CN113621620B - 具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。本发明的基因Lnc40766或基因Toll‑like receptor 6通过小菜蛾总RNA提取、cDNA合成和设计特异引物扩增获得。同时提供了干扰基因Lnc40766表达的dsRNA的制备和干扰基因Toll‑like receptor 6表达的dsRNA的制备。将Lnc40766基因的dsRNA微量注射到小菜蛾3龄幼虫体内后，Lnc40766基因和靶基因Toll‑like receptor 6的表达水平显著降低。经蝉拟青霉侵染后，幼虫死亡率显著提高。表明基因Lnc40766基因和基因Toll‑like receptor 6均具有调控小菜蛾免疫功能的作用，可作为小菜蛾害虫防治的可能靶标。本发明也可为新的害虫生物防治方法提供理论基础。

Description

具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种与调控小菜蛾免疫功能相关的基因及其制备方法和应用。
背景技术
作为世界上农作物有害生物危害最严重的国家之一，我国常见的农业害虫有860多种，重大农业害虫达20多种，危害严重，损失惊人(陆宴辉等，2017)。小菜蛾(Plutellaxylostella)便是一种十字花科蔬菜上的重要害虫，该害虫全球控制和损害费用估计每年为40-50亿美元(Li等，2016)。化学杀虫剂是控制小菜蛾的最有效工具，但由于其长期不合理使用，导致其已经对多种类型杀虫剂产生了抗药性。发展生物防治技术有效持久控制小菜蛾危害十分必要。昆虫病原真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，昆虫疾病中60％以上由病原真菌引起(Roberts等，1981)。目前利用昆虫病原真菌或病原菌产生毒素来防治害虫是害虫生物防治研究的重要领域，许多病原真菌已被开发成为对环境安全且友好的杀虫真菌产品。利用病原真菌进行生物防治成功的一个关键在于了解寄主昆虫的免疫防御机制。因此阐明小菜蛾对病原真菌的免疫机制可为新的害虫控制方法及可能的靶标提供理论基础。
由于缺乏获得性免疫反应，昆虫主要依靠其自身的天然免疫来抵御各种病原物的入侵(Lemaitre和Hoffmann,2007)。昆虫的天然免疫反应包括细胞免疫和体液免疫(Merkling和Lambrechts，2020)。体液免疫包括诱导抗菌肽产生的信号通路、涉及多酚氧化酶的黑化和凝固反应等。昆虫一旦失去天然免疫的保护，对病原微生物的侵染将变得敏感，其生存将受到严重影响。先天免疫缺失的昆虫(基因突变所致)或人为的抑制昆虫的天然免疫关键基因(例如RNAi介导的基因干扰和CRISPR-Cas9技术)，昆虫对病原微生物的抵抗力将减弱(Takahashi等，2015；Vogel等，2019；Yuan等，2020)。因而通过人为阻断昆虫天然免疫成为新的害虫生物防治策略。研究表明众多编码蛋白基因参与了昆虫的天然免疫。长期以来，编码蛋白基因一直被认为是生物过程中关键的调节因子。然而过去的十多年中，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)发现并被证明亦具有重要的调节功能(Li等，2019)。ncRNA代表不编码蛋白质但具有调节其他基因功能的一部分RNA。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)(Fatica和Bozzoni, 2013)既是ncRNA的其中一种。
LncRNA通常定义为长度超过200个核苷酸，缺少明显长度的开放阅读框。目前在人类基因组数据库中记录了16,066个lncRNA基因和29,566个lncRNA转录本。虽然LncRNA 通常表现出较差的进化保守性，但它们在各种生物学途径中发挥着重要作用。昆虫LncRNA的研究仍处于早期阶段，主要涉及发育、行为或神经等研究领域，许多研究主要集中在LncRNAs的鉴定和它们的差异表达检测上，而深入的功能分析较少。在丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的一项关于睾丸组织转录组的研究发现存在四种推定的LncRNA(Akbari等，2013)。在家蚕中，结合18种不同组织的深度转录组测序，Taguchi等(2011)发现了低表达水平的LncRNA，发现一些lncRNA具有高的空间特异性和低的序列保守性。推测一部分LncRNA 参与了家蚕Bombyx mori丝蛋白的生物合成、易位和分泌。Li等(2014)观察到一些LncRNA从B. mori的丝腺体被转录，并报告它们参与了表观遗传学对转录的抑制组蛋白的修饰。
在免疫方面，在哺乳动物中研究发现LncRNA可调节先天免疫应答。例如Guttman研究小组(2009)报告通过TNFα激活的炎症信号可诱导小鼠LncRNAs集合。其中LncRNA-Lethe负调控核因子κB，并直接参与控制炎症反应(Rapicavoli等，2013)。在人类肝细胞中，Xie等(2018)发现LncRNA ITPRIP-1参与病毒感染，通过靶向黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)在病毒触发的IFN信号通路中发挥关键作用。在昆虫中，Satyavathi等(2017)发现几种lncRNA在感染家蚕核多角体病毒(BmNPV)家蚕中选择性表达。比较研究lncRNA和免疫基因的水平表达表明，LncRNA4跟随类似于Toll4的相似表达模式，推测lncRNA4显示参与Toll信号通路。最近，Valanne等(2019)发现果蝇感染藤黄微球细菌Micrococcus luteus可引起LincRNA-IBIN高表达。LincRNA-IBIN可在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染的果蝇成虫、寄生蜂寄生的幼虫、以及在未受攻击的果蝇中激活的Toll或Imd途径中诱导表达。感染后，LincRNA-IBIN在脂肪体内、血细胞和肠道中表达，其表达受NF-κB信号传导调控。
