CN107805643A - 靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA‑DNA纳米系统及其制备方法 - Google Patents

靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA‑DNA纳米系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物耐药性研究技术领域，提供一种靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA‑DNA纳米系统及其制备方法。具体提供一种DNA纳米载体，其为由寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链组装而成的类四面体结构。在此基础上，本发明还提供DNA纳米载体负载siRNA靶向外排泵基因组成的纳米系统、制备方法及应用。本发明DNA纳米载体具有类四面体结构，其上能够稳定负载siRNA，并能将其安全、快速、高效地运输到靶细胞，以抑制沙门氏菌外排泵基因表达，提高了沙门氏菌对抗生素的敏感性，进而有效抑制沙门氏菌耐药性。

Description

靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA-DNA纳米系 统及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物耐药性研究技术领域，具体涉及一种DNA纳米载体、靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA-DNA纳米系统、其制备方法及应用。
背景技术
沙门氏菌是一类非常重要的革兰氏阴性菌，能引起人畜共患疾病。革兰氏阴性菌，尤其是沙门氏菌抗生素耐药问题不断加重，已成为全球关注的热点之一。由于多重耐药革兰氏阴性菌的不断蔓延，针对细菌感染的抗生素治疗的失败案例逐渐增多。世界卫生组织(WHO)宣称，耐药细菌已经成为威胁人类健康的主要因素之一，从而使寻找解决细菌耐药性的方法变得更加紧迫且具有意义。研究表明，外排泵可将多种抗生素排出细菌胞外，且多重耐药与广泛存在于革兰氏阴性菌中的RND外排泵过表达相关。因此，外排泵可开发为逆转耐药的潜在药物作用靶标。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一个高度有效的调控过程，导致转录后基因的沉默。该过程是由一段长度为21-23nt的短RNA双链，即小干扰 RNA(siRNA)介导。目前，siRNA已经应用于多种基因的沉默，甚至疾病的治疗，包括病毒感染和癌症，但应用于细菌基因沉默的研究报道较少。由于裸露的siRNA容易降解、不稳定，有效作用时间短，为延长siRNA的作用时间，目前siRNA沉默细菌基因大都用表达载体或转染试剂进行递送，但该方法实验周期长、试剂昂贵，不具有靶向性，需要高浓度过量的siRNA，且容易导致脱靶。
基于以上背景技术现状，如何将siRNA安全、快速、高效地运输到靶细胞是一个亟待研究的课题。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的首要目的是提供一种DNA纳米载体。该DNA纳米载体具有类四面体结构，其上能够稳定负载siRNA，并能将其安全、快速、高效地运输到靶细胞，以抑制沙门氏菌外排泵基因表达，提高了沙门氏菌对抗生素的敏感性，进而有效抑制沙门氏菌耐药性。
根据本发明的具体实施方式，本发明的DNA纳米载体，其为由寡核苷酸A 单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链组装而成的类四面体结构，所述寡核苷酸A单链的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述寡核苷酸B单链的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述寡核苷酸C单链的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
根据本发明的具体实施方式，本发明的另一目的是提供所述DNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：
A(200nM) 5μL
B(200nM) 5μL
C(200nM) 5μL
1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)配置反应体系：将(1)中准备好的各原料混匀得到反应体系；
(3)反应：将(2)中反应体系以下表作为依序反应条件，反应完毕即得所述DNA纳米载体：
。
根据本发明的具体实施方式，本发明的另一目的是提供基于所述DNA纳米载体的siRNA-DNA纳米系统，其为由前述的DNA纳米载体与Linker-sense链和antisense链负载反应而得，所述Linker-sense链的碱基序列如SEQ ID NO:4 所示，所述antisense链的碱基序列如SEQ ID NO:5所示。
根据本发明的具体实施方式，本发明还提供所述siRNA-DNA纳米系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：
A(200nM) 5μL
B(200nM) 5μL
C(200nM) 5μL
1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)配置反应体系：将(1)中准备好的各原料混匀得到反应体系；
(3)反应制取载体：将(2)中反应体系以下表作为依序反应条件，反应完毕得DNA纳米载体体系：
95℃ 5min
80℃ 5min
70℃ 5min
60-30℃ 1℃/10min
25℃ 20min
20℃ 20min
(4)负载反应：将1μL Linker-sense、antisense(9μM)加入到上述DNA 纳米载体体系中混匀，室温孵育30min，4℃保存即得。
根据本发明的具体实施方式，本发明的再一目的是提供基于所述DNA纳米载体的apt-siRNA-DNA纳米系统，其为由前述的DNA纳米载体与Linker-sense 链、antisense链以及Aptamer-linker链负载反应而得，所述Linker-sense链的碱基序列如SEQ ID NO:4所示，所述antisense链的碱基序列如SEQ ID NO:5所示，所述Aptamer-linker链的碱基序列如SEQ ID NO:6所示。
