KR20120049073A

KR20120049073A - 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제

Info

Publication number: KR20120049073A
Application number: KR1020100110652A
Authority: KR
Inventors: 김성욱; 문제선; 최원식; 김성은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2012-05-16
Also published as: KR101671885B1

Abstract

본 발명은 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제에 관한 것이다.
본 발명의 에신 화합물은 식물 병원성 그람 음성 세균류의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 아니하면서, 식물의 병원성 유발과 연관된 분비체계만을 선택적으로 저해할 수 있으므로, 그람음성 세균 등에 의한 식물병 방제를 위한 환경친화적 식물병 억제제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제{Escin compound inhibiting secretion system of phytopathogenic Gram-negative bacteria and biocontrol agent of plant diseases with this compound}

본 발명은 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제에 관한 것이다.

오래전부터 인류의 식량생산과 작물보호에는 품종 개량, 비료 투여, 토양 개량, 화학적으로 합성된 농약의 사용 및 영농의 기계화 등에 의해 많은 발전을 거듭해 왔다. 그러나 반복적인 농약의 사용으로 인해 약제 내성균의 출현과 농산물의 잔류 독성 및 환경오염 등이 나날이 증가하여 많은 사회적인 문제로 대두되고 있고, 기존 약제에 대한 내성 균주 출현 빈도가 증가하고 있으며, 일부 식물병은 기존의 화학합성 농약으로는 방제가 불가능하다고 알려져 있어 새로운 방제제에 대한 필요성이 증대되고 있다. 또한 1992년 유엔환경개발회의(UNCED)의 협약에 따라 국내에서도 향후 10년 이내에 현재 사용하고 있는 화학합성 농약의 사용량을 대폭적으로 감축시킬 예정이어서 농업 생산성을 유지할 대체 수단이 절실히 필요한 실정이다.

이와 같이 사회적인 욕구가 증대되고 있는 데도 불구하고 새로운 농업용 항생물질의 개발 속도는 지연되고 있어, 기존에 널리 사용되어 온 세균의 생육을 저해하거나 사멸시키는 방법과는 달리 병원성을 일으키는 인자만을 선택적으로 공략하는 접근방식을 통해 새로운 항생물질을 개발하려는 노력이 시도되고 있다. 특히 동ㆍ식물 그람음성 세균의 병원성 유발에 관여하는 제3유형 분비체계(Type 3 secretion system, TTSS)에 대한 연구는 새로운 병원성 기반의 목표물로 인식되어 선진 각국에서는 활발히 진행될 정도로 그 중요성이 점차 증대되고 있다(Nomura, K. et al., Science, 313: 220-223, 2006; Kauppi, A. M. et al., Chem. Biol., 10: 241-249, 2003). 동ㆍ식물에 병원성을 나타내는 그람음성 세균 (Xanthomonas campestris, Erwinia species, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Salmonella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia)의 대부분은 제3 유형 분비체계를 이용하여 기주 세포에 바늘/선모같은(needle/pilus-like) 분비 구조를 형성하여 effector 단백질을 전달하여 병을 일으키는 것으로 알려졌으며, 이러한 제3 유형 분비체계는 각 균주마다 상당히 TTSS 구조와 그 기작이 유사한 것으로 보고되고 있다 [Cornelis, G. R. et al., Annu. Rev. Microbiol., 54: 735-774, 2000].

