TWI757892B - 對抗細菌及生物膜的疫苗組成物及其製備方法與用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種對抗細菌及生物膜的疫苗組成物及其製備方法與用途。

Description

對抗細菌及生物膜的疫苗組成物及其製備方法與用途

本發明是有關於一種對抗細菌及生物膜的疫苗組成物及其製備方法與用途。

隨著醫學的進步，越來越多的醫藥品及食品產品被使用於醫療及改善人類的生活。然而，在獲得這些醫藥品及食品產品所帶來的好處的同時，感染的問題卻是個難以避免及棘手的問題。尤其是細菌感染常會造成併發症及後遺症，甚至嚴重到發生敗血症，因此對於細菌感染的預防及治療是當前醫學所致力研究之方向。特別地，在水產養殖業中，格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)、發光桿菌(photobacteria)、弧菌(vibrios)及嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)是造成國內養殖魚、蝦類常見的細菌感染症之主要細菌。

目前臨床上對於受到細菌感染的個體(例如魚隻)雖然可以選擇有效的抗生素治療，但往往投藥成效有限，並且在疾病控制後又可能反覆發生。先前技術記載許多細菌性病原可能藉由在體內形成生物膜，而增加對抗菌劑之抵抗力，導致投藥治療效果不佳。

為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出對抗細菌及生物膜的疫苗組成物以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於製備一對抗細菌及生物膜的疫苗組成物之方法，包含以下步驟：(a)將一幾丁聚醣(chitosan)置於水中，並調整pH值至酸性；(b)加熱攪拌使該幾丁聚醣溶於水中形成一液體，接而將該液體滴入一鹼性溶液中，使該幾丁聚醣形成一幾丁聚醣球體；(c)將一細菌與該幾丁聚醣球體接觸混合BHI，接而經由一懸浮培養歷時一段時間，該細菌會形成一生物膜，包覆該幾丁聚醣球體而形成一球體混合物；以及(d)對該生物膜與該幾丁聚醣球體所形成的該球體混合物進行一離心處理，收集一幾丁聚醣-生物膜球體，藉此得到該疫苗組成物。

在本發明的一實施例中，在步驟(d)中，該方法進一步包含將收集好的該幾丁聚醣-生物膜球體置於一福馬林中進行不活化，之後藉由透析方式移除福馬林，藉此得到該疫苗組成物。

本發明之另一目的為提供一種對抗細菌及生物膜的疫苗組成物，包含一細菌的生物膜(biofilm)以及一幾丁聚醣(chitosan)。

在本發明的一實施例中，該幾丁聚醣具有一至少1 mg/mL的濃度。

在本發明的一實施例中，該幾丁聚醣具有一為10 mg/mL的濃度。

在本發明的一實施例中，該細菌為格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)、嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)、硝化細菌、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、枯草桿菌( Bacillus subtilis)、鏈球菌屬( Streptococcus)或美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)。

在本發明的一實施例中，該幾丁聚醣是呈一球體的形式。

在本發明的一實施例中，該細菌的生物膜會包覆該幾丁聚醣而形成一球體混合物。

本發明之另一目的為提供一種如前所述的疫苗組成物用於製備一預防細菌感染的醫藥品或食品添加產品的用途。

在本發明的一實施例中，該細菌感染為格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)感染、嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)感染、硝化細菌感染、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)感染、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)感染、枯草桿菌( Bacillus subtilis)感染、鏈球菌屬( Streptococcus)感染或美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)感染。

綜上所述，本發明疫苗組成物的功效在於：透過懸浮培養技術製備包含細菌的生物膜以及幾丁聚醣的疫苗組成物，該疫苗組成物可有效預防細菌感染，特別是與水產養殖有關的細菌感染，例如格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)感染、嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)感染及美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)感染。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

