CN112195108B - 枝孢瓶霉菌株ms2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及枝孢瓶霉菌株MS2及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.20238的新菌株Cladophialophora sp.MS2，能够在植物根部定殖，有效促进植物生长且还起到防治番茄青枯病的作用：其对番茄平皿苗的干重提高能力达到115.64％；对盆栽苗的平均株高提高了17.33％；对感青枯病番茄品种：金石红冠608的田间青枯病防治效果，第20d达到了100％，第35d达到了50％，有效提高了感青枯番茄品种对青枯病的抵抗能力，防效明显，是一株具有良好促生、防病的枝孢瓶霉菌株；能很好促进植物生长，并具有防治番茄青枯病的作用。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及枝孢瓶霉菌株MS2及其应用。
【背景技术】
内生真菌是一类能够寄生在植物根部组织内的真菌，在对内生真菌进行研究的过程中发现，有部分内生真菌除了能够寄生在植物根部外，还对植物具有促生和防病等功效，申请人团队一直致力于对内生真菌进行研究，目前已筛选出多株具有良好生物学特性的内生真菌，发现自然界的内生真菌极其丰富，形态各异，分类更是丰富，目前也发现了枝孢瓶霉属内生真菌具有促进植物生长的效果，例如，申请人自行申请的专利：申请号为201910884589.9发明名称为《枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用》的内生真菌，该真菌由申请人从柳州的甘蔗围土壤分离而得，属于Cladophiaphora属新种，具有促进铁皮石斛、西红柿生长的作用，且具有防治香蕉枯萎病的作用；该菌株虽然与本申请同属，但不同种，在系统发育树落在不同的分支上。申请号为201910914405.9发明名称为《一种广藿香内生真菌的分离筛选方法》的内生真菌，该真菌由惠州学院从广藿香植株内分离得到，该专利分离出了多株菌株分别属于黄丝曲霉(Talaromyces)属和齿毛菌(Cerrena)属；并具有防治番茄青枯病的功效，但是该申请的菌株与本申请并不同属；由此可见，内生真菌资源是极其丰富的，在生物农业领域有着广阔的开发利用前景，利用得好，将能部分替代化学农药和肥料，减少对环境的污染，提高作物的品质；为此，为了加强对内生真菌的利用，筛选出多种内生真菌种质资源尤为重要，种质资源的丰富能有效推动内生真菌在农业自然环境保护上的利用和发展。
【发明内容】
鉴于上述内容，筛选出更多性状优良促生内生真菌，促进内生真菌种质资源的开发利用，本发明目的在于提供一种枝孢瓶霉菌株MS2及其应用及其在促进番茄生长、防治番茄青枯病上的应用。
为达到上述目的，本发明筛选出一株枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2，其保藏编号为CGMCC NO.20238。属于真菌界，Cladophialophora属。所述内生真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20238，保藏日期为2020年08月10日。
本发明还包括所述枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2在促进植物生长上的应用。
进一步的，所述植物为番茄和/或铁皮石斛。
本发明还包括一种应用所述枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2促进植物生长的方法，所述方法为：将菌株MS2直接接种到植物的组培苗和/或植株中。
本发明还包括所述枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2在防治番茄青枯病上的应用。
本发明还包括一种应用所述枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2对番茄青枯病进行防治的方法，所述方法为：将菌株MS2直接接种到番茄植株中。
进一步的，所述菌株MS2接种到番茄植株中采用灌根法：将MS2菌丝配制成菌液后向番茄的盆栽苗实行灌根，灌根时，菌液中的活菌数含量为：5×105cfu/mL；每次灌根30mL，共灌根3次，每次间隔15d。
本发明具有以下有益效果：
本申请的新菌株Cladophialophora sp.MS2能够在植物根部定殖，有效促进植物生长且还起到防治番茄青枯病的作用：其对番茄平皿苗的干重提高能力达到115.64％；对盆栽苗的平均株高提高了17.33％；对感青枯病品种：金石红冠608的第20d防效达到了100％，第35d防效达到了50％，有效提高了感青枯番茄品种对青枯病的防护能力，防效明显，是一株具有良好促生、防病的新种枝孢瓶霉菌株；能很好促进植物生长，并具有防治番茄田间青枯病的作用。
【附图说明】
图1为本发明MS2菌株在CMMY培养基上的菌落正面形态图；
图2为本发明MS2菌株在CMMY培养基上的菌落背面形态图；
图3为本发明MS2的ITS+LSU构建的系统发育树图；
图4为本发明菌株MS2对番茄平皿苗生长的影响，图中左边平皿为不接种MS2的对照组，右边平皿为接种MS2的实验组；
