CN112592922B - 一种抑制细菌生物膜生长的dna四面体复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物，属于载药体系技术领域。本发明的DNA四面体复合物是由一种兼并寡核苷酸通过共价键连接在DNA四面体上形成的复合物。所述兼并寡核苷酸具有如下序列：DTWACANNNNNDTAACA；其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G。本发明的DNA四面体复合物易于被细菌摄取，可有效抑制细菌胞外多糖的形成，从而显著抑制细菌生物膜的生长。本发明的复合物可应用于降低细菌抗逆性，提高抗生素灭菌的效果；还有望应用于局部慢性感染的辅助治疗，提高抗感染疗效。

Description

一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物
技术领域
本发明属于载药体系技术领域，具体涉及一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物。
背景技术
细菌生物被膜(或称细菌生物膜Bacterial biofilm，BF)，是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。
生理条件下，与浮游细菌相比，BF细菌对抗生素的耐药性可提高500-5000倍，其原因在于：首先，由于生物膜环境中营养物和空间的竞争，生物膜中的细菌生长和增殖，代谢率降低。其次，EPS(胞外聚合物)基质中的蛋白质和多糖成分可以防止和延迟抗生素渗透到生物膜中，给予位于基质深处的成熟细胞更多时间形成抗性。第三，个体细菌具有抗性并产生抗生素抗性因子，从而导致整个生物膜群落的抗性；它被称为被动抗性，抗性相关基因可以通过侧向基因转移在细菌之间共享，这是一种在生物膜中不同菌株之间交换基因的机制。
BF内细菌并非随意堆砌，而是相互协调，构成一个具有高度分化结构的群体。除了对抗生素的耐药性提高以外，BF相比浮游细菌适应环境的能力(抗宿主免疫能力、耐酸性、抗饥饿性等等能力等等)全面提高，还具有更高的毒力。
微生物生物膜形成现在被认为是许多局部慢性感染的主要毒力因子。例如，心脏，肺组织，皮肤，口腔等。由于生物膜具有自我保护能力和强毒性，传统的治疗方法(如机械清创，抗生素，生物膜驱逐剂)无法提供足够的治疗效果，因此对抗生物膜感染的关键是抑制生物膜的形成。
DNA四面体(TDNs或tFNAs)，是一种性能优异的纳米材料，无毒性、有良好的生物相容性和生物可降解性，优异的细胞膜通透性，特别是具有精准的结构可控性使其具备强大的应用潜力。当前，在生物医学领域引起广泛的重视，特别是作为一种性质优良的载体。tFNAs是由四条特别设计过的无义序列的单链DNA(ssDNA)S1、S2、S3、S4通过自组装形成的具有三维结构的DNA纳米材料，四条单链序列遵循“碱基互补配对原则”，合成方法简单，产率高。目前已发现单纯的tFNAs结构能够穿过细胞膜而进入活细胞，并具有促进干细胞增殖，维持细胞形态的作用，其可作为一种载体，且无细胞毒性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种有效抑制变异链球菌细菌生物膜生长的DNA四面体复合物。
本发明中，“生物膜”与“BF”、“细菌生物膜”的概念等同。
本发明中，“兼并寡核苷酸”指由具备相似碱基序列的不同寡核苷酸组成的混合物；所述的相似碱基序列可以用一个通式表示，该通式为“兼并序列”。
本发明的技术方案包括：
一种兼并寡核苷酸，其序列为DTWACANNNNNDTAACA；其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G。
如前述的兼并寡核苷酸，所述寡核苷酸中序列不同的寡核苷酸分子等摩尔比混合。
一种DNA四面体复合物，它是将前述的兼并寡核苷酸通过共价键连接在DNA四面体上形成的复合物。
如前述的DNA四面体复合物，所述DNA四面体由序列如SEQIDNO.1～4所述的DNA单链通过碱基互补配对形成。
如前述的DNA四面体复合物，所述兼并寡核苷酸通过共价键连接在序列如SEQIDNO.2所示的DNA单链上。