依據本發明，用語「生物膜(biofilm)」又稱作「生物薄膜」或「菌膜」，是一些細菌細胞由自身產生的胞外多聚物基質(主要爲多醣)所包圍而形成。

依據本發明，用語「幾丁聚醣(chitosan)」又稱作「幾丁質」、「甲殼素」、「幾丁寡醣」、「甲殼質」或「殼多醣」，分子結構「(C ₈H ₁₃O ₅N) _n」，是一種含氮的多醣類物質，為蝦、蟹、昆蟲等甲殼的重要成分，化學名為8-(1,4)-2-乙醯胺基-2-去氧-D-葡聚糖，也稱為聚(N-乙醯基-D-葡糖胺)。

依據本發明，可產生生物膜的細菌皆可用於製備本發明疫苗組成物，包括但不限於：硝化細菌、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、枯草桿菌( Bacillus subtilis)、鏈球菌屬( Streptococcus)、格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)、嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)及美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)。

依據本發明，用語「格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)」又稱格氏乳球菌，是一種兼性厭氧、不具運動性亦不會形成孢子的革蘭氏陽性球菌，它可產生生物膜。

依據本發明，用語「嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)」為革蘭氏陰性桿菌，因具有極性的單鞭毛，使其具有移動性，它可產生生物膜。此種細菌的直徑大小為0.3~1.0

m，長度為1.0~3.5

m，不具芽孢及莢膜。理想生長溫度為28

，但於37

下亦可生長。於培養基上的生長菌落顏色介於白色至淡粉紅色，圓型凸面且邊緣明顯。

依據本發明，用語「福馬林(Formalin)」是甲醛含量為35%至40% (重量百分比為37%；體積百分比為40%)的水溶液，也加入10%~15%的甲醇防止甲醛聚合，福馬林具有防腐、消毒及漂白的功能。

依據本發明，適合生物膜附著物質包括，但不限於：幾丁聚醣、洋菜膠、明膠、可分解塑膠、澱粉顆粒及在水中不會被自然分解且適合用於生物體中之物質。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明的疫苗組成物可進一步包含有一佐劑(adjuvant)。佐劑是一種用以提高接受者(例如，魚類)對於一疫苗的免疫反應之物質。適用於本發明的佐劑包括，但不限於：CpG寡去氧核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotide, CpG ODN)、細胞激素(諸如介白素-6 (interleukin-6, IL-6)、介白素-12 (IL-12)、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF))、趨化激素(chemokines)、植物皂素(saponin)、

-聚葡萄糖(

-glucan)、礦泥(mineral gel)(諸如氫氧化鋁(aluminum hydroxide, Al(OH) ₃))、表面活性物質(諸如溶血卵磷脂(lysolecithin))、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、多價陰離子(polyanions)、肽(peptides)、油或烴乳劑(oil or hydrocarbon emulsions)、鑰孔□血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)、二硝基酚(dinitrophenol)、弗侖氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)以及弗倫氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)等等。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飼料(feed)、飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。 實施例 1. 疫苗組成物的製備

依據本發明，可產生生物膜的細菌皆可用於製備本發明疫苗組成物。在本發明一較佳實施例，首先取1 g的幾丁聚醣(chitosan)(友和貿易股份有限公司購買，CAS No: 9012764，脫乙殼多醣)置於200 mL的水中，接而加入冰醋酸調整pH值至酸性(pH 5以下)。接著，加熱攪拌使幾丁聚醣完全溶解於水中形成液體，然後將溶解好的液體慢慢滴入鹼性溶液(即含有3n NaOH的水，慢慢滴定到pH 7)中(pH 10)，使幾丁聚醣形成不含鹼的幾丁聚醣球體。之後，利用300目篩網收集幾丁聚醣球體、持續清水清洗並秤重(滅菌後續使用)，然後取10 g的幾丁聚醣球體與可產生生物膜的細菌，在一實施例中為格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)(來源為實驗室分離臨床發病魚隻身上發現，且經由16S定序確認，實驗室編號930330；菌株濃度由10 ³cfu/ml培養至10 ¹⁰cfu/ml放置28

並持續用攪拌子轉動，轉速150 rpm)與100 mL的腦心浸液(brain heart infusion, BHI)培養液(啟新生物科技有限公司購買，編號： NCM0016A)混合，然後在28

