CN111849984B - 一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA - Google Patents

一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA。本发明中dsRNA的序列设计来源于黑胸散白蚁和黑翅土白蚁体内一种关键代谢酶基因，即异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）基因。利用IDH基因的特异性引物合成IDH dsRNA模板，随后通过T7体外转录系统转录生成dsIDH。采用RNAi技术将dsIDH导入白蚁体内后，IDH基因表达降低，白蚁抗真菌活性显著下降，细胞凋亡率增加，感染水平升高，IDH活性下降，ATP水平下降，运动距离降低，白蚁死亡率显著增加。本发明提供的dsIDH能显著提高金龟子绿僵菌对白蚁的防治效果，对环境友好，对人畜安全，具有良好的研究和应用前景。

Description

一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA
技术领域
本发明涉及一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA。
背景技术
白蚁是一种古老的社会性有害昆虫，能够危害我国农林作物、园林树木、房屋建筑和水利工程等，具有“无牙老虎”之称，严重威胁人民的生命和财产安全。在我国，除新疆、青海、宁夏、内蒙古和黑龙江等少数省（区）外，其余各省（区）均有白蚁分布。我国每年因白蚁危害造成的经济损失达100亿人民币，因此白蚁防治工作受到高度重视。目前，防治白蚁的方法有物理防治、化学防治、生物防治等方法，其中化学防治是白蚁防治的主要手段。目前，许多高毒高污染化学药剂已被禁用，如氯丹和灭蚁灵。因此，研究和开发无毒、无污染、对环境友好的生物防治药剂成为白蚁防治领域的迫切需求之一。
金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是应用最为广泛的昆虫致病真菌之一，其生防药剂对蝗虫、蛴螬、天牛、象甲等害虫致病力强，具有一定专一性、对人畜无害、不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性等优点，因此备受推崇。我国白蚁防治工作者在利用金龟子绿僵菌防治白蚁方面开展了大量工作，但是由于白蚁属于群居性社会昆虫，其个体之间能够执行理毛、交哺、隔离和埋尸等卫生行为，个体被病原菌感染后能够激活自身免疫、解毒和抗氧化等生理系统，这些行为和生理免疫策略导致金龟子绿僵菌对白蚁的野外防治效果一直不理想，严重限制了白蚁生物防治技术的推广和应用。
发明人前期工作发现，金龟子绿僵菌对单头白蚁具有较强致死效果，但是随着白蚁密度的增加，绿僵菌的致死效果显著降低。之所以出现这种现象，是因为同一巢群的白蚁个体之间可以相互清洁，共同抵御绿僵菌孢子的侵染。例如，少数染菌白蚁进入巢体后，多数健康白蚁会主动帮助染菌个体清理体表绿僵菌孢子。在接触的同时，健康白蚁会获得亚致死剂量的绿僵菌孢子，随后激活自身免疫系统，增强自身免疫力。通过这种类似“人痘接种”的主动免疫策略，巢内白蚁抵抗病原菌侵染的能力显著增强。由此可见，如何抑制白蚁的能量供应，进而削弱白蚁的免疫力和行为能力，将成为提高绿僵菌防治白蚁效果的关键之处。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，从白蚁代谢角度出发，提供一种专一性强、具有无毒、无污染和环境友好等特点，能够削弱白蚁抗菌能力，增强金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA，由如 SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。本发明中dsRNA的序列设计来源于黑胸散白蚁或黑翅土白蚁体内一种关键代谢酶基因，即异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase, IDH）基因。利用IDH基因的特异性引物合成IDH dsRNA模板，随后通过T7体外转录系统转录生成dsIDH。采用RNAi技术将dsIDH导入白蚁体内后，IDH基因表达降低，白蚁抗真菌活性显著下降，细胞凋亡率增加，感染水平升高，IDH活性下降，ATP水平下降，运动距离降低，白蚁死亡率显著增加。本发明提供的dsIDH能够显著提高金龟子绿僵菌对白蚁的防治效果，对环境友好，对人畜安全，具有良好的研究和应用前景。
