CN111378665B - 东亚飞蝗的serpin5基因的干扰序列及其应用 - Google Patents

东亚飞蝗的serpin5基因的干扰序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗的serpin5基因的干扰序列及其应用和防治蝗虫的方法。本发明合成了Serpin5双链RNA并通过注射入东亚飞蝗体内，在通过饲喂绿僵菌孢子粉的方法，检测了东亚飞蝗死亡率及体内Toll通路相关基因的表达量，明确了dsSerpin5在金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗中的作用。

Description

东亚飞蝗的serpin5基因的干扰序列及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗的serpin5基因的干扰序列及其应用。
背景技术
丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)是研究最为广泛的蛋白酶抑制剂家族。对于Serpins蛋白家族的研究已经超过60多年，目前已发现的serpins有1500多种，且广泛存在于在动植物和病毒等体内，Serpins家族中的大部分成员具有抑制丝氨酸蛋白酶的活性，还有的Serpin充当激素的前体，激素的转运体，以及辅助蛋白折叠的分子伴侣。
东亚飞蝗是我国发生危害的3类飞蝗之一，蝗虫的防治主要采取化学防治，随着数十年来，有机磷等高毒广谱性杀虫剂的滥用，暴露出一系列致命的问题：污染环境，昆虫的抗药性增加和天敌被杀害等，因此寻找安全有效的防治措施迫在眉睫。
RNAi技术的核心点是利用非编码小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)分子切割靶标mRNA分子，从而达到部分沉默或完全抑制靶标基因的效果。利用转基因技术在植物体表达dsRNA，当昆虫取食带有dsRNA的植物，dsRNA随食物进人到昆虫体内，使昆虫某些功能丧失造成损伤或者死亡，从而达到防治害虫的效果。利用RNAi防治害虫的设想已经在鳞翅目和鞘翅目昆虫上实现。
当干扰序列进入了microRNA途径时，通过microRNA途径，其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19～23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用，而如果进入microRNA途径，只需要11～15nt互补就可以产生干扰效果，这使得干扰可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶。
发明内容
本发明的目的是提供东亚飞蝗的serpin5基因的有效干扰序列。
本发明的再一目的是提供上述东亚飞蝗的serpin5基因的有效干扰序列的应用。
本发明的再一目的是提供有效防止蝗虫的方法。
根据本发明的东亚飞蝗的serpin5基因的有效干扰序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明提供了上述东亚飞蝗的serpin5基因的有效干扰序列用于防治蝗虫的应用。通过在使蝗虫摄入serpin5基因的干扰序列有效降低了蝗虫对生防菌的抗性，从而实现防治蝗虫的目的。本发明提供了防止蝗虫的方法，所述方法包括利用核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的dsRNA序列干扰蝗虫体内serpin5基因的步骤。
本领域技术人员可以理解，通过向植物中导入serpin5基因的有效干扰序列，在蝗虫食用植物后，或者直接食用含有serpin5基因的有效干扰序列的饵剂，干扰体内serpin5基因表达，从而降低蝗虫的免疫力，有效增强绿僵菌侵染力。
本发明过克隆serpin5基因并合成双链RNA，通过与绿僵菌共同处理东亚飞蝗，并检测各处理组东亚飞蝗的死亡率，可知在处理的第5天开始，dsSerpin5和绿僵菌混合处理组和绿僵菌处理组的死亡率均显著高于对照组，dsSerpin5和绿僵菌混合处理组的死亡率显著高于绿僵菌单独处理组。表明干扰掉东亚飞蝗的serpin5基因，可有效增强绿僵菌侵染力，减弱东亚飞蝗的免疫力。
附图说明
图1显示干扰序列dsSerpin5-1在中肠和虫体的干扰效率；
图2显示干扰序列dsSerpin5-2在中肠和虫体的干扰效率；
图3显示干扰序列dsSerpin5-3在中肠和虫体的干扰效率；
图4显示干扰序列dsSerpin5-4在中肠和虫体的干扰效率；
图5显示干扰蝗虫Serpin5后，Toll通路不同基因的相对表达量；
图6显示干扰蝗虫Serpin5后，不同处理组中东亚飞蝗的死亡率。
具体实施方式
根据本发明的具体实施方式，金龟子绿僵菌菌株IMI330189为已知菌株，将菌株接种到PDAY平板上，25℃下培养14d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。东亚飞蝗卵采集于河北省沧州市，在人工气候培养箱中孵化，温度(30士2)℃，相对湿度(60士5)％，光周期(14L:10D)，将同一时间孵化的蝗蝻转移到60cm×50cm×70cm(长×宽×高)规格的养虫笼中饲养，光周期14L:10D，温度为(32士2)℃。