下經由懸浮培養(即加入轉子轉速(100 rpm)並持續48小時)使可產生生物膜的細菌形成生物膜，其中生物膜會包覆幾丁聚醣球體而形成一球體混合物。接著，對生物膜與幾丁聚醣球體所形成的球體混合物進行一離心處理(3,000 rpm)，收集幾丁聚醣-生物膜球體，然後將收集好的幾丁聚醣-生物膜球體放置於3% (v/v)福馬林緩衝溶液(磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline, PBS))中固定球體結構24小時。之後，離心置換福馬林為PBS，藉此得到疫苗組成物，然後將疫苗組成物混合成飼料備用。

本發明疫苗組成物的製備亦使用其他可產生生物膜的細菌，該細菌包括但不限於嗜水產氣單胞菌( Aeromonas hydrophila)、硝化細菌、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、枯草桿菌( Bacillus subtilis)、鏈球菌屬( Streptococcus)、格氏乳酸球菌( Lactococcus garvieae)及美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)。 實施例 2. 以懸浮培養方式製得的疫苗組成物在生物膜產量上的效用評估

本實施例以兩種不同定量方式證明本發明以懸浮培養方式製得的疫苗組成物比一般細菌形成之生物膜產量多，實驗以二甲基亞甲藍(dimethylmethylene blue, DMMB)染色法進行。

DMMB染色法操作步驟如下：取1 mL的樣品到微量離心管(eppendorf)以3,000 rpm離心1分鐘，接而移除上清液。接著，加入1 mL的PBS清洗2次並以3,000 rpm離心1分鐘，接而移除上清液。之後，加入DMMB染劑(從友和貿易股份有限公司購買，CAS No: 931418-92-7)並避光染色30分鐘，接而移除上清液。接著，加入1 mL的ddH ₂O清洗2次，然後加入1 mL的DMMB析出液(參考 Peeters E et al., (2008), J Microbiol Methods, 72(2):157-65. Epub 2007 Nov 21文獻進行配製)，並測定OD 650nm吸光值。

將樣品分成兩組，包括生物膜組及疫苗組成物組，其中生物膜組是將10 ¹⁰CFU/ml可產生生物膜的細菌接種於10 mL培養盤中並靜置48小時以形成生物膜，然後利用DMMB染色，在本發明一實施例為格氏乳酸球菌；疫苗組成物組是將可產生生物膜的細菌接種於10 mL培養液以懸浮培養48小時(有添加幾丁聚醣而形成幾丁聚醣-生物膜球體)，然後利用DMMB染色，在本發明一實施例為格氏乳酸球菌。實驗結果顯示於圖1。

圖1是本發明疫苗組成物在生物膜產量上的效用之數據圖。由圖1可見，與生物膜組相較之下，疫苗組成物組利用OD值偵測到的格氏乳酸球菌生物膜生長量有顯著提升。本實施例的結果顯示，本發明懸浮培養方式及添加幾丁聚醣的方式有助於生物膜的形成。 實施例 3. 以懸浮培養方式製得的疫苗組成物對於細菌及生物膜生長的影響

本實施例探討本發明疫苗組成物(添加有幾丁聚醣並利用懸浮培養可產生生物膜的細菌形成生物膜，製備流程參見實施例1)在促進細菌及生物膜生長上的效用，在一實施例中為格氏乳酸球菌。結果顯示於圖2A及圖2B，其中圖2A的實驗是添加10 mg/mL幾丁聚醣懸浮培養可產生生物膜的細菌於BHI培養液中，之後在不同時間點收取1 mL的疫苗組成物利用DMMB染色(參照實施例2的實驗步驟)；圖2B的實驗是添加10 mg/mL幾丁聚醣懸浮培養可產生生物膜的細菌於BHI培養液中，之後在不同時間點收取1 mL的疫苗組成物，離心3,000轉，上層液為懸浮(planktonic)細菌(即圖2B的上清液)，下層為添加有10 mg/mL幾丁聚醣的疫苗組成物並磨碎，取100

