KR20180113446A

KR20180113446A - 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR20180113446A
Application number: KR1020170151699A
Authority: KR
Inventors: 이태훈; 최원식; 이상한; 손세진; 김태규; 박여름; 이은수
Original assignee: 전진바이오팜 주식회사
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2018-10-16
Also published as: KR102019149B1

Abstract

본 발명은 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출을 유효성분으로 포함하는 병원성 그람음성 균주의 생장 저해용 항균성 세정 조성물 및 동물 병원성 그람음성 균주에 의해 발생되는 병의 확산 방제제 첨가용 조성물에 관한 것이다.

Description

오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물{Antimicrobial detergent composition comprising an obovatol compound or extract from magnolia family as an active agent}

본 발명은 병원성 그람음성 세균의 병원성 유발 단백질 분비체계를 저해하는 오보바톨 화합물 또는 오보바톨 화합물을 포함하는 마그놀리아과 식물추출물을 유효성분으로 하는 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증 예방 또는 확산방지용 세균 비사멸성 항균 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

동·식물의 세균류에 의한 감염증은 사람과 동물 및 식물에게 심각한 피해를 일으키는 것으로 알려져 있다. 지난 수십 년 동안 발견한 항생물질 덕분에 그 동안 각종 세균 감염증에 의한 사망률이 감소 추세를 나타내었으나, 최근 들어 이러한 항생 물질의 반복 사용으로 인한 저항성 균주의 출현이 심각한 사회적 문제로 대두되고 있어 새로운 항생제에 대한 필요성이 점차 증대되고 있는 실정이다. 그러나 이러한 사회적인 욕구가 증대되고 있는데도 불구하고 새로운 항생물질의 개발 속도는 지연되고 있어, 기존에 널리 사용되어온 세균의 생육을 저해하거나 사멸시키는 방법과 달리 새로운 목표물로서 병원성을 일으키는 인자만을 공략하는 접근방식을 통해 새로운 항생물질을 개발하려는 노력이 시도되고 있다. 이러한 병원성을 일으키는 대표적인 인자들 중의 하나인 분비체계는 동·식물에 병원성을 일으키는 그람음성 세균들에 광범위하게 분포되어 있는 강력한 병원성 유발 기작으로 병원성 유발 단백질(effector protein)을 기주 세포의 사이토졸(cytosol)로 주입시켜 병을 유발하는 것으로 알려지고 있다. 세균의 분비체계는 제1 유형으로부터 제7 유형 분비체계에 이르기까지 다양한 형태가 존재하며, 인체 및 동물에 감염을 일으키는 각종 그람음성 세균류 중에는 예르시니아(Y. pestis, Y. pseudotuberculosis 및 Y. enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella species), 장 질환 대장균(enteropathogenic Escherichia coli) 및 클라미디아 종(Chlamydia species) 등의 세균들은 대부분 제3 유형 분비체계(Type III secretion system, TTSS)를 이용하여 기주 세포에 바늘/선모(needle/pilus)와 같은 구조를 형성하여 병원성을 유발하는 단백질(effector protein)을 기주로 전달하여 기 설명한 바와 같이 감염을 일으키는 것으로 알려지고 있다. 또한, 식물체 감염을 일으키는 그람음성 세균들로는 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 어위니아 종(Erwinia species), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 등도 제3 유형 분비 체계를 이용하여 기주 식물체에 병원성을 일으키는 것으로 보고되었다. 이러한 제3 유형 분비 체계에는 20여종 이상의 서로 상이한 단백질들이 관여하고 있는 전위 채널(translocation channel)이 있으며, 이들 단백질들은 병원성을 일으키는 그람음성 세균들 사이에서 상당한 염기 동등성이 있다고 보고되었다. 이외에 이러한 병원성 유발 단백질(effector protein)들은 기주 세포의 방어기작과 연관된 신호들을 억제할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 세균의 병원성을 나타내기 위해서는 필수적인 요소라고 알려졌다.

