CN106231899A

CN106231899A - 用于处理病原体的试剂和方法

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Publication number: CN106231899A
Application number: CN201580020710.3A
Authority: CN
Inventors: N·范德维登; M·A·安德森
Original assignee: HIRSCHMAN CO Ltd
Current assignee: HIRSCHMAN CO Ltd
Priority date: 2014-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2016-12-14
Also published as: JP2017519720A; WO2015161346A1; EP3133919A1; CA2946166A1; US20170049102A1; AU2015251499B2; US20190327965A1; AU2015251499A1; EP3133919A4; US10231450B2

Abstract

本公开一般地涉及控制人、动物和植物中病原体的感染和侵袭、以及在环境场所中病原体的污染，和其有用的试剂和天然的和合成的制剂和提取物。

Description

用于处理病原体的试剂和方法

申请数据

本申请与2015年4月23日提交的名称为“用于处理病原体的试剂和方法”的澳大利亚临时专利申请号2014901470有关，并要求其优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

背景技术

在说明书的结尾以字母顺序收录了在本说明书中由作者引用的出版物的文献详情。

本说明书中对任何现有技术的引用没有也不应视为承认或以任何形式暗示该现有技术形成了任何国家公知常识的一部分。

病原体感染和侵袭能够导致在人、动物和植物中严重的健康问题。

例如，由植物病原体比如真菌病原体导致的农作物损失，在农业产业中是主要的问题，并且每年数百万美元花费在杀真菌剂的应用，以控制这些损失(Oerke 和Dehne(2004)Crop Protection 23:275-285)。

尽管在人和兽医医学中以及在农业部门中化学病原体剂(pathogenicides)已经是成功的，但关于持续使用化学试剂来控制病原体感染和侵袭有一系列环境和监管问题。这些试剂的使用的增加，还提供了病原体物种中出现耐受性的选择性压力。涉及广泛使用抗生素以治疗人和动物中的感染是尤其值得关注的。显然需要开发可替代的控制人、动物和植物被病原体感染和侵袭的机制。这种需要延伸至在人、动物和植物暴露的土壤和其它环境地点来控制病原体污染。

人、动物和植物进化了多种系统以提供一些针对病原体感染和侵袭的天然保护。同时，在涉及的研究的物种中，已经研究了先天性免疫机制，关于在不同物种之间使用这些系统的成分所知甚少。在植物中，这些成分包括小的、富含二硫键的蛋白，其在植物免疫的组成型和诱导型方面起重要作用。基于它们的半胱氨酸排列，它们能够被分类成家族，包括硫素、蜕皮素、索马甜样蛋白(thaumatin-like protein)、橡胶蛋白(havein)型和knottin型蛋白、脂质转移蛋白、α-发卡蛋白(α-hairpinin)和环蛋白以及防御素。

植物防御素是具有4至5个二硫键的小的(45-54个氨基酸)碱性蛋白(Janssen 等人(2003)Biochemistry 42(27)：8214-8222)。它们共有共同的二硫键模式和共同的结构折叠，其中三链反向平行β-折叠通过3个二硫键连系于α-螺旋，形成半胱氨酸稳定化的αβ基序。第4个二硫键还连接N和C末端，导致极其稳定的结构。已将许多功能归功于防御素，包括抗菌活性、蛋白合成抑制以及α-淀粉酶和蛋白酶抑制(Colilla等人(1990)FEBS Lett 270(1-2):191-194；Bloch和Richardson(1991)FEBS Lett 279(1):101-104)。植物防御素已经在转基因植物中表达，导致对靶标病原体的耐受性增加。例如，对比未转化的对照，表达苜蓿(alfalfa)防御素(MsDef1，以前称作alfAFP)的马铃薯针对真菌病原体大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)显示显著的耐受性(Gao等人(2000)Nat Biotechnol 18(12):1307-1310)。在水稻中大丽花(Dahlia)防御素(DmAMP1)的表达，足以提供针对两种主要的水稻病原体稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)和水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的保护(Jha等人(2009)Transgenic Res 18(1):59-69)。

防御素的结构由7个定义为半胱氨酸残基之间的区域的“环”组成。环1包括第一β-链(1A)以及将该β-链与位于前两个恒定的半胱氨酸残基之间的α-螺旋(1B)相连接的柔性区域的大部分。环2、3和4的开始部分(4A)组成α-螺旋，而剩下的环(4B-7)组成β-链2和3以及连接它们的柔性区域(van der Weerden等人(2013)Cell Mol Life Sci 70(19):3545-3570)。

尽管它们存在保守结构，但植物防御素共有非常低的序列同一性，仅有8个半胱氨酸残基是完全保守的。这些半胱氨酸残基通常称为“恒定的半胱氨酸残基”，因为它们的存在、位置和连通性在防御素间是保守的。基于序列相似性，植物防御素可分类成不同的组。在每一个组内，序列同源性相对较高，然而组间氨基酸相似性低(van der Weerden等人(2013)Cell Mol Life Sci 70(19):3545-3570)。

存在两个主要的类别的植物防御素。I类防御素由内质网(ER)信号序列后跟成熟防御素结构域组成。II类防御素以更大的前体产生，具有约33个氨基酸的C末端前结构域(pro-domain)或前肽(pro-peptide)(CTPP)。目前鉴定的大多数II类防御素是在茄属(Solanaceous)植物物种中发现的。

II类茄属防御素在花组织中表达。它们包括NaD1，其以高浓度在观赏性烟草花烟草(Nicotiana alata)的花中表达(Lay等人(2003)Plant Physiol 131(3):1283-1293)。该肽的抗真菌活性包括对细胞壁的结合、质膜的透化以及肽进入菌丝的细胞质(van derWeerden等人(2008)J Biol Chem 283(21):14445-14452)，并且诱导活性氧(Hayes等人(2014)Cell Mol Life Sci.2014年二月,网上ISSN 1420-682X)。

在棉花中NaD1的表达增强了对真菌病原体尖孢镰刀菌棉花专化型(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)和大丽轮枝菌的耐受性。在实地(field)条件下，表达NaD1的植物的存活可能性是未转化对照植物的两倍，每公顷皮棉(lint)产量翻倍。尽管如此，在表达NaD1的植物中仍存在显著水平的疾病(Gaspar等人(2014)J Exp Bot Feb 6epub)。

II类茄属防御素具有不同程度的抗真菌的活性。一些I类防御素显示极低的抗真菌活性。一些防御素的耐受性的发展也是潜在的问题。迄今，关于防御素对人和动物病原体的作用仅存在有限的研究。

具有高度不同序列的防御素通过不同的作用机制起作用。质膜的透化是在许多防御素中观察到的共同特征。然而，透化的机制和它在细胞死亡中的作用在不同的防御素间不同。一些防御素在高浓度引起膜透化，但是在完全生长抑制所需的浓度则不能。实际上，引起显著的膜透化所需要的这些蛋白的浓度是生长抑制所需要的浓度的约20倍。在生长抑制所需要的浓度的这些蛋白引起轻微的膜透化，但仅在长时间(大于150分钟)之后。这可能是在真菌细胞死亡之后发生。在美国专利申请号12/535,443中描述的细胞非渗透核酸SYTOX[商标]绿色测定，已经成功地用于测量透化的速率和程度。

相比之下，对于一些其它植物防御素，植物防御素NaD1在对应于IC50的浓度导致显著的膜透化。通过NaD1的真菌菌丝的透化在15分钟内开始，并且在80分钟后达到它的最大值(van der Weerden等人(2010)J Biol Chem 285(48):37513-37520)。NaD1在不导致生长抑制的低浓度还导致一些膜透化(van der Weerden et al.(2008)J Biol Chem 283(21):14445-14452)。防御素间透化动力学的不同，可能由蛋白的作用机制的不同导致。因此，在使用透化测定来选择合适的防御素当中有作用。

有需要开发更有效地管理在人、动物和植物中的病原体感染和侵袭的规程。促进病原体的这种控制的能力与减少的化学试剂或抗生素的应用或者不需要这种应用将一起减少环境污染和随之关注的致癌性问题以及减少导致抗生素耐受性的选择性压力。

发明内容

核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO)来表示。SEQ ID NO在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)等。序列标识符的总结提供于表1中。在权利要求书后提供了序列表。

本公开教导了一种方法，其用于抑制病原体的生长、感染、侵袭或污染，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。提及的“非防御素肽”包括除了植物防御素以外的肽。该术语包括“非植物防御素肽”。在一些情况中，所述肽具有抗病原体性能。在其它的情况中，所述肽不具有或具有最低限度的抗病原体活性。

在一个实施方案中，植物防御素或它的功能性天然的或合成的衍生物或变体是透化防御素，如某些I类防御素和茄属II类防御素。实例包括NaD1(Q8GTM0)、TPP3(AAA80496)、PhD1(Q8H6Q1)、PhD1A(SEQ ID NO:47)、PhD2(Q8H6Q0)、FST(p32026)、NoD173(SEQ ID NO:48)、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036。在一个实施方案中，透化防御素是防御素的功能性天然的或合成的衍生物或变体。合成的变体的实例包括来自I类防御素的环1B取代来自茄属II类防御素的环1B。这些包括HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107。

非防御素肽包括4至100个氨基酸残基的肽或0.4至12kD的肽，其特征是α-螺旋肽(例如α-螺旋导管素(cathelicidin)肽)、通过二硫桥接稳定化形成发卡的肽(例如α-发卡蛋白和β-发卡(β-hairpin))、稳定化二硫桥接已被去除的发卡肽(例如α-发卡蛋白和β-发卡)、具有伸展构象的肽，特异性氨基酸残基富集的肽和/或衍生自蛋白酶抑制剂的肽。

α-螺旋肽的实例包括衍生自人或衍生自非人灵长动物或啮齿动物、猪、牛、山羊动物的导管素肽，比如LL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31和KS-30。

α-螺旋肽的实例包括LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30和CP-29。

β-发卡的实例包括牛抗菌肽(bactenecin)、猪抗菌肽(protegrin)、鲎素(tachyplesin)(例如鲎素II)、蝎血素(androctonin)、鲎抗菌肽(polyphemusin)(例如鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I和鲎抗菌肽II)、gomesin、死亡素(thanatin)和brevenin。α-发卡蛋白的实例包括来自植物来源的肽，包括Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、luffin P1、MBP-1、MiAMP2d、C2和VhT1。

通过使用丙氨酸残基或丝氨酸残基取代半胱氨酸残基而去除了β-发卡或α-发卡蛋白二硫键的合成发卡肽的实例包括Bac2A和EcAMP4A。

特异性氨基酸富集的肽的实例是indolicidin。

伸展构象的肽的实例包括Bac2A、EcAMP4A和indolicidin。

当蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂时，衍生自蛋白酶抑制剂的肽的实例包括SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)。

本发明不包括的肽是β-折叠或混合的α-β肽的人和植物防御素。

在本文中出人意料地确定了植物防御素和衍生自非植物来源的肽的组合给予了对人、动物和植物增强的抗病原体性能，并可以用于净化环境场所比如土壤。

尽管以上所述，一些α-发卡蛋白和β-发卡肽在相比在与植物防御素组合使用时的浓度更高的浓度时，它们本身显示对病原体的效力。

所述病原体可以是影响人、动物和/或植物的真菌或微生物。在一个实施方案中，所述病原体是真菌病原体。所述真菌病原体包括酵母和锈菌(rust)。

包括哺乳动物比如人的动物真菌病原体包括以下物种：链格孢属(Alternaeriaspp)、曲霉菌属(Aspergillus spp)、念珠菌属(Candida spp)、镰刀菌属(Fusarium spp)、发癣菌属(Trichophyton spp)、隐球菌属(Cryptococcus spp)、组织胞浆菌属(Histoplasma spp)、小孢子菌属(Microsporum spp)、青霉菌属(Penicillium spp)、肺孢子虫属(Pneumocystis spp)、毛孢子菌属(Trichosporon spp)、丝孢菌属(Scedosporiumspp)、拟青霉属(Paeciliomyces spp)、支顶孢属(Acremonium spp)、葡萄穗霉属(Stachybotrys spp)和暗色霉菌(Dermatiaceous molds)。具体的动物、包括哺乳动物以及尤其是人病原体包括链格孢菌(Alternaria alternata)、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、寄生曲霉菌(Aspergillus paraciticus)、白色念珠菌(Candida albicans)、杜氏念珠菌(Candida dubliniensis)、无名念珠菌(Candidafamata)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、黑马朗念珠菌(Candida haemulonii)、乳酒念珠菌(Candida kefyr)、克鲁斯念珠菌(Candidakrusei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、挪威念珠菌(Candida norvegensis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、维斯念珠菌(Candida viswanathii)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、串珠镰刀菌(Fusariummonoliforme)、红色毛癣菌(Trychophyton rubrum)、须毛癣菌(Trychophytonmentagrophytes)、指间毛癣菌(Trychophyton interdigitales)、断发毛癣菌(Trychophyton tonsurans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、格鲁比隐球菌(Cryptococcus grubii)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、白吉利毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、皮瘤毛孢子菌(Trichosporon inkin)、星状毛孢子菌(Trichosporon asteroides)、皮状毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、龙贡毛孢子菌(Trichosporon domesticum)、粘状毛孢子菌(Trichosporon mucoides)、卵形毛孢子菌(Trichosporon ovoides)、茁芽毛孢子菌(Trichosporon pullulans)、loubieri毛孢子菌(Trichosporon loubieri)、japonicum毛孢子菌(Trichosporon japonicum)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)、多育赛多孢子菌(Scedosporium prolificans)、多变拟青霉(Paecilomyces variotii)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、直立顶孢霉(Acremonium stricutm)、斑替支孢霉(Cladophialophora bantiana)、皮炎外瓶霉(Wangiella dermatitidis)、枝氯霉(Ramichloridium obovoideum)、深褐毛壳菌(Chaetomium atrobrunneum)、Dactlaria gallopavum、双极霉属(Bipolaris spp)、喙状明脐菌(Exserohilum rostratum)以及伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)、印度毛霉菌(Mucor indicus)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、灰色小克银汉霉(Cunninghamellabertholletiae)、屈弯科克霉(Cokeromyces recurvatus)、瓶霉(Saksenaea vasiformis)、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、蛙生蛙粪霉(Basidiobolus ranarum)、冠状耳霉(Conidiobolus coronatus)、异孢耳霉(Conidiobolus incongruus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、posadasii孢子菌(Coccidioides posadasii)、组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、波氏假阿利什霉(Pseudallescheria boydii)和申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。