前述的寡核苷酸在制备抑制细菌生物膜生长的药物中的用途；所述药物是以前述兼并寡核苷酸为活性成分，加上能将寡核苷酸运输至细菌细胞内的载体，制备而成。
如前述的用途，所述细菌为变异链球菌。
前述DNA四面体复合物在制备抑制细菌生物膜生长的药物中的用途。
进一步的，所述细菌为变异链球菌。
本发明还提供了一种抑制细菌生物膜生长的药物，它的活性成分是前述DNA四面体复合物。
进一步的，所述细菌是变异链球菌。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的寡核苷酸具有靶向多个基因的能力，使用DNA四面体运送其进入细菌体内后，能够表现出明显的抑制胞外多糖合成相关的多个基因GtfB、GtfC、GtFD，GbpB和Ftf的能力。
2)本发明的DNA四面体复合物容易被细菌摄取。实验证明，本发明的DNA四面体复合物(ASOs-tFNAs)，相比单独的寡核苷酸(ASOs)或DNA四面体(tFNAs)进入菌体能力都有显著提高；这为寡核苷酸发挥抑制生物膜作用奠定了坚实的基础。
3)本发明的DNA四面体复合物能够有效抑制细菌生物膜的形成。
值得注意的是，本发明的ASOs-tFNAs中，tFNAs能提升对ASOs的抑制功效，产生协同增效作用：实验表明，tFNAs和ASOs对生物膜形成的抑制作用之和远远低于ASOs-tFNAs。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明的DNA四面体复合物(ASOs-tFNAs)的构建流程。
图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
图3为原子力显微镜验证的tFNAs，ASOs-tFNAs粒径，形态大小结果图。
图4为透射电镜验证ASOs-tFNAs的形态结果图。
图5为tFNAs的粒径结果图。
图6为ASOs-tFNAs粒径结果图。
图7为tFNA，ASOs-tFNA粒径，电位测试统计学分析结果。
图8为流式细胞术检验变异链球菌对ASOs-tFNAs的摄取结果图。
图9为浮游细菌为加入不同浓度tFNAs，ASOs-tFNAs后的生长曲线图。
图10不同浓度tFNAs，ASOs-tFNAs在处理24，48h后的生物膜结晶紫染色图和统计结果。
图11为不同浓度不同浓度tFNAs，ASOs，ASOs-tFNAs处理24h的3D层扫结果。
图12为750nMtFNAs，ASOs，ASOs-tFNAs处理24后的生物膜扫描电镜图。
图13为q-PCR检测寡核苷酸所有目标基因表达的变化结果。
具体实施方式
实施例1本发明的DNA四面体复合物的合成
1.制备方法
每条ssDNA单链(S1、ASOs-S2、S3、S4)以相同摩尔浓度浓度加入含有TM buffer(10mM Tris-HCl，50mMMgCl2，pH 8.0)的EP管中，涡旋混匀，离心，然后置于PCR仪内，将温度迅速升高到95℃维持10min，再快速降温到4℃维持20min，合成ASOs-tFNAs，浓度约为1000nM，其构建过程如图1所示。
相关序列如表1所示，S1～S4是组成DNA四面体最基本的ssDNA，ASOs即为本发明复合物中具有抑制BF活力的反义寡核苷酸的兼并序列，ASOs通过磷酸二酯键与S1～S4中任一单链相连(本实施例中是与S2相连，形成ASOs-S2)，即可被固定于最终合成的DNA四面体上。
表1复合体中相关序列
Figure BDA0002387203340000041
注：D为A或G；W为A或T；N为任意碱基；S1、S2、S3、S4、ASOs分别对应核苷酸序列表中的SEQIDNO.1～5；实际实验操作中，ASOs是序列如表1中兼并序列DTWACANNNNNDTAACA所示的各种序列(子序列)等摩尔比混合得到的，但理论上并非一定要等摩尔比例，允许存在用量调整。
2.鉴定
(1)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证ASOs-tFNAs的分子量与合成情况
①制备聚丙烯酰胺凝胶；
②上样和电泳：将1μ16×loading buffer分别与5μl的样品和marker混合均匀，然后加入对应的电泳槽中，在恒压为80V条件下电泳90min；
