekstfase. Bestemmelse av den minimale inhibitorkonsentrasjon (MIC) til peptidene for bakteriestammer ble utført i 1 % baktopeptonvann. En standard mikrofortynnings-teknikk med et inokulum på 2 x IO<6>CFU/ml ble brukt. Alle analysene ble utført in triplo. Ettersom peptidene er positivt ladet og derfor vil kunne feste seg til plastveggene, kontrollerte vi den faktiske konsentrasjon av peptidene i oppløsningen ved hjelp av HPLC. Det var ingen forskjell mellom konsentrasjonen av peptidene før eller etter tilsetning av oppløsningen til plastveggene.

B) Syntese av peptider

Til å begynne med var det anvendte laktoferricin B en gave fra Wayne Bellamy (Nutritional Science Laboratory, Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Japan). Senere under under-søkelsen ble peptidene syntetisert med et "9050 Plus PepSynthesizer" (Milligen). Alle peptidene ble syntetisert på fast fase ved anvendelse av fluorenylmetoksykarbonylkjemi (Fmoc). Cysteiner i cysteinholdige peptider ble beskyttet med acetamidometylgrupper for å forhindre disulfid-brodannelse. Peptidene ble analysert og renset ved hjelp av reversfase-HPLC på et "Waters 600E" kromatografapparat (Millipore) med UV-påvisning ved 254 nm. Fraksjonene renset på HPLC, ble analysert på et væskekromatografi-massespektrometer (LC-MS) med elektrospray-grensefiate (Fisons VG Quattro) eller/og med hurtig atombombardement-massespektrometri (FAB-MS) (Fisons VG Tribrid).

Laktoferricinenes struktur

Strukturen til humanlaktoferrin er bestemt til 2,8 og 2,2 Å oppløsning ved hjelp av røntgenkrystallografi. Humanlaktoferricin (LFH) består av restene 1-47 i humanlaktoferricin. LFH inneholder to peptidfragmenter; ett som består av restene 12-47 ringsluttet med en disulfidbro mellom Cys20 og Cys37, det andre fragmentet (restene 1-11) er bundet til 12-47-fragmentet gjennom en disulfidbro mellom CyslO og Cys46.1 humanlaktoferirnstrukturen omfatter de tilsvarende restene en (5-tråd (restene 4-11), en a-heliks (restene 12-29), en sving (restene 30 og 31), etterfulgt av en p-tråd (restene 31-47) [Day, C.L., Anderson, B.F., Tweedie, J.W. og Baker, E.N. (1993), J. Mol. Biol. 232,1084-1100]. Bovint laktoferricin (LFB) med bare 25 rester (restene 17-41) i en enkeltkjede er strukturelt mye enklere enn LFH.

Antibiotisk aktivitet av syntetiske laktoferriciner med sekvenser fra forskjellige arter

Aminosyresekvensen til laktoferriner fra geit [Provost, F.L., Nocart, M., Guerin, G. og Martin, P. (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun. 203,1324-1332] og mus [Pentecost, B.T. og Teng, C.T. (1987), J. Biol. Chem. 262, 10134-10139] er blitt bestemt og viser høy sekvenshomologi med både human- og bovinlaktoferrinene. Restene som er engasjert i heliks-sving-tråd-motivet, kan lett identifiseres i sekvensen som vist i figur 1. Ettersom LFB er mer antibakteriell enn LFH, ble restene som tilsvarer LFB (17-41), valgt i aminosyresekvensen til human-, murin- og kaprinlaktoferrin for å fremstille analoge laktoferricinpeptider; hhv. LFH (18-42), LFM (17-41) og LFC (17-41). Disulfidbroen er ikke av avgjørende betydning for antibiotisk aktivitet i bovin- og humanlaktoferricin [Bellamy et al. (1992)], og alle peptidene ble fremstilt med ACM-beskyttelse av cysteinrestene for å unngå ringslutning eller oksidasjon.

De antibakterielle aktivitetene til de syntetiske laktoferricinene uttrykt som MIC, er sammenstilt i tabell 1 som viser at LFB (17-41) utviste den mest signifikante antibakterielle aktivitet mot E. coli og S. aureus.

LFB-analoger med forskjellig kjedelengde

En egenskap som anses for å være viktig ved bestemmelse av den antibakterielle aktivitet i lineære peptider, er deres evne til å innta heliske strukturer. I det intakte laktoferrin-protein er restene 14-28 lokalisert i en a-heliks, restene 29-31 omfatter en sving, og restene 32-41 er i en (5-tråd. Vi antok derfor at den antibakterielle effekt av laktoferricinene kunne skrive seg fra den delen av sekvensen som deltar i heliksen i det intakte protein. Ettersom den bovine laktoferricinsekvens, LFB (17-41), var det eneste peptid med signifikant antibakteriell egenskap, valgte vi å fremstille en kortere variant av det bovine peptid, LFB (17-31), som inneholder både heliks- og svingrestene til proteinet, mens de 10 restene som omfatter tråden, ble fjernet. Til tross for det faktum at LFB (17-31) har en lavere nettoladning (figur 1) enn LFB (17-41) og LFC (17-41), bibeholder det likevel mesteparten av den antibakterielle effekt som vist i tabell 1. Disse funn indikerer at selv om totalladningen er viktig, er den ikke tilstrekkelig for antibakteriell aktivitet.

Eksempel 2

Fremstilling av nye, substituerte tryptofaner

I de etterfølgende eksempler og gjennom hele teksten henviser den følgende generelle formel: Z-XX(n-y)-OH til en substituert aminosyre (XX) hvor NH2-gruppen i aminosyren er Z-beskyttet, aminosyren er y-substituert i n-stillingen, og COOH-gruppen i aminosyren er fri.

A) Fremstilling av Ac-Trp( 1 -Tos)-OH

Eksperimentelt:

En blanding av Ac-Trp-OEt (0,19 g, 0,69 mmol), tosylklorid (0,20 g, 1,04 mmol), tetrabutylammoniumhydrogensulfat (2 mg, 0,01 ekv.) og NaOH (0,07 g, 1,73 mmol) i diklormetan ble omrørt ved romtemperatur i 2,5 timer. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt fortynnet HC1 inntil en pH-verdi på 2-3 var nådd, og så ble det vasket med vann. Til den organiske fase ble det tilsatt en fortynnet base, og vannfasen ble ekstrahert med diklormetan, surgjort og igjen ekstrahert med diklormetan.

<!>H NMR (CDC13): 8 1,89 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 3,1-3,35 (m, 2H), 4,87 (m, 1H), 6,63 (d, 1H), 7,1-7,3 (m, 4H), 7,46 (m, 2H), 7,68 (d, 2H), 7,89 (d, 1H), 9,34 (s, bredt, 1H).

MS (EI): m/z 382 (10%), 284 (84%), 157 (8%), 155 (61%), 130 (26%), 129 (24%).

Materialer:

Ac-Trp-OEt Fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet under "Preparation of diacetyl- tryptophan ethyl ester", Bodanszky, M. og Bodanszky A., The Practice of Peptide Synthesis (1994), s. 30; Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 5. utg. (1989), s. 1273.

B) Fremstilling av Fmoc-Trp( 1 -benzyl)-OH

Boc-Trpa-benzylVOH<1>:

Dimetylsulfoksid (7 ml) ble tilsatt til kaliumhydroksid (0,73 g, 13 mmol) (knuste pellets), og blandingen ble omrørt i 5 minutter. Boc-Trp-OH (lg, 3,3 mmol) ble så tilsatt og blandingen omrørt i 1 time. Benzylbromid (1,13 g, 6,6 mmol) ble tilsatt og blandingen avkjølt en kort stund og omrørt i ytterligere 20 timer før vann (20 ml) ble tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med dietyleter (3 x 20 ml). pH-verdien i de sammenslåtte vannfaser ble regulert til 2-3 ved tilsetning av 1 M HC1 (20 ml), og det ble ekstrahert med dietyleter (3 x 20 ml). Hver ekstrakt ble vasket med vann (3 x 20 ml). De sammenslåtte dietyleterfaser ble tørket med MgSC>4 og oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Produktet ble isolert som hvite krystaller (0,89 g, 2,3 mmol). Utbytte 69%.

<]>H NMR (CDC13): 8 1,41 (s, 9H), 3,33 (m, 2H), 4,64 (m, 1H), 5,02 (m, 1H), 5,24 (s, 2H), 6,95 (s, 1H), 7,01-7,38 (m, 8H), 7,59 (d, J=7,7 Hz, 1H).

H-Trp(l-benzyl)-OH:

Boc-Trp(l-Bn)-OH ble oppløst i 98% TFA, og det ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Så ble oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Produktet ble isolert som en olje og brukt uten ytterligere rensing.