主要农作物的具体的病原体包括：玉米：玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum))、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、玉蜀黍壳柱孢菌(Stenocarpella maydi)(玉蜀黍色二孢菌(Diplodia maydis))、串珠镰刀菌subglutinans变种(Fusarium moniliforme var.subglutinans)、轮枝镰刀菌(Fusariumverticilloides)、玉蜀黍双极霉菌(Bipolaris maydis)O、T(异旋孢腔菌(Cochliobolisheterostrophus))、大斑病菌(Exserohilum turcicum)I、II和III、玉蜀黍灰斑病菌(Cercospora zeaemaydis)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、禾生腐霉菌(Pythium graminicola)、芨芨草腐霉(Pythium splendens)、终极腐霉菌(Pythium ultimum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、曲霉菌属(Aspergillus spp)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、玉米长蠕孢(Helminthosporiumcarbonum)I、II和III(玉米旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum))、pedicellatum长蠕孢(Helminthosporium pedicellatum)、玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis)、玉蜀黍叶点霉菌(Phyllosticta maydis)、玉蜀黍球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢菌(Cercosporasorghi)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago zeae)、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)、菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、稻黑孢(Nigrospora oryzae)、分支孢子菌(Cladosporium herbarium)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、不等弯孢菌(Curvularia inaequalis)、变淡弯孢菌(Curvularia pallescens)、绿色木霉菌(Trichoderma viride)、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、大孢色二孢(Diplodiamacrospora)、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、玉蜀黍指霜霉(Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)、玉米壳锈菌(Physopella zeae)、玉蜀黍头孢霉(Cephalosporum maydis)、枝顶孢头孢霉(Cephalosporum acremonium)；大豆：virgululiforme镰刀菌(Fusarium virgululiforme)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、南美大豆猝死综合症镰刀菌(Fusarium tucumaniae)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、大雄疫霉大豆专化型(Phytophthora megasperma f.sp.glycinea)、大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、菜豆间座壳大豆变种(Diaporthephaseolorum var.sojae)(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae))、菜豆间座壳北方大豆变种(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)、白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、紫斑病菌(Cercospora kikuchii)、大豆灰斑病菌(Cercospora sojina)、霜霉病菌(Peronosporamanshurica)、黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)(平头炭疽菌(Colletotrichumtruncatum))、黄瓜棒孢叶斑病(Corynespora cassiicola)、大豆壳针孢(Septoriaglycines)、sojicola叶点霉(Phyllosticta sojicola)、链格孢菌(Alternariaalternata)、白花蛇舌草叉丝壳(Microsphaera diffusa)、半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)、大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆丛殻菌(Glomerellaglycines)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、终极腐霉菌(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)；油菜：白锈病菌(Albugo candida)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、终极腐霉菌(Pythium ultimum)、霜霉病菌(Peronospora parasitica)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、链格孢菌(Alternaria alternata)；棉花：尖孢镰刀菌棉花专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)、大孢链格孢(Alternaria macrospora)、棉尾孢菌(Cercospora gossypina)、甜菜茎点霉(Phomaexigua)(棉花茎枯病菌(Ascochyta gossypii))、腐霉属水稻纹枯病菌(Pythium sppRhizoctonia solani)、scheddardii柄锈菌(Puccinia scheddardii)、棉花柄锈菌(Puccinia cacabata)、棉根腐病菌(Phymatotrichopsis omnivore)；油菜：十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、brasicicola链格孢(Alternaria brasicicola)、甘蓝根肿菌(Plasmodiophora brassicae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、镰刀菌属(Fusariumspp)、腐霉菌属(Pythium spp)、疫霉属(Phytophthora spp)、链格孢属(Alternaria spp)、霜霉病菌(Peronospora parasitica)、瘦果球腔菌(Mycosphaerella capsellae)(瘦果假尾孢(Pseudocercosporella capsellae))、白锈病菌(Albugo candida)、大雄疫霉变种(Phytophtohora megasperma var.megasperma)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、十字花科白粉菌(Erysiphe cruciferarum)；小麦：禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)、威勒加叶斑病菌(Drechslera wirreganensis)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、燕麦壳针孢小麦专化型(Phaeosphaeria avenaria f.sp.triticea)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)、布氏白粉菌小麦专化型(Blumeria graminis f.sp.tritici)、冰草黑粉菌(Urocystis agropyri)、链格孢菌(Alternaria alternata)、腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、伪禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)、小麦黑粉菌(Ustilago tritici)、小麦壳二孢(Ascochytatritici)、禾谷头孢霉(Cephalosporium gramineum)、禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、白粉病菌小麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、禾柄锈菌小麦专化型(Puccinia graminis f.sp.tritici)、隐匿柄锈菌小麦专化型(Pucciniarecondita f.sp.tritici)、条锈菌(Puccinia striiformis)、叶锈菌(Pucciniatriticina)、大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)、冰草黑粉菌(Urocystisagropyri)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)、小麦不孕病菌(Pyrenophorasemeniperda)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)、叶枯壳针孢(Septoria nodorum)、小麦壳针孢(Septoria tritici)、avenae壳针孢(Septoria avenae)、herpotrichoides假尾孢(Pseudocercosporella herpotrichoides)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminisvar.tritici)、腐霉菌属(Pythium spp)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、arrhenomannes腐霉菌(Pythium arrhenomannes)、gramicola腐霉菌(Pythiumgramicola)、终极腐霉菌(Pythium ultimum)、根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、Tapesia yallundae、小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)、光滑腥黑粉菌(Tilletia laevis)、龋齿腥黑粉菌(Tilletia caries)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、小麦黑粉菌(Ustilago tritici)、Wojnowicia graminis、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)；高粱：大斑病菌(Exserohilum turcicum)、sublineolum炭疽菌(Colletotrichum sublineolum)、高粱尾孢菌(Cercospora sorghi)、高粱胶尾孢(Gloeocercospora sorghi)、高粱壳二孢(Ascochyta sorghina)、紫柄锈菌(Pucciniapurpurea)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、Perconia circinata、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、链格孢菌(Alternaria alternata)、高粱双极霉(Bipolarissorghicola)、高粱长蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、新月弯孢霉(Curvularialunata)、高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱座枝孢(Ramulispora sorghicola)、Phyllachara saccari、丝黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)(丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))、黑穗病菌(Sphacelothecacruenta)、高粱黑穗病菌(Sporisorium sorghi)、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、枝顶孢霉(Acremonium strictum)、大孢指疫霉(Sclerophthona macrospora)、高粱霜霉病菌(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、arrhenomanes腐霉菌(Pythium arrhenomanes)、禾生腐霉菌(Pythium graminicola)；向日葵：向日葵霜霉病菌(Plasmopara halstedii)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、向日葵褐斑病菌(Septoria helianthi)、向日葵茎拟茎点霉(Phomopsis helianthi)、向日葵链格孢(Alternaria helianthi)、百日草链格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、黑茎病茎点霉(Phoma macdonaldii)、菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)、菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄锈菌(Pucciniahelianthe)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、枝顶孢头孢霉(Cephalosporumacremonium)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆罗门参白锈菌(Albugotragopogonis)；苜蓿：终极腐霉菌(Pythium ultimum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、芨芨草腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、三叶草霜霉(Peronosporatrifoliorum)、茎点霉苜蓿变种(Phoma medicaginis var.medicaginis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、苜蓿轮枝菌(Verticillium albo-atrum)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、草色匍柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)、刺盘孢(Colletotrichumtrifolii)、Leptosphaerulina briosiana、苜蓿单胞锈菌(Uromyces striatus)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)、苜蓿壳多孢(Stagonospora meliloti)、匍柄霉(Stemphylium botryosum)和苜蓿纤毛菌(Leptotrichila medicaginis)。

所述防御素和非防御素肽可以局部地应用至人、动物或植物，或者系统地施用至人或动物，或者一种或两种能够在经基因工程化以生产防御素和/或肽的植物中表达。在一个实施方案中，一种在植物中表达，另一种局部地应用。在另一个实施方案中，一种或两种在经基因修饰的微生物中表达，然后应用至植物种子。这是对于保护植物根和种子免受真菌或微生物侵袭尤其有用的。在另一个实施方案中，净化材料比如土壤或固体表面比如门把手或桌面或其它环境场所，或者通过以组合使用防御素和肽针对目前的或潜在的未来的病原体污染进行消毒。

本文中还教导了一种制剂或提取物，其包含防御素和非防御素肽两种，或者制剂或提取物的组合，每种包含防御素或肽之一。然后在使用前或期间将所述制剂组合。此外，提取物可以含有防御素或肽之一以及添加到提取物的其它成分。因此，植物和微生物提取物以比如草本制剂和天然的沐浴露和洗发水的形式形成本发明的一部分。

本文中提供了植物防御素和非防御素肽在制备用于治疗或预防人、动物或植物的病原体侵袭或者在材料中或上的病原体污染的药物的用途。本文还教导了一种植物防御素和非防御素肽，其用于治疗或预防人、动物或植物的病原体侵袭或者材料中或上的病原体污染。

本文中还提供了α-发卡蛋白或β-发卡在制备用于治疗或预防人、动物或植物的病原体侵袭或者在材料中或上的病原体污染的药物中的用途。本文还教导了α-发卡蛋白或β-发卡，其用于治疗或预防人、动物或植物的病原体侵袭或者在材料中或上的病原体污染。涉及这个方面，α-发卡蛋白或β-发卡的浓度大于当与植物防御素组合使用时的浓度。

待治疗的植物包括农作物植物、观赏植物、有花植物、树、灌木和草。就这一点而言，本公开延伸至基因修饰的(转基因的)植物和它们的后代。这些植物经工程化以表达防御素和非防御素肽，二者不是在植物中天然表达的，或者可选择地，在非工程化的植物中没有以需要的水平表达。在另一个实施方案中，所述转基因植物表达非防御素肽。在使用中，防御素被外源性地提供给该植物。在外源性提供防御素的情况中，然后植物还可以天然地生产防御素。待治疗的动物包括农场动物、伴侣动物、实验室测试动物和野生动物。能够被治疗的人包括任何年龄的人。能够被处理的材料包括土壤、环境样本、门把手和桌面。

本文中还涉及一种分离的微生物，所述微生物经工程化以表达防御素和/或非防御素肽的一种或另一种或两种。本文中还教导了包含微生物混合物的组合物，所述微生物每种生产防御素和防御素肽的一种或另一种或两种。这种组合物是对治疗人、动物和植物以及在原位植物的种子和根是有用的。可选择地，防御素和/或肽是作为细胞提取物提供的，包括植物提取物或微生物提取物。

本文中还教导了一种试剂盒，其包含隔室，每个所述隔室含有植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体或者非防御素肽的至少一种。本文中还涉及检测合适的防御素、肽和最佳浓度的测定。所述试剂盒还可以包括经基因工程化的微生物或者细胞提取物，所述经基因工程化的微生物表达防御素或非防御素肽的一种或另一种或两种。

表1

序列标识符的总结

附图说明

一些附图含有彩色的表示或实体。彩色图片根据请求从专利权人或从合适的专利局获得。如果从专利局获得可能征收费用。

图1是使用NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008和DMAMP1处理，尖孢镰刀菌棉花专化型(Fov)对绿色核酸荧光染料SYTOX绿色[商标]的相对摄取的图示。还可以参考表2。

图2是使用NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008、HXL009、HXL013、HXL021、hordothionin和RSAFP2处理的禾谷镰刀菌(Fgr)对绿色核酸荧光染料SYTOX绿色[商标]的相对摄取的图示。还可以参考表3。

具体实施方式

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含”或变化形式比如“包括”或“含有”应理解为意指包括所述的要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组，但是不排除任何要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组。

如本说明书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数方面，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及的“防御素”包括单一防御素，以及两种或更多种防御素；提及的“一种试剂”包括单一试剂，以及两种或更多种试剂；提及的“本公开”包括本公开教导的单一和多方面等。术语“发明”包括本文中所教导的和提供的方面。在本发明的范围内提供了所有这些方面。

开发了一种规程以促进在人和动物受试者中和在植物中病原体感染和侵袭的管理，以及在环境场所中控制病原体污染。该规程包括使用植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非植物防御素肽。本文中提出了植物防御素和肽以协同作用提供针对感染人或动物受试者或植物的病原体或者污染环境地点的病原体有效的处理和预防的规程。所述肽是除植物防御素以外的肽，称为非防御素肽或非植物防御素肽。此外，在一个实施方案中，所述非防御素肽具有抗病原体性能。在另一个实施方案中，所述肽其本身不具有或具有最低限度的抗病原体活性。

因此，本文中提供了一种方法，其用于抑制病原体的生长、感染、侵袭或污染，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非植物防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。为了方便，人、动物或植物受试者还可以称为“宿主”。所述防御素和肽各自还可以被称作“试剂(agent)”或统称为“试剂(agents)”。

根据本发明，给定的防御素或肽单独的抑制作用当二者一起使用时相比单独使用时更高。Greco等人(1995)Pharmacol Rev.47:331-385定义了一类协同，其基于相对于单独测定每种时的叠加作用，在组合中使用两种试剂具有更高的活性。因此，倘若两种试剂一起作用的组合作用大于个体试剂单独作用之和，在本文中采用的定义包括所有这样的情况。此外，如果存在一组条件，包括但不限于浓度，当一起作用的试剂的组合作用大于个体成分单独作用之和时，试剂的组合被认为是协同的，如在本文中意旨的术语。Richer(1987)Pestic Sci 19:309-315描述了一种数学方法以建立协同的证据。这种方法使用Limpel公式，用于比较观察到的两种抑制剂试剂X和Y组合存在时的抑制水平(Io)，和测量它们组合作用时所使用的相同的各自浓度独立作用的X或Y各自产生的预期的叠加作用(Ee)。叠加抑制百分率Ee以X+Y-XY/100计算，其中，X和Y以抑制百分率表示。当Io>Ee时存在协同。应注意的是，非防御素肽其本身可以显示或可以不显示抗病原体性能。

协同可以以协同标度(scale)来表示。在一个实施方案中，不超过14的值代表无显著协同，比如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14；从15至29的值代表低协同，比如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29；从30至60的值代表中等协同，比如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60；大于60的值代表高度协同。“大于60”包括从61至100(包括61、70、80、90和100)以及之间的任何值。