综合上述LncRNA在昆虫中研究进展可以看出，虽然很多昆虫LncRNA等被鉴定出来，但它们在昆虫免疫防御病原真菌侵染中的确切功能、调控机制知之甚少。蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)是半知菌纲拟青霉属病原真菌，其对小菜蛾具有较高致病性。目前小菜蛾LncRNA研究主要涉及抗药性及生长发育等方面(Liu等，2017)，并无小菜蛾LncRNA参与免疫方面的研究，也并未有从LncRNA方面厘清它们在小菜蛾抵御病原真菌-蝉拟青霉侵染中的作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，一种具有调节小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供一种具有调控小菜蛾免疫功能的基因，所述基因为基因Lnc40766或基因Toll-like receptor 6，所述基因Lnc40766的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，所述基因Toll-like receptor 6的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供一种上述具有调控小菜蛾免疫功能的基因Lnc40766的基因片段，该基因片段的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种上述具有调控小菜蛾免疫功能的基因Toll-like receptor 6的基因片段，该基因片段的核苷酸序列表如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种干扰上基因Lnc40766在昆虫体内表达的dsRNA，所述dsRNA获得方法为：
以合成的小菜蛾幼虫cDNA为模板，然后利用含T7聚合酶启动子序列的引物对A进行PCR扩增，扩增产物胶回收后按照高产率转录试剂盒操作说明进行dsRNA体外合成，并利用dsRNA纯化试剂盒纯化获得目标dsRNA；引物对A具体为：
F：TAATACGACTCACTATAGGGACTTCCCATTTGCAGGTA SEQ ID NO:5；
R：TAATACGACTCACTATAGGGCGTGTTTTGTGCTTTCC SEQ ID NO:6。
本发明还提供一种干扰上述基因Toll-like receptor 6在昆虫体内表达的dsRNA，所述dsRNA获得方法为：
以合成的小菜蛾幼虫cDNA为模板，然后利用含T7聚合酶启动子序列的引物对B进行PCR扩增，扩增产物胶回收后按照高产率转录试剂盒操作说明进行dsRNA体外合成，并利用dsRNA纯化试剂盒纯化获得目标dsRNA；引物对B具体为：
F：TAATACGACTCACTATAGGGAGACGGCTAACCTCACC SEQ ID NO:7；
R：TAATACGACTCACTATAGGGGCGTAAACAACCTTCAGT SEQ ID NO:8。
本发明还提供一种上述基因Lnc40766的制备方法，所述方法为：
以合成的小菜蛾幼虫cDNA为模板，利用特异引物对C，进行PCR扩增，获得扩增产物，扩增产物胶回收后即基因Lnc40766；其中特异引物对C具体为：
F：TTTTAACTATCTGTCGC SEQ ID NO:9；
R：CCGTGTTTTGTGCTTTCC SEQ ID NO:10。
本发明还提供一种上述基因Toll-like receptor 6的制备方法，其特征在于，所述方法为：
以合成的小菜蛾幼虫cDNA为模板，利用特异引物对D，进行PCR扩增，获得扩增产物，扩增产物胶回收后即基因Toll-like receptor 6；其中特异引物对D具体为：
F：ATGCTGCTAATACTAC SEQ ID NO:11；
R：TTATGCCAAAGACTCCG SEQ ID NO:12。
本发明还提供一种上述基因Lnc40766在防治害虫产品中的应用。
本发明还提供一种上述基因Toll-like receptor 6在防治害虫产品中的应用。
本发明还提供一种上述基因Lnc40766对应的dsRNA在防治害虫产品中的应用。
本发明还提供一种上述基因Toll-like receptor 6对应的dsRNA在防治害虫产品中的应用。
本发明的有益效果如下：本发明制备方法所得两种dsRNA可规模化工厂化生产，生产周期短，成本较低，制品得率较高，且不受外在环境得到影响。本发明所提供的小菜蛾基因Lnc40766和基因Toll-like receptor 6均被证实参与调控小菜蛾的免疫功能，基因Lnc40766在小菜蛾3龄幼虫和中肠中的表达量较高。蝉拟青霉、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌等微生物侵染小菜蛾幼虫后，可诱导基因Lnc40766的高水平表达。将基因Lnc40766对应的dsRNA微量注射到小菜蛾3龄幼虫体内后，基因Lnc40766和基因Toll-like receptor 6的表达水平均显著降低。基因Lnc40766对应的dsRNA及基因Toll-like receptor 6对应的dsRNA分别微量注射的小菜蛾龄幼虫经蝉拟青霉侵染后，其死亡率均显著提高。基因Lnc40766和基因Toll-like receptor 6具有调控小菜蛾免疫功能的作用，可作为小菜蛾害虫防治的可能靶标，两基因对应的dsRNA应用到小菜蛾害虫的生物防治上，能够减少害虫防治对化学农药的依赖性，缓解害虫抗药性的产生。