L的體積塗在血液培養機(購買於Dr. plate，型號： BDPT092)上並計算細菌數目。

圖2A及圖2B是本發明疫苗組成物在促進細菌及生物膜生長上的效用之數據圖，其中圖2A為添加10 mg/mL幾丁聚醣懸浮培養可產生生物膜的細菌觀察幾丁聚醣球體上生物膜(即本發明疫苗組成物)在不同時間點的生成曲線；圖2B為不同時間點收取的幾丁聚醣球體上的菌量及懸浮液(不含幾丁聚醣球體及生物膜的上清液)中的菌量。由圖2A及圖2B可見，在培養的第7個小時細菌開始黏附在幾丁聚醣上並且開始形成生物膜並在48小時達到最高峰。本實施例的結果顯示，以懸浮培養方式製得的疫苗組成物可有效促進細菌及生物膜生長。 實施例 4. 利用掃描式電子顯微鏡 (scanning electron microscope, SEM) 確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌的生物膜形成

本實施例利用掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣上可產生生物膜的細菌的生物膜形成，在本發明一實施例為格氏乳酸球菌，實驗方法為添加10 mg/mL幾丁聚醣懸浮培養格氏乳酸球菌於BHI培養液中，然後收取24與48小時的疫苗組成物並委託國立台灣大學生命科學院的科技共同空間(Techcomm)進行掃描式電子顯微鏡掃描。結果顯示於圖3。

圖3是利用掃描式電子顯微鏡確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌的生物膜形成之影像圖，其中A為幾丁聚醣球體；B為幾丁聚醣球體在SEM 10000X的影像，其中A為還沒有菌附著的影響，B為有菌附著的影像；C為懸浮培養24小時幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌生物膜的SEM 10000X影像；D為懸浮培養24小時幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌SEM 10000X的影像；E為懸浮培養48小時幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌生物膜的SEM影像；F為懸浮培養48小時幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌SEM 10000X的影像。本實施例的結果顯示，本發明利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中，格氏乳酸球菌可以利用幾丁聚醣懸浮培養的方式在幾丁聚醣球體上生成生物膜。 實施例 5. 利用懸浮培養方式並添加不同劑量幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌得到的疫苗組成物的生物膜形成的最佳條件

本實施例探討利用懸浮培養方式並添加不同劑量幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌得到的疫苗組成物的生物膜形成的最佳條件。實驗方法(關於細菌培養方式是相同於實施例1所述者)為分別添加不同劑量(1 mg/mL、10 mg/mL、30 mg/mL及100 mg/mL，對照組無添加)的幾丁聚醣球體到BHI培養液中，並在24小時後收取1mL的疫苗組成物進行DMMB染色來定量(參照實施例2有關DMMB染色的實驗步驟)。結果顯示於圖4。

圖4為利用懸浮培養方式並添加不同劑量(1 mg/mL、10 mg/mL、30 mg/mL及100 mg/mL)的幾丁聚醣球體培養格氏乳酸球菌並確認幾丁聚醣上的生物膜表現量之數據圖。本實施例的結果顯示，本發明疫苗組成物中幾丁聚醣球體在1 mg/ml、10 mg/ml、30 mg/ml及100 mg/ml劑量下皆會表現生物膜，其中最佳添加劑量為10 mg/mL。 實施例 6. 利用懸浮培養方式並添加不同濃度福馬林浸泡後 24 小時得到的疫苗組成物的菌量分析

本實施例對利用懸浮培養方式並添加不同濃度福馬林浸泡後24小時得到的疫苗組成物進行菌量分析。實驗方法為：添加10 mg/mL幾丁聚醣懸浮培養格氏乳酸球菌(最終濃度10 ¹⁰cfu/ml)於BHI培養液中，培養48小時後以3,000 rpm離心1分鐘。之後去上層液而得到疫苗組成物，然後添加不同比例的福馬林緩衝溶液(1% (v/v)、3% (v/v)、5% (v/v)、7% (v/v)及10% (v/v)，不活化疫苗(懸浮培養不活化疫苗是一般傳統型疫苗不含生物膜成分)及生物膜疫苗則無添加，其中生物膜疫苗的製備方式是同實施例1所述者)並靜置24小時後塗抹於血液培養基確認細菌數量。結果顯示於圖5A及圖5B。