本发明目的的实现方式为：（1）以白蚁cDNA为模板，利用IDH基因特异性引物（黑胸散白蚁：上游引物5’-AGG CTG CGA TTG AGT CTG-3’和下游引物5’-ACC AGC ACA CAT ATCAGA C-3’；黑翅土白蚁：上游引物5’-ACC CTG TCG ATC ACT GGA AG-3’和下游引物5’-TTGCTT TAT CTT GGC CTG CT-3’），通过PCR扩增得到IDH基因片段；（2）随后，以IDH基因片段为模板，利用含T7启动子的IDH特异性引物（黑胸散白蚁：上游引物5’-GGA TCC TAA TAC GACTCA CTA TAG GG AGG CTG CGA TTG AGT CTG-3’和下游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCACTA TAG GG ACC AGC ACA CAT ATC AGA C-3’；黑翅土白蚁：上游引物5’-GGA TCC TAA TACGAC TCA CTA TAG GGA CCC TGT CGA TCA CTG GAA G-3’和下游引物5’-GGA TCC TAA TACGAC TCA CTA TAG GGT TGC TTT ATC TTG GCC TGC T-3’），通过PCR进一步扩增得到IDH基因dsRNA模板；（3）最后，利用IDH基因dsRNA模板和通过T7体外转录系统转录生成dsIDH，黑胸散白蚁dsIDH片段大小为551bp，黑翅土白蚁dsIDH片段大小为530bp；（4）采用RNAi技术将dsIDH导入白蚁体内后，可以特异性降低白蚁体内IDH基因的表达量，显著降低白蚁抵抗绿僵菌侵染的能力，并引起白蚁细胞过度凋亡，抑制白蚁能量供应，特异性降低IDH活性，显著降低ATP水平，并导致运动距离显著下降，从代谢紊乱、打破免疫和行为干扰三个方面协同增强绿僵菌对白蚁的防治效果。
本发明的技术方案还提供一种将制备得到的IDH基因dsRNA在提高金龟子绿僵菌防治白蚁产品上的应用。
具体方法是将方法制备得到的IDH基因dsRNA导入到白蚁体中，并与感染金龟子绿僵菌的白蚁共同接触培养。
作为优选方案是将黑胸散白蚁特异性引物及含黑胸散白蚁T7启动子的特异性引物制备得到的IDH基因dsRNA导入到白蚁体中，并与感染金龟子绿僵菌的白蚁共同接触培养。
作为另一优选方案是将黑翅土白蚁特异性引物及含黑翅土白蚁T7启动子的特异性引物制备得到的IDH基因dsRNA导入到白蚁体中，并与感染金龟子绿僵菌的白蚁共同接触培养。
作为又一优选方案，是将上述两种IDH基因dsRNA分别导入白蚁体中，再共同与感染金龟子绿僵菌的白蚁共同接触培养。
本发明有以下3个明显的优点：
1．利用黑胸散白蚁和黑翅土白蚁cDNA和IDH特异性引物扩增dsRNA模板，使dsIDH作用于白蚁具有专一性强的特点，从而减少对非靶标生物的影响。
2．dsRNA设计来源于白蚁体内关键代谢酶基因IDH。dsIDH不仅可以降低白蚁抵抗绿僵菌侵染的能力，而且还能引起白蚁细胞过度凋亡，抑制白蚁能量供应，导致运动距离降低，从能量代谢紊乱介导的免疫抑制、组织损伤和行为干扰三个方面协同增强绿僵菌对白蚁的防治效果。
3．dsIDH属于一种双链RNA，制备方法简单，专一性强，环境友好，与金龟子绿僵菌结合使用防蚁效果理想，具有良好的研究和应用前景。
附图说明
图1为分别注射dsIDH、dsGFP对黑胸散白蚁体内IDH基因的表达量的影响，*, p <0.05; Wilcoxon test。
图2为分别注射dsIDH、dsGFP对黑翅土白蚁体内IDH基因的表达量的影响，***, p< 0.001; paired t-test。
图3为分别注射dsIDH、dsGFP对黑胸散白蚁抗绿僵菌活性的影响，**, p < 0.01;paired t-test。
图4为分别注射dsIDH、dsGFP至黑胸散白蚁体内后的细胞凋亡率，*, p < 0.05;Wilcoxon test。
图5为分别注射dsIDH、dsGFP至黑胸散白蚁体内后的感染水平，**, p < 0.01;Wilcoxon test。
图6为分别注射dsIDH、dsGFP至黑翅土白蚁体内后的IDH活性，*, p< 0.05;Wilcoxon test。
图7为分别注射dsIDH、dsGFP至黑翅土白蚁体内后的ATP水平，*, p< 0.05;Wilcoxon test。
图8为分别注射dsIDH、dsGFP至黑翅土白蚁体内后的运动距离，*, p< 0.05;paired t-test。
图9为分别注射dsIDH、dsGFP至黑胸散白蚁体内后的存活率，其中实线表示注射dsIDH的白蚁，虚线表示注射dsGFP的白蚁，p < 0.05; Kaplan-Meier methods。
具体实施方式
实施例1
dsIDH的制备过程：
（1）分别提取黑胸散白蚁和黑翅土白蚁体内总RNA，通过反转录获得白蚁cDNA库。
（2）以白蚁cDNA为模板，利用IDH特异性引物（黑胸散白蚁：上游引物5’-AGG CTGCGA TTG AGT CTG-3’和下游引物5’-ACC AGC ACA CAT ATC AGA C-3’；黑翅土白蚁：上游引物5’-ACC CTG TCG ATC ACT GGA AG-3’和下游引物5’-TTG CTT TAT CTT GGC CTG CT-3’），通过PCR扩增IDH基因片段，随后通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化IDH基因片段。