附图说明
图1基因Lnc40766与基因Toll-like receptor 6的相互作用位点分析。
图2小菜蛾基因Lnc40766在不同发育阶段的表达情况。
图3小菜蛾基因Lnc40766在不同组织的表达情况。
图4小菜蛾基因Lnc40766不同诱导方式下的表达情况。
图5扩增DNA模板与合成的dsRNA凝胶电泳图。
图6小菜蛾基因Toll-like receptor 6在不同诱导方式下的表达情况。
图7注射ds Toll-like receptor 6的小菜蛾对蝉拟青霉侵染的生物测定。
图8小菜蛾注射dsLnc40766后基因Lnc40766的表达水平分析。
图9小菜蛾注射dsLnc40766后基因Toll-like receptor 6的表达水平检测。
图10注射dsLnc40766后的小菜蛾对蝉拟青霉侵染的生物测定。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术，所有的仪器设备和原材料等均可从市场购得或是本行业常用的。
实施例1：小菜蛾基因Lnc40766制备
按照下述步骤进行小菜蛾基因Lnc40766的制备：
(1)根据Trizol试剂操作说明书要求对蝉拟青霉孢子悬浮液(1.0×107cfu/幼虫)侵染的小菜蛾3龄幼虫的总RNA进行提取，于紫外分光光度计下评估RNA的质量；
(2)参照PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara，中国北京)试剂盒说明进行小菜蛾cDNA合成。10μL反应体系：5×PrimeScript RT Master Mix 2.0μL，总RNA≤0.5μg，RNaseFree dH20补至10μL。混匀后置于PCR仪上进行，设置程序为：37℃15min；85℃5s；4℃1min；
(3)以合成的小菜蛾幼虫cDNA为模板，利用设计的特异引物对C，进行PCR扩增。其中特异引物对C具体为：
F：TTTTAACTATCTGTCGC SEQ ID NO:9；
R：CCGTGTTTTGTGCTTTCC SEQ ID NO:10；
PCR反应体系：Quick Taq HS DyeMix 12.5μL，上、下游引物各1.0μL，cDNA 0.5μL，灭菌水10μL。反应体系混合后置于PCR梯度仪上进行扩增，反应程序：94℃3min；94℃30s；55℃30s；72℃1min(39个循环)。用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0试剂盒对目的条带进行胶回收，回收的产物即为小菜蛾基因Lnc40766，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
实施例2：小菜蛾基因Toll-like receptor 6制备
按照实施例1总RNA及cDNA合成步骤进行小菜蛾幼虫cDNA的合成，利用设计的特异引物对D，进行小菜蛾Toll-like receptor 6基因的PCR扩增。其中特异引物对D具体为：
F：ATGCTGCTAATACTAC SEQ ID NO:11；
R：TTATGCCAAAGACTCCG SEQ ID NO:12；
参照实施例1PCR反应体系及反应程序进行PCR扩增。用Takara MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒对目的条带进行胶回收，回收的产物即为小菜蛾基因Toll-like receptor 6，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
实施例3：小菜蛾基因Lnc40766与基因Toll-like receptor 6间序列分析
基因Lnc40766核苷酸序列全长679bp。利用IntaRNA 2.0对基因Lnc40766与基因Toll-like receptor 6的相互作用位点进行预测分析，结果如图1所示。可以看出基因Lnc40766的186～207位的核苷酸与基因Toll-like receptor 6的877～895位的核苷酸序列部分互补结合，并且基因Lnc40766与基因Toll-like receptor 6在染色体上的位置临近，均在538663到575652之间，它们之间的距离在1K范围内，暗示基因Lnc40766可能与基因Toll-like receptor 6发生作用。基因Toll-like属于Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)家族，是一个跨膜模式识别受体家族，能识别入侵的病原体种类，进而启动昆虫的先天性免疫应答，是昆虫先天免疫中重要的关键基因。
实施例4：基因Lnc40766在小菜蛾不同发育阶段的表达水平检测