图5为本发明菌株MS2的有隔菌丝在番茄根部的定殖情况图；
图6为本发明菌株MS2对番茄盆栽苗生长的影响，图中左边平皿为不接种MS2的对照组，右边平皿为接种MS2的实验组；
图7为本发明菌株MS2对铁皮石斛平皿苗生长的影响，图中左边平皿为不接种MS2的对照组，右边平皿为接种MS2的实验组；
图8为本发明未施用MS2菌液的对照组番茄青枯病的发生情况；
图9为本发明施用MS2菌液的处理组对番茄青枯病的防效图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本发明提供了一株枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2，其保藏编号为CGMCCNO.20238。属于真菌界，Cladophialophora属。所述内生真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.20238，保藏日期为2020年08月10日。
菌株MS2分离自广西南宁市马山县百龙滩镇六罗村那便屯甘蔗根围土壤(北纬N23°47′22.88″，东经E 108°09′14.80″海拔：139.5米)。菌株MS2的分类标准如下：
1、菌株的形态学分类
该菌株在CMMY培养基上的菌落形态图如图1所示，从图1可见，该菌株在CMMY平板培养基上的菌落形态如图1和图2所示，28℃下培养两周后菌落直径30-35mm，近圆形至圆形，灰色，细绒状。菌株不产生分生孢子。
2、分子生物学鉴定
该菌株的ITS、LSU和SSU基因序列与枝孢瓶霉属Cladophialophora sp.的相似性分别为98.53％、98.85％和99.12％。把Cladophialophora属下的已知近缘种和MS2的ITS+LSU序列一起构建系统发育树，结果显示，MS2与Cladophialophora属下的chaetospira以80％的支持率聚在一个分支。由于MS2菌株没有产生分生孢子，鉴于目前掌握的鉴定信息，将该菌株鉴定为Cladophialophora sp.其构建的系统发育树图如图3所示。
实施例2：
对番茄平皿苗的促生长作用：
(1)使用培养基燕麦培养基(燕麦粉10g/L，琼脂8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO41.5g/L，NaNO3 1g/L)培养菌株MS2，在28℃条件下培养10d，得到MS2菌落；
(2)将饱满的番茄种子进行常规消毒、催芽后，移栽至步骤(1)培养好的MS2菌落上，每个菌落分别移栽1株番茄苗，每个平皿3株番茄苗，将接种了MS2菌落的平皿命名为处理组，同时，同步将步骤(1)的番茄苗移栽到未接种MS2菌株的空白OMA培养基上做为对照CK组，CK组每个平皿也移栽3株番茄苗；
(3)将步骤(2)的处理组和CK组放入培养箱中进行培养，培养条件一致：温度为25℃，光照强度为180μmol m-2s-2，光照时间为16h。
本实施例的番茄苗品种为：特级大明星F1杂交一代西红柿(广州省湛江市大地蔬菜种子有限公司)
上述处理每个处理组和CK组分别重复4次，在步骤(3)的培养条件下培养14d后，将番茄苗根部洗干净后，在50℃烘箱中烘烤3d，称量干重，得到结果如表1所示：
表1菌株MS2对番茄苗生长的影响
| 处理组 | 干重(g) |
| MS2 | 0.2440 |
| MS2 | 0.1999 |
| MS2 | 0.2990 |
| MS2 | 0.2060 |
| 平均 | 0.2372 |
| 对照 | 0.1100 |
由表1可知，处理组接种了MS2菌株后，番茄的平均干重明显高于对照CK组，提高率达到115.64％，提高效果明显。
图4是菌株MS2对番茄平皿苗生长的影响，图中左边平皿为不接种MS2的对照组，右边平皿为接种MS2的实验组，图中明显可见右边平皿的长势优于左边平皿。
对番茄苗的根部进行解剖并镜检，结果如图5所示，可见在番茄苗的根部组织出现了隔膜状的长条菌丝，由此说明MS2菌株已定殖到番茄苗根部。
实施例3：
对番茄盆栽的促生长作用：
(1)将MS2菌株活化后接种于PSB培养基中，在28℃，120r/min条件下振荡培养10d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液备用；
(2)将新鲜红壤与灭菌基质按照质量比为8:1的比例混合，等量装入8×8cm的育苗杯中待用；将番茄种子用流水冲洗后泡种1h播种，每杯播一粒种子，浇水，盖膜；
(3)待步骤(2)的番茄长出1～2片复叶后用步骤(1)的菌液对步骤(2)的番茄苗进行灌根接种，即向每株番茄苗灌溉菌液30mL，共灌溉3次，每次间隔15d；并以等量的蒸馏水为对照CK(即30mL/次/株，共灌溉3次，每次间隔15d)；
本实施例采用的番茄品种为：金石红冠608
上述每个处理设3个重复，每个重复10株，然后测量末次接种第4d的番茄株高。具体结果如表2所示：
表2接种MS2对番茄盆栽苗生长的影响
| 处理 | 平均株高(cm) |
| 接种MS2 | 20.58 |
| 对照 | 17.54 |
由表2可知，接种了菌株MS2后番茄盆栽苗的株高明显高于对照组，平均株高提高了17.33％。