如前所述，当公开的规程内的两种或更多种试剂产生组合的作用大于每种试剂单独作用的个体作用总和时，发生“协同作用”。这包括非防御素肽其本身不显示抗病原体性能的情况。该作用可以是效力、稳定性、速率和/或毒性水平中的一种或多种。如本文中所描述的，在其它方面等同的条件下，在至少一种植物防御素和至少一种肽抑制的组合存在下测量时病原体生长抑制大于在特定浓度范围的每种试剂(防御素和肽)单独地存在下测量的抑制之和时，病原体的生长抑制被认为是协同的。应当理解，无需用两种试剂的每一种浓度组合观察到超过叠加作用，才视为协同。可以在特定浓度组合而不在其它中观察到两种试剂的协同作用。例如，如果进入病原体限制毒性，那么防御素的存在能够导致协同，尤其是如果肽的浓度就抑制而言是次于最大的。在一个实施方案中，防御素和肽一种或两种的浓度是次于最大的。同样，如果一种或两种成分以如此高的水平(最大限度水平)存在，从而导致最大可观察的抑制，那么协同可以被掩蔽。防御素-非防御素肽组合的一般系统因此被称为“协同的”，因为存在协同作用的可能性，即使协同不是在所有条件下都被观察到。至少对于某些剂量，植物防御素和肽之间的协同提供比通过任一成分的单独作用能够获得的更大的病原体抑制。在某些情况下，防御素或肽中的一种并不是可测量地有效针对特定病原体，直至与另一种组合。因此，本发明提供了增加的宿主免受病原体侵袭的保护，这伴随对化学病原体剂或抗生素依赖性的减少。这意味着对人和动物健康系统和植物种植者的投入成本减少，针对病原体的更广泛的活性谱，和抗生素耐受性的环境破坏或传播的可能性减少。因此，涉及后者，发展成病原体剂耐受性的病原体株的选择压力极大减少，这允许试剂的商业寿命延长以及耐受性病原体的增殖减少和出现多重耐受性病原体株的可能性减少。

“病原体抑制”包括杀病原体(pathogenicidic)和病原体抑制活性，如通过与对照相比病原体生长的减少(或丧失活力)所测量的。根据病原体，病原体的生长能够通过本领域已知的很多不同的方法测量。例如，一种测量丝状真菌生长的通常使用的方法必须在合适的生长介质中萌发孢子，孵育足以实现可测量生长的时间，并且在具体的孵育时间之后测量在培养物中增加的光密度。光密度随生长的增加而提高。典型地，真菌生长是发病必须的。因此，抑制病原体生长提供了真菌疾病的保护的合适的指示，即抑制越强，保护越有效。使用商业试剂盒能够测量细胞活力，所述商业试剂盒依赖比色染料，比如MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐)或刃天青(7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮-10-氧化物)，或者通过将细胞接种在琼脂板上并计数出现的菌落形成单位的数量。使用饲养试验能够很容易实现昆虫的抑制。杀菌剂活性可以在固体琼脂或在液体培养中测量。

本文中的“预防感染”指与未暴露于防御素或肽或二者的宿主相比时，接受防御素和非防御素肽试剂的组合处理的人、动物或植物宿主避免了病原体感染或疾病症状或以上所有，或者表现出减少或最低限度的或较不频繁的病原体感染或疾病症状或以上所有，而所述病原体感染或疾病症状或以上所有是宿主-病原体相互作用的天然结果。也就是说，预防或减少病原体引起的疾病和/或相关疾病症状。与未如此经本文中教导的规程治疗的宿主相比，感染和/或症状减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％或更多。抑制百分率能够通过任何适合于宿主和病原体的方便方法而确定。

因此，防御素和肽试剂的组合作用是抑制病原体生长、复制、感染和/或保持，以及其它抑制活性和/或诱导病原体感染或侵袭的症状的改善。

植物保护(疾病耐受性或减少)能够通过本领域已知的方法评估。参见，Uknes等人(1993)Molecular Plant Microbe Interaction 6:680-685；Gorlach等人(1996)PlantCell 8:629-643；Alexander等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:7327-7371。技术人员将意识到用于确定植物病原体的植物感染和疾病的方法取决于待测试的病原体和植物。人和动物保护(疾病预防或治疗)起初能够使用体外实验室测定来测试(例如病原体抑制测定)，接着动物研究和最终的人临床试验。

“接触”包括在局部或系统的施用或应用至人或动物受试者或者在植物中或上局部应用或表达或者在环境地点引入试剂的组合之后，将病原体暴露于防御素和非防御素肽的组合。接触可以使用天然地含有防御素或肽的植物或细胞提取物，或者已经经工程化以生产防御素或肽的一种或另一种的植物或细胞提取物。植物提取物包括草本制剂和提取物比如天然的沐浴露和洗发水。因此，防御素和肽可以被局部地应用到人或动物受试者或植物的表面区域，或者它们可以被系统地施用至人或动物受试者，或者一种或另一种或两种可以在经基因修饰以生产防御素和/或肽的植物中表达。可选择地，涉及植物，防御素或肽之一可以被局部地应用到植物，防御素或肽的另一种可以通过经基因工程化以生产防御素或肽的植物表达。可选择地，内源性防御素的表达水平被提高至足够的水平，以便有效的与表达的肽或外源性地提供的肽组合。可选择地，防御素和肽被分散在环境地点，比如土壤或无生命物体的表面(例如门把手)。在一个实施方案中，防御素可以被外源性地提供给植物或植物种子，即使该植物可以生产相同的防御素。

在一个可选的实施方案中，微生物或植物细胞经基因工程化以表达防御素和肽的一种或另一种或两种。这些微生物或微生物的混合物或植物细胞或其提取物作为种子涂覆组合物、根定植(colonizing)组合物和净化土壤组合物是有用的，其可以通过喷雾或混合至土壤等应用。

在一个实施方案中，所述防御素和非防御素肽一起制剂，比如在局部制剂、洗发水或沐浴露溶液、种子涂覆制剂、根制剂或者适合系统施用至合适的宿主的制剂中。还可以应用表达防御素和/或肽的一种或两种的微生物混合物。局部制剂包括水溶液、液体制剂、补剂(tonic)、洗剂、喷雾、涂剂、粉剂、分散剂、雾化制剂、冲洗剂(douche)、霜剂、膏剂、唇膏、凝胶、泥、糊剂、贴片、浸渍绷带等。本文中还涉及包含防御素和肽一种或另一种或两种的植物提取物，包括向其中添加防御素或肽的一种或另一种的植物提取物。

本文中提供了一种制剂，其包含植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非防御素肽，用于抑制在人或动物受试者或植物中或上的病原体的生长或侵袭。

本文中还提供了一种制剂，其包含植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非防御素肽，用于在包含病原体或具有被病原体污染可能的材料或其它环境场所的表面或之中来抑制病原体的生长或侵袭。环境场所包括土壤、植物根球周围的环境和无生命物体的表面，比如门把手、地面和桌面。

在一个实施方案中，本文中教导了一种治疗试剂盒，其包含多个隔室，其中第一隔室包含植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体，第二隔室包含非防御素肽，以及任选地第三或另外的隔室，其包含赋形剂、载体或稀释剂，其中在使用中，在向人或动物受试者或植物或表面或包含病原体或具有被病原体污染可能的材料应用之前或期间，使第一和第二隔室的内含物混合。所述试剂盒还可以含有比如冷冻干燥形式的微生物，其在使用前重建。微生物被工程化以表达防御素和/或肽的一种或另一种或两种。可选择地，所述试剂盒包含细胞提取物，其包含防御素和/或肽。

本文中描述了并提供了一种防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非防御素肽，用于抑制病原体生长或侵袭或病原体污染，以组合使用的防御素和肽以便协同作用。

除非上下文另外明确指出，提及的“植物防御素”包括其功能性天然的或合成的衍生物或变体。本文中涉及的防御素的合适的实例包括透化防御素、茄属II类防御素和其功能性天然的或合成的衍生物或变体。

本文中所使用的防御素根据其来源在本文中可以指“天然存在的”防御素、“经修饰的”防御素、“变体”防御素、“突变的”防御素或“嵌合的”防御素。

在一个实施方案中，所述透化防御素是II类茄属防御素。在一个实施方案中，防御素在第一β-链(β-链1)和防御素的N末端部α-螺旋之间的环区域经修饰。在一个实施方案中，所述环区域包含第二恒定半胱氨酸残基的6个氨基酸N末端或其等价物。这个区域定义为“环1B”。II类茄属防御素与其它防御素的区别在于成熟结构域相对保守的C末端部。提及的“II类茄属防御素”包括与NaD1成熟结构域的C末端部具有至少70％氨基酸序列相似的任何防御素，NaD1的C末端部分包含结尾的大约20个连续的氨基酸残基，并且包括NaD1成熟结构域中最C末端的恒定半胱氨酸(例如，SEQ ID NO:1)。“至少70％”指至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。

在一个实施方案中，在II类茄属防御素中的环1B氨基酸序列被修饰为序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆(SEQ ID NO:2)，其中：

X₁是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式；

X₂是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式；

X₃是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式；

X₄是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式；

X₅是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式；和/或

X₆是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式；

使用单字母氨基酸命名法，其中，氨基酸序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆不对应于来自修饰前II类茄属防御素的环1B区域的氨基酸序列。

在一个实施方案中，在II类茄属防御素中的环1B序列被修饰为序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆(SEQ ID NO:3)，其中：

X₁是N、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、S或R；

X₂是K、R、G、H、L、N、F、I、S、T或Y；

X₃是W、Y、H、L、G、F或P；

X₄是P、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、D或G；

X₅是S、K、Y、F、G或H；和/或

X₆是P、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、I或Y；

其中，氨基酸序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆不对应于来自修饰前II类茄属防御素的环1B区域的氨基酸序列。

在一个实施方案中，在II类茄属防御素中的环1B序列被修饰为序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆(SEQ ID NO:4)，其中：

X₁是N、H、Q、D、K或E；

X₂是R、H、T、K或G；

X₃是F、H、Y或W；

X₄是P、K、S或R；

X₅是G或F；和

X₆是P、V、I或N；

提及的“X₁X₂X₃X₄X₅X₆”指对应于环1B区域的6个连续的氨基酸残基。

在一个实施方案中，人工创建的或修饰的防御素包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在这个序列中，环1B区域被定义为X₁X ₂X₃X₄X₅X₆，其中：

X₁是选自以下的氨基酸：L、F、S、I、A、H、Y、Q、D、K或G；

X₂是选自以下的氨基酸：S、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、H或G；

X₃是选自以下的氨基酸：A、F、W、N、I、S、Y、P、L或H；

X₄是选自以下的氨基酸：K、G、E、R、A、P、F、Q、V或S；

X₅是选自以下的氨基酸：M、G、K、D、S、Y、P、E、N或F；和

X₆是选自以下的氨基酸：V、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、I或N。

在一个实施方案中，人工创建的或修饰的防御素包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在这个序列中，环1B区域被定义为X₁X ₂X₃X₄X₅X₆，其中：

X₁是选自以下的氨基酸：N、H、Q、D、K或E；

X₂是选自以下的氨基酸：R、H、T、K或G；

X₃是选自以下的氨基酸：F、H、Y或W；

X₄是选自以下的氨基酸：P、K、S或R；

X₅是选自以下的氨基酸：G或F；和

X₆是选自以下的氨基酸：P、V、I或N。

在NaD1的情况中，II类茄属防御素，环1B氨基酸序列是NTFPGI(SEQ ID NO:7)。因此，NTFPGI被修饰从而N被A、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式之一取代；T被A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式之一取代；F被A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式之一取代；P被A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式之一取代；G被A、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V或其天然存在的经修饰的形式之一取代；和/或I被A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V取代；附带条件是环1B氨基酸序列不对应于来自NaD1的环1B。环1B序列可以具有单一氨基酸改变，或者2个或3个或4个或5个或所有6个氨基酸被改变。

II类茄属防御素可以通过单独的环1B区域任何数量的氨基酸改变，或者与其它突变组合来修饰。其它突变包括氨基酸置换、添加和/或缺失。环1B区域以外的突变可以从1至约50编号。“改变”包括从一种防御素的环1B区域嫁接取代II类茄属防御素环1B区域。来源可以是I类茄属防御素环1B，或者来自另一个II类防御素的环1B。这些方面基于这样的附带条件，即保持了针对至少一种植物或动物病原体的组合使用的经修饰的防御素和肽的增强的抗病原体活性。在一个实施方案中，在活性、稳定性和/或透化的水平或范围方面，相对于修饰前的II类防御素，抗病原体活性是增强的。在一个实施方案中，在活性、稳定性和/或透化的水平或范围方面，相对于II类防御素的修饰之前的肽，抗病原体活性是增强的。

因此，本文中包括人工创建的防御素的用途，所述人工创建的防御素包含经修饰的II类茄属防御素骨架，其中在N末端部的β-链1和α-螺旋之间的环区域是通过单一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失修饰的，以产生具有抗病原体活性的变体防御素。在一个实施方案中，所述环区域是环1B，其定义为N末端至第二恒定半胱氨酸残基的6个氨基酸残基。本文中涉及在任何防御素中它的等价区域。

合适的防御素的实例包括NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001(SEQID NO:25)、HXL002(SEQ ID NO:26)、HXL004(SEQ ID NO:27)、HXL007(SEQ ID NO:28)、HXL008(SEQ ID NO:29)、HXL012(SEQ ID NO:32)、HXL013(SEQ ID NO:30)、HXL015(SEQ IDNO:31)、HXL035(SEQ ID NO:33)和HXL036(SEQ ID NO:34)。合成的防御素变体的实例包括HXP4(SEQ ID NO:8)、HXP34(SEQ ID NO:15)和HXP35(SEQ ID NO:16)。变体防御素的其它实例包括HXP37(SEQ ID NO:17)、HXP58(SEQ ID NO:18)、HXP72(SEQ ID NO:19)、HXP91(SEQID NO:20)、HXP92(SEQ ID NO:21)、HXP95(SEQ ID NO:22)和HXP107(SEQ ID NO:23)。

本文中教导了一种用于抑制病原体的生长或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和具有抗病原体性能的肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

提及的“具有抗病原体性能的肽”包括长度从4个至100个氨基酸残基的肽，包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基，或者大小从0.4至12kD的肽，比如0.4、0.5、0.6、07、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12kD。

肽是除植物防御素肽以外的肽，包括4至100个氨基酸残基的肽或0.4至12kD的肽，其特征是α-螺旋肽(例如α-螺旋导管素肽)、通过二硫桥接稳定化形成发卡的肽(例如α-发卡蛋白和β-发卡)、具有伸展构象的肽，特异性氨基酸残基富集的肽和/或衍生自蛋白酶抑制剂的肽。非植物防御素肽其本身可以显示或可以不显示抗病原体活性。属于导管素家族的抗微生物肽的序列和结构是极其多变的，能够形成α-螺旋、β-发卡或伸展的构象。导管素以具有N末端前序列的前体蛋白表达。这个序列的约100个氨基酸还与一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白凯萨林(cathelin)相关。这个凯萨林样结构域被切割以释放成熟的导管素肽。α-发卡蛋白是小的(33至51个氨基酸)肽，其特征在于被10至13个氨基酸分开的两个CXXXC基序。α-发卡蛋白的结构特征在于两个α螺旋区域，每个含有一个CXXC基序，伴有中间的环区域。在CXXXC基序之间形成两个二硫键，以形成稳定的发卡结构。