종전까지 각종 병원성 세균에 효과적인 항생물질의 개발은 세균의 생육에 필수적이면서 각 세균에 공통적으로 널리 보존된 대사경로를 저해하거나, 세포와 세포간의 신호전달 체계에 관여하는 목표물을 저해하여 병원성 세균을 사멸시키거나 저해하는 화합물의 개발에 주안점을 두어 왔다. 그러나 이러한 접근방식을 통해 개발된 항생물질들은 초기에는 우수한 약효를 나타내었으나 반복 사용 및 오남용으로 인해 내성 균주가 용이하게 출현하여 많은 문제점으로 대두되고 있어, 새로운 항생물질의 개발 필요성이 꾸준히 증대되고 있는 실정이다.

한편, 세균의 생육이나 세균에 있는 공통적인 목표물을 대상으로 하여 병원성 세균뿐만 아니라 주변의 유익한 세균까지도 함께 사멸시키는 기존의 접근방식을 극복하기 위해, 병원성 세균의 병원성을 일으키는 인자만을 대상으로 하는 전략이 등장하기 시작하였다. 이러한 방식은 세균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않고, 병원성을 일으키는 인자만을 저해하기 때문에 선택적으로 병원성 세균을 저해할 수 있고, 내성 문제도 극복할 수 있을 것으로 예상되며, 기존의 항생물질에 저항성을 나타낸 병원성 세균에도 적용 가능하다는 장점이 있다고 알려졌다.

이러한 병원성 인자 중 제3 유형 분비체계를 저해하는 화합물에 대한 연구는 인체 병원성 그람음성 세균에서 많이 보고되고 있으나, 동·식물 병원성 그람음성 세균의 제3 유형 분비체계를 대상으로 한 저해제에 대한 연구는 아직까지 활성화되고 있지 못한 실정이다. 또한, 기존의 항생물질에 저항성을 나타내는 내성균의 출현 빈도가 새로운 항생물질의 개발 속도보다 빠르게 나타나고 있고 새로운 작용기작을 나타내는 화합물 발견에 많은 어려움을 겪고 있다.

이와 같이, 지난 수십 년 동안 새로운 항생물질의 개발로 인류의 건강에 지대한 공헌을 해왔으나, 항생물질의 반복 사용과 오남용으로 인한 내성균의 출현으로 새로운 작용기작과 기존의 내성균에 효과적인 새로운 항생물질의 필요성이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.

이러한 시대적 요구에 부응하기 위하여 본 발명자들은 천연자원이나 화합물 라이브러리(Chemical library)로부터 인체, 동물 및 식물 병원성 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계를 저해하는 저해제를 탐색하였고, 분비체계를 강하게 저해하는 화합물을 발견하고 선별하였다. 이 화합물은 마그놀리아 버지니아나(Magnolia virginiana), 목련(Magnolia kobus), 백목련(Magnolia denudata), 일본목련(Magnolia obovata), 자목련(Magnolia liliiflora), 태산목(Magnolia grandiflora), 함박꽃나무(Magnolia sieboldii) 등에서 발견되는 성분으로 알려진 오보바톨로서 항암, 항염증 등에 효과적인 화합물이나 그람음성세균의 병원성 인자를 저해한다는 보고는 아직까지 없었다.

따라서, 본 발명자들은 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물의 그람음성 세균의 분비체계에 대한 저해활성을 조사하고, 이를 유효성분으로 함유하는 병원성 미생물의 분비체계 저해제의 사용 가능성을 검증하고자 본 발명을 수행하였다.

최근 새로운 항생제 개발을 위해 타겟화되고 있는 병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해함으로써 병원성 미생물에 의한 피해를 최소화할 수 있는 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물의 in vitro 및 in vivo에서의 활성검정과 기작 연구를 통해 상기 화합물 및 식물추출물이 그람음성 세균의 분비체계 저해제로 활용 가능하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

