CN113881679B

CN113881679B - 一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物

Info

Publication number: CN113881679B
Application number: CN202111295097.XA
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 汤清波; 闫凤鸣; 赵晨; 刘艳敏; 万利; 赵鹏飞
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-11-03
Also published as: CN113881679A

Abstract

本发明公开了一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR‑71‑5模拟物。所述的miR‑71‑5模拟物序列来源于白蚁体内miR‑71‑5，DNA序列为SEQ 1。基于SEQ 1，设计4条单链DNA，序列分别为SEQ 2、SEQ 3、SEQ 4和SEQ 5，通过退火PCR获得2条miR‑71‑5的DNA模板，通过T7体外转录系统合成小分子双链RNA，即为miR‑71‑5模拟物，RNA序列为SEQ 6。利用显微注射技术将miR‑71‑5模拟物导入白蚁体内后，白蚁抗菌活性显著下降，感染死亡率显著上升。此外，将miR‑71‑5模拟物与白蚁食物混合，随后放入白蚁群体中供白蚁取食。白蚁取食miR‑71‑5模拟物后抗菌活性显著下降，感染死亡率显著上升。这表明miR‑7‑5模拟物能够抑制白蚁免疫力，提高生防菌对白蚁的杀灭效果。

Description

一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及黑胸散白蚁体内miR-71-5基因和miR-71-5模拟物，一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的小分子双链RNA。

背景技术

白蚁是一种古老的社会性有害昆虫，能够危害农林作物、房屋建筑和水利工程等，严重威胁人民的生命和财产安全。目前，人们主要通过人工挖巢、化学农药防治白蚁。然而，人工挖巢成本高，蚁巢难以寻找；化学药剂污染大，对人畜不安全。因此，寻找一种可替代的白蚁防治方法成为白蚁防治领域的迫切需求之一。

近年来，一些生物防治药剂，例如金龟子绿僵菌、球孢白僵菌和苏云金芽孢杆菌等被广泛用于害虫生物防治。室内试验证明，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（10⁷个孢子/毫升）感染单头白蚁，7天后死亡率达80%。然而，随着白蚁个体数量的增加，白蚁群体通过主动免疫策略，共同地提升群体免疫力——健康白蚁通过接触染菌白蚁获得亚致死剂量病原菌，亚致死剂量病原菌无法导致白蚁死亡，但是可以激活白蚁免疫系统，提升白蚁免疫力。因此，如何抑制白蚁免疫力成为瓦解白蚁主动免疫策略，提高生防菌杀蚁效果的关键。

miRNAs是动、植物体内一类大小仅18-25 nt的非编码RNA（non-coding RNA），在动物免疫、代谢、生长、发育等方面发挥重要作用。一种miRNA能够负向调控多种功能相同或者不同的编码RNA（coding RNA）。当miRNA与靶标RNA的3’ UTR区域（3’端的非翻译区域）完全匹配，靶标RNA发生降解；当miRNA与靶标RNA的3’ UTR区域部分匹配，靶标RNA的翻译受到抑制。因此，相比于编码RNA，miRNA功能紊乱对动、植物的影响范围更大、程度更深。因此，申请人拟以一种miRNA为靶标分子，通过合成miRNA模拟物负向调控白蚁免疫相关基因的表达，从而抑制白蚁免疫功能，提高生防菌的杀蚁效果。

为了筛选一种miRNA，申请人通过全转录组学发现感染绿僵菌的白蚁体内13种miRNAs和2656种mRNAs发生显著性变化。通过“miRNA-mRNA network”联合分析发现4种候选miRNAs（miR-7-9、miR-61_2-2、miR-7-5和miR-1-9）能够靶向白蚁免疫相关基因，影响白蚁免疫力。随后通过人工合成4种候选miRNAs模拟物，分别利用显微注射和喂食两种方法将模拟物导入白蚁体内，发现注射miR-71-5模拟物以及喂食miR-71-5模拟物能够显著抑制白蚁免疫力，提高生防菌对白蚁的防治效果。基于以上结果，申请人认为miR-71-5是很好的免疫靶标分子，其模拟物能够作为一种白蚁免疫抑制剂，结合生防菌使用能够显著提高生防菌的杀虫效果。

发明内容

本发明的目的是提供靶标分子miR-71-5序列及其模拟物在促进金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果中的应用。

一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物，miR-71-5模拟物RNA序列为SEQ 6。

所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物在防治白蚁上的应用。

所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物在制备防治白蚁的药物上的应用。

所述的miR-71-5模拟物协同金龟子绿僵菌在制备用于防治白蚁的产品中的应用。

一种防治白蚁的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的miR-71-5模拟物通过显微注射技术注入白蚁体内，实现抑制白蚁免疫力。

一种防治白蚁的方法，将如权利要求1所述的miR-71-5模拟物与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，即可实现抑制白蚁免疫力。