β-发卡的实例包括牛抗菌肽、猪抗菌肽、鲎素(例如鲎素II)、蝎血素、鲎抗菌肽(比如鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I和鲎抗菌肽II)、gomesin、死亡素和brevenin。α-发卡蛋白的实例包括来自植物来源的肽，包括Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、luffin P1、MBP-1、MiAMP2d、C2和VhT1。

伸展构象肽的实例包括indolicidin、Bac2A和EcAMP4A。这些包括合成的发卡肽，比如Bac2A和EcAMP4A，其β-发卡或α-发卡蛋白的二硫键通过使用丙氨酸残基取代半胱氨酸残基而去除。

特异性氨基酸富集的肽的实例是indolicidin。

一些α-发卡蛋白和β-发卡肽在相比在与植物防御素组合使用的浓度更高的浓度时，它们本身显示对病原体的效力。一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的α-发卡蛋白和β-发卡或其功能性天然的或合成的衍生物或变体接触，所述α-发卡蛋白和β-发卡或其功能性天然的或合成的衍生物或变体的浓度高于在与植物防御素组合使用时抑制生长或感染或侵袭所需要的浓度。在一个实施方案中，如本文中所定义的，所述病原体是真菌病原体。在一个实施方案中，所述真菌病原体选自镰刀菌属(Fusarium sp)、毛盘孢属(Colletotrichum sp)、酵母菌属(Saccharomyces sp)、念珠菌属(Candida sp)和毛癣菌属(Trichophyton sp)。在一个实施方案中，真菌病原体是禾谷镰刀菌、禾生炭疽菌、酿酒酵母、白色念珠菌和红色毛癣菌。α-发卡蛋白和β-发卡的实例包括但不限于CilHPN_14F、OsaHPN_86B、SitHPN_100A、SbiHPN_104C、SbiHPN_104I、EcAMP1、蝎血素和鲎抗菌肽I。

所述肽不是防御素，被称为非防御素肽或非植物防御素肽。它本身可以显示或不显示抗病原体性能。肽可以从标准的商业来源获得，包括化学合成的肽。

本文中教导了一种用于抑制病原体的生长或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)、CC7(71-104)、牛抗菌肽、Bac2A、indolicidin和CP-29的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

如前所述，所述病原体选自真菌和微生物。

本文中教导了一种用于抑制真菌病原体的生长或侵袭的方法，所述方法包含使真菌病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)、CC7(71-104)、牛抗菌肽、Bac2A、indolicidin和CP-29的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

本文中教导了一种用于抑制微生物病原体的生长或侵袭的方法，所述方法包含使微生物病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)、CC7(71-104)、牛抗菌肽、Bac2A、indolicidin和CP-29的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

本方法在具有病原体感染或侵袭的受试者的治疗或预防中或者含有病原体的材料的净化中是有用的。术语“受试者”包括任何年龄的人，或者动物，比如农场动物(例如羊、猪、马、牛、驴、骆驼、羊驼或家禽鸟(例如鸡、鸭、火鸡、野鸡、孔雀))、伴侣动物(例如狗或猫)、实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠或仓鼠)或者圈养的野生动物(例如袋鼠、袋獾或野生猫科动物)。“人”或“动物”包括其部分，比如手指、脚趾、指甲、眼、耳、嘴、皮肤和头皮。

受试者还包括植物比如农作物植物、观赏植物、有花植物或者认为是特定国家或地区本地或本土的植物(例如桉树)。提及的“植物”包括完整植物及其部分，包括但不限于芽、营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及其后代。可以使用本发明的规程加以保护的植物包括高等和低等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物和多细胞藻。能够被治疗的植物包括任何维管植物，例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于，苜蓿、苹果、拟南芥属(Arabidopsis)、香蕉、大麦、油菜(canola)、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米(玉蜀黍)、海甘蓝、越桔、黄瓜、石斛、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合(liliacea)、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油料种子油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属(Phaseolus)、马铃薯、油菜籽、稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草坪草、小麦和蔬菜作物，例如莴苣、芹菜、椰菜、花椰菜、葫芦、洋葱(包括大蒜、分葱、韭和细香葱)；果树和坚果树，例如苹果、梨、桃、橙、葡萄柚、柠檬、酸橙、杏仁、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，例如葡萄、猕猴桃、蛇麻草；果实灌木和荆棘，例如覆盆子、黑莓、醋栗；森林树，例如岑树、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、白杨；其中优选苜蓿、油菜、蓖麻、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油料种子油菜、花生、马铃薯、稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄和小麦。能够被治疗的植物包括任何农作物植物，例如饲料作物、油料种子作物、谷类作物、果实作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草皮作物、糖料作物、饮料作物和森林作物。农作物植物可以是玉米、大豆、小麦、棉花、苜蓿、油菜、甜菜、稻、马铃薯、番茄、洋葱、豆类或豌豆植物。在一个方面，提及的“植物”包括其后代和其它后裔。在一个实施方案中，通过局部施用防御素和肽，或通过使用表达防御素和/或肽的一种或另一种或两种的微生物，保护植物种子免受真菌或细菌感染或侵袭。

如前所述，提及的“病原体”包括真菌和微生物。“微生物”包括细菌。“真菌”包括酵母和锈菌。

提及的“真菌”包括感染人或动物受试者或植物的真菌以及其它病原体的真菌。

包括哺乳动物比如人的动物真菌病原体包括以下物种：链格孢属、曲霉菌属、念珠菌属、镰刀菌属、发癣菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、小孢子菌属、青霉菌属、肺孢子虫属、毛孢子菌属、丝孢菌属、拟青霉属、支顶孢属、葡萄穗霉属和暗色霉菌。具体的动物、包括哺乳动物以及尤其是人病原体包括链格孢菌、烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌、构巢曲霉菌、寄生曲霉菌、白色念珠菌、杜氏念珠菌、无名念珠菌、光滑念珠菌、吉利蒙念珠菌、黑马朗念珠菌、乳酒念珠菌、克鲁斯念珠菌、葡萄牙念珠菌、挪威念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、维斯念珠菌、絮状表皮癣菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、红色毛癣菌、须毛癣菌、指间毛癣菌、断发毛癣菌、新型隐球菌、格特隐球菌、格鲁比隐球菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、马尔尼菲青霉菌、白吉利毛孢子菌、阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、星状毛孢子菌、皮状毛孢子菌、龙贡毛孢子菌、粘状毛孢子菌、卵形毛孢子菌、茁芽毛孢子菌、loubieri毛孢子菌、japonicum毛孢子菌、尖端赛多孢子菌、多育赛多孢子菌、多变拟青霉、淡紫色拟青霉、直立顶孢霉、斑替支孢霉、皮炎外瓶霉、枝氯霉、深褐毛壳菌、Dactlaria gallopavum、双极霉属、喙状明脐菌以及伞枝犁头霉、雅致鳞质霉、印度毛霉菌、微小根毛霉、米根霉、灰色小克银汉霉、屈弯科克霉、瓶霉、总状共头霉、蛙生蛙粪霉、冠状耳霉、异孢耳霉、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、posadasii孢子菌、组织胞浆菌、巴西副球孢子菌、波氏假阿利什霉和申克孢子丝菌。

主要农作物的具体的病原体包括：玉米：玉蜀黍赤霉(禾谷镰刀菌)、禾生炭疽菌、玉蜀黍壳柱孢菌(玉蜀黍色二孢菌)、串珠镰刀菌subglutinans变种、轮枝镰刀菌、玉蜀黍双极霉菌O、T(异旋孢腔菌)、大斑病菌I、II和III、玉蜀黍灰斑病菌、畸雌腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉菌、芨芨草腐霉、终极腐霉菌、瓜果腐霉、曲霉菌属、黄曲霉菌、玉米长蠕孢I、II和III(玉米旋孢腔菌)、pedicellatum长蠕孢、玉蜀黍节壶菌、玉蜀黍叶点霉菌、玉蜀黍球梗孢、高粱尾孢菌、玉蜀黍黑粉菌、玉蜀黍黑粉菌、高粱柄锈菌、多堆柄锈菌、菜豆壳球孢菌、草酸青霉、稻黑孢、分支孢子菌、新月弯孢霉、不等弯孢菌、变淡弯孢菌、绿色木霉菌、高粱麦角菌、大孢色二孢、大孢指疫霉、高粱霜霉病菌、菲律宾指霜霉、玉蜀黍指霜霉、甘蔗指霜霉、丝黑穗病菌、玉米壳锈菌、玉蜀黍头孢霉、枝顶孢头孢霉；大豆：virgululiforme镰刀菌、茄病镰刀菌、菌核病菌、尖孢镰刀菌、南美大豆猝死综合症镰刀菌、豆薯层锈菌、大雄疫霉大豆专化型、大豆疫霉菌、菜豆壳球孢菌、水稻纹枯病菌、菌核病菌、菜豆间座壳大豆变种(大豆拟茎点霉)、菜豆间座壳北方大豆变种、白绢病菌、紫斑病菌、大豆灰斑病菌、霜霉病菌、黑线炭疽菌(平头炭疽菌)、黄瓜棒孢叶斑病、大豆壳针孢、sojicola叶点霉(Phyllostictasojicola)、链格孢菌、白花蛇舌草叉丝壳、半裸镰刀菌、大豆茎褐腐病菌、大豆丛殻菌、瓜果腐霉、终极腐霉菌、德巴利腐霉；油菜：白锈病菌、白菜黑斑病菌、十字花科小球腔菌、水稻纹枯病菌、菌核病菌、芸苔生球腔菌、终极腐霉菌、霜霉病菌、尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、粉红镰刀菌、链格孢菌；棉花：尖孢镰刀菌棉花专化型、大丽轮枝菌、烟草根黑腐病菌、大孢链格孢、棉尾孢菌、甜菜茎点霉(棉花茎枯病菌)、腐霉属水稻纹枯病菌、scheddardii柄锈菌、棉花柄锈菌、棉根腐病菌；油菜：十字花科小球腔菌、菌核病菌、白菜黑斑病菌、brasicicola链格孢、甘蓝根肿菌、水稻纹枯病菌、镰刀菌属、腐霉菌属、疫霉属、链格孢属、霜霉病菌、瘦果球腔菌(瘦果假尾孢)、白锈病菌、大雄疫霉变种、灰葡萄孢菌、十字花科白粉菌；小麦：禾旋孢腔菌、威勒加叶斑病菌、Zymoseptoria tritici(禾生球腔菌)、燕麦壳针孢小麦专化型、颖枯壳针孢、布氏白粉菌小麦专化型、冰草黑粉菌、链格孢菌、腊叶芽枝霉、禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌、黄色镰刀菌、伪禾谷镰刀菌、小麦黑粉菌、小麦壳二孢、禾谷头孢霉、禾生炭疽菌、白粉病菌小麦专化型、禾柄锈菌小麦专化型、隐匿柄锈菌小麦专化型、条锈菌、叶锈菌、大孢指疫霉、冰草黑粉菌、偃麦草核腔菌、小麦不孕病菌、颖枯壳针孢、叶枯壳针孢、小麦壳针孢、avenae壳针孢、herpotrichoides假尾孢、水稻纹枯病菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳小麦变种、腐霉菌属、瓜果腐霉、arrhenomannes腐霉菌、gramicola腐霉菌、终极腐霉菌、根腐离蠕孢、紫色麦角菌、Tapesia yallundae、小麦腥黑粉菌、光滑腥黑粉菌、龋齿腥黑粉菌、印度腥黑粉菌、小麦黑粉菌、Wojnowicia graminis、禾旋孢腔菌；高粱：大斑病菌、sublineolum炭疽菌、高粱尾孢菌、高粱胶尾孢、高粱壳二孢、紫柄锈菌、菜豆壳球孢菌、Perconia circinata、串珠镰刀菌、链格孢菌、高粱双极霉、高粱长蠕孢、新月弯孢霉、高粱茎点霉、高粱座枝孢、高粱座枝孢、Phyllachara saccari、丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)(丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana))、黑穗病菌、高粱黑穗病菌、高粱麦角菌、水稻纹枯病菌、枝顶孢霉、大孢指疫霉、高粱霜霉病菌、菲律宾指霜霉、禾生指梗霉、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、arrhenomanes腐霉菌、禾生腐霉菌；向日葵：向日葵霜霉病菌、菌核病菌、向日葵褐斑病菌、向日葵茎拟茎点霉、向日葵链格孢、百日草链格孢、灰葡萄孢菌、黑茎病茎点霉、菜豆壳球孢菌、菊科白粉菌、米根霉、少根根霉、匍枝根霉、向日葵柄锈菌、大丽轮枝菌、枝顶孢头孢霉、隐地疫霉、婆罗门参白锈菌；苜蓿：终极腐霉菌、畸雌腐霉、芨芨草腐霉、德巴利腐霉、瓜果腐霉、大雄疫霉、三叶草霜霉、茎点霉苜蓿变种、苜蓿尾孢、苜蓿假盘菌、苜蓿黄斑病菌、尖孢镰刀菌、苜蓿轮枝菌、根腐丝囊霉、草色匍柄霉、苜蓿匍柄霉、刺盘孢、Leptosphaerulinabriosiana、苜蓿单胞锈菌、三叶草核盘菌、苜蓿壳多孢、匍柄霉和苜蓿纤毛菌。

在一个实施方案中，在玉米中的真菌病原体包括禾谷镰刀菌、禾生炭疽菌、玉蜀黍壳柱孢菌、轮枝镰刀菌、异旋孢腔菌、大斑病菌、玉蜀黍灰斑病菌。

在一个实施方案中，在大豆中的真菌病原体包括virguliforme镰刀菌(Fusariumvirguliforme)、solanai镰刀菌(Fusarium solanai)、菌核病菌、尖孢镰刀菌、南美大豆猝死综合症镰刀菌、豆薯层锈菌(Phakopsora pachirhizi)。

在一个实施方案中，小麦的真菌病原体包括小麦叶枯病菌(Zymoseptoriatritici)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾柄锈菌小麦专化型、隐匿柄锈菌小麦专化型、偃麦草核腔菌。

提及的“真菌”还包括卵菌，比如腐霉菌属和疫霉属。术语“真菌”还包括锈菌。

细菌病原体包括黄单胞菌属(Xanthomonas spp)和假单胞菌属(Pseudomonasspp)。其它微生物包括植原体属(Phytoplasma spp)和螺原体属(Spiroplasma spp)。其它微生物包括葡萄球菌属(Staphylococcus spp)、链球菌属(Streptococcus ssp)、沙门氏菌属(Salmonella spp)、变形杆菌属(Proteus spp)、大肠杆菌属(E.coli spp)、分枝杆菌属(Mycobaterium spp)和支原体属(Mycoplasma spp)。