图6为本发明菌株MS2对番茄盆栽苗生长的影响，图中左边平皿为不接种MS2的对照组，右边平皿为接种MS2的实验组，图中明显可见右边盆栽番茄的长势优于左边盆栽番茄。
实施例5：
对铁皮石斛组培苗的生长影响：
(1)使用培养基(KCL 0.8g，MgSO4·7H2O 1.2g，CaPO4 2.5g，NaNO3 1.2g，燕麦粉8g，琼脂粉12g，蒸馏水定容至1 000ML)培养菌株MS2，在28℃条件下培养10d，得到MS2菌落；
(2)选择大小长势一致的铁皮石斛组培苗，移栽至步骤(1)培养好的MS2菌落上，每个菌落分别移栽1株铁皮石斛苗，每个平皿3株铁皮石斛苗，将接种了MS2菌落的平皿命名为处理组，同时，同步将步骤(1)的铁皮石斛苗移栽到未接种MS2菌株的空白燕麦培养基上作为对照CK组，CK组每个平皿也移栽3株铁皮石斛苗；
(3)将步骤(2)的处理组和CK组放入培养箱中进行培养，培养条件一致：温度为23℃，光照强度为180μmol m-2s-2，光照时间为16h。
上述处理每个处理组和CK组分别重复4次，在步骤(3)的培养条件下培养60d后，将铁皮石斛植株的根部洗干净后，在50℃烘箱中烘烤3d，称量干重，得到结果如表3所示：
表3菌株MS2对铁皮石斛组培苗生长的影响
| 处理 | 株高(cm) | 茎宽(mm) | 鲜重(g) | 干重(g) |
| CK | 4.1±0.2a | 2.1±0.1a | 0.46±0.01bB | 0.08±0.01a |
| MS2 | 4.9±0.3a | 2.6±0.4a | 0.67±0.08aA | 0.10±0.02a |
注：不同的英文字母表示同一列比较具有统计学的显着差异(P<0.05)。
由表3可知，处理组接种了MS2菌株后，铁皮石斛的株高、茎宽、鲜重、干重的平均值均高于CK组，其中，株高提高了19.51％、茎宽提高了23.81％、鲜重提高了45.65％、干重提高了25.00％；但株高、茎宽和干重未达到显著水平，而鲜重达到了极显著水平，由此说明，菌株MS2对铁皮石斛的鲜重提高幅度最大。
图7是菌株MS2对铁皮石斛组培苗苗生长的影响，图中左边平皿为不接种MS2的对照组，右边平皿为接种MS2的实验组，图中明显可见右边平皿的长势优于左边平皿。
实施例4：
对番茄青枯病的影响：
本实施例采用感青枯病品种：金石红冠608(南宁桂研种业有限公司生产)做为实验材料，将番茄种子先按照实施例3的处理方法进行盆栽种植和接种，然后移栽至大田，进行大田种植观察，移栽方法为：在末次接种后4d将番茄苗移栽至大田，株行距30×40cm；对大田进行观察、记录分别于移栽后20d、35d对处理组和对照组进行观察，记录发病株数，计算发病率、防治效果，计算公式如下：
通过上述公式的计算，本申请实验菌株MS2对番茄青枯病的防治效果如表4所示：
表4菌株MS2对番茄青枯病的田间防治效果
由表4可见，在番茄中接种MS2菌株后能提高对番茄青枯病的抗性，田间移栽第20天，其防效达到了100％；田间移栽第35天，其防效达到了50％，防治效果显著。
图8为未施用MS2菌液的对照组番茄青枯病的发生情况，图中为移栽第35d番茄苗的生长情况，可见，感青枯病品种：金石红冠608在田间表现为叶片大幅萎蔫，生长能力极差，基本不能生长；
图9为本发明施用MS2菌液的处理组对番茄青枯病的防效图，图中为移栽第35d番茄苗的生长情况，可见，感青枯病品种：金石红冠608接种了MS2菌液后，其感病情况得到改善，虽然田间也有叶片萎蔫，但是较对照组相比，生长状态明显优于对照组。
综上所述，本申请的枝孢瓶霉菌株Cladophialophora sp.MS2能起到促进植物生长、防治番茄青枯病的作用，是一种对植物有良好促生长和疾病防效的菌株，能很好的和植物共生。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (6)
1.枝孢瓶霉菌株(Cladophialophora sp.)MS2，其保藏编号为CGMCC NO.20238。
2.如权利要求1所述枝孢瓶霉菌株(Cladophialophora sp.)MS2在促进植物生长上的应用；所述植物为番茄和/或铁皮石斛。
3.一种应用如权利要求1所述枝孢瓶霉菌株(Cladophialophora sp.)MS2促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株MS2直接接种到植物的组培苗和/或植株中；所述植物为番茄和/或铁皮石斛。
4.如权利要求1所述枝孢瓶霉菌株(Cladophialophora sp.)MS2在防治番茄青枯病上的应用。
5.一种应用如权利要求1所述枝孢瓶霉菌株(Cladophialophora sp.)MS2对番茄青枯病进行防治的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株MS2直接接种到番茄植株中。
6.根据权利要求5所述枝孢瓶霉菌株(Cladophialophora sp.)MS2对番茄青枯病进行防治的方法，其特征在于，所述菌株MS2接种到番茄植株中采用灌根法：将MS2菌丝配制成菌液后向番茄的盆栽苗实行灌根，灌根时，菌液中的活菌数含量为：5×105cfu/mL；每次灌根30mL，共灌根3次，每次间隔15d。
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