圖5A及圖5B是利用懸浮培養方式並添加不同濃度福馬林浸泡後24小時後得到的疫苗組成物的菌量分析之數據圖，其中圖5A為懸浮的格氏乳酸球菌經由不同濃度的福馬林浸泡後塗在血液培養上的菌落數，圖5B為本發明疫苗組成物經由不同濃度的福馬林浸泡後塗在血液培養上的菌落數。本實施例的結果顯示，本發明疫苗組成物在添加福馬林劑量1%下即可達到最好的效果。 實施例 7. 利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌得到的疫苗組成物的功效試驗 7.1 吞噬能力試驗

本實驗的操作流程如下：對來自台灣南部養殖場的烏魚投餵本發明疫苗組成物14天後，抽取血液與格氏乳酸球菌混合，利用吉姆沙染色劑(Giemsa stain)(貝索企業有限公司，型號R18931)染色並計算每100顆細胞中具有吞噬能力的細胞百分比，每組3重複。結果顯示於圖6，其中PBS組表示投予PBS之烏魚，幾丁聚醣組表示投予幾丁聚醣之烏魚，懸浮疫苗(planktonic vaccine)組表示投予未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗之烏魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之烏魚。

圖6是本發明疫苗組成物的魚隻的吞噬細胞吞噬能力試驗之數據圖。由圖6可見，投予本發明疫苗組成物之組別的細胞具有較多具有吞噬能力的細胞。 7.2 抗體能力試驗

本實驗的操作流程如下：對烏魚投餵本發明疫苗組成物14天後，抽取血液並分離血清利用酵素結合免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)偵測血清中IgM抗體。結果顯示於圖7，其中PBS組表示投予PBS之烏魚，幾丁聚醣組表示投予幾丁聚醣之烏魚，懸浮疫苗組表示投予未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗之烏魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之烏魚。

圖7是本發明疫苗組成物的魚隻抗體形成能力試驗之數據圖。由圖7可見，投予本發明疫苗組成物之組別具有較佳的專一性針對生物膜的抗體生成。 7.3 免疫能力表現

本實驗的操作流程如下：對烏魚投餵本發明疫苗組成物14天後，收取脾臟抽取RNA，利用即時聚合酶鏈反應(Real-time PCR)偵測免疫基因(包括腫瘤壞死因子-

(tumor necrosis factor-

, TNF-

)基因、介白素-1

(interleukin-1

, IL-1

)基因、補體C3基因及類鐸受體-2 (toll-like receptor-2, TLR-2)基因，對於各基因的引子資訊顯示於下表1)表現。結果顯示於圖8，其中PBS組表示投予PBS之烏魚，幾丁聚醣組表示投予幾丁聚醣之烏魚，懸浮疫苗(planktonic vaccine)組表示投予未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗之烏魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之烏魚。 表1

標的基因	SEQ ID NO.#	引子名稱	序列(5'--＞3')
TNF-	1	TNF- -F	GCGCAGTCTGTCATTGGTT
2	TNF- -R	ACTGGACACGCTCACTGTAGTG
IL-1	3	IL-1 -F	GAGGAGCTTGGTGCAGAACA
4	IL-1 -R	CTTTGTTCGTCACCTCCTCCA
補體C3	5	C3-F	GCATCACGCTCCTTGTCTTT
6	C3-R	ACCACTATGCCACAAGAACATC
TLR-2	7	TLR-2-F	CTTTCTCCTCGTCCCTCTG
8	TLR-2-R	CGTGTTTGTTGTGGTCT