이러한 제3 유형 분비체계는 동ㆍ식물에 병원성을 일으키는 그람음성 세균들에 광범위하게 분포되어 있는 강력한 병원성 유발 기작으로 병원성 유발 단백질(effector protein)을 기주 세포의 사이토졸(cytosol)로 주입시켜 병을 유발하는 것으로 알려지고 있다[Keyser, P., et al., J. Intern. Med., 264:17-29, 2008]. 세균의 분비체계는 제1유형으로부터 제7유형 분비체계에 이르기까지 다양한 형태가 존재한다고 보고되어져 있다[Buttner, D. et al., Trends Microbiol., 10: 186-192, 2002; Vidal, J. E. et al., Cell. Microbiol., 10: 1975-1986, 2008; Bonemann, G. et al., EMBO J., 28: 315-325, 2009; Bitter, W. et al., Trends Microbiol., 17: 337-338, 2009]. 특히 예르시니아(Y. pestis, Y. pseudo tuberculosis 및 Y. enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella species), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 장 질환 대장균(enteropathogenic Escherichia coli) 및 클라미디아 종(Chlamydia species)과 같은 세균들이 인체 내에서 제3유형 분비체계를 통해 감염을 일으키는 것으로 알려지고 있다(Muschiol, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 103: 14566-14571, 2006; Veenendaal, A. K. J. et al., J. Bacteriol., 191: 563-570, 2009; Keyser, P. et al., J. Intern. Med., 264: 17-29, 2008). 또한, 식물체에서는 젠토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 어위니아 종(Erwinia species), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 및 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) 등의 그람음성 세균들이 제3유형 분비 체계를 이용하여 기주 식물체에 병원성을 일으키는 것으로 보고되어져 있다[Kauppi, A. M., et al., Chem. Biol., 10: 241-249, 2003]. 이러한 제3 유형 분비 체계에는 20여종 이상의 서로 상이한 단백질들이 관여하고 있는 전위 채널(translocation channel)로 이들 단백질들은 병원성을 일으키는 그람 음성세균들 사이에서 상당한 염기 동등성이 있다고 보고하고 있다[Yip C. K., et al., Trends Biochem. Sci., 31: 223-230, 2006]. 이외에 이러한 병원성 유발 단백질(effector protein)들은 기주 세포의 방어기작과 연관된 신호들을 억제할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 세균의 병원성을 나타내기 위해서는 필수적인 요소라고 알려졌다[Grant, J. E. et al., Annu. Rev. Microbiol., 60: 425-449, 2006).

종전의 항생물질의 개발 전략은 세균의 생육에 필수적이면서 각 세균에 공통적으로 널리 보존된 대사경로를 저해하거나, 세포와 세포간의 신호전달 체계에 관여하는 목표물을 저해하여 병원성 세균을 사멸시키거나 저해하는 화합물의 개발에 주안점을 두어 왔다[Baron, C. et al., Infect. Disord. Drug Targets, 7: 19-27, 2007]. 그러나, 이러한 접근방식을 통해 개발된 항생물질들은 초기에는 우수한 약효를 나타내었으나 반복 사용 및 오ㆍ남용으로 인해 내성 균주의 출현으로 많은 사회적인 문제점으로 대두되고 있고, 최근에는 기존 항생물질로는 치료가 되지 않는 슈퍼박테리아의 출현으로 사망에까지 이르고 있다는 보고가 되고 있어, 새로운 항생물질의 개발 필요성이 꾸준히 증대되고 있는 실정이다[Keyser, P. et al., J. Intern. Med., 264: 17-29, 2008; Baron, C. et al., Infect. Disord. Drug Targets, 7: 19-27, 2007].

한편, 기존의 접근방식은 병원성 세균뿐만 아니라 주변의 유익한 세균까지도 함께 사멸된다는 단점을 지니고 있으나, 1980년대 중반부터 등장한 병원성 세균의 병원성을 일으키는 인자만을 대상으로 하는 전략은 세균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않고, 병원성을 일으키는 인자만을 저해하기 때문에 선택적으로 병원성 세균을 저해할 수 있고[Kauppi, A. M. et al., Chem. Biol., 10: 241-249, 2003], 내성 문제도 극복할 수 있을 것으로 예상되어[Clatworthy, A. E.,, et al., Nat. Chem. Biol., 3: 541-48, 2007], 기존의 항생물질에 저항성을 나타낸 병원성 세균에도 적용 가능하다는 장점이 있다고 알려졌다.

이러한 제3유형 분비체계를 저해하는 저해제에 대한 연구는 인체 병원성 그람음성 세균에서는 많이 보고되고는 있으나[Nordfelth, R. et al., Infect. Immun., 73: 3104-3114, 2005; Hudson, D. L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 51: 2631-2635, 2007; Keyser, P. et al., J. Intern. Med., 264: 17-29, 2008; Kauppi, A. M. et al., Chem. Biol., 10: 241-249, 2003], 식물 병원성 그람음성 세균의 제3 유형 분비체계를 대상으로 한 저해제에 대한 연구는 아직까지 활성화되지 못한 실정이다.