KR

1020010001237

A

KR

1020120049073

A

본 발명의 목적은, 동식물 병원성 그람음성 세균의 병원성 유발 단백질 분비체계를 저해하면서 병원성 세균 및 유익한 세균의 생육에는 영향이 없는 항균 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시된 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 과 식물추출을 유효성분으로 포함하는 동물 병원성 그람음성 세균에 대한 감염증 예방 및 감염에 의한 동물 질병 확산방지를 위한 세정제, 생활용품, 의약, 동물사료, 식품 등에 첨가할 수 있는 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시된 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물추출물을 유효성분으로 포함하고, 그람음성 세균의 병원성 유발 단백질(effector protein) 분비체계를 저해하여 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증을 예방 또는 확산방지할 수 있는 세균 비사멸성 항균 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 병원성 그람음성 세균은 예르시니아 페스티스(Yersinia . pestis ), 예르시니아 슈도튜버큘러시스(Y. pseudotuberculosis), 예르시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella species), 장 질환 대장균(enteropathogenic Escherichia coli), 클라미디아 종(Chlamydia species), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 어위니아 종(Erwinia species), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 등이 있고, 상기 마그놀리아 과 식물은 마그놀리아 버지니아나(Magnolia virginiana), 목련(Magnolia kobus), 백목련(Magnolia denudata), 일본목련(Magnolia obovata), 자목련(Magnolia liliiflora), 태산목(Magnolia grandiflora) 및 함박꽃나무(Magnolia sieboldii)가 이에 포함되나 이에 한정되지는 않는다.

또 다른 예로, 본 발명의 상기 조성물을 고체화장비누, 손 세정제, 액체샴푸, 액체비누, 스프레이제제, 액체린스, 바디 세정제, 크림상 비누, 클렌징폼, 클렌징 젤 또는 입욕제로 제형화하여 사용할 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명의 상기 조성물은 식기 세정제, 세탁물 세정제, 식품 세정제, 생활용품 세정제, 애완동물 세정제에 첨가하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시된 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물추출물을 유효성분으로 포함하는, 동물 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증 예방 또는 확산방지용 식품 조성물을 제공한다. 상기 동물 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증은 개, 고양이, 가축 및 가금류의 폐렴, 폐혈증, 부루세라병, 클라미디아 감염증, 대장균감염증, 살모넬라증, 비브리오병, 어류의 솔방울병, 에드와드병, 절창병, 및 철갑상어의 적란병 등을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 오보바톨 화합물 및 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물은 병원성 그람음성 세균류의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않으면서 동물에 병원성을 유발하는 분비체계만을 선택적으로 저해함으로써, 항균제의 반복 사용 또는 오남용에 의한 내성균주의 발생 문제를 해결할 수 있고 기존 항생물질에 저항성을 지닌 병원성 세균에도 적용할 수 있어, 세균 감염증에 대한 항균물질로 광범위하게 사용할 수 있다.

도 1은 오보바톨의 분비체계 저해 효과를 Hemolysis assay를 통해 나타낸 것이다.
도 2는 오보바톨의 분비체계 저해 효과를 Motility assay를 통해 나타낸 것이다.
도 3은 오보바톨을 처리한 경우 분비체계를 거쳐 분비되는 병원성 단백질을 SDS-PAGE를 이용해 나타낸 것이다.
도 4는 오보바톨을 처리한 경우 분비체계 관련 병원성 유전자 발현을 transcription level에서 mRNA의 발현량을 분석할 수 있는 RT-PCR를 이용해 나타낸 것이다.
도 5는 오보바톨 처리에 의한 동물병 방제 효과를 마우스모델을 이용해 나타낸 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 기존에 항암, 항염증 등의 효과를 가지는 것으로 보고되고 있는 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물이 동물 병원성 세균의 생육에는 영향을 나타내지 않고, 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계에 저해활성이 우수하여, 그람음성 세균에 의한 동물에서의 병 발생 억제에 활용될 수 있다는 것을 최초로 밝혀낸 발명이다.