根据本发明的具体实施方式，本发明还提供所述apt-siRNA-DNA纳米系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：
A(200nM) 5μL
B(200nM) 5μL
C(200nM) 5μL
1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)配置反应体系：将(1)中准备好的各原料混匀得到反应体系；
(3)反应制取载体：将(2)中反应体系以下表作为依序反应条件，反应完毕得DNA纳米载体体系：
95℃ 5min
80℃ 5min
70℃ 5min
60-30℃ 1℃/10min
25℃ 20min
20℃ 20min
(4)负载反应：将1μL Linker-sense、antisense(9μM)和1μL Linker-aptamer (3μM)加入到上述DNA纳米载体体系中混匀，室温孵育30min，4℃保存即得。
根据本发明的具体实施方式，本发明的还一目的是提供所述DNA纳米载体、所述siRNA-DNA纳米系统和/或所述apt-siRNA-DNA纳米系统在抑制细菌抗生素耐药性中的应用。更为优选的是提供所述DNA纳米载体、所述siRNA-DNA纳米系统和/或所述siRNA-DNA纳米系统在制备抑制细菌抗生素耐药性的药物中的应用。
进一步优选的，根据本发明的具体实施方式，本发明的还提供所述DNA纳米载体、所述siRNA-DNA纳米系统和/或所述apt-siRNA-DNA纳米系统在制备抗菌药物中的应用。优选的，所述菌为沙门氏菌。进一步优选的，所述抗菌药物中还包含有抗生素，所述抗生素优选为氯霉素、庆大霉素和/或氨苄青霉素。
本发明的有益效果为：本发明首先创新性地设计了一个类四面体DNA纳米载体，并在此基础上进一步制得了siRNA-DNA纳米系统和apt-siRNA-DNA纳米系统。在本发明的具体实施例中，通过原子力显微镜观察表明，成功制备了类四面体DNA纳米载体；通过非变性凝胶电泳实验表明，成功制备了类四面体 DNA纳米载体和适配体介导的类四面体DNA纳米载体；通过生物相容性实验表明，沙门氏菌培养液中仅添加该类四面体DNA纳米载体不影响沙门氏菌的生长。本发明针对沙门氏菌外排泵基因acrA设计了一对siRNA，并构建了两组 DNA纳米系统：类四面体DNA纳米载体负载siRNA(siRNA-DNA纳米系统)、适配体介导的类四面体DNA纳米载体负载siRNA(apt-siRNA-DNA纳米系统)，并设置不携带siRNA的DNA纳米载体为对照组。将两组系统与沙门氏菌孵育处理后，通过RT-qPCR测定了沙门氏菌外排泵基因acrA表达水平，结果表明，与对照组相比，apt-siRNA-DNA纳米系统处理后的鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因 acrA表达量下降3.62倍，siRNA-DNA纳米系统处理后的鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因acrA表达量下降1.37倍(p<0.05)；apt-siRNA-DNA纳米系统处理的肠炎沙门氏菌外排泵基因acrA表达量下降1.21倍，siRNA-DNA纳米系统处理的肠炎沙门氏菌外排泵基因acrA表达量下降1.26倍(p<0.05)。siRNA-DNA纳米系统和apt-siRNA-DNA纳米系统均有效抑制了沙门氏菌外排泵基因acrA的表达(p<0.05)，且鼠伤寒沙门氏菌适配体介导的siRNA-DNA纳米系统处理后的鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因acrA表达量下降更多。通过微量稀释法测定氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素对处理后沙门氏菌MIC值，结果表明，与对照组相比，三种抗生素对apt-siRNA-DNA纳米系统处理后鼠伤寒沙门氏菌MIC值分别下降4、4、8倍，肠炎沙门氏菌MIC值均下降2倍(p<0.05)；三种抗生素对siRNA-DNA纳米系统处理后鼠伤寒沙门氏菌MIC值均下降2倍，肠炎沙门氏菌MIC值均下降2倍(p<0.05)。siRNA-DNA纳米系统和apt-siRNA-DNA纳米系统均有效降低了抗生素对沙门氏菌MIC值(p<0.05)，且鼠伤寒沙门氏菌适配体介导的siRNA-DNA纳米系统处理后鼠伤寒沙门氏菌MIC值下降更多。
综上所述，本发明创新性设计了一种类四面体DNA纳米载体，以用于负载 siRNA；为了增强靶向性，巧妙地添加了鼠伤寒沙门氏菌适配体引导DNA纳米载体靶向结合沙门氏菌。通过原子力显微镜和非变性凝胶电泳表征了制备的上述两种纳米载体。针对MDR沙门氏菌中流行性广泛且能介导多重耐药的外排泵基因acrA设计了siRNA，并用上述DNA纳米载体载带siRNA，从而制备了 siRNA-DNA纳米系统。将两组系统与沙门氏菌孵育处理后，通过RT-qPCR测定了沙门氏菌外排泵基因acrA表达水平，通过微量稀释法测定氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素对处理后的沙门氏菌的MIC值。本发明能够高效、靶向抑制沙门氏菌耐药关键位点，提高了沙门氏菌对抗生素的敏感性，显著抑制沙门氏菌耐药性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是DNA类四面体自组装模式图；
图2是siRNA-DNA类四面体自组装模式图；
图3是apt-siRNA-DNA类四面体自组装模式图；
图4是自组装类四面体DNA纳米载体的非变性PAGE分析图；
图5是类四面体DNA纳米载体的AFM鉴定图；
图6是沙门氏菌R5经类四面体DNA处理后不同时间OD值；
图7是siRNA-DNA纳米系统处理鼠伤寒沙门氏菌R5acrA表达水平柱状图；
图8是siRNA-DNA纳米系统处理肠炎沙门氏菌R2acrA表达水平柱状图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本发明的设计原理及作用效果，下文将结合具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释。应当声明的是，其不应当理解成对本发明的保护范围的限制。