Fmoc-Trp(l-benzyl)-OH:

H-Trp(l-Bn)-OH (1,90 g, 6,5 mmol) ble oppløst i en 10% oppløsning av Na2CC>3 i vann (21 ml, 20 mmol). Dioksan (15 ml) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i et isvannbad. 9-fluorenylmetylklorkarbonat (1,69 g, 6,5 mmol) ble tilsatt i små porsjoner, og omrøring ble fortsatt ved isvannbadtemperatur i 4 timer og så ved romtemperatur i 8 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i vann (400 ml), og det ble ekstrahert med eter (3 x 200 ml). De kombinerte eterfaser ble tørket med MgSC«4 og oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Produktet ble renset ved hjelp av kromatografi på silikagel i oppløsningsmiddel A (oppløsningsmiddel A = etylacetatmetanol = 4:1). Etter rensing ble produktet erholdt som en hvit, krystallinsk forbindelse. Utbyttet var 2,42 g (72%).

<]>H NMR (400 MHz, CDCI3): 8 3,34 (m, 2H), 4,18 (m, 1H), 4,37 (m, 2H), 4,78 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 5,31 (d, 1H), 6,91-7,74 (m, 19H).

Materialer:

Boc-Trp-OH BACHEM nr. A-2360

Fmoc-ONSu Fluka nr. 46920

Trifluoreddiksyre Fluka nr. 91700/KEBO

nr. 1.8341-100

Referanse 1: Heaney, H. og Ley, S.V., J. Chem. Soc. Perkin 1. (1973), 499-500.

C) Fremstilling av Fmoc-Trp(2-Nps)-OH

Til en oppløsning av 2,0 g (4,7 mmol) Fmoc-L-tryptofan i 12 ml dioksan ble 0,87 g (4,6 mmol) 2-nitrofenylsulfenylklorid (2-Nps-Cl) i 25 ml dioksan tilsatt under omrøring ved romtemperatur. Etter å ha stått i 3 dager ble 50 ml etyleter tilsatt til reaksjonsblandingen, og oppløsningsmidlet ble avdampet. Produktet ble renset ved hjelp av kromatografi på silikagel i oppløsningsmiddel A (oppløsningsmiddel A = kloroform:etanol:heptan - 1:1:1). Rf 0,43. Etter rensing ble produktet erholdt som en gulbrun, krystallinsk forbindelse. Utbyttet var 2,5 g (89%).

HPLC (C18): tR 8,3 min, 85-100% B i 20 min. (A:H20 + 0,1% TF A; B:CH3CN + 0,1% TF A).

<]>H NMR (DMSO-de): 8 3,16 (m, 1H), 3,38 (m, 1H), 4,00-4,10 (m, 3H), 4,19 (m, 1H), 6,72 (d, J=8,l Hz, 1H), 7,03 (t, J=7,3 Hz, 1H), 7,18 (t, 1H), 7,22-7,49 (m, 7H), 7,60 (dd, J=7,3 og 12,1 Hz, 2H), 7,86 (m, 3H), 8,24 (d, J=8,l Hz, 1H), 11,51 (s, 1H).

Etter inkorporering av Fmoc-Trp(2-Nps)-OH i et peptid bekreftet MS-elektrosprayanalyse den forventede molekylvekt.

Materialer:

Fmoc-Trp-OH BACHEM nr. B-1445/

SENN nr. 02019

2-nitrofenylsulfenylklorid Fluka nr. 73740

D) Oksidasj on av Fmoc-Trp(2-Nps)-OH

Til en oppløsning av 1,12 g (1,9 mmol) Fmoc-Trp(2-Nps)-OH i 15 ml iseddik ble det tilsatt 12 ml 30% H2O2under omrøring ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble varmet opp i 2 timer ved 65 °C. Utfellingen ble samlet opp, tilsatt vann og lyofilisert. Utbyttet var 0,59 g (52%). Produktet ble erholdt som en gul, krystallinsk forbindelse.

HPLC (C18): tR6,4 min, 85-100% B i 20 min. (A=H20 + 0,1% TF A; B:CH3CN + 0,1% TF A).

<]>H NMR (DMSO-de): 8 3,25 (dd, J=9,0 og 14,5 Hz, 0,5H), 3,54 (m, 1H), 3,77 (dd, J=5,9 og 14,3 Hz, 0,5H), 4,01-4,26 (m, 3H), 4,32 (m, 0,5H), 4,40 (m, 0,5H), 7,00-7,98 (m, 15H), 8,23 (m, 1H), 8,35 (m, 1H), 8,56 (d, J=8,l Hz, 1H), 11,08 (s, 0,5H), 11,17 (s, 0,5H).

Etter inkorporering av Fmoc-Trp(2-Nps02)-OH i et peptid avslørte MS-elektro-sprayanalyse at oksidasjonen av Fmoc-Trp(2-Nps)-OH var blitt ufullstendig; produktet var en ca. 3:1 blanding av sulfoksidet Fmoc-Trp(2-NpsO)-OH og sulfonet Fmoc-Trp(2-Nps02)-OH. Proton-NMR indikerer en 1:1 blanding av de to forbindelsene basert på doble sett av signaler for p-, a- og karboksylprotoner.

E) Fremstilling av Fmoc-Trp(2-Pmc)-OH

Metode I: Ved overføring av Pmc-gruppen fra Fmoc-Arg(Pmc)-OH

Fmoc-Arg(Pmc)-OH (0,5 g, 0,75 mmol) og Fmoc-Trp-OH (0,43 g, 0,1 mmol) ble oppløst i 10 ml 100% TF A, og det ble varmet opp ved 30 °C i 1,5 time. Etter avdamping av TF A ble Fmoc-Arg-OH fjernet ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel med heptan/etylacetat 2:1 som mobil fase. Fmoc-Trp(2Pmc)-OH ble isolert ved hjelp av preparativ HPLC (Cl8, 70-100% B i 15 min, tR14,8 min, (A: H20 + 0,1% TF A; B: CH3CN + 0,1% TF A)). Isolert utbytte: 130 mg (0,19 mmol, 25%).

<]>H NMR (400 MHz, CDC13): 8 1,30 (s, 6H), 1,79 (t, 2H), 2,07 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,59 (t, 2H), 3,03 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 4,1-4,3 (m, 3H), 4,42 (m, 1H), 6,53 (d, 1H), 7,15-7,78 (m, 12H), 8,90 (s, 1H).

Materialer:

Fmoc-Arg(Pmc)-OH BACHEM nr. B-1670

Fmoc-Trp-OH BACHEM nr. B-1445/SENN nr. 02019

Trifluoreddiksyre KEBO nr. 1.8341 -100/Fluka nr. 91700

Metode II: Ved overføring av Pmc-gruppen fra fenyletylguanidyl-Pmc

2, 2, 5, 7, 8- pentametvlkroman:

Referanser: Robert Ramage, Jeremy Green og Alexander J. Blake, Tetrahedron, vol. 47, nr. 32, s. 6353-6370, 1991.

Reaksjon:

Kjemikalier:

Fremgangsmåte:

2,3,5-trimetylfenol (50,03 g, 0,367 mol), isopren (25,09 g, 0,368 mol) og kondensert sinkklorid (5,94 g, 0,044 mol) ble omrørt med vannfri eddiksyre (47 ml) i 14 timer ved romtemperatur. Den grumsede, rødfargede blanding ble så gradvis varmet opp, og den ble klar. Etter koking under tilbakeløpskjøling gikk reaksjonsblandingen over til svart, og etter 8 timers refluks ble den avkjølt til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble helt over i 250 ml vann og den sorte olje fraskilt. Vannet ble ekstrahert med pentan (3 x 200 ml) og de sammenslåtte, organiske faser vasket med Claisens alkali (2 x 150 ml), vann (3 x 250 ml) og saltoppløsning (2 x 200 ml), tørket over CaCl2og inndampet til en brun olje under redusert trykk. Råproduktet ble destillert ved 0,48 mBar, hvorved man fikk produktet som en lysegul væske (36,90 g, 49% utbytte); kp. 82-96 °C (0,48 mBar); >95% rent (GC).

Resultater:

Produktet ble isolert som en lysegul væske som størknet etter avkjøling i 49% utbytte.

<]>H NMR (CDC13, 400 MHz): 8 1,30 (6H, s, 2 x CH3), 1,78 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 2,07 (3H, s, CH3), 2,15 (3H, s, CH3), 2,19 (3H, s, CH3), 2,59 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 6,54 (1H, s, aromatisk H).

<I3>C NMR (CDC13,400 MHz): 8 = 11,42 (CH3), 18,91 (CH3), 19,84 (CH3), 20,49 (CH2), 26,97 (2 x CH3), 32,79 (CH2), 73,10 (C(CH3)2), 116,67 (Ar-C), 122,03 (Ar-C), 122,29 (Ar-C), 133,44 (Ar-C), 134,70 (Ar-C), 151,72 (Ar-C).

MS (GC/MS): m/z = 204 (100), 189 (14), 149 (91).