（3）通过T-A克隆将IDH基因片段导入pMD 18-T质粒（宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)），通过摇菌检测获得含目的基因IDH的纯净质粒。
（4）以上述IDH质粒为模板，利用含T7启动子的IDH特异性引物（黑胸散白蚁：上游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGC TGC GAT TGA GTC TG-3’和下游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CCA GCA CAC ATA TCA GAC-3’；或黑翅土白蚁：上游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CCC TGT CGA TCA CTG GAAG-3’和下游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT TGC TTT ATC TTG GCC TGCT-3’），通过PCR扩增得到IDH 基因dsRNA模板，随后通过酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1）方法对IDH 基因dsRNA模板进行纯化和浓缩。
（5）利用上述IDH 基因dsRNA模板和通过T7体外转录系统转录生成dsIDH，再通过酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1）方法对产物进行纯化和浓缩。
实施结果：获得大小551bp的黑胸散白蚁IDH基因dsRNA，具体序列如下：
5’-aggctgcgattgagtctgtaaacaaaaacaaagttggtttgaaaggtcctcttatgactccagtcggtaaaggccaccgctcattgaatttagccttaagaaaggaattcaatctgtacgcaaatgtgcgaccatgtcgatcactggaaggttatgagaccctttatgataatgtagacgttgtgacaatccgtgagaacaccgagggtgaatactctggcattgagcatgagattgtcgatggagtggtccagagtatcaagctcatcactgaagaagcatctagaagagtagctgagtttgcattcacgtatacaaaagaaaatggccgccacaaggttacagctgtacataaagccaatattatgagaatgtctgatggtctttttctccactgttgccgtgaagcagccgagaagcatccagatgtgaaatttgaagagaagtatttggacactgtgtgtctgaacatggtgcaggatcctacgcagtatgatgtactagtcatgccgaatctgtatggagacattttgtctgatatgtgtgctggt-3’。
获得大小530bp的黑翅土白蚁IDH基因dsRNA，具体序列如下：
5’-accctgtcgatcactggaagggtatgagaccctctatgataacgtggatgttgtgacaattcgtgagaacactgaaggtgaatactctggcattgagcatgagattgtggatggagtggtccagagtatcaagctcatcactgaagaagcatctagcagagtagctgagtttgcattcacgtatacaaaagaacatggccgccacaaagttacagctgtacataaagccaatattatgagaatgtctgatggtctttttctgcgctgttgccgtgatgcagctgagaagcatccagatgtgaaatttgaagagaagtatttggatactgtgtgtctgaacatggtgcaggatccctcgcaatatgatgtactggtcatgccaaatctgtatggagacattttgtccgatatgtgtgctggcctggttggtggcctgggtctaacacccagtggtaacattggtatcaatggagctctgtttgaatcggttcatggcacagctcctgatatagcaggccaagataaagcaa-3’。
实施例2
dsIDH的实施过程1：
通过显微注射将1.5 μg 对应的dsIDH导入黑胸散白蚁体内，在铺有湿润滤纸的直径3.5 cm的培养皿中培养2天，作为dsIDH处理组；通过显微注射将1.5 μg dsGFP导入黑胸散白蚁体内，在铺有湿润滤纸的直径3.5 cm的培养皿中培养2天，作为dsGFP对照组。