本公开还教导了编码防御素或其衍生物或变体和/或非防御素肽的核酸分子。所述核酸分子可以是以分离的形式或载体的部分，所述载体包括适合用于植物细胞、微生物细胞和非人动物细胞的表达或转移载体。提及的“载体”包括多基因表达载体(MGEV)比如PCT/AU02/00123描述的。

根据后者方面，提供了多基因表达载体(MGEV)，其包含具有2至8个结构域片段的多核苷酸，每个结构域编码功能性蛋白，每个结构域在线性序列中通过接头片段与下一个结构域相连，结构域和片段都在相同的阅读框，并且其中至少一个结构域是如本文中描述的透化防御素比如II类茄属防御素或其经修饰的形式。在一个实施方案中，至少一个其它的结构域是如本文中描述的非防御素肽。在一个实施方案中，至少一种结构域是防御素，至少一个其它的结构域是肽。

编码防御素和/或肽的核酸序列可以与合适的调控序列(启动子、终止子、转运肽等)组合并入DNA构建体或载体中。所述核酸还可以被可操作地连接到异源性启动子。对于一些应用，编码防御素和/或肽的核酸序列可以插入表达另一种蛋白的编码区，以形成防御素和/或肽融合蛋白，或者可以用于取代蛋白质的结构域以给予该蛋白抗病原体活性。核酸序列可以被置于同源性或异源性启动子控制下，所述同源性或异源性启动子可以是组成型的或诱导型的启动子(例如，受环境条件、病原体的存在、化学品的存在的刺激)。转运肽可以是与防御素同源性或异源性的，选择所述转运肽以确保分泌到期望的细胞器或细胞外空间。转运肽可以是与特定防御素天然相连的。这种DNA构建体可以被克隆或转化到生物系统中，所述生物系统允许编码的经修饰的防御素或防御素的活性部分的表达。合适的生物系统包括微生物(比如毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统、大肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞菌(Pseudomonas)、内生菌比如木质棒形杆菌犬齿亚种(Clavibacter xylisubsp.Cynodontis)(Cxc)；酵母；病毒；噬菌体等)、培养的细胞(比如昆虫细胞、哺乳动物细胞)和植物。在一些情况中，随后将表达的防御素提取并分离使用。在另一些情况中，将表达防御素和/或肽的一种或另一种或两种的微生物细胞应用到植物或根或种子周围的区域。在一个实施方案中，防御素或肽的一种是微生物生产的，另一种是局部应用的。在一个实施方案中，一种类型的微生物生产防御素和肽。在一个实施方案中，两种不同的微生物的每种生产防御素或肽的一种或另一种。

本文中教导的防御素和肽的组合对于对抗在人、动物或植物中的病原体疾病或感染、以及促进环境场所的净化是有用的。因此，本说明书教导了用于病原体的治疗、预防或净化的规程。所述规程具有人、兽医、园艺和/或农业应用。还提供了一种对抗病原体的过程，其通过将它们暴露于本文中描述的防御素和肽的组合。防御素和/或肽的一种或两种可以以组合物的形式使用。

本文中教导的另一个方面是一种组合物，其包含植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非防御素肽，与一种或多种药学上或兽医或园艺可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中，使用两种组合物，一种包含防御素，另一种包含非防御素肽。在一个实施方案中，所述组合物是以以下形式：喷雾、薄雾(mist)、微米或纳米颗粒、水溶液、洗剂、补剂、分散剂、雾化制剂、冲洗剂、唇膏、泥、粉剂、霜剂、膏剂、凝胶、贴片、浸渍绷带、液体制剂、涂剂或其它合适的分布介质，包括组合物的局部或系统形式。“系统形式”包括适合口服、静脉内外周、皮下、鞘内、颅内、阴道或直肠施用的形式。

对于药学上的应用，所述防御素和/或肽可以用作病原体剂或病原体抑制试剂，以治疗哺乳动物感染(例如对抗酵母比如念珠菌属)。有用的应用包括用于趾、足、手、指甲、眼、耳、嘴和头皮的真菌感染的粉剂、滴剂和膏剂

根据本公开的防御素和肽还可以用作防腐剂(例如，作为食品添加剂)或用作土壤或生长介质制备程序的一部分，或者帮助净化无生命物体比如门把手和桌面的表面。

对于农业应用，在植物生命期间或收割后农作物保护，经修饰的防御素可以用于提高农作物的疾病抗性或疾病耐受性。暴露于防御素和肽的组合的病原体的生长、分裂、活动或感染或侵袭潜能被抑制。经修饰的防御素可以根除已经在植物上建立的病原体，或者可以保护植物免受进一步的病原体攻击。

植物病原体暴露于防御素和肽可以以多种方式实现，例如：

(a)所述试剂可以被应用到植物部分，或者应用到植物的根周围的土壤或其它生长介质，或者在播种前使用标准的农业技术(比如喷雾)应用到植物的种子。所述试剂可以被化学合成或从微生物或植物或经基因修饰以表达防御素和/或肽的一种或两种的微生物提取。试剂可以以组合物的形式应用到植物或应用到植物的生长介质中，所述组合物包含与固体或液体稀释剂和任选地多种助剂比如表面活性试剂混合的防御素和肽。固体组合物可以以可分散性粉剂、颗粒或晶粒(grain)的形式。

(b)一种包含经基因修饰以表达防御素和/或肽的微生物的组合物，所述组合物可以应用到植物或种子或植物生长的土壤。

(c)一种经基因修饰以表达防御素和/或肽的内生菌，其可以引入植物组织中(例如，通过种子处理过程)。内生菌被定义为一种有能力进入与植物宿主非致病性内共生关系的微生物。内生菌增强的植物保护方法已经在农作物遗传国际公司(Crop GeneticsInternational Corporation)的一系列专利申请中描述(例如国际申请公开号W090/13224、欧洲专利公开号EP-125468-B1、国际申请公开号W091/10363、国际申请公开号W087/03303)。内生菌可以经基因修饰以生产农业化学品。国际专利申请公开号W094/16076(ZENECA有限公司)描述了使用经基因修饰以表达植物衍生的抗真菌肽的内生菌的用途。

(d)编码防御素和/或肽的DNA可以被引入植物基因组，从而所述肽可以在植物体内表达(DNA可以是cDNA、基因组DNA或使用标准的核酸合成仪制备的DNA)。

对于包含本文中描述的包含防御素和/或肽的组合物，其通常包括载体、赋形剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂和/或固体或液体添加剂。包含防御素和/或肽的一种或另一种或两种的植物提取物也可以在制剂中使用比如沐浴露或洗发水中。

根据目标施用方法，所述组合物可以采用各种形式。一般但不排他地，对人或动物受试者或植物可以使用局部组合物。例如，在制备组合物中，可以采用常用的介质，比如水、乙二醇、油、乙醇、防腐剂和/或着色剂。例如，所述组合物可以采取液体制剂的形式，比如悬浮液、酏剂和溶液。还可以使用载体比如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。所述组合物还可以是以粉剂、胶囊和片剂的形式。

防御素和肽可以直接地施用至植物或其部分、施用至种子或根系统，或者根系统周围的土壤或介质，或者施用至包括哺乳动物比如人的动物的皮肤、毛发或皮。

当通过气雾剂或喷雾施用时，根据农业和药学制剂领域熟知的技术制备所述组合物，并且可以被制备为在本领域中已知的在生理盐水、采用苯甲醇或其它的合适的防腐剂、用以增强生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物和/或其它增溶或分散试剂中的溶液。

根据采用的特定的组合、施用模式、待治疗的病原体和病原体侵袭的严重性，防御素和肽的有效剂量可以变化。因此，根据多种因素，包括植物或受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学病症，待治疗的病症的严重性，施用途径，其采用的具体的防御素来选择使用防御素和肽的剂量方案。普通技能的园艺工作者、医生、临床医生或兽医能够很容易确定和开处方预防、对抗或阻止病原体侵袭的进展所需要的有效量的防御素。本文中还涉及缓释制剂。

提供了具有合适的包衣的糖衣丸芯。为了这个目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以添加到片剂或糖衣包衣中，用于识别或表征不同的活性化合物剂量的组合。

防御素-非防御素肽制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和塑化剂比如甘油或山梨糖醇制成的软的、密封的胶囊。所述推入配合胶囊能够含有与填料比如乳糖、粘合剂比如淀粉和/或润滑剂比如滑石或硬脂酸镁和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以被溶解或者悬浮在合适的液体中，比如脂肪油、液体石蜡或者液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。

防御素-非防御素肽组合物或编码它的表达载体还可以包含另一种抗病原体物质，比如另一种防御素或抗病原体蛋白或肽或者化学病原体剂或蛋白酶抑制剂或其前体。

本文中教导的另一个方面包括一种用于治疗或预防植物病原体侵袭的规程或方法，所述规程或方法包括向植物或其部分比如植物种子或者向植物周围的土壤或生长支持介质单独或与另一种抗病原体试剂一起应用抗病原体有效量的组合物，所述组合物包含如本文中描述的植物防御素和非防御素肽。

在另一个方面提供了一种用于治疗或预防病原体感染或侵袭的动物包括哺乳动物比如人受试者的规程或方法，所述规程或方法包括向受试者应用抗病原体有效量的组合物，所述组合物包含如在本文中描述的植物防御素和非防御素肽。

另一个方面提供了一种用于净化病原体侵袭的环境场所的规程或方法，所述规程或方法包括向场所应用抗病原体有效量的组合物，所述组合物包含如本文中所描述的植物防御素和非防御素肽。

在另一个实施方案中，可以向植物、种子、根或者向人或动物应用表达防御素和/或肽的一种或另一种或两种经基因修饰的微生物。

术语“应用”包括接触和暴露。

在另一个实施方案中，植物细胞可以根据多种已知的方法使用重组DNA构建体(农杆菌(Agrobacterium)Ti质粒、电穿孔、微注射、微粒枪等)进行转化。在合适的情况下，转化的细胞再生成为完整植物，其中新的核材料是稳定整合入基因组中的。转化的单子叶和双子叶植物可以以这种方式获得，即使双子叶植物通常更容易再生。这些原代转化株的一些后代继承了编码抗病原体防御素和肽组合的重组DNA。

本公开还提供了对病原体提高耐受性的植物，其含有表达植物防御素和非防御素肽的重组DNA。这种植物可以在标准的植物育种杂交中用作亲本，以开发具有病原体包括真菌耐受性的杂交物和系。可选择地，植物可以表达异源性防御素或提高表达的内源性防御素。在使用中，肽是外源性提供给这种植物的。另可选择地，植物表达肽，并且防御素是外源性提供的。因此，本公开延伸至转基因植物和它们的后代。在另一个实施方案中，防御素和/或肽是通过微生物表达的，外源性提供给靶标的。当防御素局部地应用至植物或植物种子时，所述植物本身仍然可以天然地生产该防御素。

重组DNA通常是异源性的DNA，其通过转化被引入植物或它的先祖。重组DNA编码表达的防御素和肽，用于递送至病原体攻击的位置(比如叶)。

当本防御素和非防御素肽在转基因植物或它的后代中表达时，病原体在病原体攻击植物的位置或远离该位置暴露于防御素和肽。在一个实施方案中，通过使用合适的基因调控序列，在体内防御素可以在最有效的时间和位置生产。例如，防御素和肽可以在通常不大量表达但对疾病耐受性重要的植物部分中生产(比如叶)。

可以生产的经基因修饰的植物的实例包括实地农作物、谷物、水果和蔬菜，比如玉米、大豆、高粱、小麦、大麦、玉蜀黍、棉花、油菜籽、稻、麻蕉、苜蓿、杏仁、苹果、芦笋、香蕉、菜豆(bean-phaseolus)、黑莓、蚕豆、油菜、腰果、木薯、嘴豆、柑橘、椰子、咖啡、无花果、亚麻籽、葡萄、落花生、大麻、薰衣草、蘑菇、橄榄、洋葱、豌豆、花生、梨、狼尾草、马铃薯、油菜籽、黑麦草、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、蕃薯、芋头、茶、烟草、番茄、黑小麦、松露和山药。

病原体可以是任何生长在植物之上、之中或附近的病原体。关于这点，耐受性包括对比野生型植物时病原体耐受性增强。耐受性可以是变化的，从对病原体的作用的耐受性稍有增加(病原体部分被抑制)至总耐受性从而植物不受病原体的存在的影响(病原体被严格抑制或杀死)。针对特定病原体的耐受性的水平的增加或针对更广泛范围的病原体的耐受性均构成耐受性的提高。植物转化或随后的杂交之后，选择显示提高的耐受性的转基因植物(或由此衍生的植物)。

本公开还提供一种方法，其用于生成显示抗病原体活性的基因修饰的植物或其后代，如本文中所描述的，所述方法包括构建植物，所述植物包含表达编码植物防御素和非防御素肽的核酸的细胞，表达水平足以用于防御素和肽显示针对植物病原体的协同保护作用。

本文中提供了一种方法，其用于生成一种显示抗病原体性能的植物，所述方法包括构建基因修饰的植物或它的后代，其包含表达植物防御素和非防御素肽的细胞。这种植物降低了促进病原体耐受性的风险。

本防御素和肽可以基于它的氨基酸序列，例如使用肽或蛋白合成仪，使用标准的逐步添加一个或多个氨基酸残基而制备。可选择地，所述防御素和肽可以通过重组方式制备。

如前所述，防御素和肽的组合显示提高的或增强的抗病原体活性。

另一方面提供了一种用于减少或控制在人或动物受试者上或中的病原体感染或侵袭的方法，所述方法包括局部地应用植物防御素和非防御素肽的组合至人或动物上的潜在感染的表面区域。因此，本文涉及动物尤其是哺乳动物比如人抗病原体药物。在一个实施方案中，所述药物是以以下的形式：粉剂、喷雾、喷雾器(atomizer)、纳米颗粒、凝胶、糊剂、浸渍绷带、涂剂、气雾剂、浸液(drench)或其它液体。这种抗病原体制剂还可以是缓释组合物。所述制剂可以被用于治疗感染的受试者或作为预防性的。

本文中公开的另一个实施方案是一种用于鉴定防御素的方法，所述防御素增强或诱导肽的抗病原体活性。方便地，该测定对真菌细胞进行，然而可以采用其它物种的细胞。该方法需要测量防御素允许透化性指示化合物进入真菌细胞的能力。合适的透化指示化合物是其位置无论在细胞内或细胞外均能够被检测到的透化指示化合物。在正常的条件下，指示化合物保留在细胞外，并且不能自由通过细胞壁和膜。在透化防御素存在时，在2小时内能够在给定的真菌的细胞内检测到指示化合物。当存在于真菌时，如果通过指示化合物在细胞内的量增加，发现待测试防御素(测试防御素)增加了给定真菌的透化性，当防御素和肽组合存在于真菌时，从而该防御素被鉴定为一种增强或诱导肽的抗真菌活性的防御素。还提供了在其它病原体中比如微生物中相同的防御素在增强或诱导肽的抗病原体性能中是有用的。