具体实施例：
1、材料与仪器
1.1菌株
氯霉素敏感沙门氏菌S1分离株、具有多重耐药表型且RND外排泵家族耐药基因呈阳性，耐氯霉素但相关耐药基因呈阴性的氯霉素抗性鼠伤寒沙门氏菌 R5分离株、肠炎沙门氏菌R2分离株和质控菌株大肠杆菌(E.coli，ATCC 25922) 均由四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存。
1.2主要试剂
Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；
Taq酶、T4DNA连接酶、dNTP、逆转录试剂盒RevertAidTM First strand cDNASynthesis Kit购自Fermentas公司；
所有设计并采用的DNA序列均由行业常规方法于上海生工生物公司合成；
50×TAE/Mg2+Buffer：称量242.28g Tris，37.22g Na2EDTA·2H2O，268.625 g Mg(Ac)2放于烧杯中，加入800ml ddH2O，充分搅拌溶解。加入57.1mL醋酸，充分混匀。加ddH2O定容至1L，室温保存。使用时，稀释为1×工作液。
1.3主要仪器
本实施例主要采用的仪器见下表：
2、方法
2.1DNA纳米载体的制备
2.1.1DNA单链碱基序列设计与合成
本实施例合成DNA纳米载体所需序列如下表所示：
A、B、C依次分别为寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链的简述代称。
DNA纳米载体的DNA类四面体自组装原理参见图1。
2.1.2DNA类四面体自组装
(1)反应体系
将合成好的A、B、C分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液，并按以下成分配制体系，混匀。
A(200nM) 5μL
B(200nM) 5μL
C(200nM) 5μL
1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)反应条件：
95℃ 5min
80℃ 5min
70℃ 5min
60-30℃ 1℃/10min
25℃ 20min
20℃ 20min
2.1.3自组装DNA类四面体的特性表征
原子力显微镜(AFM)观察
取5μL DNA类四面体溶液样品，轻轻滴加到新剥离的云母表面上，静置2 min待其吸附后，用30μL Mg(Ac)2(2mM)溶液轻轻冲洗，压缩氮气彻底吹干，使用MultiMode 8AFM系统(Bruker)检测样品，采用轻巧模式(AC mode) 成像。
2.1.4DNA纳米载体生物相容性
用LB培养基振荡培养多重耐药株R5，直至菌液浓度达到106CFU/mL。取 96孔细胞培养板，向每孔中分别加入200μL上述菌液，各3个重复。向各孔中加入30μL上述制备的DNA类四面体溶液，混合均匀。37℃培养，每2h测量一次OD值，持续8h。
2.2siRNA-DNA纳米系统的制备
2.2.1沙门氏菌R5DNA提取、acrA基因克隆、测序
选用沙门氏菌R5进行DNA提取，根据GenBank公布的鼠伤寒沙门氏菌基因组序列(GenBank:AL513382.1)设计acrA基因的引物，克隆acrA基因并测序。克隆引物为acrA F：5′-AGGCGUCGGCGCUGCAGCCCGUGC-3′；R： 5′-GCACGGGCUGCAGCGCCGACGCCU-3′。
2.2.2siRNA序列的设计与合成
根据上述acrA基因测序结果，设计siRNA，序列如下表4-3所示，并经行业常规方法于广州锐博生物科技有限公司合成。
siRNA 序列Sequence(5′-3′)
acrA-siRNAsense AGGCGUCGGCGCUGCAGCCCGUGC
acrA-siRNAantisense GCACGGGCUGCAGCGCCGACGCCU
Scramblecontrolsense GCGCGUUUGGUUAUCGUAU
Scramblecontrolantisense AUACGAUAACCAAACGCGC
siRNA-DNA纳米系统的自组装原理参见图2。
2.2.3单链碱基序列设计与合成
本实施例中用于制备siRNA-DNA纳米系统的单链碱基序列如下表所示：
2.2.4携带acrA siRNA的DNA类四面体自组装
(1)反应体系
A(200nM) 5μL
B(200nM) 5μL
C(200nM) 5μL
1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)反应条件：
95℃ 5min
80℃ 5min
70℃ 5min
60-30℃ 1℃/10min
25℃ 20min
20℃ 20min
(3)将1μL Linker-sense、antisense(9μM)加入到上述体系中混匀，室温孵育30min。4℃保存。
2.3基于适配体的siRNA-DNA纳米系统(即本发明的apt-siRNA-DNA纳米系统)的制备
2.3.1DNA单链碱基序列设计与合成
本实施例中用于制备适配体介导的siRNA-DNA纳米系统的DNA单链碱基序列如下表所示：
apt-siRNA-DNA纳米系统的自组装原理参见图3。
2.3.2基于适配体的携带acrA siRNA的DNA类四面体自组装
(1)反应体系：
A(200nM) 5μL
B(200nM) 5μL
C(200nM) 5μL
1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)反应条件：
95℃ 5min
80℃ 5min
70℃ 5min
60-30℃ 1℃/10min
25℃ 20min
20℃ 20min
(3)将1μL Linker-sense、antisense(9μM)和1μL Linker-aptamer(3μM) 加入到上述体系中混匀，室温孵育30min。4℃保存。
2.3.3基于适配体的DNA纳米系统表征
使用非变性凝胶电泳技术表征apt-DNA纳米载体。
2.4siRNA-DNA纳米系统靶向结合沙门氏菌外排泵基因acrA
2.4.1siRNA-DNA纳米系统靶向结合鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因acrA