2, 2, 5, 7, 8- pentametvlkroman- 6- sulfonylklorid:

Til en oppløsning av 2,2,5,7,8-pentametylkroman (3,39 g, 16,6 mmol) i 30 ml diklormetan ved -8 °C ble det under omrøring tilsatt klorsulfonsyre (3,98 g, 34,2 mmol) i 30 ml diklormetan i løpet av 3 minutter. Blandingen ble omrørt ved -8 °C i 15 minutter og ved romtemperatur i 2,5 timer. Reaksjonsblandingen ble forsiktig ristet med 50 ml diklormetan og 100 ml is noen ganger, og fasene separert. Råproduktet inneholdt ca. 16 % utgangsmateriale bedømt ved hjelp av<]>H NMR. Da varm pentan ble tilsatt til råproduktet, ble det dannet en mørk olje som ble fjernet ved dekantering. Produktet ble så isolert ved krystallisasjon fra pentan som et lysebrunt pulver (2,80 g, 9,3 mmol). Utbytte 56 %.

<]>H NMR (CDC13): 8 1,34 (s, 6H), 1,85 (t, J=7,0 Hz, 2H), 2,14 (s, 3H), 2,60 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 2,68 (t, J=7,0 Hz, 2H).

2- fenyletylguanidinhemisulfat:

2-fenyletylamin (8,49 g, 70,1 mmol) og S-metylisotioureasulfat (9,43 g, 33,9 mmol) ble oppløst i 100 ml destillert vann. Luft ble sendt over reaksjonsblandingen og gjennom 50% NaOH (500 ml), og så gjennom 5% kobbersulfat (250 ml). Reaksjonsblandingen ble varmet opp ved refluks i 5 timer. Avdamping av oppløsningsmidlet ga et hvitt pulver. Produktet ble isolert ved krystallisasjon fra 96 % etanol, vasket med kald aceton og dietyleter og tørket i en eksikkator. Etter tre krystallisasjoner inneholdt produktet bare mindre mengder utgangsmateriale. Omsetningen ga 61, % (9,14 g) 2-fenyletylguanidinhemisulfat.

<!>H NMR (D20): 8 2,87 (t, J=6,6 Hz, 2H), 3,44 (t, J=6,6 Hz, 2H), 7,24-7,38 (m, 5H).

Fenyletylguanidyl- Pmc:

Reaksjon: lan Michael Eggleston, Ph.D. thesis, University of Oxford, 1990.

U svr» Ima a n •

Kjemikalier:

Fremgangsmåte:

2-fenyletylguanidinhemisulfat (3) (7,40 g, 34,87 mmol) ble oppslemmet i 6 M NaOH (80 ml), og det ble ekstrahert i kloroform (2 x 80 ml). Etter avdamping av oppløsnings- midlet under vakuum ble oljeresten saminndampet med benzen (2x10 ml). Det frie guanidin (3b) ble oppløst i 75 ml diklormetan i en 250 ml rundbunnet kolbe utstyrt med en magnetisk rørestav og 100 ml tilsetningstrakt med trykkutjevner. Trakten ble fylt med Pmc-SC>2-Cl (7,00 g, 23,17 mmol) oppløst i 75 ml diklormetan. Utstyret ble gjennomblåst med nitrogen, og omsetningen ble utført under en svak nitrogenstrøm. Den rundbunnede kolbe ble avkjølt i et isvannbad og Pmc-S02Cl-oppløsning tilsatt i løpet av et tidsrom på 20-25 minutter. Reaksjonsblandingen fikk nå romtemperatur i løpet av natten. Diklormetanet ble avdampet under vakuum og resten fordelt mellom vann (100 ml) og etylacetat (120 ml). Det organiske lag ble så vasket med vann (100 ml). Etter avkjøling av etylacetatet fremkom produktet som et hvitt/lysegult pulver som ble frafiltrert og tørket under vakuum.

Resultater:

3,32 g av et lysegult pulver ble isolert. Utbyttet av omsetningen er 33%. Smeltepunkt: 145-147 °C.

<]>H NMR (CDC13): 8 1,30 (6H, s, 2 x CH3), 1,80 (2H, t, J=7,0 Hz, CH2), 2,09 (3H, s, CH3), 2,51 (3H, s, CH3), 2,52 (3H, s, CH3), 2,61 (2H, t, J=6,6 Hz, CH2), 2,81 (2H, t, J=7,0 Hz, CH2), 3,43 (2H, m, CH2), 6,21 (3H, bred s, 3 x NH), 7,12-7,25 (5H, m, aromatiske protoner).

MS: m/z = 429 (6), 204 (37), 149 (100), 105 (24), 92 (37).

Fmoc- Trp( 2- Pmc)- OH:

Reaksjon:

Kjemikalier:

Fremgangsmåte: NG<->(6-S02-Pmc)-2-fenyletylguanidin (2,08 g, 4,84 mmol) og Fmoc-Trp-OH (4,14 g, 9,71 mmol) ble omrørt med trifluoreddiksyre (25 ml) ved romtemperatur i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble så inndampet under vakuum og resten fordelt mellom kloroform og 1 M saltsyre. Ved avkjøling av kloroformoppløsningen kunne overskuddet av Fmoc-Trp-OH fjernes ved hjelp av filtrering.

Produktet ble renset ved hjelp av hurtigkromatografi (etylacetat/heptan, 1:1).

Resultater:

Tittelforbindelsen ble isolert som et hvitt pulver i 26 % utbytte.

Materialer:

Klorsulfonsyre Fluka nr. 26388

Fenyletylamin Fluka nr. 77900

S-metylisotioureasulfat Fluka nr. 67730

Fmoc-Trp-OH BACHEM nr. B-1445/SENN nr. 02019

Trifluoreddiksyre KEBO nr. 1.8341 -100/Fluka nr. 91700

F) Fremstilling av Fmoc-2,5,7-tritert.-butyltryptofan

2, 5, 7- tritert.- butvltrvptofan

Tryptofan (4,00 g, 19,59 mmol), trifluoreddiksyre 98% (60 ml) og tert.-butanol (15,54 g, 209,66 mmol) ble blandet. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 48 timer. Trifluoreddiksyren ble avdampet. Resten ble oppslemmet i 40 ml destillert vann og pH regulert til nøytral med tilsetning av natriumhydrogenkarbonat. Råproduktet ble erholdt ved filtrering. Krystallisasjon fra 50% etanol ga produktet som et hvitt pulver (85-90% rent).

<!>H NMR (CDC13): 8 1,34 (9H, s, 3 CH3), 1,46 (9H, s, 3 CH3), 1,49 (9H, s, 3 CH3), 7,45 (1H, s, CH arom), 7,18 (1H, s, CH arom), 5,29 (1H, s, NH).

Fmoc- 2, 5, 7- tritetr.- butyltrvptofan:

Tittelforbindelsen ble fremstilt som beskrevet for Fmoc-Trp(l-benzyl)-OH.

Eksempel 3

Bioaktivitet av laktoferricinanaloger

Syntese av analogene

Alle peptidene ble syntetisert på et "9050 Millipore" automatisk peptidsynteseapparat under anvendelse av Fmoc-beskyttelse og aktivering med pentafluorfenylestere (Pfp) eller in situ aktivering med koblingsreagenset HATU (0-(7-azabenzotriazol-l-yi)-l,1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat). I tilfellet med kobling med pentafluorfenylestere ble 1-HOBt (1-hydroksybenzotriazol) tilsatt for å katalysere reaksjonen, og da koblingsreagenset HATU ble brukt, ble reaksjonen basekatalysert med DIPEA (diisopropyletylamin). Alle amino syrene med reaktive sidekjeder ble beskyttet med syrelabile beskyttelsesgrupper og spaltet etter behandling med TFA (trifluoreddiksyre) inneholdende rensemidler. (Se nedenunder for rense-middelblanding). Samtidig ble peptidene spaltet fra den faste bærer etter behandling med TFA-oppløsningen.

A) Binding av den første aminosyre til den faste bærer når alle D-peptider syntetiseres

Den faste bærer PAC-PEG-PS (peptidsyre-polyetylenglykol-polystyrenharpiks) (1 ekv.) ble blandet sammen med Fmoc-D-aminosyre-OPfp (5 ekv.) og DMAP (dimetylaminopyridin) (1 ekv.) i et lite volum av DMF (dimetylformamid) og fikk svelle i 30 minutter. Oppløsningen ble så omrørt sakte i 4,5 time. AC2O (eddiksyreanhydrid) (2,5 ekv.) og DMAP (0,1 ekv.) ble så tilsatt til oppløsningen for å acetylere eventuelle gjenværende hydroksylgrupper på den faste bærer. Oppløsningen ble så omrørt i ytterligere 1 time. Den faste bærer med den C-terminale aminosyre bundet ble isolert ved filtrering og vasket flere ganger på filteret med DMF. Den faste bærer ble så brukt i syntesen av målpeptidet på "9050 Millipore" automatisk peptidsynteseapparatet.