상기 화학식 1의 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물은 동물 및 인체 병원성 그람음성 세균에 의해 발생하는 동물 병원균, 구체적으로 Aeromonas 종(어류의 솔방울병 절창병 폐혈증), Acinetobacter 종(개, 고양이, 가금류 및 가축 폐렴), Alcaligenes 종(철갑상어의 적란병), Brucella 종(소, 돼지, 사슴, 개, 고양이에 부루세라병), Bordetella 종(개, 고양이 보데텔라 폐렴), Chlamydia 종(개, 고양이, 가금류 및 가축 클라미디아 감염증), Edwardsiella tarda(넙치, 조피볼락 갑각류 돔류의 에드와드병), Escherichia coli 종(가금류 및 가축, 개, 고양이 대장균감염증), Pseudomonas aeruginosa 종(가금류, 어류 및 가축, 개, 고양이 폐혈증), Salmonella 종(개, 고양이, 가금류 티푸스, 가축 및 가금류 살모넬라증), Vibrio 종(개, 고양이, 가금류, 가축 및 어류 비브리오증)에 대한 방제 및 질병예방 효과가 우수하다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물을 유효성분으로 함유하는 그람음성 병원균(동물에 영향을 주는 병원균)의 방제 및 질병 예방에 효과적이다.

본 발명에 따른 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물은 항생제 조성물 또는 그람음성 병원균에 대한 방제제에 대한 유효성분으로 사용되며, 그 함량은 전체 조성물 100 중량%에 대하여 0.0001~100 중량%가 바람직하며 0.0014~10 중량%가 더욱 바람직하다. 액상, 분말, 고체, 젤 형태로 다양하게 사용가능하다. 그러나, 상기 유효량은 적용 대상의 그람음성 세균의 종류나 병원균의 감염 정도 및 주변 환경 조건 등에 따라 조절될 수 있다.

본 발명에서는 오보바톨 또는 이를 포함하는 마그놀리아과 식물추출물을 유효성분으로 하는 특정 조성물을 그람음성 세균의 생육에는 전혀 영향을 미치지 않으면서도 그람음성 세균에 의해 동물에 나타나는 병원균의 방제 및 질병 예방에 효과적인 저해제로 활용할 수 있도록 실질적인 기틀을 마련함에 그 의의가 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하고자하는 하나의 예일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변경되거나 축소되는 것은 아니다.

[ 실험예 1] 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 저해제의 활성 검정 및 도출

본 발명에서 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 과 식물추출물에 의한 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 여부를 검정하기 위하여 Salmonella, E. Coli , Vibrio 균주를 배지(Brain Heart Infusion, Luria-Bertani, Luria-Bertani(NaCl) medium)에 접종하고 25℃에서 14시간 동안 배양하여 600 nm에서 흡광도 1.0으로 조절하고 10배 희석한 균액 (1~5x10⁷ CFU/ml) 1 ml에 시험하고자하는 저해제를 다양한 농도로 처리하고자 한다. 37℃에서 1시간 동안 Salmonella, E. Coli, Vibrio 균주를 배양하는 동안 양(sheep)의 whole blood에서 적혈구를 분리하기 위하여 양의 whole blood를 원심분리하여 상등액을 제거한 후 세척하고, 4℃에서 원심분리하고 BHI 배지로 현탁한다. 다시 37℃에서 배양한 Salmonella, E. Coli, Vibrio 를 다시 원심분리하고 상등액을 제거한 후 세척하고 BHI 배지로 재현탁한 후 새로운 micro tube에 균액과 양의 적혈구를 각각 100 ㎕씩 첨가한 후 원심분리하고 37℃에서 다시 배양한 후 완충용액을 첨가하여 현탁시키고, 원심분리를 행한 후 530 nm에서 흡광도를 측정하여 hemolytic activity(%)를 하기 수식으로부터 계산하여 나타내었다[도 1 참조]. 한편, Salmonella 를 이용하여 0.3% soft agar LB배지를 만들어 Moility assay를 수행하여 분비체계 저해 양상을 확인하였다[도 2 참조].

[수식]