分别收集小菜蛾卵、1龄、2龄、3龄、4龄幼虫、蛹和成虫，根据Trizol试剂操作说明书要求分别提取它们的总RNA。利用RT-qPCR方法进行Lnc40766在小菜蛾不同发育阶段的表达水平检测。具体如下：参照PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara，中国北京)试剂盒说明进行小菜蛾cDNA合成。使用Primer 5设计基因Lnc40766荧光定量PCR引物(上游引物：CTTAGTTATCTGCCTTCTC SEQ ID NO:13，下游引物：TCCTTTTCATGGTCCTT SEQ ID NO:14)。使用TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(Takara，中国北京)试剂盒说明配制荧光定量反应体系。将混合好的反应体系于荧光定量PCR仪上进行反应，94℃3min；94℃30s；60℃30s；72℃30s(39个循环)。小菜蛾Actin基因作为内参基因(上游引物：TGGCACCACACCTTCTAC，SEQ ID NO:15，下游引物：CATGATCTGGGTCATCTTCT，SEQ ID NO:16)，相对表达水平计算根据2-ΔΔCt算法进行计算，每个实验进行三次重复。
图2为基因Lnc40766在小菜蛾不同发育历期的表达结果。根据RT-qPCR结果显示，基因Lnc40766在小菜蛾3龄中的表达量明显比卵、1龄、2龄、4龄、蛹和成虫高。
图中，误差线代表平均值±标准误(n＝3)，字母表示差异显著水平(P＜0.05)。
实施例5：小菜蛾基因Lnc40766在不同组织中的表达水平检测
分别收集小菜蛾表皮、中肠、马氏管、脂肪体和血细胞组织，根据Trizol试剂操作说明书要求分别提取它们的总RNA。利用实施例4中的RT-qPCR方法进行小菜蛾不同组织中Lnc40766的表达水平检测。
基因Lnc40766在小菜蛾不同组织里的表达情况如图3所示。从图可以看出小菜蛾基因Lnc40766在中肠中(Mg)的表达量要显著高于表皮(Ep)、马氏管(Mt)、脂肪体(Ft)和血细胞(Hc)。
图3中，Ep：表皮；Mg：中肠；Mt：马氏管；Ft：脂肪体；Hc：血细胞。误差线代表平均值±标准误(n＝3)，字母表示差异显著水平(P＜0.05)。
实施例6：不同微生物诱导下小菜蛾基因Lnc40766表达水平检测
将1.0×107cfu/幼虫的蝉拟青霉孢子悬浮液(Pc)、1.0×106cfu/幼虫的金黄色葡萄球菌(Sa)和大肠杆菌(Ec)菌液对3龄小菜蛾幼虫进行诱导。分别收集各处理材料，根据Trizol试剂操作说明书要求分别提取它们的总RNA。利用实施例4中的RT-qPCR方法进行不同微生物诱导下小菜蛾基因Lnc40766表达水平检测。
RT-qPCR结果表明(图4)，基因Lnc40766在蝉拟青霉、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌等微生物诱导后的表达量明显高于对照组(ddH2O和CK)，暗示其在抵御微生物侵染中可能发挥免疫作用。
图4中，Pc：蝉拟青霉；Sa：金黄色葡萄球菌；Ec：大肠杆菌；ddH2O：灭菌水；CK：无处理。误差线代表平均值±标准误(n＝3)，字母表示差异显著水平(P＜0.05)。
实施例7：基因Lnc40766对应的dsRNA和基因Toll-like receptor 6对应的dsRNA体外合成
以合成的小菜蛾幼虫cDNA为模板，利用设计的含T7聚合酶启动子序列的引物对基因Lnc40766的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和基因Toll-likereceptor 6的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)分别进行PCR扩增，获得扩增产物。
其中：
对基因Lnc40766的片段扩增用的引物对A为：
F：TAATACGACTCACTATAGGGACTTCCCATTTGCAGGTA SEQ ID NO:5；
R：TAATACGACTCACTATAGGGCGTGTTTTGTGCTTTCC SEQ ID NO:6；
对基因Toll-like receptor 6的片段扩增用的引物对B为：
F：TAATACGACTCACTATAGGGAGACGGCTAACCTCACC SEQ ID NO:7；
R：TAATACGACTCACTATAGGGGCGTAAACAACCTTCAGT SEQ ID NO:8；
以含GFP的质粒为模板作为对照组，GFP扩增用引物对E为：
F：TAATACGACTCACTATAGGGAGGGCGAGGGCGATGCCACC，SEQ ID NO:17
R：TAATACGACTCACTATAGGGTGTACTCCAGCTTGTGCCCC SEQ ID NO:18为对照基因。
将三者PCR扩增后的产物进行1％凝胶电泳检测(图5A)，并用Takara MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒对目的条带进行胶回收，测定DNA的浓度和纯度。将胶回收的PCR产物用于合成对应dsRNA。按照TranscriptAid T7High YieldTranscription Kit(Thermo)试剂盒操作说明进行dsRNA体外合成，并利用dsRNA纯化试剂盒(GeneJET RNA Purification Kit)(Thermo，美国)纯化dsRNA。用1％琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000对纯化后的dsRNA质量和浓度进行检测(图5B)。结果表明，dsRNA片段大小及质量符合后续检测要求。
基因Lnc40766的片段对应所得dsRNA命名为ds Lnc40766，基因Toll-likereceptor 6的片段对应所得dsRNA命名为ds Toll-like receptor 6，含GFP的质粒所得dsRNA命名为dsGFP。
图5中A：扩增DNA模板；B：合成的dsRNA。