B) Acetylering av den N-terminale H2N-gruppe under anvendelse av eddiksyreanhydrid

Peptid-harpiks-komplekset ble oppløst i et lite volum DMF og behandlet med et overskudd av eddiksyreanhydrid (20 ekv.) og DMAP (5 ekv.) i 4 timer mens oppløsningen sakte ble omrørt med en liten magnet. Fullstendig acetylering ble bekreftet ved hjelp av en ninhydrintest/Kaisers test (se nedenunder).

C) Ninhydrintest/Kaisers test

Mindre enn 1 mg av peptid-harpiks-komplekset ble behandlet med små like volumer av en 5% ninhydrinoppløsning i etanol, en oppløsning av 80 g fenol i 20 ml etanol og en oppløsning av tørket, destillert pyridin. Reaksjonsblandingen ble varmet opp i 2 minutter ved 110 °C og undersøkt under et mikroskop. (I denne testen indikerer en gul reaksjonsblanding vellykket acetylering, mens en blå oppløsning indikerer fortsatt frie aminogrupper).

D) Spalting av syrelabile beskyttelsesgrupper

Spalting av syrelabile beskyttelsesgrupper og spalting av peptidene fra den faste bærer ble oppnådd ved å anvende en blanding av 2% anisol, 2% etanditiol (EDT), 2% vann og 2% fenol i TFA, og med spaltningstider som ikke er mer enn 4 timer. Den faste bærer ble så fjernet ved filtrering og peptidet utfelt i dietyleter. Eteroppløsningen inneholdende TFA, ble fjernet under anvendelse av en pasteurpipette, og peptidet ble vasket flere ganger med dietyleter og tørket under høyvakuum.

E) Rensing

Peptidene ble renset ved hjelp av HPLC under anvendelse av en C18-reversfase-kolonne (<*>) og en blanding av vann og acetonitril (begge tilsatt 0,1% TFA) som mobil fase. Utvalgt bølgelengde for påvisning av peptidfraksjoner var 254 nm.

(<*>) "PrePak" patron 25 x 100 mm. "DeltaPak" Cl8 15^im 100 Å. (Waters Corporation).

F) Analyse

Alle peptidene ble analysert med hensyn på urenheter på en analytisk HPLC Cl 8-reversfasekolonne under anvendelse av en blanding av vann og acetonitril (begge tilsatt 0,1% TFA) som mobil fase. Molekylvekten til peptidene ble bestemt ved hjelp av positivt ion-elektrosprayioniseringsmassespektrometri (VG Quattro Quadrupole).

Aminosyrederivater ble innkjøpt fra enten Bachem, MilliGen/Biosearch (Division of Millipore) eller PerSeptive Biosystems.

Antimikrobiell aktivitet av alaninskanningspeptider inneholdende en tryptofan- Pmc- rest

Under avbeskyttelse av syrelabile beskyttelsesgrupper og spalting av peptidet fra harpiksen med trifluoreddiksyre ble det observert en bireaksjon som omfatter overføring av beskyttelsesgruppen Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonylgruppe) fra arginin til den andre stillingen i tryptofans indol. Isolering av disse biproduktene er blitt gjort, og resultatene fra MIC-analyser er gjengitt i tabell 2. Denne tabellen viser også resultatene av en alaninskanning utført på LFB uten noen Pmc-grupper.

I løpet av en alaninskanning fremstilles en serie peptider hvor på hverandre følgende aminosyrer er blitt byttet ut med alanin.

Sekvensen til naturlig forekommende bovint laktoferricin fra aminosyrene 17 til 31 (LFB 17-31) er H2N-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-COOH (SEQIDNo. 1).

<*>MIC på 25 er blitt observert

Resultatene viser at en Pmc-gruppe bundet til én av tryptofanrestene, øker aktiviteten fire ganger for E. coli. Enda mer markert er effekten på S. aureus. Denne grampositive bakterie ble funnet å være nesten fullstendig resistent overfor alle alaninskannings-analoger, men oppviser nå en MIC mellom 10 og 22,5 (ig/ml. Dette utgjør en ti gangers økning i antibakteriell aktivitet i forhold til naturlig forekommende LEB 17-31. Tryptofan-Pmc-resten som er hydrofob, synes derfor å øke peptidaffiniteten for de hydrofobe delene av den bakterielle cellemembran i et slikt omfang at den antibakterielle aktivitet til peptidet ikke lenger er så sekvensavhengig som for peptidet uten denne resten.

Sammenligning av antimikrobiell aktivitet mellom naturlig forekommende bovint laktoferricin ( LFB 17- 31) og enantio-, retro- og retro- enantio- LFB 17- 31, og disse samme peptidene som inneholder en tryptofan- Pmc- rest

Peptider inneholdende en Pmc-gruppe overført fra en argininrest til en tryptofanrest, ble også isolert etter syntese av enantio-, retro- og retro-enantio-LFB 17-31.

Enantiopeptidet som er det nøyaktige speilbilde av det naturlig forekommende peptid, oppviser bemerkelsesverdige forbedringer i antibakteriell aktivitet. (Faktisk oppviser dette peptidet den samme aktivitet som det naturlig forekommende peptid LFB 17-31 med en tryptofan-Pmc-rest, i tilfellet med E. coli). Konfigurasjonsmessig betyr dette at en alle-D-aminosyre-analog av LFB 17-31 reagerer bedre med de kirale fosfolipidene i bakteriecellemembranen enn det naturlig forekommende alle-L-aminosyre-peptid LFB 17-31. Det kan også medføre at dette enantio-peptidet er mer resistent overfor nedbrytbare proteaser fra bakteriene.

Retro-peptidet med en invertert sekvens i forhold til LFB 17-31, oppviser ingen forbedringer i antibakteriell aktivitet, noe som er i overensstemmelse med teorien om at den antibakterielle aktivitet av LFB 17-31 er sekvensspesifikk. Dette peptidet er ikke egentlig en isomer av bovint laktoferricin ettersom aminosyresekvensen er fullstendig forskjellig. Den lave antibakterielle aktivitet av dette peptidet kommer derfor ikke som noen overraskelse.

En bemerkelsesverdig høy antibakteriell aktivitet mot E. coli ble observert for retro-enantio-peptidet som, som allerede nevnt, inntar den samme a-heliske konformasjon som det naturlig forekommende peptid LFB 17-31, bortsett fra at amidbindingene peker i motsatte retninger. Alle-L-aminosyre-stereoisomeren, retro LFB 17-31, oppviser lav antibakteriell aktivitet. Grunnen kan være at alle-D-aminosyre-peptider enten reagerer sterkere med de kirale fosfolipidene i bakteriecellemembranen, eller at de er mer resistente overfor proteaser enn deres alle-L-aminosyre-motparter.

Aktiviteten av peptidene mot S. aureus er ikke like høy som observert for E. coli, noe som indikerer at interaksjonene mellom peptidene og lipopolysakkaridlaget i gramnegative bakterier vil kunne være sterkere enn interaksjonene med lipidcellemembranen i grampositive bakterier.

Aktiviteten av de tryptofan-Pmc-holdige peptider oppviser ikke de samme forskjeller mellom alle-D- og alle-L-aminosyre-isomerene som observert for peptidene uten Pmc-gruppen. Effekten av tryptofan-Pmc-resten synes å være mer uttalt enn de konfigurasjons-messige effektene som finnes blant peptidene uten denne resten, spesielt i tilfellet med S. aureus. Mest bemerkelsesverdig er den voldsomme økning i aktivitet hos retro-Pmc-peptidet. Aktiviteten av dette peptidet økes åtte ganger i tilfellet med E. coli og mer enn ti ganger i tilfellet med S. aureus, bare på grunn av tryptofan-Pmc-resten.

Forbedringene som ble observert etter Pmc-modifikasjon i tilfellet med E. coli, er neglisjerbare, men modifikasjonen øker aktiviteten mot S. aureus ca. seks ganger. De grampositive bakteriene er åpenbart mer sårbare overfor tryptofan-Pmc-holdige peptider enn deres ikke-tryptofan-Pmc-holdige motparter.

Antimikrobiell aktivitet av tryptofanmodifisert human- ( LFH"), porcin- ( LFP") og kaprin- ( LFG") laktoferricin

Resultatene fra alaninskanningen av bovint laktoferricin (LFB 17-31) viste at de to tryptofanrestene i stillingene 6 og 8 ikke kunne byttes ut med alanin uten et stort tap av antibakteriell aktivitet. Undersøkelse av de lignende sekvensdeler av naturlig forekommende LFH-, LFP- og LFG-laktoferricin viser at disse peptidene mangler tryptofanresten i stilling 8, men har under evolusjonen konservert tryptofanresten i stilling 6. Vi har syntetisert LFH-, LFP-og LFG-analoger med en tryptofanrest substituert i stillingen 8 for å se om den antimikrobielle aktivitet av disse peptidene kunne økes. MIC-verdiene for de naturlig forekommende sekvensene er gjengitt i tabell 4 sammen med de tryptofanmodifiserte peptider.