Hemolytic activity = (S-NC/PC-NC)x100

S : Salmonella 및 시료 처리구

NC : Salmonella 무 처리구

PC : Salmonella 처리구

[ 실험예 2] 병원성 그람음성 세균에 대한 항균 활성 검증

병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 과 식물추출물이 분비체계 이외에 세균의 생육이 저해되어 분비체계가 저해되는 것으로 나타나는 지의 여부를 조사하기 위하여, 여러 종류의 인체 병원성 세균을 대상으로 2-fold broth dilution 방법으로 MIC를 측정하고자 한다. BHI(S. typhimurium)나 LB 배지(기타 균주)에 E. coli ACC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella typhimurium SL1344, Salmonella typhimurium ATCC14028, Salmonella typhimurium 및 Vibrio vulnificus 6종의 각종 병원성 세균들을 25-30℃에서 하룻밤 동안 진탕배양을 하고 600 nm에서의 흡광도를 1.0이 되도록 조절한다. 접종 균액을 조절한 후 시험하고자 하는 저해제의 최종 농도가 0.03125~512 ㎍/ml 되도록 신선한 LB 배지로 2배 계열로 희석시킨 96 well titer plate에 일정량씩 분주하고, 접종 균액의 최종 농도가 1x10⁵ CFU/ml 되도록 96 well titer plate에 일정량씩 첨가하여 37℃에서 18-24 시간 동안 배양하여 MIC 값을 측정하였다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 오보바톨은 6종의 피검균 모두에 대해 512 ㎍/ml의 농도에서 항균력을 나타내지 않는 반면, 대조구로 이용한 나리디직산(nalidixic acid)은 6종의 피검균에 대해 4 내지 128 ㎍/ml의 농도에서 항균력을 나타내어 오보바톨과 다른 양상을 보였다.

Strain	Obovatol (㎍/ml)	Nalidixic acid (㎍/ml)
E.coli ATCC25922	>512	4
Pseudomonas aeruginosa ATCC278553	>512	128
Salmonella typhimurim ATCC14028	>512	8
Salmonella typhimurim SL1344	>512	8
Salmonella typhimurim경상대 의대	>512	16
Vibrio	>512	4

[ 실험예 3] SDS-PAGE에 의한 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 시험

병원성 그람음성 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 오보바톨 또는 이를 포함하는 마그놀리아 과 식물추출물이 실제로 분비체계를 통한 병원성 인자의 분비를 저해하는지의 여부를 조사하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였다. Salmonella를 BHI 배지에 접종하여 25℃에서 14시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 1.0으로 조절하고 10배 희석한 균액 (1~5x10⁷ CFU/ml) 1 ml에 시험하고자 하는 저해제를 다양한 농도로 처리한다. 37℃에서 4시간 동안 다시 배양한 배양액을 7,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 상등액을 여과한 후 TCA 농도가 최종 10%가 되게 첨가하여 얼음에서 30분 동안 정치시킨 후, 4℃에서 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 제거한 다음 acetone을 넣고 4℃에서 10분 동안 12,000 x g에서 다시 원심분리를 실시한다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 acetone을 첨가하여 다시 원심분리를 행한 후 상등액을 제거하고 충분히 건조시킨 후 단백질을 정량하고 12% acrylamide gel을 이용하여 SDS-PAGE를 행하려고 한다. SDS-PAGE 후 coomassie brilliant blue R-250으로 1시간 동안 염색하고 탈색한 후 단백질 band를 확인하였다[도 3 참조].

그 결과 아무것도 처리하지 않은 대조구의 경우 세포질에서 분비체계를 통해 분비되는 단백질은 정상적으로 분비되어 진하게 검출되는 반면, 오보바톨을 처리한 경우에는 50 μM에서 대조구에 비해 밴드가 감소하기 시작하여 농도 의존적으로 단백질이 감소하는 것을 알 수 있다[도 3 참조].

[ 실험예 4] RT- PCR에 의한 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 시험

병원성 그람음성 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 오보바톨 또는 이를 포함하는 마그놀리아 과 식물추출물이 실제로 분비체계를 통한 병원성 인자의 분비를 저해하는지의 여부를 조사하기 위하여 RT-PCR를 실시하였다.

Salmonella를 BHI 배지에 접종하여 25℃에서 14시간 동안 배양하고 600 nm에서 흡광도 1.0으로 조절한 후 10배 희석한 균액(1~5x10⁷ CFU/ml) 1 ml에 시험하고자 하는 저해제를 다양한 농도로 처리한다. 37℃에서 4시간 동안 다시 배양하고 멸균된 micro tube에 균을 옮긴 후 4에서 7,000 x g로 30분 동안 원심분리를 행하려고 한다. 상등액을 제거한 후 Trizol (MRC, TRI reagent) 1 ml를 첨가하여 실온에서 5분 동안 배양하고, 다시 chloroform을 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 15분 동안 배양한다. 다시 4℃에서 20분 동안 13,000 x g에서 원심분리하고, 상등액 400 ㎕를 취하여 새로운 tube에 옮긴 후 isopropanol을 280 ㎕ 첨가하여 -70℃에서 30분 동안 방치하고, 4℃에서 15분 동안 13,000 x g로 원심분리를 행한다. 상등액을 제거하고 80% ethanol을 첨가하여 다시 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하고 얻은 total RNA를 DEPC-treated water 50 ㎕에 용해한 후 Nano Drop spectrophotometer로 정량한다.