2天后，利用金龟子绿僵菌（浓度109个孢子/mL）感染1头白蚁，同时放入5头已注射上述dsRNA（dsIDH或者dsGFP）的白蚁。因此，实验包括2个处理组：（1）1头染菌白蚁+5头注射dsIDH白蚁；（2）1头染菌白蚁+5头注射dsGFP白蚁。共同培养1天后，组内注射白蚁由于接触染菌白蚁均感染少量金龟子绿僵菌孢子，随后对黑胸散白蚁dsIDH的实施效果进行以下检测：
1. dsIDH对IDH基因表达量影响的检测
每种处理设置6个生物学重复，来自3个不同巢体。利用RT-qPCR检测IDH基因表达量，使用Wilcoxon test分析数据显著性。
2. dsIDH对抗真菌活性影响的检测
每种处理设置9个生物学重复，来自3个不同巢体。将白蚁研磨，4℃条件下6000 xg离心，提取组织液。组织液（2 μL）与含有绿僵菌孢子（2 μL 约10000个孢子）的PD溶液（50μL）混合，培养1天后利用酶标仪测其吸光度，根据吸光度的差值计算抗菌活性。
抗菌活性=（a-b）/（a-c）*100%。
a. 不含组织液，含绿僵菌孢子的PD溶液。
b. 含组织液，含绿僵菌孢子的PD溶液。
c. 不含组织液，不含绿僵菌孢子的PD溶液。
3. dsIDH对细胞凋亡影响的检测。
利用Image-Pro Plus 6.0软件分析照片，计算细胞凋亡率。每种处理分析12张照片，来自3个不同巢体的白蚁切片。使用Wilcoxon test分析数据显著性。
4. dsIDH对感染水平影响的检测
每种处理随机选取17头白蚁个体，来自3个不同巢体。个体研磨，分别涂布PDA平板。1周后，计数平板上的菌落形成单位。使用Wilcoxon test分析数据显著性。
5. dsIDH对感染死亡影响的检测
每种处理设置6个生物学重复，来自3个不同巢体。使用Kaplan-Meier methods分析不同实验处理间白蚁存活率的差异显著性。
IDH的实施过程2：
通过显微注射将3.0 μg对应的 dsIDH导入黑翅土白蚁体内，在铺有湿润滤纸的直径9.0 cm的培养皿中培养3天，作为dsIDH处理组；通过显微注射将3.0 μg dsGFP导入黑翅土白蚁体内，在铺有湿润滤纸的直径9.0 cm的培养皿中培养3天，作为dsGFP对照组。
3天后，利用金龟子绿僵菌（浓度109个孢子/mL）感染1头白蚁，同时放入5头已注射上述dsRNA（dsIDH或者dsGFP）的白蚁。因此，实验包括2个处理组：（1）1头染菌白蚁+5头注射dsIDH白蚁；（2）1头染菌白蚁+5头注射dsGFP白蚁。共同培养1天后，组内注射白蚁由于接触染菌白蚁均感染少量金龟子绿僵菌孢子，随后对黑翅土白蚁dsIDH的实施效果进行以下检测：
1. dsIDH对IDH基因表达量影响的检测
每种处理设置9个生物学重复，来自3个不同巢体。利用RT-qPCR检测IDH基因表达量，使用paired t-test分析数据显著性。
2. dsIDH对IDH活性影响的检测
每种处理设置6个生物学重复，来自2个不同巢体。将白蚁研磨，4℃条件下5000 xg离心，提取组织液。吸取50 μL组织液，按照ELISA试剂盒操作步骤，利用酶标仪测其吸光度，根据标准曲线计算IDH活性。使用Wilcoxon test分析不同实验处理间白蚁体内IDH活性的差异显著性。
3. dsIDH对ATP水平影响的检测
每种处理设置9个生物学重复，来自3个不同巢体。将白蚁研磨，加入裂解液进行充分匀浆，4℃条件下12000 x g离心，提取组织液。组织液（20 μL）与ATP检测工作液（100 μL）混匀，利用液闪仪测定RLU值，根据标准曲线计算ATP水平值。使用Wilcoxon test分析不同实验处理间白蚁体内ATP水平的差异显著性。
4. dsIDH对运动距离影响的检测
每种处理设置10个生物学重复，来自4个不同巢体。每种处理随机选取10头白蚁个体，放置于直径30 cm的圆形行为测定装置中，用EthoVision XT行为追踪系统实时记录10头白蚁的运动距离，使用paired t-test分析不同实验处理间白蚁运动距离的差异显著性。
IDH的实施过程3：
通过显微注射将1.0 μg 对应的dsIDH导入黑胸散白蚁体内，将1.0 μg 对应的dsIDH导入黑翅土白蚁体内，在铺有湿润滤纸的直径3.5 cm的培养皿中培养2天，作为dsIDH处理组；通过显微注射将2.0 μg dsGFP导入黑胸散白蚁体内，在铺有湿润滤纸的直径3.5cm的培养皿中培养2天，作为dsGFP对照组。
利用金龟子绿僵菌（浓度109个孢子/mL）感染1头白蚁，同时分别放入3头已注射上述dsRNA（对应的dsIDH导入黑胸散白蚁及对应的dsIDH导入黑翅土白蚁）的白蚁。共同培养1天后，组内注射白蚁由于接触染菌白蚁均感染金龟子绿僵菌孢子。
IDH的实施效果：
从图1中可以看出，注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁体内IDH基因表达量显著低于注射dsGFP（下调29.2%）。（*, p < 0.05; Wilcoxon test）。