生测筐(长×宽×高＝30cm×12cm×9cm)，玻璃盖板(长×宽＝36cm×16cm)，镊子，培养皿，温湿度计等常规耗材购自华奥宝生科技有限公司。其他生化试剂均为市售可得。PCR引物公司合成。仪器主要包括智能人工气候箱等。
1、克隆serpin5基因
serpin5基因克隆于东亚飞蝗成虫，提取飞蝗的总RNA，通过反转录合成cDNA。以cDNA为模板，以已去除信号肽的目的基因为引物，以serpin5-F(5'-CGGGATCCGATGCCAGTCCGCGC-3'(BamHI))和serpin5-R(5'-CCCAAGCTTTTGCGGAGGCCTTTGTGG-3'(HindIII))为引物，进行PCR，扩增serpin5基因。
serpin5基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2、合成dsRNA
基于serpin5基因进一步合成dsRNA。
设计4段Serpin5的RNAi的引物和荧光定量的引物。取已验证成功的菌液提取质粒，将质粒作为模板，引物序列见表1。将dsSerpin5的溶液的浓度调整至1000ng/μL，第一段serpin5双链RNA的序列总长为538bp，第二段serpin5双链RNA的序列总长为461bp，第三段serpin5双链RNA的序列总长为461bp，第四段serpin5双链RNA的序列总长为458bp。分别进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s，共35个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。
表1 dsSepin5引物序列
名称 引物序列
dsSerpin5-1-F TAATACGACTCACTATAGGATCAGCACAGCCAGGAAAC
dsSerpin5-1-R: TAATACGACTCACTATAGGCGGCATCGGAGAAGTATTG
dsSerpin5-2-F TAATACGACTCACTATAGGCAGGCAAACAACTCGGACTA
dsSerpin5-2-R: TAATACGACTCACTATAGGTCTGGCAGGACGATAAACA
dsSerpin5-3-F TAATACGACTCACTATAGGTGAAGATGGCTTGTCGGA
dsSerpin5-3-R: TAATACGACTCACTATAGGCGCTGCTGTAGTTCCTTGTT
dsSerpin5-4-F TAATACGACTCACTATAGGAGCCTCAGTTCTCCTTTCC
dsSerpin5-4-R: TAATACGACTCACTATAGGTGCTGTAGTTCCTTGTTCGT
以纯化产物为模板，并参照T7 RiboMAX system(Promega,Madison,WI,USA)试剂盒说明书合成3段serpin5的双链RNA。并用NanoPhotometer微量分光光度计分别检测dsSerpin5的浓度，置于-20℃保存待用。
dsSerpin5-1基因序列如SEQ ID NO:2所示
Figure BDA0002437760770000031
Figure BDA0002437760770000041
dsSerpin5-2基因序列如SEQ ID NO:3所示
Figure BDA0002437760770000042
dsSerpin5-3基因序列如SEQ ID NO:4所示
Figure BDA0002437760770000043
dsSerpin5-4基因序列如SEQ ID NO:5所示
Figure BDA0002437760770000044
3、RNAi干扰后serpin5基因表达量
检测干扰处理后东亚飞蝗的中肠内和整头虫体的serpin5基因的表达量。实验采用分组分别注射4段Serpin5的双链RNA，取发育一致的三龄蝗蝻分为五组处理，四组为干扰组，一组为对照组，每组蝗虫注射5μL的dsSerpin5溶液，在东亚飞蝗蝗蝻处理后的24小时后，东亚飞蝗中肠的处理为：每个处理共取5头，在冰浴上解剖出东亚飞蝗的中肠，挤出中肠内的残留物采用0.7％的生理盐水冲洗干净后置于匀浆器中，加入500μLtrizol，匀浆2分钟后，提取RNA，后根据反试剂盒反转为cDNA。东亚飞蝗整头虫体处理为：将整头虫体置于匀浆器中，加入500μLtrizol，匀浆2分钟后，提取RNA，后根据反试剂盒反转为cDNA。以cDNA为模板，并设计dsSerpin5的荧光定量引物，以Actin基因作为对照(表2)，采用实时荧光定量PCR方法检测各处理组serpin5基因的表达量。荧光定量反应的总体系为20μL，其中2×SsoFastSYBR-Green Mix10μL，10μmol/L的上下游引物各0.8μL，模板1μL，ddH2O补足至20μL，反应的条件为：105℃预变性60s，95℃10s，60℃50s，共40个循环。每个样本重复测定3次。