实施例8：小菜蛾基因Toll-like receptor 6的免疫功能分析
(1)小菜蛾基因Toll-like receptor 6在不同微生物诱导下的表达
将1.0×107cfu/幼虫的蝉拟青霉孢子悬浮液、1.0×106cfu/幼虫的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌液侵染3龄小菜蛾幼虫，灭菌水(ddH2O)和无处理(CK)做对照。通过RT-qPCR的方法检测基因Toll-like receptor 6在不同诱导方式下的表达情况。RNA提取、cDNA合成及RT-qPCR参照上述实施例4中的方法进行。其中荧光定量PCR引物为：上游引物：GTCGGTGCCTTATTTGT，SEQ ID NO:19，下游引物为：AGTGCCATTGTGGATGA，SEQ ID NO:20。
结果显示小菜蛾基因Toll-like receptor 6在蝉拟青霉(Pc)、金黄色葡萄球菌(Sa)和大肠杆菌(Ec)诱导下与对照相比均表现出显著上调表达(图6)。
图6中：Pc:蝉拟青霉；Sa：金黄色葡萄球菌；Ec：大肠杆菌；ddH2O：灭菌水；CK：无处理。误差线代表平均值±SD(n＝3)，字母表示差异显著水平(P＜0.05)。
(2)小菜蛾基因Toll-like receptor 6在RNAi后的生物测定
选取3龄小菜蛾幼虫，使用微量注射仪将2μL(2μg/幼虫)的ds Toll-likereceptor 6注入到小菜蛾体内。注射dsGFP和DEPC水作为对照。dsToll-like 6注射6h后，将配置好的浓度为1.0×108cfu/mL的蝉拟青霉的孢子悬浮液侵染处理组的小菜蛾幼虫，然后放入温度为25±1℃，相对湿度为75±5％和14：10h(光照：黑暗)的环境下继续饲养。每隔12h统计小菜蛾存活率。每组注射20头，每组设置三个重复。
结果表明(图7)，用蝉拟青霉侵染未注射ds Toll-like receptor 6(CK)、注射DEPC水和dsGFP的小菜蛾幼虫，48h时存活率分别为77.78％、64.45％和68.89％。而注射dsToll-like receptor 6的幼虫在经蝉拟青霉侵染后的48h存活率仅有46.67％，明显低于dsGFP组、DEPC水组和CK组的存活率。从以上结果表明，小菜蛾基因Toll-like receptor 6在抵御蝉拟青霉的侵染中发挥着免疫防御功能。
图7中：CK：对照；DEPC：注射DEPC水；dsGFP：注射dsGFP；ds Toll-like receptor6：注射ds Toll-like receptor 6；Pc：1.0×108cfu/mL蝉拟青霉侵染，数据以平均值±标准误表示。
实施例9：基因Lnc40766调控免疫功能分析
(1)小菜蛾基因Lnc40766的RNAi后表达水平检测
将体外合成的dsLnc40766以2μL(2μg/幼虫)剂量注射到3龄小菜蛾幼虫体内，dsGFP和DEPC处理水作为对照。放入温度为25±1℃，相对湿度为75±5％和14：10h(光照：黑暗)的环境下饲养。在0h、6h、12h和24h随机收集4～6头小菜蛾幼虫放入1.5mL RNA管中，-80℃冰箱储存备用。利用RT-qPCR检测小菜蛾基因Lnc40766的干扰效果。RNA提取、cDNA合成及RT-qPCR参照上述实施例4中的方法进行。
结果表明，dsLnc40766注射6h后，基因Lnc40766的表达水平与0h相比下降了84.63％(图8)。结果表明注射dsLnc40766可显著降低Lnc40766表达水平。
图8中，dsLnc40766：注射dsLnc40766；dsGFP：注射dsGFP；DEPC water：注射DEPCwater。数据以平均值±标准误差表示。不同小写字母表示不同样本间转录差异显著(p<0.05)。
(2)干扰基因Lnc40766表达后基因Toll-like receptor 6的表达水平分析
选取3龄小菜蛾幼虫，使用微量注射仪将2μL(2μg/幼虫)的dsLnc40766注入到小菜蛾体内，注射dsGFP和DEPC水作为对照，然后放入温度为25±1℃，相对湿度为75±5％和14：10h(光照：黑暗)的环境下饲养。在0h、6h、12h、24h随机收集4～6头小菜蛾幼虫放入1.5mLRNA管中，-80℃冰箱储存备用。利用RT-qPCR检测小菜蛾Toll-like receptor 6基因的干扰效果。
由RT-qPCR结果(图9)得知，在注射dsLnc40766 6h后，小菜蛾基因Toll-likereceptor 6的转录水平与0h相比下降了79.03％，显著低于dsGFP和DEPC处理水注射组。随着时间的增加，基因Toll-like receptor 6的转录水平逐渐升高。结果表明基因Lnc40766可能通过调控基因Toll-like receptor 6的表达参与对蝉拟青霉的免疫防御反应。
图9中，dsLnc40766：注射dsLnc40766；dsGFP：注射dsGFP；DEPC water：注射DEPCwater。数据以平均值±标准误差表示。不同小写字母表示不同样本间转录差异显著(p<0.05)。
(3)小菜蛾基因Lnc40766沉默后的生物测定
对3龄小菜蛾幼虫注射dsLnc40766，并以注射dsGFP、DEPC处理水及CK(无处理)作为对照。dsLnc40766注射6h后，将配置好的浓度为1.0×108cfu/mL的蝉拟青霉的孢子悬浮液侵染处理组的小菜蛾幼虫，然后放入温度为25±1℃，相对湿度为75±5％和14：10h(光照：黑暗)的环境下继续饲养。每隔12h统计小菜蛾存活率。每组注射20头，每组设置三个重复。