圖8是本發明疫苗組成物的免疫能力表現之數據圖。由圖8可見，投予本發明疫苗組成物之組別在TNF-

基因、IL-1

基因及TLR-2基因之抗細菌相關免疫基因表現都有上升。 7.4 攻毒試驗

本實驗的操作流程如下：對烏魚投餵本發明疫苗組成物14天後，利用格氏乳酸球菌攻毒並觀察魚隻死亡。結果顯示於圖9，其中PBS組表示投予PBS之烏魚，幾丁聚醣組表示投予幾丁聚醣之烏魚，懸浮疫苗組表示投予未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗之烏魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之烏魚，負對照組表示沒攻毒的正常烏魚魚隻，確認養殖過程沒問題。

圖9是本發明疫苗組成物的攻毒試驗之數據圖。由圖9可見，投予本發明疫苗組成物之組別具有高達74%存活率。 實施例 8. 利用掃描式電子顯微鏡確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣球體上美人魚發光桿菌美人魚亞種 ( Photobacterium damselaesubsp. damselae) 的生物膜形成

本實施例利用掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣上美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)的生物膜形成，實驗方法為添加10 mg/mL幾丁聚醣懸浮培養美人魚發光桿菌美人魚亞種於BHI培養液中，然後收取24小時的疫苗組成物，並委託國立台灣大學生命科學院的科技共同空間(Techcomm)進行掃描式電子顯微鏡掃描。結果顯示於圖10。

圖10是利用掃描式電子顯微鏡確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣球體上美人魚發光桿菌美人魚亞種的生物膜形成之影像圖，其中原始放大倍率為1000X，箭頭拉出來的放大倍率為10000X。本實施例的結果顯示，本發明利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中，美人魚發光桿菌美人魚亞種可以利用幾丁聚醣懸浮培養的方式在幾丁聚醣球體上生成生物膜。 實施例 9. 利用懸浮培養方式並添加不同劑量幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種 ( Photobacterium damselaesubsp. damselae) 得到的疫苗組成物的生物膜形成的最佳條件

本實施例探討利用懸浮培養方式並添加不同劑量幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)得到的疫苗組成物的生物膜形成的最佳條件。實驗方法(關於細菌培養方式是相同於實施例1所述者)為分別添加不同劑量(1 mg/mL、10 mg/mL及100 mg/mL，對照組無添加)的幾丁聚醣球體到BHI培養液中，並在24小時後收取1mL的疫苗組成物進行DMMB染色來定量(參照實施例2有關DMMB染色的實驗步驟)。結果顯示於圖11。

圖11為利用懸浮培養方式並添加不同劑量(1 mg/mL、10 mg/mL及100 mg/mL)的幾丁聚醣球體培養美人魚發光桿菌美人魚亞種並確認幾丁聚醣上的生物膜表現量之數據圖。本實施例的結果顯示，本發明疫苗組成物中幾丁聚醣球體在1 mg/ml、10 mg/ml及100 mg/ml劑量下皆會表現生物膜，其中最佳添加劑量為10 mg/mL。 實施例 10. 利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種得到的疫苗組成物的功效試驗 10.1 吞噬能力試驗

本實驗的操作流程如下：對石斑魚投餵本發明疫苗組成物14天後，收取脾臟培養巨噬細胞，之後與市售含有螢光的陰性菌(Invitrogen™，型號V6694)混合並利用96-孔螢光分光光度計偵測並計算吞噬能力。結果顯示於圖12，其中懸浮疫苗組表示投予未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，幾丁聚醣疫苗組表示投予添加幾丁聚醣但未培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)組表示投予非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之?，PBS組表示投予PBS之石斑魚。

圖12是本發明疫苗組成物的魚隻的吞噬細胞吞噬能力試驗之數據圖。由圖12可見，投予本發明疫苗組成物之組別的巨噬細胞具有較強的吞噬能力。 10.2 抗體能力試驗

本實驗的操作流程如下：對石斑魚投餵本發明疫苗組成物14天後，抽取血液並分離血清利用酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)偵測血清中IgM抗體。結果顯示於圖13，其中懸浮疫苗組表示投予未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，幾丁聚醣疫苗組表示投予添加幾丁聚醣但未培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)組表示投予非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之石斑魚，PBS組表示投予PBS之石斑魚。