(1)采用96孔细胞培养板进行试验，共分为5组。
组号 处理
1 3μLnakedsiRNA
2 siRNA-DNA纳米系统
3 Apt-siRNA-DNA纳米系统
4 3μLScrambledsiRNA
5 3μLddH2O
(2)根据实验分组，向上述1-5组中分别接种106CFU/mL氯霉素抗性鼠伤寒沙门氏菌R5分离株，各做三个重复。向106CFU/mL氯霉素敏感沙门氏菌 R2分离株中加入3μLddH2O，作为对照。
(3)37℃培养6h。
2.4.2siRNA-DNA纳米系统靶向结合肠炎沙门氏菌外排泵基因acrA
(1)采用96孔细胞培养板进行试验，共分为5组。
(2)根据实验分组，向上述1-5组中分别接种106CFU/mL氯霉素抗性肠炎沙门氏菌R2分离株，各做三个重复。向106CFU/mL氯霉素敏感沙门氏菌S1 分离株中加入3μL ddH2O，作为对照。
(3)37℃培养6h。
2.4.3siRNA-DNA纳米系统靶向结合沙门氏菌acrA表达水平测定
2.4.3.1扩增沙门氏菌外排泵基因acrA及内参基因16S rRNA，所用引物序列见下表：
基因 引物序列(5′-3′)
acrA AAAACGGCAAAGCGAAGGT
GTACCGGACTGCGGGAATT
16SrRNA AAAGCGTGGGGAGCAAACAG
CCGCTGGCAACAAAGGATAA
2.4.3.2外排泵基因RT-qPCR扩增
(1)PCR反应体系：
DNA模板 1.5μL
SYBRGreenExTaq 12.5μL
dNTP 2μL
Forwardprimer 0.5μL
Reverseprimer 0.5μL
ddH2O 10μL
(2)PCR扩增条件：
每个样品做3个重复。
(3)以16S rRNA为参照基因，每个样品做3个重复。用2-ΔΔCT的方法计算外排泵基因的相对表达水平。再以氯霉素敏感沙门氏菌S1分离株为对照，计算氯霉素抗性沙门氏菌分离株外排泵基因acrA变化倍数。
2.4.4siRNA-DNA纳米系统靶向结合沙门氏菌后MIC值测定
参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的操作规程，采用微量稀释法测定氯霉素、氨苄青霉素和庆大霉素对上述各组中沙门氏菌MIC值。质控菌为大肠杆菌ATCC25922。
2.4.5抗生素的制备
依据实验中所需抗生素浓度范围准备合适浓度的抗生素母液。向足够孔数的96孔细胞培养板的各孔中加入100μL灭菌的MH肉汤。将提前准备的抗生素母液用移液器分别加入到第1列的各孔，每孔100μL，吹打混合均匀；取100μL移至第2列，依此步骤对抗生素进行二倍递减稀释，直至稀释至第 11列，每个浓度下的抗生素稀释液体积均为100μL。每种抗生素做3个重复。
2.4.6菌液的制备
用新鲜配制的MH肉汤将4.3.5中培养6h的沙门氏菌培养物调整至 OD＝0.5，再按照1:1000的比例对其进行稀释，将该稀释菌液加入到上述各孔中，每孔中各加100μL菌液。第12列中加入200μL MH肉汤，作为空白对照。
2.4.7微量稀释法测定抗生素敏感性
密封后置恒温培养箱中于37℃培养16-20h，判断结果。耐药和敏感的突破点见下表：
2.5数据处理
所有实验数据采用平均数±标准差表示，并用SPSS 25.0统计软件进行分析，两组均数之间的比较采用独立样本t检验，p<0.05设为显著差异。
3、结果
3.1DNA纳米载体的鉴定
设计的三条DNA单链A、B、C通过碱基互补配对自组装形成类四面体DNA 纳米载体。为了鉴定设计的纳米载体是否构建成功，利用非变性凝胶电泳进行表征。在非变性凝胶电泳中，DNA分子量越大，构型越复杂，则迁移率越低。根据分子量大小和空间结构，预期的迁移率为：构建的适配体介导的DNA类四面体纳米载体最小，单链DNA最大。
参见图4所展示的自组装类四面体DNA纳米载体的非变性PAGE分析图，图中，A：apt-DNA四面体；B：DNA四面体；C：单链DNA。迁移率C>B>A，与预期的一致，且从图上可以直观的看出，目的条带单一、清晰，说明构建的类四面体DNA纳米载体纯度较高。
为了进一步直观验证设计的类四面体DNA纳米载体是否构建成功，利用原子力显微镜验证构建的类四面体DNA纳米载体，如图5所示，DNA结构完整、边缘清晰、大小均一，大小约为17nm，与预期一致，表明成功构建类四面体DNA纳米载体。
3.2DNA纳米载体生物相容性鉴定
将构建的类四面体DNA纳米载体与鼠伤寒沙门氏菌R5共同孵育后，结果如图6所示，与没有加入类四面体DNA纳米载体的对照组相比，各时间点OD 值都无显著性差异(p>0.05)。
3.3 siRNA-DNA纳米系统的制备
3.3.1 acrA基因克隆测序
根据GenBank中公布的鼠伤寒沙门氏菌acrA基因，设计引物克隆分离株 R5的acrA基因，测序结果如下(另也可详见序列表中的SEQ ID NO:7)：TTAAGACCTGGGCTGAGCAGGTTGATCACCGCTTGCGGCTTGCTGTTTGTTATCCGCGGTAATTTCCTGCACTTTAACCTGTGCGCCAGGACGTACTTTTTGCAGCCCGCTGACGACTACGCGGTCGCCCGCTTTCAACCCGTCAGTCACCAGCCACTTATCGCCGATCGCCTGGCTTGCGACGATTTGGCGGGTTTCCACTTTGTTATCAGCGCCAACCACCAGCACCGTGGCATCGCCGCGTGGAGTACGGGTAACGCCCTGTTGTGGAACCAGTAATGCCGTCGGTTTTGTCCCTTCCTGCAGACGTGCGCGAACGAACATTCCTGGCAATAAGGTGTGATCCGGGTTAGGGAAGATGGCGCGCAAAGTAATAGACCCGGTGCTTTGGTCAACGGTCACGTCGGAGAATTCAAGCGTACCGGACTGCGGGAATTTGATACCGTCGCTTGTCACCAGATCGACCTTCGCTTTGCCGTTTTCCTGCTTCAGCGAACCATTTGCCAGCTCCTGCTTCAGGCGCAGGAAGTCATTGCTGGACTGGGTCACATCGACATAAATAGGGTCCAGCTGCTGCACTGTCGCCAGCGCCGACGCCTGACCGTTCTGTACCAGCGCGCCTTCCGTTACGGACGACTTACCAATACGACCGCTAATCGGTGAGGTGACTTTGGTATACGCCAGGTTGATACGTGCGGTTTCAACGGCGGCTTTTGCTGCGACAACGGCGGCAGTCGCTTGTTGCGCGTCAGCCAGCGCCTGATCGTATTCCTGCTTACTGATGTACTGCGTACCCAGCAGCTTTTGATAACGCTTCACCGTCAGTTCAGCGATATTCGCGGCGGCCTGCGCTTTTGCCAGATCGCCCTTAGCGCTGTCGTAAGTCGCCTGGTAAGTCGCAGGATCAATCTGATAGAGAGAGACTCCCGCTTCGATATCACTTCCCTCAACGAAATTACGCTTCAGGATAATGCCGCTTACCTGCGGGCGAACTTCGGCGATACGGTAAGCAACGGTACGACCCGGAAGTTCAGTTGTGATTTGCAGTGGTTCCGTTTTTAGTGTGACAACCCCAACTTCTGGCATCTGCTGGCCGCCTTGCTGGTCCTGTTTGTCGTCACATCCTGTTAGCGCTAAGCTGCCTGAGAGCATCAGAACGACCGCCAGAGGCGTTAACCCTCTGTTTTTGTTCAT。
3.3.2 siRNA序列的设计与合成
根据上述acrA基因测序结果，设计siRNA序列。
3.3.3 siRNA-DNA纳米系统靶向结合沙门氏菌对acrA表达水平的影响
3.3.3.1 siRNA-DNA纳米系统靶向结合鼠伤寒沙门氏菌对acrA表达水平的影响
基于沙门氏菌氯霉素敏感株S1，实验测定了不同处理后鼠伤寒沙门氏菌 R5分离株acrA表达水平，结果如图7所示。与未加siRNA处理的鼠伤寒沙门氏菌R5分离株相比，用siRNA-DNA纳米系统处理鼠伤寒沙门氏菌R5分离株 6h后，acrA表达水平下降了1.87倍；用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导 siRNA-DNA纳米系统处理鼠伤寒沙门氏菌R5分离株6h后，acrA表达水平下降了3.62倍(p<0.05)；用裸露siRNA处理鼠伤寒沙门氏菌R5分离株6h后， acrA表达水平略有下降，但不显著(p>0.05)。
3.3.3.2 siRNA-DNA纳米系统靶向结合肠炎沙门氏菌对acrA表达水平的影响
基于沙门氏菌氯霉素敏感株S1，实验测定了不同处理后肠炎沙门氏菌R2 分离株acrA表达水平，结果如图8所示。与未加siRNA处理的肠炎沙门氏菌 R2分离株相比，用siRNA-DNA纳米系统处理肠炎沙门氏菌R2分离株6h后， acrA表达水平下降了1.26倍；用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导siRNA-DNA 纳米系统处理肠炎沙门氏菌R2分离株6h后，acrA表达水平下降了1.21倍 (p<0.05)；用裸露siRNA处理肠炎沙门氏菌R2分离株6h后，acrA表达水平略有下降，但不显著(p>0.05)。
3.3.4siRNA-DNA纳米系统靶向结合沙门氏菌后MIC值测定
3.3.4.1siRNA-DNA纳米系统靶向结合鼠伤寒沙门氏菌后MIC值测定
实验测定了氯霉素对siRNA-DNA纳米系统处理前后R5分离株的MIC值，结果如下表所示，氯霉素对siRNA-DNA纳米系统处理6h后R5分离株的MIC 值比处理前下降了2倍。另外，用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导siRNA-DNA 纳米系统处理鼠伤寒沙门氏菌R5分离株6h，MIC值下降了4倍(p<0.05)。
实验测定了氨苄青霉素对siRNA-DNA纳米系统处理前后R5分离株的MIC 值，结果如下表所示，氨苄青霉素对siRNA-DNA纳米系统处理6h后R5分离株的MIC值比处理前下降了2倍。另外，用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导 siRNA-DNA纳米系统处理鼠伤寒沙门氏菌R5分离株6h，MIC值下降了4倍 (p<0.05)。
实验测定了庆大霉素对siRNA-DNA纳米系统处理前后R5分离株的MIC 值，结果如下表所示，庆大霉素对siRNA-DNA纳米系统处理6h后R5分离株的MIC值比处理前下降了2倍。另外，用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导 siRNA-DNA纳米系统处理鼠伤寒沙门氏菌R5分离株6h，MIC值下降了4倍 (p<0.05)。
3.3.4.2siRNA-DNA纳米系统靶向结合肠炎沙门氏菌后MIC值测定
实验测定了氯霉素对siRNA-DNA纳米系统处理前后R2分离株的MIC值，结果如下表所示，氯霉素对siRNA-DNA纳米系统处理6h后R2分离株的MIC 值比处理前下降了2倍。另外，用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导siRNA-DNA 纳米系统处理肠炎沙门氏菌R2分离株6h，MIC值也下降了2倍(p<0.05)。
实验测定了氨苄青霉素对siRNA-DNA纳米系统处理前后R2分离株的MIC 值，结果如下表所示，氨苄青霉素对siRNA-DNA纳米系统处理6h后R2分离株的MIC值比处理前下降了2倍。另外，用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导 siRNA-DNA纳米系统处理肠炎沙门氏菌R2分离株6h，MIC值也下降了2倍 (p<0.05)。
实验测定了庆大霉素对siRNA-DNA纳米系统处理前后R2分离株的MIC 值，结果如下表所示，庆大霉素对siRNA-DNA纳米系统处理6h后R2分离株的MIC值比处理前下降了2倍。另外，用鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体介导 siRNA-DNA纳米系统处理肠炎沙门氏菌R2分离株6h，MIC值也下降了2倍 (p<0.05)。
4、结论分析
4.1 RNA干扰策略的选择
裸露siRNA是一种高分子量的分子，有一个带负电荷的磷酸骨架，能与同样带负电荷的细胞膜产生静电排斥作用，从而限制了它扩散到细胞。裸露siRNA 对血清核酸酶敏感，容易被肾清除，且呈无靶标生物分布，这些都给siRNA靶向高效抑制基因造成了阻碍。稳定性差和循环半衰期短，严重限制了裸露siRNA 在治疗方面中的运用。因此，利用各种载体和化学修饰的策略已被运用到siRNA 对靶细胞的高效递送中。