结果(图10)显示，用蝉拟青霉侵染未注射dsLnc40766(CK)、注射DEPC水和dsGFP的小菜蛾幼虫，48h时存活率分别为77.78％、64.45％和68.89％。而注射dsLnc40766的幼虫经蝉拟青霉侵染48h后的存活率为51.11％，明显低于CK组、dsGFP组和DEPC水组。以上实施例结果表明，小菜蛾基因Lnc40766可能通过调控基因Toll-like receptor 6的表达，进而在抵御蝉拟青霉的侵染中发挥着免疫的功能。
图10中，CK：对照；DEPC：注射DEPC水；dsGFP：注射dsGFP；dsLnc40766：注射dsLnc40766；Pc：1.0×108cfu/mL蝉拟青霉侵染，数据以平均值±标准误表示。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 679
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )
<400> 1
ttttaactat ctgtcgcata tagatactat ctaatatggt cagactgtat gtataaattt 60
atgaaggatg tcagttgaat aagtatagta gtagtttttg aattaagaat acatggtaga 120
attttatcag tgtagtatgg taaacacttc ccatttgcag gtatccaaca tatgagctat 180
atacagggtg ttgcaaaaaa ggtatagtaa gccgaaacct acatgtgcag catggtatat 240
ctaagcccga aaatgaaatc agaatttcaa aattcaaatt gatatatcat gctgcacatg 300
tagctttcgg ctaactatac cctttttgca acaccctgta tacttactga gttattttac 360
catgatacca actgtgactt gactttgact ttgaaatact tagttatctg ccttctcaag 420
tgaaatgaag atatacctag gtagataatc tataacttcc gtattttttt tacatattgg 480
tcccgcaatg ttcagtttat tttgtaggat tctaggatgt gatgtctatt cactactgtt 540
aaaccgtatt gaacatttcg atccggctcg aaggaccatg aaaaggaagt gtagtgataa 600
tttcacagtc gccttgatcg ttggtagacg caatgtttat taaaattagt agtagtagta 660
aggaaagcac aaaacacgg 679
<210> 2
<211> 2313
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )
<400> 2
atgctgctaa tactacttat gcttctctcg gcccagccag ccttccctag tgggggttta 60
cacctagggg gggtggtgaa acatgtggac caggactgcc tgacaggaac tatgacggac 120
gtacagtcct gggtcggtcc tgacggtcac ctgttgatgg acgtcgatct tttcaaaaat 180
ggcatcgacc tagctggact ctcggatccc gatgtaaaac ttaggttttt tcttcaagag 240
aaccctaatc atacgttcag gtacatcagc atggcgagat gcaaacttag gtcggtgcct 300
tatttgtatg gaaactgcag cagagtgact ggcactctgc agtacctgtc tctgtacggg 360
aaccacttcg atagcgacga tgacggcgaa gagctcaggg tcacgatcac gagcgaggtc 420
atccacaatg gcactctcca gaaacactcc gtcgacaata cgacaaaacc agatcccaac 480
caagttcccc attggtatag tggcttcgag acggctaacc tcaccggcct tttggagctc 540
gacctacggg cgtgctccat ccggtacata aaaaatgata ccttctccag aatggtcagc 600
ctgcgcgcct tgtatctgtc agaaaaccga atccataaaa ttgagccgtc cgcattccaa 660
ggaatgctga gactcgtcca tttggacctg agcagaaatg cggcatcgac tgctataact 720
tggggtctga acgtcttcac aggacttgct agccttctat ctctagacct ttcgtttgca 780
gacctgtcac aagatctagc gtttgcagac atgtcaggtc agacaatgat gctcggccat 840
attaagcgta gaatttttgg gtctagattg aaaacgctat ccatatgcaa cacccaccta 900
cgcagtataa aagggctcac agaagtattc caagagttgg aaaacctgga tgtgtctggt 960