③GelRed染色及曝光：将聚丙烯酰氨凝胶放置于以GelRed和蒸馏水按照1：50的比例混合的混合液中，避光，摇床15-25min，然后曝光，其结果见图2。
图2中，泳道2-6分别为marker、S1、S2、S3、S4、ASOs-S2、泳道10-18分别为marker、S1、S1+S2、S1+ASOs-S2、S1+S2+S3、S1+S3+ASOs-S2、tFNA、ASOs-tFNA.从左到右的样品分子量大小分别为60bp，40bp，40bp，40bp，80bp，40bp，120bp，180bp，240bp，300bp，450bp，500bp左右，ASOs-tFNA成功合成且多以二聚体(大小为500bp左右)的形式存在。
(2)采用原子力显微镜(AFM)验证ASOs-tFNAs的粒径大小
将稀释20倍和50倍的样品，斡旋，离心，然后滴在硅片上，待样品干燥后，镜检，其结果如图3所示，tFNAs的粒径大小在10nm左右，ASOs-tFNAs的粒径大小在15nm左右(圆圈标记)。
(3)采用透射电镜验证ASOs-tFNAs的形态
取出铜片，将样品滴到铜片上，烘烤5-6min，重复2-3次，镜检，其结果见图4。
由图4可知，ASOs-tFNAs的形状呈现为近似三角形，且存在一定数量的多聚体(均为虚线标记)。
(4)粒径，zeta电位
采用动态光散射仪检测tFNAs，ASOs-tFNA的粒径，其平均粒径分别约为10.58nm，16.66nm结果如图5，6所示。
采用zeta电位仪检测tFNAs，ASOs-tFNA的电位，结果如图7所示。
以上结果表明ASOs-tFNA的制备成功。
以下以实验例的方式进一步说明本发明的复合物ASOs-tFNAs抑制生物膜形成的能力。实验例中需要对tFNAs、ASOs-tFNAs等进行示踪时，会事先在S1-S4任一单链中加入荧光基团Cy5，经实施例1的方法合成后，即得到Cy5-tFNAs、Cy5-ASOs-tFNAs；ASOs也可直接进行Cy5荧光基团标记，得到Cy5-ASOs。
实验例1变异链球菌对ASOs-TDNs的摄取
在96孔板中接种变异链球菌细胞悬液，将培养板置于5％CO2培养箱中，在37℃预培养6h，然后在595nm处测定菌液OD值，接着将菌液稀释5倍后接种于24孔板，使用tFNAs(Cy5-tFNAs，500,750nM)，ASOs(Cy5-ASOs，500,750nM)和ASOs-tFNAs(Cy5-ASOs-tFNAs，500，750nM)分别处理细菌12小时(5％CO2，37℃避光条件下培养过夜)，收集细胞于2ml EP管中，12000r/min离心5min，弃上清，用PBS洗涤，接着12000r/min离心5min，重复洗涤离心2-3次，最后将所得细胞转移至流式管中，上机检测。检测结果见图8。
由图8可知，用cy5荧光标记的tFNAs，ASOs-tFNAs被变异链球菌成功摄取，并且ASOs可以促进tFNAs的摄取。
实验例2浮游细菌生长试验
挑取变异链球菌UA 159单菌落生长并培养直至达到早期对数期(OD595nm＝0.2～0.3)。调整细菌的OD值一致后。将其与不同浓度的tFNAs和ASOs-tFNAs(500nM，750nM)共培养，并在细胞培养板中与BHI(无蔗糖)一起孵育。使用自动分光光度计(BioTek，Winooski，VT，美国)测量浮游细菌的生长，并在24小时内获取相应的光密度读数(595nm)；每2小时测试一次OD595nm值，每30分钟摇动一次平板。
由图9可知，在不加蔗糖的条件下，添加tFNAs与ASOs-tFNAs对悬浮细菌的生长没有明显区别。
结论：无糖条件下，ASOs-tFNAs不会影响细菌的生长。
实验例3生物膜形成的分析
(1)生物膜的结晶紫染色
为了测试ASOs-tFNAs对生物膜形成的抑制作用，将实验菌株接种到含有BHIS(含1％蔗糖)的96孔板的孔中。分别用tFNAs，ASOs，ASO-tFNAs(500、750nM)处理24h和48h。然后，将培养液吸出并用PBS再次洗涤。并向每个孔中添加100ul甲醇以固定15分钟，吸出多余的液体并自然干燥。将0.1％的结晶紫染色溶液加入到每个孔中，并在20℃下染色5分钟，镜检。随后吸出孔中的染色液后，用干燥箱干燥。最后，在每个孔中加入100μl乙酸(33％)，以在37℃下溶解结晶紫染色溶液30分钟。用紫外分光光度计测试洗脱液样品的OD值(OD595nm)。