圖13是本發明疫苗組成物的抗體能力試驗之數據圖。由圖13可見，投予本發明疫苗組成物之組別具有最佳的專一性針對生物膜的抗體生成。 10.3 免疫能力表現

本實驗的操作流程如下：對石斑魚投餵本發明疫苗組成物14天後，收取脾臟抽取RNA，利用即時聚合酶鏈反應(Real-time PCR)偵測免疫基因(包括介白素-8 (interleukin-8, IL-8)基因、主要組織相容性複合體-II (major histocompatibility complex-II, MHC-II)基因及類鐸受體-3 (toll-like receptor-3, TLR-3)基因)表現。結果顯示於圖14，其中懸浮疫苗組表示投予未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，幾丁聚醣疫苗組表示投予添加幾丁聚醣但未培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)組表示投予非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之石斑魚，PBS組表示投予PBS之石斑魚。

圖14是本發明疫苗組成物的免疫能力表現之數據圖。由圖14見，投予本發明疫苗組成物之組別在IL-8基因及TLR-3基因之抗細菌相關免疫基因表現都有上升。 10.4 攻毒試驗

本實驗的操作流程如下：對石斑魚投餵本發明疫苗組成物14天後，利用美人魚發光桿菌美人魚亞種攻毒並觀察魚隻死亡。結果顯示於圖15，其中懸浮疫苗組表示投予未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，幾丁聚醣組表示投予幾丁聚醣之石斑魚，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)組表示投予非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗之石斑魚，疫苗組成物組表示投予實施例1所製得的疫苗組成物之石斑魚，PBS組表示投予PBS之石斑魚。

圖15是本發明疫苗組成物的攻毒試驗之數據圖。由圖15可見，投予本發明疫苗組成物之組別具有高達68%存活率，投予其他類型疫苗及PBS之組別皆低於15%存活率。

綜上所述，本發明疫苗組成物可透過懸浮培養技術製備包含細菌的生物膜以及幾丁聚醣的疫苗組成物，該疫苗組成物可有效預防細菌感染，特別是與水產養殖有關的各種細菌感染。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

無

圖1是本發明疫苗組成物在生物膜產量上的效用之數據圖，其中*表示 p＜0.05。 圖2A是本發明疫苗組成物在促進細菌及生物膜生長上的效用之數據圖。 圖2B是本發明疫苗組成物在促進細菌及生物膜生長上的效用之另一數據圖。 圖3是利用掃描式電子顯微鏡確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣球體上格氏乳酸球菌的生物膜形成之影像圖，其中箭頭代表生物膜樣式。 圖4為利用懸浮培養方式並添加不同劑量(1 mg/mL、10 mg/mL、30 mg/mL及100 mg/mL)的幾丁聚醣球體培養格氏乳酸球菌並確認幾丁聚醣上的生物膜表現量之數據圖，其中**表示 p＜0.001。 圖5A是利用懸浮培養方式並添加不同濃度福馬林浸泡後24小時後得到的疫苗組成物的菌量分析之數據圖。 圖5B是利用懸浮培養方式並添加不同濃度福馬林浸泡後24小時後得到的疫苗組成物的菌量分析之另一數據圖。 圖6是本發明疫苗組成物的魚隻的吞噬細胞吞噬能力試驗之數據圖，其中懸浮疫苗(planktonic vaccine)表示未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗；*表示 p＜0.05，**表示 p＜0.001。 圖7是本發明疫苗組成物的魚隻抗體形成能力試驗之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗；*表示 p＜0.05。 圖8是本發明疫苗組成物的免疫能力表現之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗；*表示 p＜0.05，**表示 p＜0.001，***表示 p＜0.0001。 圖9是本發明疫苗組成物的攻毒試驗之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養格氏乳酸球菌的疫苗，負對照組表示沒攻毒的正常魚隻，確認養殖過程沒問題。 圖10是利用掃描式電子顯微鏡確認利用懸浮培養方式得到的疫苗組成物中幾丁聚醣球體上美人魚發光桿菌美人魚亞種的生物膜形成之影像圖。 圖11為利用懸浮培養方式並添加不同劑量(1 mg/mL、10 mg/mL及100 mg/mL)的幾丁聚醣球體培養美人魚發光桿菌美人魚亞種( Photobacterium damselaesubsp. damselae)並確認幾丁聚醣上的生物膜表現量之數據圖，其中*表示 p＜0.05，***表示 p＜0.0001。 圖12是本發明疫苗組成物的魚隻的吞噬細胞吞噬能力試驗之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，幾丁聚醣疫苗表示添加幾丁聚醣但未培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)表示非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，**表示 p＜0.001，***表示 p＜0.0001。 圖13是本發明疫苗組成物的抗體能力試驗之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，幾丁聚醣疫苗表示添加幾丁聚醣但未培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)表示非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，***表示 p＜0.0001。 圖14是本發明疫苗組成物的免疫能力表現之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，幾丁聚醣疫苗表示添加幾丁聚醣但未培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)表示非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，**表示 p＜0.001，***表示 p＜0.0001。 圖15是本發明疫苗組成物的攻毒試驗之數據圖，其中懸浮疫苗表示未添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗，靜態生物膜疫苗(staticbiofilm vaccine)表示非利用懸浮培養方式並添加幾丁聚醣培養美人魚發光桿菌美人魚亞種的疫苗。