Sekvens til modifisert humanlaktoferricin (LFHW8).

Substituert tryptofan er uthevet. (Arg-^Trp)

Sekvens til modifisert kaprinlaktoferricin (LFGW8). Substituert tryptofan er uthevet. (Arg-^Trp)

Både LFHW8 og LFGW8 oppviser forbedringer i aktivitet mot E. coli sammenlignet med de naturlig forekommende sekvenser til de samme peptidene.

Antimikrobiell aktivitet av LFH, LFP og LFG med en trvptofan- Pmc- rest

Under syrespalting av peptidet (enten med eller uten de ovenfor nevnte modifikasjoner i den naturlig forekommende sekvens) fra harpiksen og spalting av syrelabile beskyttelsesgrupper ble et biprodukt med en Pmc-gruppe bundet til én av tryptofanrestene, isolert og analysert med hensyn på antibakteriell aktivitet. Resultatene er vist i tabell 5.

Som for alle tryptofan-Pmc-holdige peptider som hittil er analysert, oppviser disse peptidene generelt bemerkelsesverdige forbedringer i antibakteriell aktivitet mot både E. coli og S. aureus.

Antimikrobiell aktivitet av tryptofanrike analoger av bovint laktoferricin ( LFB 17- 31")

Alaninskanningen viste at de to tryptofanrestene i sekvensen til bovint laktoferricin 17-31 var absolutt av avgjørende betydning for den antibakterielle aktivitet til peptidet. Alanin - substitusjon av hvilken som helst av disse to restene førte til et stort tap av antibakteriell aktivitet. Alaninskanningen viste også at de ikke-essensielle aminosyrene i sekvensen til bovint laktoferricin 17-31 var tre rester Cys(3), Gln(7) og Gly(14). Basert på denne kunnskap syntet-iserte vi derfor en serie på fem tryptofanrike analoger av bovint laktoferricin 17-31 med én, to eller tre av de ikke-essensielle aminosyrene substituert med tryptofan. Denne teknikken for utførelse av en alaninskanning og så erstatning av tilsynelatende ikke-essensielle aminosyrer med tryptofan eller andre voluminøse og/eller lipofile aminosyrer, kan brukes til å øke cytotoksisiteten til peptider generelt, og er ikke begrenset til laktoferricin. Sekvensene til de tryptofanrike, bovine laktoferricinanaloger er vist nedenunder.

Utbytting av ikke-essensielle aminosyrer i sekvensen til LFB 17-31 med tryptofanrester forbedrer den antibakterielle aktivitet til disse peptidene med minst to ganger aktiviteten til den naturlig forekommende sekvens i tilfellet med E. coli, og med fire ganger i tilfellet med S. aureus.

Peptid W3714 med tre ytterligere tryptofanrester (i alt fem tryptofanrester i peptidet) har nedsatt aktivitet. Dette er sannsynligvis mer et resultat av et oppløselighetsproblem idet dette peptidet er mindre oppløselig i vandige oppløsninger og derfor gir lavere konsentrasjoner enn beregnet. Dette er blitt observert fysisk under MIC-testingsfremgangsmåter når peptidet var tilbøyelig til å utfelles ved høye konsentrasjoner.

Eksempel 4

Substituerte magaininpeptider er også blitt fremstilt. Naturlig forekommende magainin 2 har den følgende sekvens:

Tabell 7 nedenunder viser MIC-resultatene for det naturlig forekommende peptid og et antall modifiserte peptider, hvor enkeltaminosyresubstitusjoner for tryptofan eller fenylalanin i stillingene 16 eller 19 er blitt gjort, med en resulterende økning i antibakteriell aktivitet. Tabell 7

Eksempel 5

Antitumorale effekter av forskjellige peptider

Syklisk LFB 17-41 var fra Morinaga, Milk Industry, Japan.

Cytotoksisitet

Forskjellige munn- og humanturnorceller (4 x IO6) ble tilført i 96-brønners kulturplater (Costar) i et volum på 0,1 ml RPMI 1640-medium. Peptidoppløsninger (0,1 ml) ble tilsatt og platene inkubert ved 37 °C i 30 minutter, 4 timer eller 24 timer. Cytotoksisiteten ble målt ved å anvende MTT-metoden (Mosmann et al, J. Immunol. (1986) 136,2348-2357).

Elektronmikroskopi

Skanningelektronmikroskopi ( SEM)

For skanningelektronmikroskopi ble Meth A-celler dyrket i en 12-brønners kulturplate og behandlet med forskjellige peptider som beskrevet ovenfor. Celler ble fiksert i McDowells fiksativ, etterfiksert i 1% OsC«4, dehydratisert og kritisk punkt tørket i henhold til standardprosedyrer. Cellene ble undersøkt i et "Jeol JSM-5300" skanningmikroskop.

Transmisjonselektronmikroskopi ( TEM)

Meth A-celler ble innhøstet fra 12 kulturplater ved aspirasjon og fiksert i McDowells fiksativ over natten, etterfulgt av etterfiksering, dehydratisering og innleiring i Epon aralditt i henhold til standardprosedyrer. Ultratynnsnitt ble kuttet på en "Reichert Ultracut S" og så kontrastbehandlet i 5% uranylacetat og Reynolds blysitrat. Snittene ble undersøkt i et "Jeol LEM-1010" transmisjonselektronmikroskop.

Forsøksdyr

Spesifikke patogenfrie CB6F1 (Balb/c x C57 BL/6) hunnmus ved ca. 8 ukers alder ble erholdt fra Charles River (Tyskland). Musene ble holdt på standard laboratoriefor og vann. Tumorbærende mus ble skreenet serologisk med hensyn på virus- (LDH, CMV) og mykoplasma-infeksjon, og i alle tilfeller testet negativt.

Tumorer

Meth A er en ikke-adhesiv murin sarkomcellelinje [Sveinbjørnsson et al., (1996) BBRC 223:643-649] som er syngen i Balb/c, og ble holdt in vitro i RPMI 1640 inneholdende 2% kalvefosterserum. Celler i vekstfasen ble innhøstet og vasket i nytt medium og ble injisert subkutant i det abdominale område i musene. Hver mus fikk en enkeltinokulasjon på 5 x IO6 levedyktige tumorceller i RPMI 1640.

Resultater

In vitro

Cytotoksisitet

Laktoferricin B-derivater

A) Meth A

1. Syklisk og lineært LFB

Den cytotoksiske effekt av syklisk og lineært LFB (17-41) på Meth A-celler ble undersøkt. Lineært LFB med cysteinene beskyttet med Acm, drepte Meth A-cellene (lx 10<4>/ml) effektivt ved konsentrasjoner som er høyere enn 0,6 mg/ml etter 4 timers inkubasjon (figur 2). Syklisk LFB som er et enzymatisk spaltet fragment av bovint laktoferrin, drepte effektivt mer enn 99% av cellene ved høyere konsentrasjoner enn 0,8 mg/ml.

2. LFB-derivater

LFB-derivater med forskjellige lengder og modifikasjoner ble testet med hensyn på deres cytotoksiske egenskaper. Meth A-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av de forskjellige LFB-derivatene i 1/2 time og 4 timer. Som vist i figur 3, hadde umodifisert LFB 17-31 ingen signifikant cytotoksisk effekt på Meth A-cellene ved konsentrasjoner opp til 1 mg/ml etter 1/2 times inkubasjon. I dette forsøket hadde det en svak effekt ved 1 mg/ml etter 4 timers inkubasjon (figur 4). Den PMC-modifiserte LFB 17-31-analog drepte tumorcellene ved høyere konsentrasjoner enn 500 fig/ml etter 1/2 times inkubasjon. Den samme konsentrasjonen trengtes for å oppnå effektiv dreping etter 4 timer. Lineært LFB (17-41) modifisert med Pmc, var litt mer effektiv enn Pmc-modifisert LFB 17-31.

I figurene betegner"-" ingen Pmc-modifikasjon, og"+" betegner med Pmc-modifikasjon.

En kortere sekvens LFB 20-29 modifisert med PMC drepte mer enn 90% av cellene ved 250 ug/ml. En LFB 17-31-analog (alaninsubstitusjon i stilling 8) som var modifisert med PMC og N-terminalt Fmoc-beskyttet, var effektiv ved høyere konsentrasjoner enn 100 fig/ml etter 1/2 time og ved 50 ug/ml etter 4 timer. Et Fmoc-beskyttet LFB-peptid (alaninsubstitusjon i stilling 8) drepte mesteparten av cellene ved 250 ug/ml etter 1/2 og 4 timer (figur 5 og 6). Det synes således som om en kombinasjon av Fmoc- og Pmc-modifikasjon økte den cytotoksiske effekt av LFB mer enn hver av de to modifikasjonene alene. Retro-LFB-analogen ble også testet. Retro-Pmc-modifisert LFB 17-31 har også en forøkt cytotoksisk effekt sammenlignet med umodifisert LFB 17-31 (figur 5 og 6).