结果如图10所示，图10a，10b分别是处理24，48h的结果，可以看出单纯的tFNAs不影响细菌生物膜的形成，单纯的ASOs对其有一定的抑制效果，但不明显；ASOs-tFNAs对生物膜的抑制效果十分显著，高于单纯的ASOs的抑制效果的数倍。
(2)激光共聚焦显微镜分析细菌生物膜和胞外多糖的分布
将实验菌株的过夜培养物接种到带有tFNAs，ASOs和ASOs-tFNA(500，750nM)的BHIS中24小时。通过对变异链球菌和EPS进行原位标记，我们观察到了细菌生物膜的结构。在接种菌株之前，向BHIS培养基中添加了Alexa Fluor 647标记的葡聚糖偶联物(1μM；Thermo Fisher Scientific，MA，USA)。在细胞培养箱中培养24h后，将培养基吸出，将每个样品用无菌PBS重洗两次，以去除浮游性细胞和松散结合的细胞。然后添加SYTOTM9染料(赛默飞科技)100∶1的比例标记生物膜15分钟。通过共聚焦激光显微镜(Nikon A1R MP+，日本)检查了细菌生物膜的结构。我们使用Z截面来记录生物膜的厚度，每层厚度为1μM。每个样本都在五个随机选择的位置进行扫描。最后，共聚焦图像是生物膜的三维结构图像，我们使用COMSTAT图像处理软件来分析共聚焦图像堆栈并计算EPS和细菌细胞(S.mUA159)的生物量。
结果如图11所示，图11a，11b分别是500，750nMASOs-tFNAs处理24小时后的3d层扫结果。当浓度为500nM时，ASOs-tFNAs处理组的EPS和细菌覆盖率比值(EPS/BacteriaRatio)比ASOs组明显更低；浓度为750nM时，ASOs-tFNAs处理组的EPS和细菌覆盖率比值比ASOs组低十倍以上(曲线下面积)。
该实验表明，ASOs-tFNAs具有比ASOs更为显著的抑制生物膜的能力。
(3)扫描电镜观察生物膜形态
用扫描电镜(FEI，Hillsboro，OR，美国)观察ASOs-tFNAs对生物膜结构和EPS含量的影响，将变形链球菌过夜培养接种到带有玻璃盖玻片和BHIS培养基的细胞培养板上。孵育一天后，用无菌PBS再次洗涤，去除浮游细菌和松散的细胞，将每个样品在4℃下用2.5％戊二醛固定过夜，然后每个样品洗涤一次。用无菌PBS洗涤并在无水乙醇系列中脱水以保持细菌细胞的形态，每个样品都涂上金，并在SEM下观察。
如图12所示为750nMASOs-tFNAs处理24h后的变异链球菌生物膜的扫描电镜结果，可以明显看见单纯的tFNAs，ASOs组都还存在胞外多糖(白色箭头，海绵孔状)，生物膜结构完整，但ASOs-tFNAs实验组已经无法看见完整的生物膜结构了。
结论：本发明的DNA四面体复合物可通过抑制胞外多糖的产生而达到抑制生物膜形成的作用。
实验例4抑制胞外多糖生成的机制验证
发明人使用定量RT-PCR验证了ASOs-tFNAs的多重靶向，涉及的靶基因有GtfB、GtfC、GtFD，GbpB和Ftf，这些基因均是与胞外多糖合成相关的基因。
用16S rRNA作为对照基因定量了靶基因的表达。菌株在带有tFNA和ASOs-tFNA(750nM)的BHIS中生长到对数后期。然后，通过离心(4000g，4℃，10分钟)收获菌株，并在TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific)中速冻直至需要。从每个样品中提取总RNA，并通过带有基因组DNA消除剂的RNeasy Mini Kit(Hiden，德国)进行纯化。将提取的样品溶解在无RNase的水中。cDNA的制备，使用cDNA合成试剂盒(TaKaRa，中国)。通过定量RT-PCR进行所有靶mRNA的扩增。在此实验中，对照组使用tFNAs。
从图13可以看出靶基因的表达均被降低。
结论：本实验例证明了多重靶向的有效性和通过抑制胞外多糖相关基因的表达以达到抑制生物膜形成的效果。