一种防治白蚁的方法，将如权利要求1所述的miR-71-5模拟物利用显微注射技术注入白蚁体内，随后使用金龟子绿僵菌孢子悬浮液感染注射miR-71-5模拟物的白蚁，实现防治。

一种防治白蚁的方法，将如权利要求1所述的miR-71-5模拟物与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，随后使用金龟子绿僵菌孢子悬浮液感染取食miR-71-5模拟物的白蚁，即可实现防治。

白蚁食物为纸片、木块的纤维素物质，其与miR-71-5模拟物的混合方式为浸润、或涂抹的固、液混合方法，所述的金龟子绿僵菌孢子悬浮液的浓度为10⁶-10⁹个孢子/毫升。

一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物的制备方法，包括如下步骤：

（1）将黑胸散白蚁体内miR-71-5，序列为SEQ 1设计成4条单链DNA，4条单链DNA分别为：正义链1为SEQ 2，正义链2为SEQ 3，反义链1为SEQ 4和反义链2为SEQ 5；

（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火PCR得到miR-71-5正义链DNA模板；

（3）反义链1与反义链2等量混合后，进行退火PCR得到miR-71-5反义链DNA模板；

（4）将miR-71-5正义链DNA模板与反义链DNA模板等量混合，通过T7体外转录系统获得miR-71-5模拟物，通过酚/氯仿（1:1）的方法提纯miR-71-5模拟物，通过醋酸钠结合无水乙醇的方法浓缩miR-71-5模拟物，产物长度21 bp，RNA序列如SEQ 6所示。

本发明中miR-71-5模拟物是一种大小仅为23 bp的miRNA，其DNA序列来源于黑胸散白蚁miRNA，为SEQ 1。

本发明通过显微注射技术注射上述合成的miR-71-5模拟物对白蚁抗菌能力进行检测：利用显微注射系统将1微克miR-71-5模拟物注入20头白蚁体内，放入培养皿中培养，作为处理组；利用显微注射技术将1微克对照模拟物（来源GFP的一种19 bp的双链RNA）注入20头白蚁体内，放入培养皿中培养，作为对照组。培养1天后进行抗菌活性检测。结果表明，与对照组染菌白蚁相比，注射miR-71-5模拟物的染菌白蚁体内抗菌活性显著下降。

本发明通过注射miR-71-5模拟物协同生防菌在白蚁生物防治中的应用：利用显微注射系统将1微克miR-71-5模拟物注入42头白蚁体内，放入3个培养皿中（每个培养皿培养14头白蚁）培养1天，作为处理组；利用显微注射技术将1微克对照模拟物注入42头白蚁体内，放入3个培养皿中（每个培养皿培养14头白蚁）培养1天，作为对照组。随后将两种注射后的白蚁分别浸入金龟子绿僵菌孢子悬浮液（10⁷个/毫升）中5秒，重新放回培养皿中培养10天并记录每天白蚁的死亡情况。结果显示，与对照组染菌白蚁相比，注射miR-71-5模拟物的染菌白蚁死亡率显著上升。

本发明通过喂食上述合成的miR-71-5模拟物对白蚁的抗菌能力进行检测：将70微克miR-71-5模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养15头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组；将70微克对照模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养15头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组。取食2天后，对培养皿中白蚁进行抗菌活性检测。结果表明，与对照组白蚁相比，取食2天miR-71-5模拟物的处理组白蚁体内抗菌活性显著下降。

本发明通过喂食miR-71-5模拟物协同生防菌在白蚁生物防治中的应用：将70微克miR-71-5模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养14头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组（共3个处理组，42头白蚁）；将70微克对照模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养15头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组（共3个对照组，42头白蚁）。取食2天后，用0.35微升金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度10⁸个孢子/毫升）滴加到喂食后的白蚁体表。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。结果显示，与对照组染菌白蚁相比，喂食miR-71-5模拟物的染菌白蚁死亡率显著上升。

综上所述，miR-7-5模拟物能够有效抑制白蚁免疫力，显著提高了金龟子绿僵菌对白蚁的防治效果。

本发明有以下4个明显的优点：1. miR-71-5模拟物是一种大小仅为23 bp的双链RNA，制备简单，效率更高，对环境友好，对人畜安全；2. 联合分析表明miR-71-5能够靶标185种mRNAs，因此miR-71-5模拟物能够影响更多的白蚁基因表达，作用范围更广、程度更深；3. miR-71-5模拟物与白蚁食物混合，随白蚁取食食物进入白蚁体内，使用方法简单；4.与金龟子绿僵菌结合使用，miR-71-5模拟物能够显著提高生防菌对白蚁的杀灭效果，具有良好的应用前景。