aacgtaggca tcctcgatga cgtagactct ctgacaaaag cacagaagtc actgaaggtt 1020
gtttacgcta acgacgtcgg actgcattca cttgatgttt tcgttaactt taccagtcta 1080
gtaattgtca aggcgacaaa aaattatatc gaagacatcg gaaatgaaac ggcgatgtct 1140
ttccggaatc taaaagtgtt ggacctagat cataatcgca tgaaaggttg gactcaaagc 1200
acattctccc tgatgccaaa tttggatgtt cttttgctga aaagtaacca agtcaccatg 1260
atccaggaag agatgttgca agatattgcc aatgtctctt acattggaat taaagacaac 1320
ttcgttatat gcagctgttc cgtccgggac ttcctggata ttgcaataag gaatgacgtg 1380
gaaaaaaaat tccattctaa accgttattt ccaacgattt atacttcgca ggagttccac 1440
agagcttacg atgaatactc cagactggtt cataatcgaa aacctttgaa aatcgaatgc 1500
gacaacgaac cttgtgagat taaagagcca agtatcgatg gcaagtttgt gattctcgat 1560
tatgagaatg aatctactga ttaccaatgt tattcgctgg cggattacag gcaaatcccg 1620
tttttgatga acactccatg ttcgcaccac aggggtggtg attatctaga tacgattgaa 1680
gatacttcac agttggttgt tctcatggtg tgtctagctc ttttggctgc gacaattggg 1740
attgctgtga tatttaggaa gaggatcata tatttctgcg taactgtcaa gaattcagca 1800
ttattaagct ctatgaccac tgctaacggt ttccaagaat cctccacgta ccactacgac 1860
gtgttcgttt cgtactgcaa cgaggaccgg ccctgggtgc tggaccatct gctgccgcac 1920
gtggagaagc actgcaacgt cagcgtgtgt ctgcacgaga gggacttcct ggtgggcctg 1980
tcaattttgg agaacatagt gtcgtgcatg gaccggtcta agtccatcct gctggtcatc 2040
tcccagcggt tccttctgtc gcagtggtgc caattcgaaa tgcatttggc tcagcacaga 2100
ctcctggaga ctcgtcgtga ggacctgatc ctggtgcttc tggaggacat cccgcggccg 2160
atgagaccca acaccctgca ctacctcatg ctgaccaaga cctacgtgct ctggccgaag 2220
gagaaggcgg aacgacgggt attctggcga cggcttcaga agtgcatcgt tttgcagaag 2280
ttgaggaaaa atgaaacgga gtctttggca taa 2313
<210> 3
<211> 533
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )
<400> 3
acttcccatt tgcaggtatc caacatatga gctatataca gggtgttgca aaaaaggtat 60
agtaagccga aacctacatg tgcagcatgg tatatctaag cccgaaaatg aaatcagaat 120
ttcaaaattc aaattgatat atcatgctgc acatgtagct ttcggctaac tatacccttt 180
ttgcaacacc ctgtatactt actgagttat tttaccatga taccaactgt gacttgactt 240
tgactttgaa atacttagtt atctgccttc tcaagtgaaa tgaagatata cctaggtaga 300
taatctataa cttccgtatt ttttttacat attggtcccg caatgttcag tttattttgt 360
aggattctag gatgtgatgt ctattcacta ctgttaaacc gtattgaaca tttcgatccg 420
gctcgaagga ccatgaaaag gaagtgtagt gataatttca cagtcgcctt gatcgttggt 480
agacgcaatg tttattaaaa ttagtagtag tagtaaggaa agcacaaaac acg 533
<210> 4
<211> 520
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )
<400> 4
agacggctaa cctcaccggc cttttggagc tcgacctacg ggcgtgctcc atccggtaca 60