合适的透化性指示化合物是核酸染色剂，比如绿色核酸染色剂或蓝色核酸染色剂。鉴定增强肽效力的防御素的方法不限于使用核酸染色剂，还可以使用当测试防御素时产生相似的透化性数据的任何透化性指示化合物来实施。本文中定义了相对透化性指数(RPI)，其中真菌菌株由限定浓度的给定防御素诱导的透化程度相对于相同浓度NaD1的1.0值得到确定。协同可以以协同标度来表示。在一个实施方案中，不超过14的值代表无显著协同，比如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14；从15至29的值代表低协同，比如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29；从30至60的值代表中等协同，比如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60；大于60的值代表高度协同。“大于60”包括从61至100(包括61、70、80、90和100)以及之间的任何值。

使用以下描述的方法或者使用本领域技术人员理解的等同的适应性改变来实施描述的方法。方法的步骤包括：在存在测试防御素和不存在测试防御素(作为对照)时，分别将真菌与透化性指示化合物组合；然后比较在存在和不存在测试防御素时在真菌中任何可检测的细胞内透化性指示化合物的量。相比对照，如果测试防御素存在这样的作用，即在2小时内在真菌中检测到的细胞内指示化合物的量增加，测试化合物被鉴定为一种能够增强非植物防御素肽的效力的防御素，当存在真菌时所述防御素和杀真菌剂进行组合。如本文中所公开的，通过刚才描述的方法鉴定的植物防御素将被理解为用于保护植物免受真菌疾病的系统中的作为防御素成分是有用的，无论是否已知防御素具有抗真菌活性。

一旦透化防御素与提供最佳透化的浓度范围一起被鉴定，针对所选择的病原体，使用不同的肽的组合测试。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。如本文所使用的，“由……组成”排除在权利要求要素中未指定的任何元件、步骤或组分。如本文所使用的，“基本上由……组成”不排除实质上不影响权利要求的基本和新型特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何陈述，特别是在描述组合物的成分或描述装置的元件时，应理解为包括基本上由所述成分或元件组成和由所述成分或元件组成的那些组合物和方法。本文举例说明性描述的本公开适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

当本文使用马库什(Markush)组或其它组时，该组的所有个体成员以及可能的组的所有组合和亚组合预期都各自包括在公开中。

当在本文中陈述范围时，预期在所述范围中所有亚范围、以及所述范围中的所有整数值意图如每个亚范围和整数值被陈述。

实施例

现在在以下非限制性实施例中对本文中公开的和提供的方面进行描述。

方法

从毕赤酵母(Pichia pastoris)纯化防御素

使用单一的pPINK-防御素或pPIC9-防御素毕赤酵母(P.pastoris)(PichiaPink或GS115商标)株1菌落来接种在250mL烧瓶中的25mL BMG介质(在Invitrogen毕赤表达手册中进行了描述)，并将其在30℃震荡培养箱(140rpm)中孵育2至3天。将该培养物用于接种在1L三角烧瓶(baffled flask)中的200mL BMG，将该1L三角烧瓶放置在30℃震荡培养箱(140rpm)中过夜。通过离心(1,500×g，10分钟，4℃)收集细胞，将细胞重悬于5L三角烧瓶中的1L BMM介质中并在28℃震荡培养箱中孵育3天。通过添加6ml的100％的甲醇，在t＝24小时和48小时时诱导培养物。通过离心(6000rpm，20分钟)将表达介质与细胞分离。将介质调节至pH 3.0，之后将其施加到经100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0预平衡的SP Sepharose柱(1cm×1cm，Amersham Biosciences)上。然后，将该柱用10个柱体积的100mM磷酸钾缓冲液pH6.0洗涤，并用10×10mL的包含500mM或1M NaCl的100mM磷酸钾缓冲液洗脱结合的蛋白质。使用斑点印记和含有蛋白的合并馏分(protein-containing fractions pooled)分析小体积的每个馏分(10μL)。将蛋白质用离心柱浓缩至1mL，并用无菌milliQ超纯水洗涤5×。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定(Pierce Chemical Co.)来确定毕赤表达的防御素的蛋白质浓度，并以牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质标准物。

非防御素肽

大多数非防御素肽从商业来源获得。一般地，所述肽是使用标准的肽合成机器和规程化学合成的。

重组生产EcAMP1。编码α-发卡蛋白EcAMP1的成熟结构域的DNA从Genscript订购。使用Sac II和Sac I将该DNA从pUC57载体切下，使用Perfectprep试剂盒(Eppendorf)从琼脂糖凝胶提取，并且连接到pHUE，然后将其用于转化TOP10大肠杆菌细胞。分离质粒DNA，然后用于转化大肠杆菌Rosetta-Gami B细胞。

使用单克隆的大肠杆菌Rosetta-Gami B接种在2YT介质(10mL，16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl)，其含有氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四环霉素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.015mg/mL)，在37℃震荡生长过夜。使用该培养物接种2YT介质(500mL)，所述2YT介质含有氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)、四环霉素(0.1mg/mL)和卡那霉素(0.015mg/mL)，然后生长4小时至约1.0的光密度(600nm)。然后添加IPTG(终浓度0.5mM)，并且在16℃培养生长另外的16小时。通过离心(在4℃，4,000g，20分钟)收集细胞，以原生(native)裂解缓冲液(每升细胞培养物20mL，100mM Tris-Cl，1MNaCl，20mM pH 8.0)重悬，并且冷冻在–80℃。然后将细胞解冻并使用溶菌酶(每25mL重悬细胞5mg)在4℃处理20分钟。然后添加DNase I(125uL，2mg/mL在20％甘油，75mM NaCl)和MgCl₂(125uL，1M)，在摇摆平台(rocking platform)上，在室温孵育样本40分钟。然后将样本在冰上超声2x 30s(80％功率，Branson超声波仪450)并离心(在4℃，20,000g，30分钟)。然后，根据制造商的说明，通过固相金属亲和色谱(IMAC)在原生条件下使用Ni-NTA树脂(1.5mL至约25mL天然蛋白提取物，Qiagen)，从蛋白提取物纯化六聚组氨酸标记的泛素融合蛋白(His6-Ub-EcAMP1)。使用洗脱缓冲液(100mM Tris-Cl，1M NaCl，500mM咪唑pH 8.0)洗脱重组蛋白。将洗脱的蛋白施加到预包装的Sephadex G50凝胶过滤柱(PD-10，Amersham)去除咪唑，所述过滤柱使用50mM Tris.Cl，100mM NaCl pH 8.0平衡。

使用去泛素化酶6H.Usp2-cc将六聚组氨酸标记的泛素从重组蛋白切割(Cantanzariti等人2004)。通过另一轮IMAC用去泛素化的蛋白酶抑制剂作为未结合的蛋白质去除经切割的标签。然后通过反向HPLC进一步纯化。

透化测定

将尖孢镰刀菌棉花专化型(Fov)或禾谷镰刀菌(Fgr)从5x10⁴孢子/mL的起始浓度在25℃下在半强度PDB中生长18小时。然后，将菌丝悬浮液(90μL)转移至黑色96孔微量滴定板并与SYTOX(注册商标)绿色(0.5μM)(一种绿色核酸荧光染料)孵育10分钟，之后加入10μL肽溶液以得到10μM(Fov)或5μM(Fgr)的最终蛋白质浓度。SYTOX绿色摄取(指示透化)通过使用微量滴定板读数仪(SpectraMax M5e；Molecular Devices)分别以488nm和538nm的激发和发射波长测量荧光来量化。每2分钟进行读数，持续2小时。透化测定的实施例结果示于图1和表2中。

本文中对相对透化性指数进行了定义，其中真菌菌株由限定浓度的防御素诱导的透化程度相对于相同浓度NaD1的1.0值得到确定。

图1示出了用10μM NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008和DmAMP1处理后，Fov菌丝中SYTOX绿色的相对摄取。还参见表2。防御素NaD1、HXP4、HXL002、HXL007和HXL008能够使Fov菌丝透化，而防御素DmAMP1则不能。每种防御素的相对透化性指数示于表2中。出于本发明的目的，认为对Fov的相对透化性指数大于0.2的防御素是透化的。

图2示出了用5μM NaD1、HXP4、HXL001、HXL002、HXL004、HXL008、HXL009、HXL013、HXL021、Hordothionin和RsAFP2处理后，Fgr菌丝中SYTOX绿色的相对摄取。与防御素HXL009、HXL021、hordothionin和RsAFP2相比，防御素NaD1、HXP4、HXL002、HXL004和HXL008引起Fgr菌丝发生显著更多的透化。每种防御素的相对透化性指数示于表3中。出于本发明的目的，认为对Fgr的相对透化性指数大于0.5的防御素是透化的。

产生转基因植物细胞和/或组织

用于在植物细胞和/或组织中引入和选择存在的异源性DNA的技术和试剂是熟知的。允许在植物细胞中选择异源性DNA的遗传标记物也是熟知的，例如携带对抗生素比如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博莱霉素的耐受性的基因。所述标记物允许选择在含有合适抗生素的介质中生长的成功转化的植物细胞，因为这些细胞将携带相应的耐受性基因。在大多数情况下，插入到植物细胞中的异源性DNA包含编码选择性标记物比如抗生素耐受性标记物的基因，但这不是强制性的。一个示例性的抗药性标记是其表达产生卡那霉素耐受性的基因，即包含胭脂碱合酶启动子n5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合成酶3’非翻译区的嵌合基因。

用表达盒将植物细胞和/或组织基因工程化的技术是将其通过农杆菌介导的转化、电穿孔、微注射、粒子轰击或本领域已知的其它技术引入植物细胞或组织中，所述表达盒包含与异源性编码序列和转录终止序列融合的诱导型启动子或嵌合启动子。有利地，所述表达盒还包含允许在植物细胞中选择异源性DNA的标记，例如携带对抗生素比如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博莱霉素的耐受性的基因。

可将携带植物可表达基因或其它感兴趣的DNA的DNA构建体通过任何合适的方法插入植物基因组中。这样的方法可包括，例如使用脂质体、电穿孔、扩散、粒子轰击、微注射、基因枪、增加游离DNA摄取的化学物质例如磷酸钙共沉淀法、病毒载体和本领域中实践的其它技术。合适的植物转化载体包括衍生自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒的那些，比如Herrera-Estrella等人(1983)EMBO J 2：987-995；Bevan等人(1983)Nucleic Acids Res 11(2)：369-385；Klee等人(1985)Bio/Technology 3：637-642和EPO公开120，516(Schilperoort等人，欧洲专利公开120，516)公开的那些。除衍生自农杆菌的Ti质粒或根诱导型(Ri)质粒的植物转化载体之外，可使用替代的方法来将本发明的DNA构建体插入植物细胞中。

如本领域中所熟知的，对与感兴趣的DNA可操作地连接的载体的选择直接取决于所期望的功能性能例如复制、蛋白质表达，以及待转化的宿主细胞，这些是构建重组DNA分子领域中固有的限制。期望所述载体包括原核复制子，即当被引入原核生物宿主细胞比如细菌宿主细胞中时，能够指导重组DNA分子自主复制并使其维持在染色体外的DNA序列。这样的复制子在本领域中是熟知的。此外，包括原核复制子的优选实施方案还包括当被导入这些转化细胞中时其表达赋予细菌宿主细胞选择性优势比如抗药性的基因。典型的细菌抗药性基因是赋予对氨苄青霉素或四环素及其它选择的试剂的耐受性的那些基因。新霉素磷酸转移酶基因具有以下优势：其在原核细胞以及真核细胞中都表达。

包括原核复制子的那些载体一般还包括用于插入本发明的重组DNA分子的方便的限制性位点。典型的这样的载体质粒是获自BioRad Laboratories(Richmond，CA)的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329；以及获自Pharmacia(Piscataway，NJ)的pPL、pK和K223；和获自Stratagene(La Jolla，CA)的pBLUESCRIPT tmand pBS。本发明的载体还可以是本领域中已知的λ噬菌体载体或λZAP载体(获自Stratagene La Jolla，CA)。另一种载体包括，例如pCMU(Nilsson等(1989)Cell58：707)。其它的合适载体还可以是根据已知方法合成的，例如本文中用在不同应用中的载体pCMU/Kb和pCMUII是pCMUIV的改进形式(Nilsson等(1989)上文)。

能够在植物细胞中表达重组核酸序列并能够在该宿主植物细胞中指导稳定整合的典型表达载体包括衍生自根癌农杆菌的肿瘤诱导型(Ti)质粒的载体。

转基因植物可通过本领域已知的任何标准方法产生，包括但不局限于根癌农杆菌介导的DNA转移，优选用错臂(disarmed)T-DNA载体、电穿孔、直接DNA转移和粒子轰击。用于将DNA引入单子叶植物以及双子叶植物的技术是本领域熟知的，同样地用于培养此类植物组织并再生这些组织的技术也是本领域熟知的。

协同分类

按照观察到的由两种防御素之组合引起的真菌生长抑制％(Io值)与基于每种防御素自身真菌生长抑制％之和的这两种防御素的预期生长抑制％(Ee值根据Richer等(1987)(同上)使用的Limpel公式计算)之间的差值来对协同作用进行分类。差值Io-Ee是协同值。协同值不超过15意味着无显著的协同；15至30是低协同水平；30至60是中等协同水平；而大于60是高协同水平。

用于活体转化(In planta)研究的生物测定方法

制备禾生炭疽菌接种物

禾生炭疽菌(美国分离株Carroll-1A-99)分离自玉蜀黍玉米(Zea maize)(Pioneer Hi-Bred International,Inc.Johnston,Iowa,USA)。孢子分离自在V8琼脂上生长约2至3周的孢子形成培养物。如下收集禾生炭疽菌孢子：将平板表面物刮到无菌水中并经通过面巾纸(facial tissue)的过滤来将孢子与菌丝物质分离。使用血球计数器测量滤液中的孢子浓度。

制备禾谷镰刀菌接种物

禾谷镰刀菌分离株(73B1A)分离自玉蜀黍玉米(Zea maize)(Pioneer Hi-BredInternational,Inc.Johnston,Iowa,USA)。孢子分离自在SNP琼脂上生长约2至3周的孢子形成培养物。通过将平板表面物刮到无菌水中来收集禾谷镰刀菌孢子。使用血球计数器测量孢子浓度。

接种玉米植物

在出瓶(deflasking)后，将用于生物测定的植物在温室中培养约6至12周。

接种禾生炭疽菌

在玉米叶鞘的相对侧上制造两个长度为2.0mm的伤口，然后用1×10⁶禾生炭疽菌孢子/mL覆盖。然后，将伤口用Glad Press’n’Seal密封3天。在接种后10天通过数码摄影测量感染面积。