이와 같이, 지난 수십 년 동안 새로운 항생물질의 개발로 인류의 건강과 복지 증진에 커다란 공헌을 해왔으나, 항생물질의 반복 사용과 오ㆍ남용으로 인한 내성균의 출현으로 새로운 작용기작과 기존의 내성균에 효과적인 새로운 항생물질의 필요성이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.

한편 에신 화합물은 전 세계에 널리 분포되어 있는 서양 칠엽수(Aesculus hippocastamum)의 주된 성분 중의 하나인 트리터어펜 사포닌 계열의 화합물로서 만성 정맥성 기능 부전, 치질 및 수술 후 부종 및 염증에 효과가 있다고 알려져 있다(Sirtori, C., Pharmacol. Res., 44:183-193, 2001). 또한 일시적인 국소 뇌 허혈(transient focal cerebral ischemia)로 유도된 세포소멸(apoptosis)에도 효과적이라고 알려진 화합물이다[Hu, X. M. et al., Acta Pharmacol. Sin., 25: `1267-1275, 2004].

그리고 한국등록특허 제228,750호에서는 에신 화합물을 금속 이온 포착제로 사용하여 중금속 오염 토양에서 중금속 이온을 분리할 수 있음이 개시되어 있고, 일본공개특허 제2007-238468호에는 에신 화합물이 리파아제 저해 활성이 있음을 개시하고 있으며, 미국특허 제2010-227830호에서는 알레르기 질환에 효과가 있음이 개시되어 있다.

그러나 상기 화합물이 그람음성 세균의 병원성 인자를 저해한다는 내용은 아직 밝혀진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 식물 병원성 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계에 대한 저해활성이 우수한 에신 화합물을 탐색하고, in vitro 및 in vivo에서의 활성검정을 통해 상기 화합물이 식물병 방제제로서 사용될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 식물 병원성 그람음성 세균의 병원성을 유발하는 분비체계를 저해할 수 있는 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제를 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제를 그 특징으로 한다.

본 발명의 에신 화합물은 식물 병원성 그람 음성 세균류의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 아니하면서, 식물의 병원성 유발과 연관된 분비체계만을 선택적으로 저해할 수 있으므로, 그람음성 세균 등에 의한 식물병 방제를 위한 환경친화적 식물병 억제제의 유효성분으로 사용될 수 있다.

도 1은 HpaG와 Gus 유전자를 함유한 벡터의 구성과 분비체계 저해제 탐색의 한 예를 나타낸 도식도이다.
도 2는 서양 칠엽수(Aesculus hippocastanum)로부터 분리한 에신 화합물의 ESI-MS 스펙트럼이다.
도 3은 서양 칠엽수(Aesculus hippocastanum)로부터 분리한 에신 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 4은 서양 칠엽수(Aesculus hippocastanum)로부터 분리한 에신 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 트립티케이스 소이 브로스(Trypticase soy broth) 배지를 이용한 콩의 불마름병균 생육에 미치는 에신 화합물의 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 에신 화합물 처리에 의한 GUS 융합 단백질의 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다[분비된 GUS 융합 단백질은 SDS-PAGE로 분리한 후 웨스턴 블랏팅을 행하였음].
도 7은 벼 잎에 흰잎마름병균을 접종하고 에신 화합물로 처리한 후, 잎의 병반 증상을 나타낸 것이다[병반은 접종 후 14일 후 관찰].
도 8은 벼 잎에 흰잎마름병균을 접종하고 에신 화합물로 처리한 후, 잎의 병반 길이를 비교한 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 에신 화합물이 식물 병원성 그람음성 세균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않으면서도 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계에 대한 우수한 저해활성을 나타내는 바, 그람음성 세균에 의한 식물병 발생 억제에 활용할 수 있다는 것을 최초로 밝혀낸 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 에신 화합물은 식물병원성 그람음성 세균에 의해 발병하는 식물병, 구체적으로 콩 불마름병(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 토마토 얼룩병(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000), 벼 알마름병(Burkholdera glumae BGR1과 Burkholdera glumae mutant BGS6), 고추 청고병(Ralstonia solanacearum SL341 및 Ralstonia solanacearum SL2029), 벼 흰잎 마름병(Xanthomonas oryzae pv. oryzae KX085) 또는 고추 점무늬병(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)에 대한 방제 효과가 우수하다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 에신 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물 병해 방제제를 그 특징으로 한다.