可用于递送siRNA的载体分为两大类：病毒性和非病毒性载体。多种腺病毒、逆转录病毒和慢病毒已被用来作为siRNA递送系统的载体。使用这些病毒载体有助于克服转染效率差和细胞定位差的问题。然而，病毒载体有一定的局限性。由于序列插入缺乏可预测性，病毒载体具有高突变的风险；病毒载体的承载能力有限；它可能会导致不良的免疫反应。这些缺点严重限制了病毒载体作为siRNA递送系统的使用。因此，现在的关注点是非病毒载体介导的安全递送细胞特异性siRNA。非病毒载体结合siRNA的形式通常包括阳离子载体 -siRNA复合物、siRNA结合小分子的复合物或将siRNA封装在聚合物纳米粒子中。利用纳米材料递送siRNA延长了其循环半衰期，降低了毒性和潜在的诱导免疫应答。然而，这些载体大多数不能准确地识别目标组织和特异性结合靶细胞，导致siRNA非靶向生物分布，使siRNA难以接触靶位点进行有效抑制。因此，它们有许多局限性，如高治疗剂量、诱发炎症反应的倾向和低效的细胞内基因沉默。解决这一问题的有效策略是使用siRNA递送系统提高细胞吸收效率。靶向siRNA递送系统的一个重要机制是非病毒载体与靶向基团的结合，降低了非特异性递送到非目标组织的可能，从而减少治疗剂量使用和降低脱靶效应。其中，适配体被认为是优良的靶向配体，由于它们对靶分子的高亲和力和特异性。核酸适配体介导的靶向递送系统具有如下优点，包括通过化学合成易于精准生产、延长的半衰期、能逃避多重耐药、稳定性增强、降低的非特异性毒性和靶向能力增强。基于碱基互补配对原则，本研究通过三条序列不同的DNA单链设计了一个类四面体结构，原子力显微镜和非变性凝胶电泳结果表明，成功自组装成类四面体结构，即构建了一个新型DNA纳米载体，以携带siRNA高效干扰目的基因。
4.2RNA干扰目的基因的选择
RND外排泵是革兰氏阴性菌中一类非常重要的外排泵。在革兰氏阴性菌的 5种外排泵家族中，RND外排泵是多重耐药阴性菌中最普遍的一类，而且在细胞内代谢产物的解毒、固有和获得性耐药、群体感应以及对宿主的入侵、黏附与定植中起到一定作用，尤其在革兰氏阴性菌多重耐药中起到重要作用。MDR 是减少抗生素泵入或增加泵出的结果。RND外排泵能催化多种抗生素、染料和洗涤剂等底物的主动外排，而且其中大部分底物结构不相似，但这也为发现新的药物靶点提供了重要的发展方向。因此，选取RND外排泵作为肠炎沙门氏菌 siRNA干扰的靶标。
AcrAB-TolC是存在于大肠杆菌中的RND外排系统，它能泵出多种抗菌药物包括抗生素、杀虫剂等，它对细菌的存活、定植和毒力也很关键。在对氯霉素耐药的26株MDR沙门氏菌中，有8株检测不到相关耐药基因，而AcrAB-TolC 呈阳性，且阳性率最高，同时基因表达量上调。另外，氯霉素已被我国禁止用于食品动物，规模化养殖场已经停止使用氯霉素，针对氯霉素抗性的产生原因，实验结果表明，AcrAB-TolC外排泵在MDR沙门氏菌对氯霉素的耐药中发挥一定作用，相关报道也证明了这一观点。AcrA是膜融合蛋白，能将两种跨膜蛋白AcrB和TolC联系起来，起到稳定RND外排泵三聚体结构的作用。研究表明， AcrA能够促进AcrB转运底物的活性；且acrA基因突变将导致与TolC的联系失败，不能诱导TolC外排药物。近年来，AcrAB-TolC复合物的透射电子显微镜(TEM)或冷冻电镜(cryo-EM)图像表明，外排泵组成的化学计量，即AcrB： AcrA：TolC的比率为3：6：3。因此，AcrAB-TolC外排泵系统的正常生理功能需要更多数量的acrA基因来维持。而且，同源性分析表明，acrA基因在三者之间是相对保守的。综上，选取acrA作为MDR沙门氏菌siRNA干扰的靶标。
4.3 siRNA-DNA纳米系统对沙门氏菌耐药性的影响
研究表明，RNA干扰技术可以用于细菌重要基因的干扰。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)凝固酶是发挥感染作用最重要的酶之一。Yanagihara等针对MRSA凝固酶设计并合成了21bp的siRNA，研究siRNA对凝固酶表达的影响。结果表明，siRNA能抑制体外培养的MRSA凝固酶mRNA表达和活性；同时体内实验结果也表明，siRNA可有效减少血源性肺感染小鼠的细菌负荷。利用siRNA靶向凝固酶可能是用于治疗MRSA感染的一种新策略。 MexAB-OprM是铜绿假单胞菌最主要的外排泵。Liu等构建了能表达mexA的正向互补RNA的表达载体，在铜绿假单胞菌中表达正向互补RNA。结果表明，铜绿假单胞菌对多种可作为MexAB-OprM底物的抗生素MIC值下降50％。溴化乙锭(EB)的积累初速度为对照组的2倍。
上述研究表明，利用RNA干扰技术可以使目标基因，包括外排泵相关基因发生沉默。但Yanagihara等使用的是裸露siRNA，容易降解、不稳定，有效作用时间短，且需要每小时连续添加siRNA。为延长siRNA的作用时间，目前 siRNA沉默细菌基因大都用表达载体或转染试剂进行递送，但该方法实验周期长、试剂昂贵，不具有靶向性，需要高浓度过量的siRNA，且容易导致脱靶。本研究构建了一个类四面体DNA载体，并携带siRNA。定量实验表明，与未添加siRNA处理的对照组相比，用siRNA-DNA纳米系统处理沙门氏菌6h，acrA 表达量显著下降(p<0.05)。但用裸露siRNA处理沙门氏菌6h，acrA表达量略有降低，无显著差异(p>0.05)。表明类四面体DNA载体能有效保护siRNA不受降解，构建的siRNA-DNA系统具有高效的干扰作用。同时，类四面体DNA 载体能通过DNA自组装形成，相比构建表达载体，过程简单、可控；而且类四面体DNA载体具有良好的生物相容性，对沙门氏菌正常生长没有影响。
AcrAB-TolC能泵出多种抗菌药物，包括抗生素、杀虫剂等。针对其重要组分acrA进行干扰，可能有效降低AcrAB-TolC外排泵基因的表达量，减少对多种抗生素的泵出。本研究利用DNA纳米载体携带siRNA干扰MDR沙门氏菌外排泵基因acrA，降低了acrA表达量，而且能引起氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素对沙门氏菌MIC值的下降，证明构建的siRNA-DNA纳米系统可提高MDR 沙门氏菌对多种抗生素的敏感性，具有广谱性。