接种禾谷镰刀菌

在玉米叶鞘的相对侧上制造两个长度为2.0mm的伤口。将伤口用已在1×10⁶禾谷镰刀菌孢子/mL中浸过的6mm直径纸盘覆盖。然后，将伤口用Glad Press’n’Seal密封3天。在接种后10天通过数码摄影测量感染面积。

分析玉米植物中的转基因表达

ELISA方法

蛋白质提取：从在温室中生长的植物切下叶和鞘组织。将该组织(50mg)冷冻在液氮中并在混磨机(mixer mill)(Retsch MM300)中以30s-1的频率研磨3×15秒。通过加入每重量9倍体积的2％w/v的不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％v/v Tween 20并涡旋20秒来进行蛋白提取。将样品离心15分钟(3,700rpm)并收集上清液。

将ELISA板(NuncMaxisorp#442404)与100μL/孔的在PBS中的一抗(100ng/每孔抗防御素抗体)孵育。将板在湿润的盒中在4℃下孵育过夜。然后，将它们用PBS/0.05％v/vTween 20洗涤2分钟×4。将板用200μL/孔的在PBS中的3％w/v BSA(Sigma A-7030：98％w/vELISA级)封闭，并在25℃下孵育2小时。然后，将板用PBS/0.05％v/v Tween 20洗涤2分钟×4。

然后，将玉米鞘或叶蛋白提取物(100μL/孔，在PBS/0.05％v/v Tween 20中进行稀释)施加到板，并随后将其在25℃下孵育2小时。然后，将板用PBS/0.05％v/v Tween 20洗涤2分钟×4，之后施加100μL/孔的在PBS中的二抗(例如75ng/孔生物素标记的防御素抗体)。该生物素标记的抗体通过使用EZ-连接磺基-NHS-LC-生物素化试剂盒(Pierce)来制备；使用2mL蛋白A纯化的抗体和2mg生物素试剂。将板在25℃下孵育1小时，随后用PBS/0.05％v/vTween 20洗涤2分钟×4，并施加100μL/孔的在PBS中的NeutriAvidin HRP-缀合物(Pierce#31001；1∶1000稀释；0.1μL/孔)。将板在25℃下孵育1小时，之后用PBS/0.05％v/v Tween20洗涤2分钟×2，接着用H2O洗涤2分钟×2。在临用前，通过将1个ImmunoPure OPD片剂(Pierce#34006)溶解于9mL H2O中，然后加入1mL稳定的过氧化物缓冲液(10X，Pierce#34062)来制备底物。将底物以100μL/孔施加并将板在25℃下孵育，直至产生颜色(约9分钟)。通过施加50μL 2.5M硫酸来停止反应。在板读数仪(Molecular Devices)中测量490nm的吸光度。

表2

表3

实施例1

真菌病原体在透化防御素和非防御素肽的存在下的体外生长抑制

防御素包括茄属II类防御素(NaD1)、人工变体(HXP4)和I类防御素(HXL001、HXL004、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035)，这些是透化防御素。这些与导管素(牛抗菌肽、BMAP28和LL37)、牛抗菌肽的合成的变体(Bac2A)、合成的肽(CP29)、α-发卡蛋白肽(Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F)、β-发卡肽(蝎血素和鲎抗菌肽(F12I)以及衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的肽(SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104))配合。

基本按照Broekaert等人(1990)FEMS Microbiol Lett 69:55-59所描述的测量透化防御素与非防御素肽的组合对以下的生长的抑制作用：对禾谷镰刀菌(Giberella zea)(Fgr，Pioneer Hybrid International(PHI)分离株73B1A)、尖孢镰刀菌棉花专化型(Fov，分离自棉花的澳大利亚分离株VCG01111；来自农业系统研究所(Farming SystemsInstitute)，农业部(Department of Agriculture)，渔业和林业(Fisheries&Forestry)，昆士兰，澳大利亚)、禾生炭疽菌(Cgr，PHI分离株Carroll-1A-9)、白色念珠菌(分离株DAY185，生物化学和分子生物学系，莫纳什大学，维多利亚，澳大利亚)、格特隐球菌(分离株BAL11)、指间毛癣菌、红色毛癣菌和粉小孢子菌(获自国家真菌学参考中心(NationalMycology Reference Centre)，南澳大利亚妇女和儿童医院病理科，阿德莱德，澳大利亚)。

从生长在合成型营养缺乏琼脂(Fgr)、V8琼脂(Cgr)、1/2强度马铃薯葡萄糖琼脂(Fov)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂(白色念珠菌、格特隐球菌)或1/2强度沙氏葡萄糖琼脂(指间毛癣菌、红色毛癣菌、粉小孢子菌)上的孢子形成型真菌属分离孢子。通过添加1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)将孢子从板上移除。使用血球计数器测量孢子浓度。

基本上如本文中描述的，在96孔微量滴定板中进行抗真菌测定。向孔中上样10μL经过滤灭菌(0.22μm注射过滤器，Millipore)的防御素(每种终浓度的10×贮存液)或水、10μL经过滤灭菌(0.22μm注射过滤器，Millipore)的非防御素肽(每种终浓度的10×贮存液)或水以及80μL1/2强度PDB中的5×10⁴孢子/mL。在25℃(Fgr、Cgr、Fov)或30℃(白色念珠菌、格特隐球菌、指间毛癣菌、红色毛癣菌、粉小孢子菌)孵育这些板。通过使用微量滴定板读数仪(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)测量在595nm(A595)处的光密度来测定真菌生长。允许继续生长直至在不存在任何测试防御素的情况下真菌的光密度(OD)达到0.2的OD。每个测试以一式两份进行。

按照由防御素和非防御素肽的组合引起的观察到的真菌生长抑制％(Io值)与所述防御素和所述非防御素肽的预期的真菌生长抑制％(Ee值根据Richer等(1987)(上文)使用的Limpel公式计算)(其是基于所述防御素和所述非防御素肽其自身各自真菌生长抑制％之和)之间的差来对协同进行分类。差Io-Ee是协同值。协同值不超过15指无显著的协同；15至30是低协同水平；30至60是中等协同水平；以及大于60是高协同水平。协同计算示于表4至表12中，其中如上所述，Ee是来自根据Limpel公式的叠加响应的以抑制百分率表示的预期作用，而Io是观察到的抑制百分率。当Io值高于Ee值时，发生协同。结果示于表4至表12中。

白色念珠菌的协同抑制结果在表4中显示。

表4

白色念珠菌

格特隐球菌的协同抑制结果在表5中显示。

表5

格特隐球菌

禾谷镰刀菌的协同抑制结果在表6中显示。

表6

禾谷镰刀菌

指间毛癣菌的协同抑制结果在表7中显示。

表7

指间毛癣菌

粉小孢子菌的协同抑制结果在表8中显示。

表8

粉小孢子菌

尖孢镰刀菌棉花专化型的协同抑制结果在表9中显示。

表9

尖孢镰刀菌棉花专化型

禾生炭疽菌的协同抑制结果在表10中显示。

表10

禾生炭疽菌

禾谷镰刀菌的协同抑制结果在表12中显示。

表11

禾谷镰刀菌

白色念珠菌的协同抑制结果在表12中显示。

表12

白色念珠菌

实施例2

真菌病原体在α-发卡蛋白或β-发卡存在下的生长抑制

一些α-发卡蛋白和β-发卡肽在相比在与植物防御素组合使用时的浓度更高的浓度，它们本身显示对病原体的效力。在组合中使用的浓度，α-发卡蛋白或β-发卡肽显示没有或最低限度的抗病原体活性。结果显示在表13中。

表13

IC₅₀值

Cgr–禾生炭疽菌(Collectotrichum graminicola)

Fgr–禾谷镰刀菌(Fusarium greaminearum)

S.cer–酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

C.alb–白色念珠菌(Candida albicans)

T.rub–红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

本领域中的技术人员将认识到，本文中所述的公开很容易进行不同于具体描述的那些的改变和修改。应当理解，本公开涉及所有这样的变化和修改。本公开还提供本说明书中单独或一起提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，并提供所述步骤或特征或组合物或化合物中任何两个或更多个的任何和所有组合。

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Yount和Yeaman(2005)Protein Pept Lett 12(1):49-67。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和选自导管素肽、发卡肽、二硫桥接已经被去除的发卡肽、indolicidin、合成的肽CP-29和衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的肽的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物防御素是透化防御素。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述透化防御素选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述透化防御素是茄属II类防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述防御素变体包含来自I类防御素的环1B，其取代来自茄属II类防御素的对应的环1B。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素变体选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述导管素肽选自牛抗菌肽、LL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31和KS-30。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述发卡肽是α-发卡蛋白，其选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、luffinP1、MBP1、MiAMP2d、C2和VhT1。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述发卡肽是β-发卡，其选自蝎血素、牛抗菌肽、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素和猪抗菌肽。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述去除二硫桥接的肽是Bac2A或EcAMP4A。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其选自SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原体选自真菌病原体和微生物病原体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述真菌生物选自链格孢属Alternaria spp、曲霉菌属Aspergillus spp、念珠菌属Candida spp、镰刀菌属Fusarium spp、发癣菌属Trichophyton spp、隐球菌属Cryptococcus spp、组织胞浆菌属Histoplasma spp、小孢子菌属Microsporum spp、青霉菌属Penicillium spp、肺孢子虫属Pneumocystis spp、毛孢子菌属Trichosporon spp、丝孢菌属Scedosporium spp、拟青霉属Paeciliomyces spp、支顶孢属Acremonium spp、葡萄穗霉属Stachybotrys spp、暗色霉菌、轮枝菌属Verticilliumspp、腐霉菌属Pythium spp、丝核菌属Rhizoctonia spp、核盘霉属Sclerotinia spp、小球腔菌属Leptosphaeria spp、疫霉属Phytophthora spp、炭疽菌属Colletotrichum spp、尾孢菌属Cercospora spp、链格孢属Alternaria spp和锈菌。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述真菌生物选自伞枝犁头霉Absidiacorymbifera、雅致鳞质霉Apophysomyces elegans、直立顶孢霉Acremonium stricutm、链格孢菌Alternaria alternata、甘蓝链格孢菌Alternaria brassicicola、大孢链格孢Alternaria macrospora、莱菔子链格孢菌Alternaria raphani、烟曲霉菌Aspergillusfumigatus、黑曲霉菌Aspergillus niger、黄曲霉菌Aspergillus flavus、构巢曲霉菌Aspergillus nidulans、寄生曲霉菌Aspergillus paraciticus、蛙生蛙粪霉Basidiobolusranarum、双极霉属Bipolaris spp、皮炎芽生菌Blastomyces dermatitidis、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、白色念珠菌Candida albicans、杜氏念珠菌Candida dubliniensis、无名念珠菌Candida famata、光滑念珠菌Candida glabrata、吉利蒙念珠菌Candidaguilliermondii、黑马朗念珠菌Candida haemulonii、乳酒念珠菌Candida kefyr、克鲁斯念珠菌Candida krusei、葡萄牙念珠菌Candida lusitaniae、挪威念珠菌Candidanorvegensis、近平滑念珠菌Candida parapsilosis、热带念珠菌Candida tropicalis、维斯念珠菌Candida viswanathii、菜生尾孢菌Cercospora beticola、棉尾孢菌Cercosporagossypina、大豆灰斑病菌Cercospora sojina、玉蜀黍灰斑病菌Cercospora zeae maydis、深褐毛壳菌Chaetomium atrobrunneum、斑替支孢霉Cladophialophora bantiana、异旋孢腔菌Cochliobolus heterostrophus、粗球孢子菌Coccidioides immitis、posadasii孢子菌Coccidioides posadasii、禾生炭疽菌Colletotrichum graminicola、屈弯科克霉Cokeromyces recurvatus、冠状耳霉Conidiobolus coronatus、异孢耳霉Conidiobolusincongruus、新型隐球菌Cryptococcus neoformans、格特隐球菌Cryptococcus gattii、格鲁比隐球菌Cryptococcus grubii、灰色小克银汉霉Cunninghamella bertholletiae、Dactlaria gallopavum、大豆茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum、絮状表皮癣菌Epidermophyton floccosum、白粉病菌Erysiphe graminis(布氏白粉菌(Blumeriagraminis)、喙状明脐菌Exserohilum rostratum、大斑病菌Exserohilum turcicum、燕麦镰刀菌Fusarium avenaceum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、尖孢镰刀菌棉花专化型Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum(Fov)、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、黄色镰刀菌Fusarium culmorum、尖孢镰刀菌瞿麦专化型Fusarium oxysporum f.sp.dianthi、尖孢镰刀菌番茄专化型Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici、伪禾谷镰刀菌Fusariumpseudograminearum、轮枝镰刀菌Fusarium verticilloides、茄病镰刀菌Fusariumsolani、串珠镰刀菌Fusarium monoliforme、禾顶囊壳小麦变种Gaeumannomyces graminisvar.tritici、组织胞浆菌Histoplasma capsulatum、十字花科小球腔菌Leptosphaeriamaculans、菜豆壳球孢菌Macrophomina phaseolina、犬小孢子菌Microsporum canis、石膏样小孢子菌Microsporum gypseum、印度毛霉菌Mucor indicus、玉蜀黍球腔菌Mycosphaerella zeae、多变拟青霉Paecilomyces variotii、淡紫色拟青霉Paecilomyceslilacinus、巴西副球孢子菌Paracoccidioides brasiliensis、波氏假阿利什霉Pseudallescheria boydii、马尔尼菲青霉菌Penicillium marneffei、大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata、豆薯层锈菌Phakopsora pachyrhizi、大豆疫霉菌Phytophthorasojae、甜菜茎点霉Phoma exigua、乱子草柄锈菌Puccinia schedonnardii、棉花柄锈菌Puccinia cacabata、棉根腐病菌Phymatotrichopsis omnivora、甘蓝根肿菌Plasmodiophora brassicae、禾柄锈菌Puccinia graminis、叶锈菌Puccinia triticina、高粱柄锈菌Puccinia sorghi、枝氯霉Ramichloridium obovoideum、禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis、米根霉Rhizopus oryzae、微小根毛霉Rhizomucor pusillus、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、瓶霉Saksenaea vasiformis、菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、小麦壳针孢Septoria tritici、叶枯壳针孢Septoria nodorum、尖端赛多孢子菌Scedosporium apiospermum、多育赛多孢子菌Scedosporium prolificans、申克孢子丝菌Sporothrix schenckii、玉蜀黍壳柱孢(色二孢)菌Stenocarpella(Diplodia)maydis、总状共头霉Syncephalastrum racemosum、烟草根黑腐病菌Thielaviopsis basicola、小麦矮腥黑粉病菌Tilletia controversa、印度腥黑粉菌Tilletia indica、龋齿腥黑粉菌Tilletia caries、红色毛癣菌Trychophyton rubrum、须毛癣菌Trychophytonmentagrophytes、指间毛癣菌Trychophyton interdigitales、断发毛癣菌Trychophytontonsurans、白吉利毛孢子菌Tricosporon beigelii、阿萨希毛孢子菌Trichosporonasahii、皮瘤毛孢子菌Trichosporon inkin、星状毛孢子菌Trichosporon asteroides、皮状毛孢子菌Trichosporon cutaneum、龙贡毛孢子菌Trichosporon domesticum、粘状毛孢子菌Trichosporon mucoides、卵形毛孢子菌Trichosporon ovoides、茁芽毛孢子菌Trichosporon pullulans、loubieri毛孢子菌Trichosporon loubieri、japonicum毛孢子菌Trichosporon japonicum、小麦黑粉菌Ustilago tritici、玉蜀黍黑粉菌Ustilagozeae、大丽轮枝菌Verticillium dahliae和皮炎外瓶霉Wangiella dermatitidis。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素和肽局部地应用到人、动物、植物或环境场所。