한편, cDNA 합성은 SuperScript III Fist-Strand Synthesis system (Invitrogen Co.)을 사용하여, 앞서 추출한 1 ㎕ RNA, 각 1 ㎕의 primer, 1 ㎕의 10 mM dNTP mix 및 6 ㎕의 DEPC-treated water를 첨가한 후 65℃에서 5분 동안 배양하고 1분 이상 얼음에서 정치한다. 2 ㎕의 10x RT butter, 4 ㎕의 25 mM MgCl₂, 2 ㎕의 0.1 M DTT, 1 ㎕의 RNaseOUT 및 1 ㎕의 SuperScript III RT를 첨가하여 50℃에서 5분 85 ℃에서 5분 동안 배양하고 얼음에서 정치시킨 후 1 ㎕의 RNase H를 첨가하고 20분 동안 37℃에서 배양한 후 즉시 PCR을 하거나 -20℃에 cDNA를 보관하고자 한다. 각 effector gene의 발현 양상을 확인하기 위하여 500 ng의 cDNA와 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 각 10 pM primer, 250 μM dNTP 및 1 unit의 Taq polymerase (AccuPower PCR PreMix, BIONEER)를 포함하여 총 20 ㎕로 PT-PCR을 실시하려고 한다. Bio-Rad의 I-cycler에서 94℃에서 first denaturation 2분 후 denaturation을 94℃에서 15초, annealing을 58℃에서 30초, extension 72℃에서 30초로 40cycle을 수행하고, terminal elongation은 72℃에서 3분간 하여 전 증폭 과정을 완료하려고 한다. 증폭하여 얻은 최종 반응 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하고 유전자의 발현 여부를 BioDoc-lt. Imaging System (UVP, USA)으로 확인하였다.

그 결과 아무것도 처리하지 않은 대조구의 경우 Sip A, Sip B, Sop A, Sop B, Sop E2 밴드가 진하게 검출되는 반면, 오보바톨을 처리한 경우에는 50 μM에서 대조구에 비해 밴드가 감소하기 시작하여 농도 의존적으로 그람음성 세균의 분비체계와 관련된 유전자의 발현이 감소하는 것을 알 수 있다[도 4 참조].

[ 실험예 5] 마우스 모델을 이용한 TTSS 저해를 통한 동물병 방제 효능 확인

병원성 그람 음성 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 오보바톨 또는 이를 포함하는 마그놀리아 과 식물추출물이 실제로 동물질병을 억제하는 지 여부를 조사하기 위하여 동물실험을 실시하였다. Salmonella를 투여하기 이틀 전부터 24시간 간격으로 추출물을 마우스에 경구 투여하여 공급하였다. 그 후 Salmonella를 BHI 배지에 접종하여 25℃에서 14시간 동안 배양하고 600 nm에서 흡광도 1.0으로 조절한 후 희석하여 1~5x10^-6CFU/ml의 살모넬라균을 주입한 후 추출물을 계속 투여하면서 급여 기간 동안 마우스의 생존율을 관찰하였다.

그 결과 아무것도 처리하지 않은 대조구의 경우 감염 후 6일째부터 마우스의 폐사가 나타나기 시작해 11일째 모두 폐사하였고 Obovatol 처리구의 경우 9일째 일부 마우스의 폐사가 발생하였으나 최종 생존율은 약 50%로 나타났다[도 5 참조].