B) Human promelocyttisk leukemiceUelinje HL60

Den cytotoksiske effekt av LFB 17-41 (PB), LFB 14-31 (Pl), LFB 14-31 Pmc (P2), LFB (P3) 17-31 og LFB 17-31 Pmc (P4) på human-HL 60-celler ble undersøkt. LFB 14-31 og LFB 17-31 oppviste ingen cytotoksisk effekt ved den testede konsentrasjon, mens LFB 17-41 hadde en svak konsentrasjonsavhengig cytotoksisk effekt. LFB 17-31-Pmc-peptid induserte en merkbart sterkere effekt (ca. fem ganger sterkere) enn de øvrige peptidene som ble testet. Se figur 7.

3. EM-undersøkelser

SEM- og TEM-resultatene viser at cellemembranene er sterkt oppbrutt av laktoferricinpeptider, noe som resulterer i effektiv frigjørelse av intracellulært materiale. Lysen synes å være svært hurtig, dvs. innen minutter for de mest effektive peptidene.

In r/ ro

1. Tumorregresjon

Murint Meth A- fibrosarkom

Etter en enkeltinokulasjon av 5 x IO7 levedyktige Meth A-celler ble forskjellige LF-peptider injisert intratumoralt (LFB 14-31, LFB 17-31 Pmc, 500 jig i en 50 (il dose; LFB 17-31,1 000 \ i% i en 50 \ i\ dose), på dag 7 og dag 10. LFB 14-31 ble også injisert intraperitonealt (PBI), 500 (lg/ml. Bare saltoppløsning ble injisert i kontrollmusene (50 (Kl, K2, K3). Tumordiameteren (gjennomsnitt av tverrgående og langsgående) ble målt med en elektronisk krumpasser.

In v/ vo- effekten av LFB 17- 31, LFB 17- 31- Pmc og LFB på murint Meth A- fibrosarkom

Som vist i figur 8, induserte alle tre peptidene som ble testet, LFG 17-31 (PB), LFB 14-31 Pmc (P2), LFB 14-31 (Pl), regresjon av Meth A-tumorene etterbehandling på dag 7 og 10. "Diam.mm" henviser til tumorenes diameter.

Interessant nok ble tumorer også utryddet hos musene som ble behandlet intraperitonealt med LFB 14-31 (PBI). Mus behandlet med saltoppløsning alene, er vist som Kl, K2 ogK3.

Eksempel 2 - Murint melanom B16F10

Etter en enkeltinokulasjon av 5 x IO6 levedyktige B16F10 murine melanomceller ble D-LFB A7-Pmc-NH2injisert intratumoralt i tumorene på dag 10 og 12 (500 (ig/injeksjon i 50 (il saltoppløsning). Saltoppløsning alene ble injisert i kontrollmusene (50 \ >X). Tumordiameteren

(gjennomsnitt av tverrgående og langsgående) ble målt hver andre dag med en elektronisk krumpasser.

In v/ vo- effekten av D- LFB A7- Pmc- NH2 på murint melanom Bl6F10

Som vist i figur 9, var D-LFB A7-Pmc-NH.2 (pep) i stand til effektivt å indusere regresjon av de faste tumorene, y-aksen utgjør diameteren til tumoren i mm. Tre av fem ble totalt utryddet etter bare to injeksjoner. Etter 6 dager etter den første behandling startet én av tumorene å vokse igjen, og 10 dager etter den første behandlingen startet en andre tumor å vokse.

2. Adaptiv immunitet

Etter vellykket behandling av etablerte Meth A-tumorer ble noen mus oppbevart i én måned før reinokulasjon av tumorceller som beskrevet ovenfor. Hos noen av disse musene ble en tredje inokulasjon av tumorceller utført én måned senere enn den andre inokulasjon. Ingen tumorer ble etablert hos disse musene, og musene ble oppbevart i et lengre tidsrom uten noen effekt på den normale tilstand til disse musene.

Eksempel 6

Effekten av kjemisk modifikasjon av et ytterligere, middels aktivt peptid er også blitt undersøkt. Utgangspeptidet er et fragment av bovint laktoferrin som tilsvarer restene 14-31 i den naturlig forekommende sekvens (se tabell 1 i figur 1 for hele sekvensen). Den antimikrobielle aktivitet i form av MIC-verdier mot E. coli og S. aureus, toksisiteten uttrykt som den konsentrasjon som forårsaket 50% hemolyse (EC 50) og antitumoraktiviteten i form av antallet (ig/ml peptid påkrevet for å drepe 50% av Meth A-celler for peptidene, er vist nedenunder i tabell 8.

Som tidligere øker tilstedeværelsen av den voluminøse/lipofile gruppe PMC på én eller flere av tryptofanrestene den antimikrobielle aktivitet og antitumoraktiviteten. Interessant nok er tilstedeværelsen av denne kunstige, voluminøse og lipofile gruppe i stand til selektivt å øke bakteriocidal aktivitet, idet aktivitet mot S. aureus generelt økes mer enn mot E. coli.

Eksempel 7

Tabell 9 viser antibakteriell aktivitet og toksisitetsdata for LFB-baserte peptider som omfatter en ikke-genetisk, voluminøs og lipofil aminosyre i stedet for én av aminosyrene i den naturlig forekommende sekvens. Ytterligere peptider omfatter også en gruppe (PMC) som øker massen og lipofilisiteten til én av de naturlig forekommende tryptofanrester.

I tabellen ovenfor:

Bip = bifenylalanin

Tbt = tri-tert.-butyltryptofan

Nal = 2-naftylalanin

NPS = orto-nitrofenylsulfinyl

NPS-0 = orto-nitrofenylsulfonyl

PMC = 2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl.

Alle peptidene er LFB 17-31 og modifikasjoner derav.

Eksempel 8

Forsøk ble utført for å undersøke effekten av PMC og varierende peptidlengde på antitumoraktivitet og toksisitet (hemolytisk aktivitet).

Resultatene av disse forsøkene er presentert i tabell 10 nedenunder.

Tilstedeværelsen av en PMC-gruppe på én eller flere av tryptofanrestene i et LFB-peptid økte signifikant dets antitumoraktivitet og i et mindre omfang dets hemolytiske aktivitet. Overraskende nok ble det funnet at ved å redusere peptidets lengde økte selektiviteten, dvs. antitumor- versus den hemolytiske aktivitet til peptidet.

Eksempel 9

Modifiserte peptider ble fremstilt for å undersøke effekten av å øke antallet tryptofanrester i magaininavledede, aktive peptider. Resultatene av disse modifikasjonene er vist i tabell 11 nedenunder som har MIC-verdier for typiske bakterier og viser antitumoraktivitet vedHg/ml peptid påkrevet for å drepe 50 % av Meth A-celler.

For peptidene som bare har middels antitumoraktivitet, øker erstatningen av én rest med tryptofans aktivitet signifikant.

Tosmag er allerede svært cytotoksisk, og det er ikke overraskende at aktiviteten ikke øker signifikant ved substitusjon med tryptofan ettersom det erstatter én eller flere fenylalaninrester som i seg selv er voluminøse og lipofile.

Økning av massen og lipofilisiteten til peptidet for mye kan klart være uproduktivt. Dette kan skyldes det faktum at viktige rester erstattes eller det faktum at det er en grense for hvor voluminøs/lipofil sidekjedene i peptidet bør være.

Eksempel 10

Fremgangsmåter for fremstillingen av peptidestere

OMESTRING FRA HARPIKS

Fullstendig beskyttede peptidestere kan fås ved hjelp av basekatalysert omestring fra SASRINTM og Merrifield-lignende harpikser. Gode utbytter er blitt oppnådd med metanol og benzylalkohol. De beste resultatene ble oppnådd ved å anvende enten KCN2 eller LiBr/DBU som katalysator.

Standardfremgangsmåte for KCN-katalysert omestring:

Peptidharpiksen og oppløsningsmidlet som anvendes, må være tørket forsiktig før bruk ettersom alt må kunne motstå langvarig KCN-behandling. Omestring vil inntre selv om oppløseligheten av KCN er lav; gjenværende salt forstyrrer ikke. Peptidharpiksen oppslemmes i en blanding av den ønskede alkohol og samoppløsningsmidlet, f.eks. dimetylacetamid (vanligvis 1:1, 10 ml/g harpiks). Etter 30 minutter tilsettes tilstrekkelig fast KCN slik at det fås en 0,08 M oppløsning (eller minst metning). Etter omrøring i 24 timer frafiltreres harpiksen og vaskes med samoppløsningsmidlet. Katalysatoren må ødelegges umiddelbart, f.eks. ved hjelp av kraftig risting av filtratet med tilstrekkelig, fast, vannfritt FeCl2. Jernblått vil utflokkes, og det får stå for å bunnfelles i ca. 30 minutter og frafiltreres. Filtratet kan forbli grønnaktig. Ytterligere opparbeidelse avhenger av oppløseligheten av produktet, men det bør behandles med vann: Etter fjerning av alkohol og samoppløsningsmiddel tas resten opp i et organisk oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat og kloroform, for videre vandig ekstraksjon for å fjerne salter.