基因同源性比对分析表明，acrA在沙门氏菌中相对保守，因此，针对鼠伤寒沙门氏菌acrA设计的siRNA可能也适用于对其它沙门氏菌的干扰。本研究结果表明，应用siRNA-DNA纳米系统处理后，不仅引起氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素对鼠伤寒沙门氏菌MIC值的下降，同样也引起氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素对肠炎沙门氏菌MIC值的下降，证明针对acrA设计siRNA并用DNA 纳米系统携带可有效降低多种沙门氏菌的耐药性。
传统的siRNA表达载体不具有靶向性，为达到一定实验效果，需要siRNA 过量添加，但有时仍出现局部浓度过低的情况。本研究利用适配体介导 siRNA-DNA纳米系统靶向结合鼠伤寒沙门氏菌，结果表明，相比于siRNA-DNA 纳米系统处理，鼠伤寒沙门氏菌适配体介导的siRNA-DNA纳米系统处理后的鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因acrA表达量和MIC值下降更多，证明用适配体介导siRNA-DNA纳米系统靶向结合MDR沙门氏菌，可提高siRNA到达沙门氏菌的速度，增加对沙门氏菌的特异性结合，减少非特异性结合，从而增加沙门氏菌周围siRNA浓度，减少siRNA添加量，提高siRNA利用效率。
5、基于以上论述，本发明建立了一种新型类四面体构象DNA纳米载体自组装方法，创新性地设计了一个类四面体DNA纳米载体，原子力显微镜和非变性凝胶电泳实验表明，成功制备了类四面体DNA纳米载体。生物相容性实验表明，沙门氏菌培养液中添加该类四面体DNA纳米载体不影响沙门氏菌的正常生长。
针对沙门氏菌外排泵基因acrA成功设计了siRNA，并应用类四面体DNA 纳米载体负载siRNA结合沙门氏菌。RT-qPCR检查表明，siRNA-DNA纳米系统处理后的鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌外排泵基因acrA表达量均不同程度下降，且鼠伤寒沙门氏菌适配体介导的siRNA-DNA纳米系统处理后的鼠伤寒沙门氏菌外排泵基因acrA表达量下降更多。
氯霉素、庆大霉素、氨苄青霉素对沙门氏菌MIC值测定结果表明，抗生素对siRNA-DNA纳米系统处理后鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌MIC值均不同程度下降，且鼠伤寒沙门氏菌适配体介导的siRNA-DNA纳米系统处理后鼠伤寒沙门氏菌MIC值下降更多。
本发明建立了一种新型类四面体DNA纳米载体自组装方法，成功构建了 siRNA-DNA纳米系统和适配体介导siRNA-DNA纳米系统，且抑制了沙门氏菌外排泵基因表达，降低了抗生素对沙门氏菌MIC值。通过抑制非抗生素作用关键基因的表达，为探索有效抑制沙门氏菌耐药性的提供新的方向。
序列表
<110> 四川大学
<120> 靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA-DNA纳米系统及其制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gtagcgctac tagcatctct cccagcgtgg ttcagtttac cttcctccgc aatactgca 59
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
ctctgcagag cattgaggcc gtctgactgt acatagacca cgctgggaga gatgcta 57
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gacgatcgtc tgcagtattg cggaggaagg taaaacatta cagtcagacg gcctcaatg 59
<210> 4
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
actgactatg atgttaggcg ucggcgcugc agcccgugc 39
<210> 5
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
gcacgggcug cagcgccgac gccu 24
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
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actgactatg atgtt 75
<210> 7
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
ttaagacctg ggctgagcag gttgatcacc gcttgcggct tgctgtttgt tatccgcggt 60
aatttcctgc actttaacct gtgcgccagg acgtactttt tgcagcccgc tgacgactac 120
gcggtcgccc gctttcaacc cgtcagtcac cagccactta tcgccgatcg cctggcttgc 180
gacgatttgg cgggtttcca ctttgttatc agcgccaacc accagcaccg tggcatcgcc 240
gcgtggagta cgggtaacgc cctgttgtgg aaccagtaat gccgtcggtt ttgtcccttc 300
ctgcagacgt gcgcgaacga acattcctgg caataaggtg tgatccgggt tagggaagat 360
ggcgcgcaaa gtaatagacc cggtgctttg gtcaacggtc acgtcggaga attcaagcgt 420
accggactgc gggaatttga taccgtcgct tgtcaccaga tcgaccttcg ctttgccgtt 480
ttcctgcttc agcgaaccat ttgccagctc ctgcttcagg cgcaggaagt cattgctgga 540