采用通过分组注射4段serpin5双链RNA于飞蝗体内，检测5个处理组24小时后东亚飞蝗的中肠和整个虫体内serpin5基因的变化量。24小时处理后的结果如图1～4所示，当干扰掉serpin5-1基因后，东亚飞蝗中肠和整头虫体的serpin1的表达量都显著降低，虫体的干扰效率为87.51％，中肠的干扰效率为84.54％(图1)。当干扰掉serpin5-2基因后，虫体的干扰效率为78.18％，中肠的干扰效率为74.60％(图2)。当干扰掉serpin5-3基因后，虫体的干扰效率为75.51％，中肠的干扰效率为70.56％(图3)。当干扰掉serpin5-4基因后，虫体的干扰效率为68.51％，中肠的干扰效率为66.84％(图4)。研究表明第一段dsSerpin5的干扰效率最高。后续实验操作均注射第一段dsSerpin5(serpin5-1)并研究。
4、Toll路径相关基因表达量
设计Toll通路相关基因myd88基因，tube基因，pelle基因，persephone基因，defensin基因引物，送至上海生工有限公司合成(表2)。注射已筛选出的dsSerpin5片段处理飞蝗，分别在取出饵剂后24小时后各处理分别取5头蝗蝻，用4℃预冷的0.1M NaCl溶液冲去体液，取血淋巴置于匀浆器中，加入500μL trizol，匀浆2分钟后，提取RNA，根据反试剂盒反转为DNA，并以此为模板，采用SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa,大连,中国)实时荧光定量PCR方法，每个样本重复测定3次。以Actin基因作为对照，检测Toll通路相关基因的表达量。
表2各基因引物序列
Figure BDA0002437760770000051
Figure BDA0002437760770000061
通过注射第一段serpin5的双链RNA，干扰掉东亚飞蝗serpin5基因，在处理后24小时后收集各处理组血淋巴，通过荧光定量PCR技术检测Toll通路相关基因的变化量如图5，研究发现注射serpin5基因的双链RNA 24小时后，Toll通路相关基因的表达量较对照组显著降低其中tube基因下降量最多，为对照组的0.014428倍，Pelle基因的表达量为对照的0.017533倍，persephone基因的表达量为对照的0.029794倍，myd88基因的表达量为对照的0.100683倍，defensin基因的表达量为对照的0.818657倍。
5、对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响
实验采用注射筛选出的Serpin5的双链RNA，后饲喂绿僵菌孢子粉的方法来测定dsSerpin5对绿僵菌IMI330189的毒力影响，将新鲜收集的绿僵菌IMI330189孢子粉加入到含1％甘油的试管中震荡均匀，显微镜下观察并记录孢子数，并通过稀释制成终浓度为2.5×108spore/mL的孢子悬浮液。将dsSerpin5浓度调整为1000ng/μL，得到dsSerpin5溶液。不同的处理如下：处理1:注射5μLdsSerpin5，后饲喂麦麸。处理2：饲喂含绿僵菌IMI330189孢子悬浮液的麦麸。处理3：注射5μLdsSerpin5，后饲喂含绿僵菌IMI330189孢子悬浮液。以不含任何处理的5g麦麸为对照。各处理的终浓度如表3。
将预先饥饿了12h的3龄蝗蝻放入无菌的生测筐中，每筐30头为1个重复，每个处理5筐(重复5次)，每筐中加入相应的1g饵剂，饲喂24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至实验结束，每日记录死亡和存活数，并计算累计死亡率。试验在30℃,16L:8D下室内进行。
表3不同处理饵剂成分及浓度
Figure BDA0002437760770000062
Figure BDA0002437760770000071
注：饵剂是含有5％植物油的无菌麦麸
东亚飞蝗经不同处理后的累计死亡率见图6。在处理的前10天dsSerpin5单独处理组的累计死亡率与对照无显著差异(P＞0.05)，但在第5天后显著低于相同时间点绿僵菌IMI330189单独处理和dsSerpin5和IMI330189混合处理组的累计死亡率，且差异显著(P＜0.05)。IMI330189处理组第4天起飞蝗开始死亡，从第8天至第12天飞蝗大量死亡；且第6天直到第12天，飞蝗的累计死亡率显著高于对照(P＜0.05)。dsSerpin5和IMI330189混合处理组第3天开始的累计死亡率显著高于对照组(P＞0.05)，且在第5后显著高于绿僵菌IMI330189单独处理(P＞0.05)；dsSerpin1处理组自第4天开始较对照组明显升高，且差异显著(P＜0.05)。
以上试验结果表明，通过干扰掉4段dsSerpin5基因后的24小时后，可知中肠和整个虫体内的serpin5基因的干扰效率均超过80％，且第1段dsSerpin5的干扰效率最高，表明serpin5基因能有效增强东亚飞蝗的先天性免疫反应。当干扰掉serpin5基因后的24小时后，Toll通路相关基因的表达量较对照组显著降低，表明干扰掉serpin5基因后，体液免疫中的Toll路径受到抑制。
本发明过克隆serpin5基因并合成双链RNA，通过与绿僵菌共同处理东亚飞蝗，并检测各处理组东亚飞蝗的死亡率，可知在处理的第5天开始，dsSerpin5和绿僵菌混合处理组和绿僵菌处理组的死亡率均显著高于对照组，dsSerpin5和绿僵菌混合处理组的死亡率显著高于绿僵菌单独处理组。表明干扰掉东亚飞蝗的serpin5基因，可有效增强绿僵菌侵染力，减弱东亚飞蝗的免疫力。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 东亚飞蝗的serpin5基因的干扰序列及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1263