<![CDATA[<110>  國立臺灣大學]]>
          <![CDATA[<120>  對抗細菌及生物膜的疫苗組成物及其製備方法與用途]]>
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          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
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Claims (10)

1. 一種用於製備一對抗細菌及生物膜的疫苗組成物之方法，包含以下步驟：(a)將一幾丁聚醣(chitosan)置於水中，並調整pH值至酸性；(b)加熱攪拌使該幾丁聚醣溶於水中形成一液體，接而將該液體滴入一鹼性溶液中，使該幾丁聚醣形成一幾丁聚醣球體；(c)將一細菌與該幾丁聚醣球體接觸混合，接而經由一懸浮培養歷時一段時間，該細菌會形成一生物膜，包覆該幾丁聚醣球體而形成一球體混合物；以及(d)對該生物膜與該幾丁聚醣球體所形成的該球體混合物進行一離心處理，收集一幾丁聚醣-生物膜球體，藉此得到該疫苗組成物；其中該細菌是選自於下列所組成的群組：嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、硝化細菌、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鏈球菌屬(Streptococcus)、格氏乳酸球菌(Lactococcus garvieae)及美人魚發光桿菌美人魚亞種(Photobacterium damselae subsp.damselae)。
2. 如請求項1的方法，其中在步驟(d)中，該方法進一步包含將收集好的該幾丁聚醣-生物膜球體置於一福馬林中進行不活化，之後藉由透析方式移除該福馬林，藉此得到該疫苗組成物。
3. 如請求項1的方法，其中該幾丁聚醣具有一至少1mg/mL的濃度。
4. 如請求項3的方法，其中該幾丁聚醣具有一為10mg/mL的濃度。
5. 一種對抗細菌及生物膜的疫苗組成物，包含一細菌的生物膜(biofilm)以及一幾丁聚醣(chitosan)，其中該細菌是選自於下列所組成的群組：嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、硝化細菌、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鏈球菌屬(Streptococcus)、格氏乳酸球菌(Lactococcus garvieae)及美人魚發光桿菌美人魚亞種(Photobacterium damselae subsp.damselae)。
6. 如請求項5的疫苗組成物，其中該幾丁聚醣是呈一球體的形式。
7. 如請求項6的疫苗組成物，其中該細菌的生物膜會包覆該幾丁聚醣而形成一球體混合物。
8. 如請求項5的疫苗組成物，其中該幾丁聚醣具有一至少1mg/mL的濃度。
9. 如請求項8的疫苗組成物，其中該幾丁聚醣具有一為10mg/mL的濃度。
10. 一種如請求項5至9中任一項的疫苗組成物用於製備一預防細菌感染的醫藥品或食品添加產品的用途。

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