taaaaaatga taccttctcc agaatggtca gcctgcgcgc cttgtatctg tcagaaaacc 120
gaatccataa aattgagccg tccgcattcc aaggaatgct gagactcgtc catttggacc 180
tgagcagaaa tgcggcatcg actgctataa cttggggtct gaacgtcttc acaggacttg 240
ctagccttct atctctagac ctttcgtttg cagacctgtc acaagatcta gcgtttgcag 300
acatgtcagg tcagacaatg atgctcggcc atattaagcg tagaattttt gggtctagat 360
tgaaaacgct atccatatgc aacacccacc tacgcagtat aaaagggctc acagaagtat 420
tccaagagtt ggaaaacctg gatgtgtctg gtaacgtagg catcctcgat gacgtagact 480
ctctgacaaa agcacagaag tcactgaagg ttgtttacgc 520
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 5
taatacgact cactataggg acttcccatt tgcaggta 38
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 6
taatacgact cactataggg cgtgttttgt gctttcc 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 7
taatacgact cactataggg agacggctaa cctcacc 37
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 8
taatacgact cactataggg gcgtaaacaa ccttcagt 38
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 9
ttttaactat ctgtcgc 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 10
ccgtgttttg tgctttcc 18
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 11
atgctgctaa tactac 16
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<211> 17
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<213> 人工合成(Synthetic sequences)
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<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
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cttagttatc tgccttctc 19
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<213> 人工合成(Synthetic sequences)
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tccttttcat ggtcctt 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 15
tggcaccaca ccttctac 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 16
catgatctgg gtcatcttct 20
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 17
taatacgact cactataggg agggcgaggg cgatgccacc 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 18
taatacgact cactataggg tgtactccag cttgtgcccc 40
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 19
gtcggtgcct tatttgt 17
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequences)
<400> 20
agtgccattg tggatga 17

Claims (2)

1.一种具有调控小菜蛾免疫功能的基因，其特征在于，所述基因为基因Lnc40766，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述基因在防控小菜蛾中的应用，其特征在于，通过抑制小菜蛾基因Lnc40766表达，降低小菜蛾在抵御蝉拟青霉侵染时的免疫能力。
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