<212> DNA
<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)
<400> 1
atgctgtacg agggcgcgac gggagacacc gcgcgccagc tcgaaacggg gctgctgctc 60
accaaggacc gctcgcagac gcgcgagaag tacagcgcca tcgtggcgtc gttgcaggca 120
aacaactcgg actatctgtt cgacttgggg aacaaagtat acgcagactt gtcactgact 180
ctacgcccac gctttgttac gatcctgagg gcgttttata acagtgatat tgaaaatgtc 240
gactttagag atcccaaaac tgtgccctta attaatgaat gggtaaaaaa tgcaacacgt 300
ggtcacattg actcgataat gagtgaagat ggcttgtcgg acgccgtcct cctgcttgtg 360
aacgcactgt acttcaaagg gtcatggaaa taccaatttc agcctcagtt ctcctttccc 420
ggcaatttct acgcaggcaa aggaaagagt atagccgcac agttcatgcg tcagagtgca 480
gaattttact acttgcactc aaaggaaatt aatgcaagca tattgcgact accgtatctt 540
ggcaggaaat ttgcgatgtt tatcgtcctg ccagatgaca aggatggact tgaaaatctt 600
ttgagcaccg taaacccatt cgctctgcga gaagatctcg gacttctcag accgactgca 660
gtacatgtgg tgctgccaaa atttactttc gaattttctg tgctcttaaa tgatgttctg 720
aaggagctgg gaataaagca gattttcact gacagagcta atctgcaagg aatcgcgagg 780
agtcgttatg gaagactgtc agtctcgaag gttttacaga aatcagctct agaagtaaac 840
gaacaaggaa ctacagcagc ggcagttaca ggcatcgagg tcattgatcg aattggagtc 900
agagaggtga cgttcaatgc tacacatcca ttccttttct ttatcgaaga cgagacgacc 960
ggtacggtaa tattcgtagg aaaagttgtg gaaccatcaa ctgacaaaac accgaaaact 1020
acgatttctg ttcggcaagg agagttcccg ggtgacaaga agaaagataa ctccaaaggt 1080
ggtcatcaac ctcacattcc tcaaactgac aaggacggac cttacacaat agaaatgcca 1140
gattttgacg tcacatctca aacaatctac aaggacggac agcagaaaaa gcgtgtctat 1200
tatatcttat cccaaagcgc gtttcattac ttgattcaat ttttaccaca aaggcctccg 1260
caa 1263
<210> 2
<211> 538
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagtgaagat ggcttgtcgg acgccgtcct cctgcttgtg aacgcactgt acttcaaagg 60
gtcatggaaa taccaatttc agcctcagtt ctcctttccc ggcaatttct acgcaggcaa 120
aggaaagagt atagccgcac agttcatgcg tcagagtgca gaattttact acttgcactc 180
aaaggaaatt aatgcaagca tattgcgact accgtatctt ggcaggaaat ttgcgatgtt 240
tatcgtcctg ccagatgaca aggatggact tgaaaatctt ttgagcaccg taaacccatt 300
cgctctgcga gaagatctcg gacttctcag accgactgca gtacatgtgg tgctgccaaa 360
atttactttc gaattttctg tgctcttaaa tgatgttctg aaggagctgg gaataaagca 420
gattttcact gacagagcta atctgcaagg aatcgcgagg agtcgttatg gaagactgtc 480
agtctcgaag gttttacaga aatcagctct agaagtaaac gaacaaggaa ctacagca 538