제형예 1: 고체형 비누

오보바톨 화합물 또는 마그놀리아 식물추출물 0.1 내지 5 중량부, 글리세린 0.2 중량부, 폴리에틸렌글리콜 4000 0.8 중량부, 비누베이스 96.25 내지 97.25 중량부, 토코페롤 아세테이트 0.3 중량부, 호호바유 0.3 중량부 및 세탄올 0.15 중량부 성분들을 혼합기에서 잘 혼합한 후 비누 제조 기계에서 압출하고 일정한 크기로 절단하여 고체형태의 비누를 제조하였다.

제형예 2: 손 세정제

오보바톨 화합물 또는 마그놀리아 식물추출물 0.1 내지 5 중량부, 토코페롤 아세테이트 0.3 중량부, 글리세린 0.2 중량부, 알킬벤젠 설폰산 0.4 중량부, 비누베이스 10 중량부, 올레인산 0.1 중량부, 세탄올 5 중량부 및 증류수 65 내지 68 중량부 성분들을 혼합기에서 혼합하여 액체 형태의 비누를 제조하였다.

제형예 3: 샴푸

오보바톨 화합물 또는 마그놀리아 식물추출물 0.1 내지 5 중량부, 비누베이스 5 중량부, 호호바유 0.3 중량부, 세탄올 0.15 중량부, 글루타치온 1.0 중량부, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 0.05 중량부, 토코페롤 아세테이트 0.3 중량부, 글리세린 0.2 중량부, 알킬벤젠 설폰산 0.4 중량부 및 증류수 63.6 내지 64.6 중량부를 혼합기에서 잘 혼합하여 액체형태인 샴푸를 제조하였다.

제형예 4: 바디 세정제

오보바톨 화합물 또는 마그놀리아 식물추출물 0.1 내지 5 중량부, 올레인산 0.1 중량부, 세탄올 0.15 중량부, 글루타치온 1.0 중량부, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 0.05 중량부, 토코페롤 아세테이트 0.3 중량부, 글리세린 0.2 중량부 및 증류수 78.2 내지 88.2 중량부를 혼합기에서 혼합하여 액체 형태인 바디 세정제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시된 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물추출물을 유효성분으로 포함하고, 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증 예방 또는 확산방지용 세균 비사멸성 항균 조성물.
<화학식 1>
제1항에 있어서, 상기 조성물은 그람음성 세균의 병원성 유발 단백질(effector protein) 분비체계를 저해하는 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물추출물의 함량이 전체 조성물 100 중량%에 대하여 0.0001 내지 100 중량%인 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
제2항에 있어서, 상기 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물추출물의 함량이 전체 조성물 100 중량%에 대하여 0.0014 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 병원성 그람음성 세균은 예르시니아 페스티스(Yersinia. pestis ), 예르시니아 슈도튜버큘러시스(Y. pseudotuberculosis), 예르시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella species), 장 질환 대장균(enteropathogenic Escherichia coli), 클라미디아 종(Chlamydia species), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 어위니아 종(Erwinia species), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 마그놀리아는 마그놀리아 버지니아나(Magnolia virginiana), 목련(Magnolia kobus), 백목련(Magnolia denudata), 일본목련(Magnolia obovata), 자목련(Magnolia liliiflora), 태산목(Magnolia grandiflora) 또는 함박꽃나무(Magnolia sieboldii)인 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 고체화장비누, 손 세정제, 액체샴푸, 액체비누, 스프레이제제, 액체린스, 바디 세정제, 크림상 비누, 클렌징폼, 클렌징 젤 또는 입욕제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 식기 세정제, 세탁물 세정제, 식품 세정제, 생활용품 세정제, 애완동물 세정제에 첨가되는 것을 특징으로 하는 세균 비사멸성 항균 조성물.
하기 화학식 1로 표시된 오보바톨 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 식물추출물을 유효성분으로 포함하는, 동물 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증 예방 또는 확산방지용 식품 조성물.
<화학식 1>
제9항에 있어서, 상기 동물 병원성 그람음성 세균에 의한 감염증은 개, 고양이, 가축 및 가금류의 폐렴, 폐혈증, 부루세라병, 클라미디아 감염증, 대장균감염증, 살모넬라증, 비브리오병, 어류의 솔방울병, 에드와드병, 절창병, 및 철갑상어의 적란병으로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.