DIREKTE BENZYLFORESTRING AV N-ACYLPEPTIDER

(p-Hydroksyfenyl)benzylmetylsulfoniumderivater (HOBMX) genererer lett benzylkationer som omdanner N-terminalt og sidekjedebeskyttede peptider til deres benzylestere uten racemisering.

Generell fremgangsmåte: Peptidet og kaliumkarbonatet oppløses i diklormetan, og blandingen omrøres ved romtemperatur. Etter 10 minutter tilsettes HOBMC1 til oppløsningen, og den omrøres i 8 timer. Uorganiske salter i reaksjonsblandingen frafiltreres, og filtratet inndampes under vakuum. Resten oppløses i toluen og vaskes med 0,5 M NaOH vandig oppløsning og så med vann. Det organiske lag tørkes over vannfritt natriumsulfat, og filtratet inndampes under vakuum.

Eksempel 11

En serie av ytterligere modifiserte peptider ble fremstilt, basert på murint laktoferrin. I de etterfølgende data (se tabell 12) henviser LFM til restene 17-31 i murint laktoferrin. Kortere peptider er angitt ved hjelp av anførselen hvor f.eks. LFM 17-24 utgjør et 8-mert peptid som tilsvarer aminosyrene i stillingene 17-24 i murint laktoferrin.

Den murine ekvivalent av LFB er generelt mye mindre aktiv enn dens bovine ekvivalent, ved å modifisere peptidet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan imidlertid peptider med svært forøkt antibakteriell aktivitet fremstilles. LFM har ikke en tryptofanrest i 8-stilling, i motsetning til dets mer aktive bovine motpart. Oppfinnerne har identifisert denne resten som viktig for aktiviteten til LFB, og denne substitusjonen av asparagin for tryptofan er derfor blitt gjort.

Denne substitusjonen alene økte ikke signifikant aktiviteten mot bakteriestammene som ble testet. Aktivitet kan økes ytterligere ved å bytte ut én av eller begge de anioniske restene i stillingene 1 og 9 med uendret alanin, eller mer foretrukket, en kationisk rest, slik som arginin.

Ved å inkorporere ytterligere voluminøse/lipofile rester, f.eks. en tyrosinrest i 13-stilling i stedet for det mindre voluminøse valin, og/eller ved å modifisere tryptofanresten ved inkorporering av den mer voluminøse PMC-gruppe, vil det kunne lages peptider med god antimikrobiell aktivitet.

I tillegg ble det overraskende funnet at kortere peptider basert på fragmenter av LFM, var særlig effektive når de ble modifisert til å innføre ytterligere voluminøse/lipofile aminosyrer, f.eks. tryptofan eller tyrosin, og til å øke den totale ladning til peptidet ved å erstatte naturlig forekommende rester med kationiske rester, slik som arginin.

Eksempel 12

Tabell 13 nedenunder illustrerer effekten av ytterligere kjemiske modifikasjoner som gir peptider i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Eksempel 13

Tabell 14 illustrerer den antibakterielle aktivitet samt toksisitet (% hemolyse) med data for ytterligere peptider ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 14

Antibakterielle peptider som er aktive mot bakteriestammer som er blitt påvist å utvise resistens overfor andre antibiotika, er potensielt svært nyttige peptider. Tabell 15 nedenunder gir den antibakterielle aktivitet og toksisitetsdata for noen foretrukne peptider ifølge oppfinnelsen. MRSA er meticillinresistent S. aureus, og MRSE er meticillinresistent S. epidermidis.

I tabell 15 er LFB = LFB 17-31 med mindre annet er angitt. De tidligere identifiserte én- og trebokstavskoder er brukt, og i tillegg er de følgende N-terminale, modifiserende grupper representert:

Bz = benzyl

CHx = sykloheksyl

Ad = adamantyl

Eksempel 15

Tabell 16 nedenunder angir MIC-verdier for flere forskjellige peptider som omfatter en del D-aminosyrer.

Eksempel 16

Cytotoksisitet til peptidene ifølge oppfinnelsen

Den cytotoksiske effekt av peptidene på forskjellige murin- og humantumorceller ble målt ved å anvende MTT-metoden (Mosmann et al., J. Immunol. (1986) 136, 2348-2357). MTT er et oppløselig tetrazoliumsalt som gir en gul oppløsning når den fremstilles i medier eller saltoppløsninger som mangler fenolrødt. Oppløst MTT omdannes til et uoppløselig fiolett formazan ved spalting av tetrazoliumringen ved hjelp av dehydrogenaseenzymer. Dette vann-uoppløselige formazan kan oppløseliggjøres ved å anvende isopropanol eller andre oppløsnings-midler, og det oppløste materiale måles spektrofotometrisk. Absorbansen ble målt som en funksjon av konsentrasjon av omdannet fargestoff.

Omdannelsen av det oppløselige fargestoff til det uoppløselige, fiolette formazan benyttes i analyser for måling av celleproliferasjon. Aktive mitokondriedehydrogenaser fra levende celler forårsaker denne endringen, mens døde celler ikke gjør det.

Vi brukte denne analysen til å måle graden av celledød forårsaket av peptider.

Celler:

Celler ble oppbevart i RPMI-1641-medium inneholdende 10% FBS, 1% L-glutamin og 0,1% penicillin og streptomycin. Celler som skulle anvendes i analysen, ble dyrket til sammenflytning, trypsinert og splittet til enkeltcellesuspensjon, tellet og sentrifugert ved 1 500 rpm i 10 minutter. Cellepelleten ble på nytt oppslemmet til en konsentrasjon på 4 x 105 celler/ml i RPMI-1640 uten FBS og L-glutamin (analysemedium). 100 ml cellesuspensjon ble overført til hver brønn på en 96-brønners mikrotiterplate. Cellene ble stimulert ved å tilsette 100 ml av forskjellige konsentrasjoner av peptider fortynnet med analysemedium til hver brønn. Slutt-konsentrasjonene av peptid var f.eks.: 5,10, 20, 40, 60, 80,100 og 200 mg/ml. På grunn av at det er en to gangers fortynning etter tilsetning av peptidoppløsningen til brønnene som inneholder cellesuspensjonen, måtte peptidoppløsningen lages to ganger konsentrert. Som en negativ kontroll ble bare medium tilsatt til cellene, og som en positiv kontroll (100% dreping) ble 1% "Triton X-100" tilsatt. Etter en inkubasjonsperiode på 4 timer ble 20 ml MTT oppløst i PBS ved en konsentrasjon på 5 mg/ml tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert videre i 2 timer. 130 ml av supernatanten ble så fjernet og 100 ml sur alkohol (0,04-0,1 N HC1 i isopropanol) tilsatt til hver brønn for å oppløse de mørkeblå krystaller. Platen ble plassert på et risteapparat i 1 time og avlest spektrofotometrisk ved 590 nm i en mikrotiterplateavleser under anvendelse av " Softmaxå" -programmet.

Hemolytisk analyse

De hemolytiske aktivitetene til peptidene ble bestemt ved å anvende nyuttatte, røde blodlegemer fra menneske. 8 ml blod ble tatt fra en frisk person. 4 ml blod ble overført til et polykarbonatrør inneholdende heparin inntil en sluttkonsentrasjon på 10 U/ml, og de gjenværende 4 ml blod ble overført til et glassrør inneholdende EDTA med sluttkonsentrasjon på 15% EDTA. Erytrocyttene ble isolert fra heparinbehandlet blod ved hjelp av sentrifugering ved 1 500 rpm i 10 minutter og vasket tre ganger med fosfatbufret saltoppløsning (PBS) for å fjerne plasma og brungult belegg. Cellepelleten ble på nytt oppslemmet i PBS slik at sluttvolumet var 4 ml. Peptidet ble fortynnet inntil en konsentrasjon på 2 mg/ml og 0,1 mg/ml. Peptidet ble fortynnet videre til konsentrasjonene angitt i tabell 1. For hvert rør ble PBS tilsatt først, så RBC-er og peptidoppløsninger. Hematocriten i blodet behandlet med EDTA, ble bestemt etter 30 minutter med "Sysmex K-1000", og de på nytt oppslemmede RBC-er ble fortynnet til 10% hematocrit. RBC-er i PBS (1%) med og uten peptider (tabell 18) ble inkubert i et risteapparat ved 37 °C i 1 time og så sentrifugert ved 4 000 rpm i 5 minutter. Supernatanten ble forsiktig overført til nye polykarbonatrør, og absorbansen til supernatanten ble målt ved 540 nm. Grunnlinje-hemolyse var hemoglobin frigjort i nærvær av PBS, og 100% hemolyse var hemoglobin frigjort i nærvær av 0,1% "Triton X-100".