<210> 3
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggcaaaca actcggacta tctgttcgac ttggggaaca aagtatacgc agacttgtca 60
ctgactctac gcccacgctt tgttacgatc ctgagggcgt tttataacag tgatattgaa 120
aatgtcgact ttagagatcc caaaactgtg cccttaatta atgaatgggt aaaaaatgca 180
acacgtggtc acattgactc gataatgagt gaagatggct tgtcggacgc cgtcctcctg 240
cttgtgaacg cactgtactt caaagggtca tggaaatacc aatttcagcc tcagttctcc 300
tttcccggca atttctacgc aggcaaagga aagagtatag ccgcacagtt catgcgtcag 360
agtgcagaat tttactactt gcactcaaag gaaattaatg caagcatatt gcgactaccg 420
tatcttggca ggaaatttgc gatgtttatc gtcctgccag a 461
<210> 4
<211> 478
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaagatggc ttgtcggacg ccgtcctcct gcttgtgaac gcactgtact tcaaagggtc 60
atggaaatac caatttcagc ctcagttctc ctttcccggc aatttctacg caggcaaagg 120
aaagagtata gccgcacagt tcatgcgtca gagtgcagaa ttttactact tgcactcaaa 180
ggaaattaat gcaagcatat tgcgactacc gtatcttggc aggaaatttg cgatgtttat 240
cgtcctgcca gatgacaagg atggacttga aaatcttttg agcaccgtaa acccattcgc 300
tctgcgagaa gatctcggac ttctcagacc gactgcagta catgtggtgc tgccaaaatt 360
tactttcgaa ttttctgtgc tcttaaatga tgttctgaag gagctgggaa taaagcagat 420
tttcactgac agagctaatc tgcaaggaat cgcgaggagt cgttatggaa gactgtca 478
<210> 5
<211> 458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcctcagtt ctcctttccc ggcaatttct acgcaggcaa aggaaagagt atagccgcac 60
agttcatgcg tcagagtgca gaattttact acttgcactc aaaggaaatt aatgcaagca 120
tattgcgact accgtatctt ggcaggaaat ttgcgatgtt tatcgtcctg ccagatgaca 180
aggatggact tgaaaatctt ttgagcaccg taaacccatt cgctctgcga gaagatctcg 240
gacttctcag accgactgca gtacatgtgg tgctgccaaa atttactttc gaattttctg 300
tgctcttaaa tgatgttctg aaggagctgg gaataaagca gattttcact gacagagcta 360
atctgcaagg aatcgcgagg agtcgttatg gaagactgtc agtctcgaag gttttacaga 420
aatcagctct agaagtaaac gaacaaggaa ctacagca 458

Claims (5)

1.蝗虫serpin5基因的干扰序列，其特征在于，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列用于防治蝗虫的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，蝗虫食用含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列的饵剂。
4.一种防治蝗虫的方法，其特征在于，所述方法包括利用核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列干扰蝗虫体内serpin5基因表达的步骤。
5.根据权利要求4所述的防治蝗虫的方法，其特征在于，所述方法包括蝗虫摄取包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列的饵剂的步骤。
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