综上，本发明的复合物ASOs-tFNAs可以被变异链球菌吸收，前者通过抑制后者的多个基因，抑制细菌胞外多糖形成，从而抑制生物膜形成。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种抑制细菌生物膜生长的DNA四面体复合物
<130> GYKH1118-2019P018175CC
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
dtwacannnn ndtaaca 17

Claims (7)

1.一种DNA四面体复合物，其特征在于：它是将兼并寡核苷酸通过共价键连接在DNA四面体上形成的复合物；所述兼并寡核苷酸为如下序列：
DTWACANNNNNDTAACA，其中D为碱基A或G；W为碱基A或T；N为碱基A、T、C或G；所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1～4所述的DNA单链通过碱基互补配对形成。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述兼并寡核苷酸中序列不同的寡核苷酸等摩尔比混合。
3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述兼并寡核苷酸通过共价键连接在序列如SEQ ID NO.2所示的DNA单链上。
4.权利要求1～3任一所述复合物在制备抑制细菌生物膜生长的药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：所述细菌为变异链球菌。
6.一种抑制细菌生物膜生长的药物，其特征在于：它的活性成分是权利要求1～3任一所述复合物。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述细菌是变异链球菌。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108085317A (zh) * 2018-01-17 2018-05-29 四川大学 一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108085317A (zh) * 2018-01-17 2018-05-29 四川大学 一种特异性靶向变异链球菌gtfB位点的CRISPR-B基因编辑方法及应用
CN108498806A (zh) * 2018-04-13 2018-09-07 四川大学 一种反义肽核酸-dna四面体载体复合物及其制备方法和应用
CN109620959A (zh) * 2019-01-18 2019-04-16 四川大学 一种dna四面体-汉黄芩素复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《A VicRK Signal Transduction System in Streptococcus mutans Affects gtfBCD, gbpB, and ftf Expression, Biofilm Formation, and Genetic Competence Development》;Senadheera MD等;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20051231;第187卷(第12期);摘要 *
《DNA框架核酸递送多重靶向的反义寡核苷酸以抑制生物膜的形成》;张雨欣;《2019第九次全国口腔生物医学学术年会论文汇编中华口腔医学会会议论文集》;20191011;第1页 *
《Multi-targeted Antisense Oligonucleotide Delivery by a Framework Nucleic Acid for Inhibiting Biofilm Formation and Virulence》;Zhang Yuxin等;《NANO-MICRO LETTERS》;20200317;第12卷(第1期);第1-13页 *

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