16.一种制剂或细胞或植物提取物，其包含植物防御素或其功能性合成的或天然的衍生物或变体和选自导管素肽、发卡肽、二硫桥接已经被去除的发卡肽、indolicidin、合成的肽CP-29和衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的肽的非防御素肽的组合，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

17.根据权利要求16所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述植物防御素是透化防御素。

18.根据权利要求17所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述透化防御素是II类茄属防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体。

19.根据权利要求16所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述制剂是沐浴露或洗发水。

20.权利要求16至19中任一项所述的制剂或细胞或植物提取物在制备用于治疗或预防人或动物受试者的病原体的药物中的用途。

21.一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和选自导管素肽、发卡肽、二硫桥接已经被去除的发卡肽、indolicidin、合成的肽CP-29、衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的肽和衍生自蛋白酶抑制剂的肽的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

22.一种转基因植物或其后代或植物的种子，其表达异源性防御素和非防御素肽，所述非防御素肽选自导管素肽、发卡肽、二硫桥接已经被去除的发卡肽、indolicidin、合成的肽CP-29和衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的肽，所述植物显示对病原体增强的耐受性。

23.根据权利要求22所述的转基因植物，其中所述防御素选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物。

24.根据权利要求22所述的转基因植物，其中所述导管素肽选自牛抗菌肽、LL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31和KS-30。

25.根据权利要求22所述的转基因植物，其中所述发卡肽是α-发卡蛋白，其选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、luffin P1、MBP1、MiAMP2d、C2和VhT1。

26.根据权利要求22所述的转基因植物，其中所述发卡肽是β-发卡，其选自蝎血素、牛抗菌肽、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素和猪抗菌肽。

27.根据权利要求22所述的转基因植物，其中所述去除二硫桥接的肽是Bac2A或EcAMP4A。

28.根据权利要求22所述的转基因植物，其中所述衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂的肽选自SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

权利要求书：

修改的权利要求书1-28项替换原权利要求书1-53项。

Claims

1.一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是植物防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体和非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

6.根据权利要求6所述的方法，其中所述防御素变体选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽从约0.4至约12kD。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述肽小于约5kD。

9.根据权利要求1或7或8所述的方法，其中所述肽是α-螺旋肽或肽、通过二硫桥接稳定化形成发卡的肽、具有伸展构象的肽、特异性氨基酸富集的肽或衍生自蛋白酶抑制剂的肽。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽是衍生自人、非人灵长动物、啮齿动物、猪动物、牛动物、绵羊动物、马动物和山羊动物的导管素肽。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述导管素选自牛抗菌肽、LL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31和KS-30。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽是发卡肽。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述发卡肽是α-发卡蛋白，其选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、luffin P1、MBP1、MiAMP2d、C2和VhT1。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述发卡肽是β-发卡，其选自蝎血素、牛抗菌肽、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素和猪抗菌肽。

15.根据权利要求9所述的方法，其中去除稳定化二硫桥接的肽是Bac2A或EcAMP4A。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽是衍生自蛋白酶抑制剂的肽，其选自SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)。

17.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽是特异性氨基酸富集的indolicidan。

18.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽是合成的肽CP-29。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原体是植物病原体。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原体是动物或人病原体。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述病原体选自真菌和微生物病原体。

22.根据权利要求10所述的方法，其中所述病原体是真菌生物。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述真菌生物选自链格孢属Alternaeria spp、曲霉菌属Aspergillus spp、念珠菌属Candida spp、镰刀菌属Fusarium spp、发癣菌属Trichophyton spp、隐球菌属Cryptococcus spp、组织胞浆菌属Histoplasma spp、小孢子菌属Microsporum spp、青霉菌属Penicillium spp、肺孢子虫属Pneumocystis spp、毛孢子菌属Trichosporon spp、丝孢菌属Scedosporium spp、拟青霉属Paeciliomyces spp、支顶孢属Acremonium spp、葡萄穗霉属Stachybotrys spp和暗色霉菌。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述真菌生物选自链格孢菌Alternariaalternata、烟曲霉菌Aspergillus fumigatus、黑曲霉菌Aspergillus niger、黄曲霉菌Aspergillus flavus、构巢曲霉菌Aspergillus nidulans、寄生曲霉菌Aspergillusparaciticus、白色念珠菌Candida albicans、杜氏念珠菌Candida dubliniensis、无名念珠菌Candida famata、光滑念珠菌Candida glabrata、吉利蒙念珠菌Candidaguilliermondii、黑马朗念珠菌Candida haemulonii、乳酒念珠菌Candida kefyr、克鲁斯念珠菌Candida krusei、葡萄牙念珠菌Candida lusitaniae、挪威念珠菌Candidanorvegensis、近平滑念珠菌Candida parapsilosis、热带念珠菌Candida tropicalis、维斯念珠菌Candida viswanathii、絮状表皮癣菌Epidermophyton floccosum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、茄病镰刀菌Fusarium solani、串珠镰刀菌Fusarium monoliforme、红色毛癣菌Trychophyton rubrum、须毛癣菌Trychophyton mentagrophytes、指间毛癣菌Trychophyton interdigitales、断发毛癣菌Trychophyton tonsurans、新型隐球菌Cryptococcus neoformans、格特隐球菌Cryptococcus gattii、格鲁比隐球菌Cryptococcus grubii、犬小孢子菌Microsporum canis、石膏样小孢子菌Microsporumgypseum、马尔尼菲青霉菌Penicillium marneffei、白吉利毛孢子菌Tricosporonbeigelii、阿萨希毛孢子菌Trichosporon asahii、皮瘤毛孢子菌Trichosporon inkin、星状毛孢子菌Trichosporon asteroides、皮状毛孢子菌Trichosporon cutaneum、龙贡毛孢子菌Trichosporon domesticum、粘状毛孢子菌Trichosporon mucoides、卵形毛孢子菌Trichosporon ovoides、茁芽毛孢子菌Trichosporon pullulans、loubieri毛孢子菌Trichosporon loubieri、japonicum毛孢子菌Trichosporon japonicum、尖端赛多孢子菌Scedosporium apiospermum、多育赛多孢子菌Scedosporium prolificans、多变拟青霉Paecilomyces variotii、淡紫色拟青霉Paecilomyces lilacinus、直立顶孢霉Acremoniumstricutm、斑替支孢霉Cladophialophora bantiana、皮炎外瓶霉Wangielladermatitidis、枝氯霉Ramichloridium obovoideum、深褐毛壳菌Chaetomiumatrobrunneum、Dactlaria gallopavum、双极霉属Bipolaris spp、喙状明脐菌Exserohilumrostratum以及伞枝犁头霉Absidia corymbifera、雅致鳞质霉Apophysomyces elegans、印度毛霉菌Mucor indicus、微小根毛霉Rhizomucor pusillus、米根霉Rhizopus oryzae、灰色小克银汉霉Cunninghamella bertholletiae、屈弯科克霉Cokeromyces recurvatus、瓶霉Saksenaea vasiformis、总状共头霉Syncephalastrum racemosum、蛙生蛙粪霉Basidiobolus ranarum、冠状耳霉Conidiobolus coronatus/异孢耳霉Conidiobolusincongruus、皮炎芽生菌Blastomyces dermatitidis、粗球孢子菌Coccidioides immitis、posadasii孢子菌Coccidioides posadasii、组织胞浆菌Histoplasma capsulatum、巴西副球孢子菌Paracoccidioides brasiliensis、波氏假阿利什霉Pseudallescheria boydii和申克孢子丝菌Sporothrix schenckii。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述真菌生物选自镰刀菌属Fusarium、轮枝菌属Verticillium、腐霉菌属Pythium、丝核菌属Rhizoctonia、核盘霉属Sclerotinia、小球腔菌属Leptosphaeria、疫霉属Phytophthora、炭疽菌属Colletotrichum、尾孢菌属Cercospora、链格孢属Alternaria和锈菌的物种。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述真菌生物选自禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum、尖孢镰刀菌棉花专化型Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum(Fov)、禾生炭疽菌Colletotrichum graminicola、十字花科小球腔菌Leptosphaeria maculans、甘蓝链格孢菌Alternaria brassicicola、链格孢菌Alternaria alternata、构巢曲霉菌Aspergillus nidulans、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、菜生尾孢菌Cercosporabeticola、玉蜀黍灰斑病菌Cercospora zeae maydis、异旋孢腔菌Cochliobolusheterostrophus、大斑病菌Exserohilum turcicum、黄色镰刀菌Fusarium culmorum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、尖孢镰刀菌瞿麦专化型Fusarium oxysporum f.sp.dianthi、尖孢镰刀菌番茄专化型Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici、茄病镰刀菌Fusariumsolani、伪禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum、轮枝镰刀菌Fusariumverticilloides、禾顶囊壳小麦变种Gaeumannomyces graminis var.tritici、甘蓝根肿菌Plasmodiophora brassicae、菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、玉蜀黍壳柱孢(色二孢)菌Stenocarpella(Diplodia)maydis、烟草根黑腐病菌Thielaviopsis basicola、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、玉蜀黍黑粉菌Ustilago zeae、高粱柄锈菌Pucciniasorghi、菜豆壳球孢菌Macrophomina phaseolina、大豆茎褐腐病菌Phialophora gregata、大豆茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum、大豆灰斑病菌Cercospora sojina、大豆疫霉菌Phytophthora sojae、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、豆薯层锈菌Phakopsorapachyrhizi、大孢链格孢Alternaria macrospora、棉尾孢菌Cercospora gossypina、甜菜茎点霉Phoma exigua、乱子草柄锈菌Puccinia schedonnardii、棉花柄锈菌Pucciniacacabata、棉根腐病菌Phymatotrichopsis omnivora、燕麦镰刀菌Fusarium avenaceum、白菜黑斑病菌Alternaria brassicae、莱菔子链格孢菌Alternaria raphani、白粉病菌Erysiphe graminis(布氏白粉菌Blumeria graminis)、小麦壳针孢Septoria tritici、叶枯壳针孢Septoria nodorum、玉蜀黍球腔菌Mycosphaerella zeae、禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis、小麦黑粉菌Ustilago tritici、禾柄锈菌Puccinia graminis、叶锈菌Puccinia triticina、印度腥黑粉菌Tilletia indica、龋齿腥黑粉菌Tilletiacaries和小麦矮腥黑粉病菌Tilletia controversa。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素和肽局部地应用到人、动物、植物或环境场所。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素和肽非局部地应用到人或动物。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素和/或肽通过植物细胞或微生物细胞生产。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素和肽中的一种局部地应用到植物，并且另一种由植物细胞或微生物细胞生产。

31.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素和/或肽的一种或另一种或两种包含在植物或微生物提取物中。

32.一种制剂或细胞或植物提取物，其包含植物防御素或其功能性合成的或天然的衍生物或变体和非防御素肽的组合，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

33.根据权利要求32所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述植物防御素是透化防御素。

34.根据权利要求33所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述透化防御素是II类茄属防御素或其功能性天然的或合成的衍生物或变体。

35.根据权利要求32、33或34所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述制剂是局部制剂。

36.根据权利要求35所述的制剂或细胞或植物提取物，其中所述局部制剂是沐浴露或洗发水。

37.根据权利要求32、33、34或35所述的制剂，其包含的肽选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)。

38.权利要求30至37中任一项所述的制剂或细胞或植物提取物在制备用于治疗或预防人或动物受试者的病原体的药物中的用途。

39.一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物和非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

40.一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

41.一种用于抑制真菌病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使真菌病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

42.一种用于抑制微生物病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使微生物病原体与有效量的组合接触，所述组合是选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的植物防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素变体或衍生物，和选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、EcAMP1、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)的非防御素肽的组合，与以组合中所使用的相同的个体剂量单独使用每种相比，防御素和肽的组合是协同的。

43.一种转基因植物或其后代或植物的种子，其表达异源性防御素和非防御素肽，所述植物显示对病原体增强的耐受性。

44.根据权利要求42所述的转基因植物，其中所述防御素选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物。

45.根据权利要求43或44所述的转基因植物，其表达非防御素肽，所述非防御素肽选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)。

46.一种分离的微生物，其经基因修饰以表达选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL013和HXL015的防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，和/或选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)的肽。

47.一种组合物，其包含权利要求43所述的微生物。

48.一种制剂，其包含植物提取物，所述植物提取物包含选自NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD172、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035和HXL036的防御素或选自HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95和HXP107的防御素的变体或衍生物，所示制剂还包含选自Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、牛抗菌肽、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、Bac2A、indolicidin、CP-29、蝎血素、鲎抗菌肽(F12I)、鲎抗菌肽I、鲎抗菌肽II、鲎素II、gomesin、死亡素、猪抗菌肽、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)和CC7(71-104)的非防御素肽。

49.一种用于抑制病原体的生长或感染或侵袭的方法，所述方法包括使病原体与有效量的α-发卡蛋白或β-发卡或其功能性天然的或合成的衍生物或变体接触，所述α-发卡蛋白或β-发卡或其功能性天然的或合成的衍生物或变体的浓度高于在与植物防御素组合使用时抑制生长或感染或侵袭所需要的浓度。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述病原体是真菌病原体。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述真菌病原体选自镰刀菌属Fusarium sp、毛盘孢属Colletotrichum sp、酵母菌属Saccharomyces sp、念珠菌属Candida sp和毛癣菌属Trichophyton sp。

52.根据权利要求51所述的方法，其中选自禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、禾生炭疽菌Colletotrichum graminicola、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、白色念珠菌Candida albicans和红色毛癣菌Trichophyton rubrum。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述α-发卡蛋白或β-发卡选自CilHPN_14F、OsaHPN_86B、SitHPN_100A、SbiHPN_104C、SbiHPN_104I、EcAMP1、蝎血素和鲎抗菌肽I。