Eksempel 17

Fasefasepeptidsyntese

Til å begynne med var det anvendte laktoferricin B en gave fra Wayne Bellamy (Nutritional Science Laboratory, Morinaga Milk Industry Co., Ltd., Japan). Alle de øvrige peptidene ble syntetisert på et "9050 Millipore" automatisk peptidsynteseapparat. Generelt settes, ved fastfasesyntese, peptidkjedene sammen fra karboksyenden til aminosyreenden. Den første (C-terminale) aminosyre ble bundet kovalent til en uoppløselig bærer (harpiksen) ved hjelp av en linker (4-hydroksymetylfenoksyeddiksyre). De gjenværende aminosyrer ble tilsatt én etter én inntil peptidsekvensen var fullført.

Ved å anvende Fmoc-metoden ble a-aminoenden av aminosyren midlertidig beskyttet ved hjelp av den baselabile gruppe 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc). Ikke bare a-aminogruppen i aminosyren ble beskyttet. Noen av aminosyrene har reaktive sidekjeder som det er nødvendig å beskytte under syntesen for å forhindre bireaksjoner. Disse beskyttelses-gruppene, bortsett fra cystein, var syrelabile og spaltet etter behandling med TFA (trifluoreddiksyre) og rensemidler (se nedenunder).

Før syntesen ble det til den faste bærer PEG-PS (polyetylenglykolpolystyren-harpiks) tilsatt et lite volum DMF (dimetylformamid), og den fikk stå å svelle i 30 minutter. Emballert i en kolonne ble Fmoc-gruppen fjernet ved behandling med en 20 % piperidin-oppløsning i DMF. Den innkommende, beskyttede aminosyre var nå i stand til å binde seg til den frie aminoende av den harpiksbundne aminosyre med dens karboksyende. Kobling eller acylering inntrer imidlertid ikke spontant, karboksylatet må aktiveres. Dette ble oppnådd ved hjelp av bruken av foraktiverte aminosyrer, slik som pentafluorfenylestere (Pfp), eller aminosyrer med frie karboksylater som er i stand til å reagere med koblingsreagenset HATU (0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat) in situ. Ved å anvende Pfp-estere ble 1,3 ekv. HOBt (1-hydroksybenzotriazol) tilsatt for å katalysere reaksjonen, mens når koblingsreagenset HATU ble anvendt, ble reaksjonen basekatalysert med 2,4 ekv. DIPEA (diisopropyletylamin). Et fire gangers overskudd av aktiverte aminosyrer ble generelt anvendt. Aminosyrene ble oppløst i aktivatoroppløsningen i tilstrekkelig mengde, som beregnet ved hjelp av ekspress-peptidprogrammet.

Aminosyrer ble så avlevert til den bærerbundne aminosyre/det bærerbundne peptid med fullstendig beskyttet a-amingruppe, og resirkulert gjennom den blandede sløyfe for å oppnå peptidbindingsdannelse. Kapasiteten til harpiksen som ble anvendt, varierte fra 0,15 til 0,23 mmol/g, noe som betyr tilgjengelige bindingsseter for de innkommende aminosyrer, hvorfra mengden av aktivatorekvivalenter ble beregnet. Standardkoblingssyklusen for aminosyrer var 30 minutter, med unntak av arginin, isoleucin, treonin, tyrosin, valin og aminosyrene koblet deretter som krevde 60 minutter. Forlengede koblingstider for disse aminosyrene ble valgt på grunn av deres store sidekjeder som er kjent for å forårsake sterisk hindring under koblingsreaksjonen. Når først sammenkobling var fullstendig, ble overskuddet av aminosyreoppløsning og reaksjons-biprodukter fjernet ved vasking med DMF. Den neste syklusen begynte med avblokkering av a- aminogruppen i den N-terminale aminosyre. Fremgangsmåten med a-aminogruppeavblokkering etterfulgt av sammenkobling ble gjentatt i så mange sykluser som var nødvendig for å sette sammen det ønskede peptid.

Etter at syntesen var fullstendig, ble kolonnematerialet overført til en trakt og vasket med metanol (3x) og diklormetan (2x). Avspaltingen av de syrelabile sidekjedebeskyttelsesgruppene og avspalting av peptidene fra den faste bærer ble oppnådd ved å anvende en blanding av 2% anisol, 2% etanditiol, 2% vann og 2% fenol i TFA, og med spaltingstider som ikke var mer enn 4 timer. Den faste bæreren ble så fjernet ved filtrering, filtratet konsentrert under et høyvakuum og peptidet utfelt i dietyleter. Eteroppløsningen som inneholder TFA, ble fjernet under anvendelse av en pasteurpipette, og peptidet ble vasket flere ganger med dietyleter og tørket under et høyvakuum.

Aminosyrederivater:

Fmoc-L-Ala-OPfp

Fmoc-L-Arg(Pmc)-OPfp

Fmoc-L-Cys(Acm)-OPfp

Fmoc-L-Gln-OPfp

Fmoc-L-Glu(OtBu)-OPfp

Fmoc-L-Gly-OPfp

Fmoc-L-Ile-OPfp

Fmoc-L-Leu-OPfp

Fmoc-L-Lys(tBoc)-OPfp

Fmoc-L-Met-OPfp

Fmoc-L-Phe-OPfp

Fmoc-L-Ser(tBu)-OPfp

Fmoc-L-Trp-OPfp

Fmoc-L-Tyr(tBu)-OPfp

Fmoc-L-Val-OPfp

Aminosyrederivater: Aminosyrederivater ble innkjøpt enten fra Bachem, MilliGen/Biosearch (avdeling av Millipore) eller PerSeptive Biosystems. Fenol ble innkjøpt fra Fluka, og anisol ble innkjøpt fra Sigma. DMF-, PIP-, DIPEA-, TFA- og PEG-PS-harpiks ble alle innkjøpt fra PerSeptive Biosystems.

Eksempel 18

Tabell 18 nedenunder viser antitumoraktiviteten og de toksiske dataene for et LFB 14-31-derivat som omfatter én av to ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer i stedet for et Trp, eller som omfatter en gruppe (Pmc) som øker volumet og lipofilisiteten til én av de naturlig forekommende Trp- eller Phe-rester.

Tilstedeværelsen av én av de tre ikke-genetiske modifikasjonene på et LFB 14-31-derivat økte signifikant dets antitumoraktivitet. Det Tbt-modifiserte peptid hadde imidlertid den høyeste hemolytiske aktivitet blant de tre modifiserte analogene som ble testet.

Eksempel 19

Tabell 17 nedenunder viser den antibakterielle aktivitet og antitumoraktiviteten og toksisiteten til ytterligere peptider ifølge oppfinnelsen. Substitusjonene viser særlig hvordan erstatning av tryptofan kan resultere i peptider med fordelaktig lav toksisitet (aktivitet mot røde blodlegemer og normale fibroblaster).

Claims

1. Modifisert 7- til 15-mert peptid med tre eller flere kationiske rester,karakterisert vedat det er i stand til å danne en amfipatisk a-heliks og der cytotoksisiteten er forbedret ved innføring av én eller flere ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyrer hvor R-gruppen i den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre har minst 9 atomer som ikke er hydrogen og har to lukkede ringer med 5 eller 6 atomer, samt estere, amider, salter og sykliske derivater derav, for anvendelse ved behandling av en bakterieinfeksjon eller tumor i en pasient.

2. Peptid for anvendelse ifølge krav 1, hvor den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre er en modifisert tryptofanrest eller fenylalaninrest.

3. Peptid for anvendelse ifølge krav 2, hvor den modifiserte rest er tryptofan som har blitt substituert i posisjon 1 eller 2 i indolringen.

4. Peptid for anvendelse ifølge krav 1, hvor den ikke-genetiske, voluminøse og lipofile aminosyre er utvalgt fra gruppen bestående av 3-benzotienylalanin, 4,4'-bifenylalanin, 3,3-difenylalanin, 1-naftylalanin, 2-naftylalanin, benzyl-tyrosin, sykloheksyltyrosin, 7-benzyloksytryptofan, 3-antracenyl-L-alanin, 3-(2-kinoyl)alanin, p-benzoylfenylalanin, tyroksin og 3,3 ',5 -trij od-L-tyronin.

5. Peptid for anvendelse ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, som også omfatter én eller flere D-aminosyrer.

6. Anvendelse av et peptid som angitt ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, ved fremstilling av et medikament for anvendelse ved behandling av en bakterieinfeksjon eller en tumor i en pasient.