附图说明

图1：感染绿僵菌白蚁体内差异变化的miRNAs和mRNAs数量。A. miRNAs的变化数量；B. mRNAs的变化数量。

图2：“miRNA-mRNA network”联合分析图表。A. 不同miRNA与靶标mRNAs的网络图；B. 不同miRNAs对应的靶标mRNAs数量。

图3：3种miRNA模拟物对白蚁抗菌活性的影响。A. miR-7-9模拟物对白蚁抗菌活性的影响；B.miR-61_2-2模拟物对白蚁抗菌活性的影响；C.miR-1-9模拟物对白蚁抗菌活性的影响。

图4：注射miR-71-5模拟物对白蚁免疫力的影响。A. 注射miR-71-5模拟物对白蚁抗菌活性的影响；B.注射miR-71-5模拟物对染菌白蚁死亡率的影响。

图5：喂食miR-71-5模拟物对白蚁免疫力的影响。A. 喂食miR-71-5模拟物对白蚁抗菌活性的影响；B.喂食miR-71-5模拟物对染菌白蚁死亡率的影响。

具体实施方式

实施例1 miRNA-71-5的筛选过程

利用全转录测序发现感染金龟子绿僵菌的黑胸散白蚁体内13种miRNAs和2656种mRNAs发生显著性变化（图1）。通过“miRNA-mRNA network”联合分析（图2）发现4种候选miRNAs能够靶向白蚁免疫相关基因，分别为miR-7-9、miR-61_2-2、miR-71-5和miR-1-9。通过T7转录系统分别合成miR-7-9模拟物、miR-61_2-2模拟物和miR-1-9模拟物。抗菌活性实验结果表明，喂食miR-7-9模拟物（t =1.405, df = 4, P>0.05, Paired t-test）、miR-61_2-2模拟物（t = 0.656, df = 4, P>0.05, Paired t-test）和miR-1-9模拟物（t = -0.198, df = 4, P>0.05, Paired t-test）对白蚁抗菌活性均无显著影响（图3）。

实施例2 miRNA-71-5模拟物的制备过程

利用黑胸散白蚁miR-71-5的DNA序列SEQ 1设计4条单链DNA，分别为正义链1为SEQ2（5’-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A-3’）；正义链2为SEQ 3（5’-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATAGTG AGT CGT ATT AGTGAT C-3’）；反义链1为SEQ 4（5’-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACCCAT GTC TTT CAA A-3’）；反义链2为SEQ 5（5’-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCTATAGTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3’）。

将2微升100 μM的正义链1与2微升100 μM的正义链2混合，进行退火PCR获得miRNA-71-5正义链模板。将2微升100 μM的反义链1与2微升100 μM的反义链2混合，进行退火PCR获得miRNA-71-5反义链模板。

将2.5微升上述miRNA-71-5正义链反应液与2.5微升miRNA-71-5反义链反应液混合，利用T7体外转录系统获得miRNA-71-5模拟物。收集反应体系，加无酶水到300微升。随后加入30微升醋酸钠溶液、150微升水饱和酚溶液和150微升氯仿溶液，13200转/分钟离心15分钟，取上清液。再加入600微升无水乙醇，负20度冰箱过夜，之后再次13200转/分钟离心15分钟，弃上清液。最后75%酒精洗涤沉淀，干燥，溶解沉淀，从而获得miRNA-71-5模拟物。

实施例3 注射miRNA-71-5模拟物对黑胸散白蚁抗菌活性的影响

利用显微注射系统将150纳升含1微克miR-71-5模拟物的溶液注入20头白蚁体内，放入直径3.5厘米的培养皿中培养，作为处理组；利用显微注射系统将1微克对照模拟物注入20头白蚁体内，放入直径3.5厘米的培养皿中培养，作为对照组。培养1天后，提取白蚁组织液，-20℃冰箱冻存待用。利用96孔酶标板，通过检测混合液（组织液+绿僵菌孢子）的吸光度计算白蚁抗菌活性。实验重复6次，利用Paired t-test分析数据差异性。如图4A所示，注射miR-71-5模拟物的白蚁抗菌活性显著低于对照组白蚁抗菌活性（t = -5.797, df = 5,P<0.05, Paired t-test），说明注射miR-71-5能够抑制白蚁免疫力。

实施例4 注射miRNA-71-5模拟物对黑胸散白蚁死亡率的影响

利用显微注射系统将150纳升含1微克miR-71-5模拟物的溶液注入42头白蚁体内，放入3个直径3.5厘米的培养皿中培养（每个培养皿中培养14头白蚁），作为处理组；利用显微注射系统将1微克对照模拟物注入42头白蚁体内，放入3个直径3.5厘米的培养皿中培养（每个培养皿中培养14头白蚁），作为对照组。培养1天后，将两种注射后的白蚁分别浸入金龟子绿僵菌孢子悬浮液（10⁷个/毫升）中5苗，重新放回培养皿中培养10天并记录每天白蚁的死亡情况，及时移除死亡个体。整理数据，利用Kaplan-Meier分析数据差异性。如图4B所示，注射miR-71-5模拟物的染菌白蚁[LT₅₀: 2.355 (2.127-2.579)]死亡率显著高于对照组染菌白蚁[LT₅₀: 4.218 (2.304-5.522)]死亡率（χ²= 20.442, P<0.001），说明注射miR-71-5能够提高金龟子绿僵菌的杀蚁效果。