从图2中可以看出，注射对应的dsIDH的黑翅土白蚁体内IDH基因表达量显著低于注射dsGFP（下调47.3%）。（***, p < 0.001; paired t-test）。
从图3中可以看出，注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁抗绿僵菌活性显著低于注射dsGFP（下调22.4%）。（**, p < 0.01；paired t-test）。
从图4中可以看出，注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁体内细胞凋亡率显著高于注射dsGFP（上调214.1%）。（*, p< 0.05; Wilcoxon test）。
从图5中可以看出，注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁体内感染水平显著高于注射dsGFP（上调1102.9%）。（**, p < 0.01; Wilcoxon test）。
从图6中可以看出，注射对应的dsIDH的黑翅土白蚁体内IDH活性显著低于注射dsGFP（下调11.0%）。（*, p< 0.05; Wilcoxon test）。
从图7中可以看出，注射对应的dsIDH的黑翅土白蚁体内ATP水平显著低于注射dsGFP（下调44.9%）。（*, p< 0.05; Wilcoxon test）。
从图8中可以看出，注射对应的dsIDH的黑翅土白蚁的运动距离显著低于注射dsGFP（下调7.5%）。（*, p< 0.05; paired t-test）。
从图9中可以看出，10天内，注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁存活率（实线；LT50:5.3 (4.1–6.8)）显著低于注射dsGFP（虚线；LT50: 7.2 (6.1–9.4)）（p < 0.05; Kaplan-Meier methods）。表明本发明提供的dsIDH能显著提高金龟子绿僵菌防治白蚁的效果。10天的时间，注射对应的dsIDH的黑翅土白蚁体存活率与注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁存活率基本相同，均显著低于注射dsGFP。10天的时间，注射对应的dsIDH的黑翅土白蚁与注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁在混合的过程中重的存活率与注射对应的dsIDH的黑胸散白蚁存活率基本相同，均显著低于注射dsGFP。
序列表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
<110>华中农业大学
<120>一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA
<160>2
<210>SEQ ID NO: 1
<211>551bp
<212>DNA
<213>黑胸散白蚁IDH基因dsRNA
<400>1
5’-aggctgcgattgagtctgtaaacaaaaacaaagttggtttgaaaggtcctcttatgactccagtcggtaaaggccaccgctcattgaatttagccttaagaaaggaattcaatctgtacgcaaatgtgcgaccatgtcgatcactggaaggttatgagaccctttatgataatgtagacgttgtgacaatccgtgagaacaccgagggtgaatactctggcattgagcatgagattgtcgatggagtggtccagagtatcaagctcatcactgaagaagcatctagaagagtagctgagtttgcattcacgtatacaaaagaaaatggccgccacaaggttacagctgtacataaagccaatattatgagaatgtctgatggtctttttctccactgttgccgtgaagcagccgagaagcatccagatgtgaaatttgaagagaagtatttggacactgtgtgtctgaacatggtgcaggatcctacgcagtatgatgtactagtcatgccgaatctgtatggagacattttgtctgatatgtgtgctggt-3’
<210>SEQ ID NO: 2
<211>530bp
<212>DNA
<213>黑翅土白蚁IDH基因dsRNA
<400>2
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序列表
<110>华中农业大学
<120>一种能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA
<160>2
<210>SEQ ID NO: 1
<211>551bp
<212>DNA
<213>黑胸散白蚁IDH基因dsRNA
<400>1
5’-aggctgcgattgagtctgtaaacaaaaacaaagttggtttgaaaggtcctcttatgactccagtcggtaaaggccaccgctcattgaatttagccttaagaaaggaattcaatctgtacgcaaatgtgcgaccatgtcgatcactggaaggttatgagaccctttatgataatgtagacgttgtgacaatccgtgagaacaccgagggtgaatactctggcattgagcatgagattgtcgatggagtggtccagagtatcaagctcatcactgaagaagcatctagaagagtagctgagtttgcattcacgtatacaaaagaaaatggccgccacaaggttacagctgtacataaagccaatattatgagaatgtctgatggtctttttctccactgttgccgtgaagcagccgagaagcatccagatgtgaaatttgaagagaagtatttggacactgtgtgtctgaacatggtgcaggatcctacgcagtatgatgtactagtcatgccgaatctgtatggagacattttgtctgatatgtgtgctggt-3’
<210>SEQ ID NO: 2
<211>530bp
<212>DNA
<213>黑翅土白蚁IDH基因dsRNA
<400>2
5’-accctgtcgatcactggaagggtatgagaccctctatgataacgtggatgttgtgacaattcgtgagaacactgaaggtgaatactctggcattgagcatgagattgtggatggagtggtccagagtatcaagctcatcactgaagaagcatctagcagagtagctgagtttgcattcacgtatacaaaagaacatggccgccacaaagttacagctgtacataaagccaatattatgagaatgtctgatggtctttttctgcgctgttgccgtgatgcagctgagaagcatccagatgtgaaatttgaagagaagtatttggatactgtgtgtctgaacatggtgcaggatccctcgcaatatgatgtactggtcatgccaaatctgtatggagacattttgtccgatatgtgtgctggcctggttggtggcctgggtctaacacccagtggtaacattggtatcaatggagctctgtttgaatcggttcatggcacagctcctgatatagcaggccaagataaagcaa-3’

Claims (1)

1.IDH基因dsRNA在提高金龟子绿僵菌防治黑翅土白蚁上的应用，其特征在于，能提高金龟子绿僵菌防治白蚁效果的IDH基因dsRNA由如 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成，IDH基因dsRNA的制备方法如下：
（1）提取黑翅土白蚁体内总RNA，通过反转录获得白蚁cDNA库；
（2）以白蚁cDNA为模板，利用IDH特异性引物，通过PCR扩增IDH基因片段，随后通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化IDH基因片段，所述的IDH特异性引物为：黑翅土白蚁的上游引物5’-ACC CTG TCG ATC ACT GGA AG-3’，下游引物5’-TTG CTT TAT CTT GGC CTG CT-3’；
（3）通过T-A克隆将IDH基因片段导入pMD 18-T质粒，通过摇菌检测获得含目的基因IDH的IDH质粒；
（4）以上述IDH质粒为模板，利用含T7启动子的IDH特异性引物，通过PCR扩增得到IDH基因dsRNA模板，随后通过酚/氯仿/异戊醇混合溶剂对模板进行纯化和浓缩，含T7启动子的IDH特异性引物为：黑翅土白蚁的上游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGACCC TGT CGA TCA CTG GAA G-3’，下游引物5’-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGTTGC TTT ATC TTG GCC TGC T-3’；
（5）利用上述IDH 基因dsRNA模板和通过T7体外转录系统转录生成IDH基因dsRNA；将所述方法制备得到的IDH基因dsRNA导入到白蚁体中，并与感染金龟子绿僵菌的白蚁共同接触培养。
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