ctgggtcaca tcgacataaa tagggtccag ctgctgcact gtcgccagcg ccgacgcctg 600
accgttctgt accagcgcgc cttccgttac ggacgactta ccaatacgac cgctaatcgg 660
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gacaacggcg gcagtcgctt gttgcgcgtc agccagcgcc tgatcgtatt cctgcttact 780
gatgtactgc gtacccagca gcttttgata acgcttcacc gtcagttcag cgatattcgc 840
ggcggcctgc gcttttgcca gatcgccctt agcgctgtcg taagtcgcct ggtaagtcgc 900
aggatcaatc tgatagagag agactcccgc ttcgatatca cttccctcaa cgaaattacg 960
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acccggaagt tcagttgtga tttgcagtgg ttccgttttt agtgtgacaa ccccaacttc 1080
tggcatctgc tggccgcctt gctggtcctg tttgtcgtca catcctgtta gcgctaagct 1140
gcctgagagc atcagaacga ccgccagagg cgttaaccct ctgtttttgt tcat 1194

Claims (10)

1.DNA纳米载体，其为由寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链组装而成的类四面体结构，所述寡核苷酸A单链的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述寡核苷酸B单链的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述寡核苷酸C单链的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
2.权利要求1所述的DNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：
A(200nM) 5μL B(200nM) 5μL C(200nM) 5μL 1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)配置反应体系：将(1)中准备好的各原料混匀得到反应体系；
(3)反应：将(2)中反应体系以下表作为依序反应条件，反应完毕即得所述DNA纳米载体：
。
3.siRNA-DNA纳米系统，其为由权利要求1所述的DNA纳米载体与Linker-sense链和antisense链负载反应而得，所述Linker-sense链的碱基序列如SEQ ID NO:4所示，所述antisense链的碱基序列如SEQ ID NO:5所示。
4.权利要求3所述的siRNA-DNA纳米系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：
A(200nM) 5μL B(200nM) 5μL C(200nM) 5μL 1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)配置反应体系：将(1)中准备好的各原料混匀得到反应体系；
(3)反应制取载体：将(2)中反应体系以下表作为依序反应条件，反应完毕得DNA纳米载体体系：
95℃ 5min 80℃ 5min 70℃ 5min 60-30℃ 1℃/10min 25℃ 20min 20℃ 20min
(4)负载反应：将1μL Linker-sense、antisense(9μM)加入到上述DNA纳米载体体系中混匀，室温孵育30min，4℃保存即得。
5.apt-siRNA-DNA纳米系统，其为由权利要求1所述的DNA纳米载体与Linker-sense链、antisense链以及Aptamer-linker链负载反应而得，所述Linker-sense链的碱基序列如SEQID NO:4所示，所述antisense链的碱基序列如SEQ ID NO:5所示，所述Aptamer-linker链的碱基序列如SEQ ID NO:6所示。
6.权利要求5所述的apt-siRNA-DNA纳米系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH2O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：
A(200nM) 5μL B(200nM) 5μL C(200nM) 5μL 1×TAE/Mg2+ 15μL
(2)配置反应体系：将(1)中准备好的各原料混匀得到反应体系；
(3)反应制取载体：将(2)中反应体系以下表作为依序反应条件，反应完毕得DNA纳米载体体系：
95℃ 5min 80℃ 5min 70℃ 5min 60-30℃ 1℃/10min 25℃ 20min 20℃ 20min
(4)负载反应：将1μL Linker-sense、antisense(9μM)和1μL Linker-aptamer(3μM)加入到上述DNA纳米载体体系中混匀，室温孵育30min，4℃保存即得。
7.权利要求1所述的DNA纳米载体、权利要求3所述的siRNA-DNA纳米系统和/或权利要求5所述的apt-siRNA-DNA纳米系统在抑制细菌抗生素耐药性中的应用。
8.权利要求1所述的DNA纳米载体、权利要求3所述的siRNA-DNA纳米系统和/或权利要求5所述的apt-siRNA-DNA纳米系统在制备抗菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述菌为沙门氏菌。
10.根据权利要求8或9所述的应用，所述抗菌药物中还包含有抗生素，所述抗生素优选为氯霉素、庆大霉素和/或氨苄青霉素。
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