实施例5 喂食miRNA-71-5模拟物对黑胸散白蚁抗菌活性的影响

将含70微克上述miRNA-71-5模拟物的溶液湿润直径1.5厘米的圆形滤纸片，放入直径3.5厘米的培养皿中，供15头黑胸散白蚁取食，作为处理组；将含70微克对照模拟物的溶液湿润直径1.5厘米的圆形滤纸片，放入直径3.5厘米的培养皿中，供15头黑胸散白蚁取食，作为对照组。喂食1天后，提取白蚁组织液，-20℃冰箱冻存待用。利用96孔酶标板，通过检测混合液（组织液+绿僵菌孢子）的吸光度计算白蚁抗菌活性。如图5A所示，喂食miR-71-5模拟物的白蚁抗菌活性显著低于对照组白蚁抗菌活性（t = -4.000, df = 5, P = 0.01,Paired t-test），说明喂食miR-71-5能够抑制白蚁免疫力。

实施例6 注射miRNA-71-5模拟物对黑胸散白蚁死亡率的影响

将含70微克上述miRNA-71-5模拟物的溶液湿润直径1.5厘米的圆形滤纸片，放入直径3.5厘米的培养皿中，供14头黑胸散白蚁取食，作为处理组（共3个处理组，42头白蚁）；将含70微克对照模拟物的溶液湿润直径1.5厘米的圆形滤纸片，放入直径3.5厘米的培养皿中，供15头黑胸散白蚁取食，作为对照组（共3个对照组，42头白蚁）。取食2天后，利用移液枪将0.35微升孢子悬浮液（10⁸个孢子/毫升）滴加到黑胸散白蚁腹部背面，将14头染菌白蚁共同培养10天，每天记录死亡个体数量并及时移除死亡个体。整理数据，利用Kaplan-Meier方法分析数据差异性。如图5B所示，喂食miR-71-5模拟物的染菌白蚁[LT₅₀: 2.481 (2.268-2.694)]死亡率显著高于对照组染菌白蚁[LT₅₀: 5.272 (5.001-5.554)]死亡率（χ²=63.593, P<0.001），说明喂食miR-71-5能够提高金龟子绿僵菌的杀菌效果。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物

<130>

<160> 3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> SEQ 1

5’-TGA AAG ACA TGG GTA ATG AGA-3’

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> SEQ 2

5’-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A-3’

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> SEQ 3

5’-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3’

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213>SEQ 4

5’-GAT CAC TAAT ACG ACT CAC TAT AGG GTC TCA TTA CCC ATG TCT TTC AAA-3’

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213>SEQ 5

5’-TTT GAA AGA CAT GGG TAAT GAG ACC CTAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3’

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213>SEQ 6

5’- UGA AAG ACA UGG GUA AUG AGA AA -3’

Claims

1.一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物，其特征在于，miR-71-5模拟物RNA序列为SEQ-ID NO: 6。

2.权利要求1所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物协同金龟子绿僵菌在制备用于防治白蚁的产品中的应用。

3.一种防治白蚁的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的miR-71-5模拟物通过显微注射技术注入白蚁体内；或者将如权利要求1所述的miR-71-5模拟物与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，使用金龟子绿僵菌孢子悬浮液感染miR-71-5模拟物处理的白蚁，实现防治。

4.根据权利要求3所述的防治白蚁的方法，其特征在于，注射方法采用显微注射系统，所述的金龟子绿僵菌孢子悬浮液的浓度为10⁶-10⁹个孢子/毫升。

5.根据权利要求3所述的防治白蚁的方法，其特征在于，喂食方法采用食物为纤维素制品，纤维素制品与miR-71-5模拟物的混合方式为浸润、或涂抹的固液混合方法，所述的金龟子绿僵菌孢子悬浮液的浓度为10⁶-10⁹个孢子/毫升。

6.一种增强生防菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将黑胸散白蚁体内miR-71-5，序列为SEQ 1设计成4条单链DNA，4条单链DNA分别为：正义链1为SEQ-ID NO:2，正义链2为SEQ-ID NO:3，反义链1为SEQ-ID NO:4和反义链2为SEQ-ID NO: 5；

（4）将miR-71-5正义链DNA模板与反义链DNA模板等量混合，通过T7体外转录系统获得miR-71-5模拟物，miR-71-5模拟物RNA序列为SEQ-ID NO: 6。