이러한 식물병 방제제는 유효성분 외에 농약 제제로 사용가능한 담체를 함께 사용하여 제조될 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 농약 제형으로 허용 가능한 담체이면 모두 사용할 수 있으나, 특히 동결보존제 스킴밀크(skim milk), 효모 추출물(yeast extract), 전착제 SOF70, 트윈20, 계면활성제 TD20A, AS65D 등을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 유효성분은 전체 식물병 방제제 조성 100 중량%에 대하여 0.003 ~ 2.0 중량%가 바람직하며, 0.003 ~ 0.5 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 에신 화합물은 분말화해서 사용하거나 액상으로도 사용 가능하며, 사용 시 10 ~ 1000배로 희석하여 사용한다. 그러나, 상기 유효량은 적용 대상의 그람음성 세균의 종류나 병원균의 감염 정도 및 주변 환경 조건 등에 따라 조절될 수 있다. 이때, 희석제로는 정제수를 포함하여 통상적으로 사용되고 있는 것을 사용한다.

이렇게 제조된 식물병 방제제는 작물을 정식한 후 30 ~ 40일부터 또는 발병 직전 시기에 식물체 지상부에 경엽 처리 방법으로 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 에신 화합물을 유효성분으로 하는 특정 조성물을 그람음성 세균의 생육에는 전혀 영향을 미치지 않으면서도 그람음성 세균에 의한 식물병 방제에 효과적인 저해제로 활용할 수 있는 실질적인 기틀을 마련함에 그 의의가 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 식물체 추출물 라이브러리의 구입

본 발명에 사용한 에신 화합물은 한국생명공학연구원 자생식물이용기술개발사업단의 한국식물추출물은행으로부터 식물체 추출물 라이브러리를 분양받아 사용하였다.

실시예 2 : 분양받은 식물체 추출물 라이브러리로부터 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 저해제의 활성 검정 및 도출

본 발명에서는 에신 화합물의 식물 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 여부를 검정하기 위하여, 콩에 세균성 불마름병을 일으키는 잰토모나스 악소노포디스 글라이신스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 균주로부터 분비체계에 관여한다고 알려진 하핀(harpin) 유전자의 일종인 HpaG 유전자[Kim, J. G. et al., J. Bacteriol., 185: 3155-3166, 2003]와 리포터 유전자로서 Gus를 융합시킨 잰토모나스 악소노포디스 글라이신스 8ra(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra, 이하 Xag8ra) 검정체계를 확립하였다[도 1].

HpaG-Gus 융합 단백질을 함유한 재조합 균주인 Xag8ra 균주를 LB 배지(tetracycline 10 ㎍/㎖, rifampicin 50 ㎍/㎖) 10 ㎖에 하룻밤 동안 28 ℃에서 배양한 후, 최소 배지인 XVM2 배지(NaCl 20 mM, (NH₄)₂SO₄10 mM, MgSO₄ㆍ7H₂O 5 mM, CaCl₂ㆍ2H₂O 10 mM, CaCl₂ㆍ2H₂O 1 mM, KH₂PO₄0.16 mM, K₂HPO₄0.32 mM, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.01 mM, casamino acid 0.03%, fructose 10 mM, sucrose 10 mM, tetracycline 10 ㎍/㎖, rifampicin 50 ㎍/㎖) 1 ㎖에 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 균액을 2% 접종하고, 시험하고자 하는 화합물을 첨가하여 28 ℃에서 10 ~ 12시간 동안 배양하였다. 배양한 Xag8ra 균액을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮긴 후, 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리를 실시하고, 상등액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겨 잘 교반한 후, 100 ㎕를 취하여 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 첨가 후, Duchefa Co.에서 구입한 기질인 X-GIcA(cyclohexylammonium) 100 ㎕를 첨가하고, HpaG2-Gus 융합 단백질(fusion protein)이 저해되는지의 여부를 확인하기 위하여 GUS 염색을 실시하고, 37 ℃ 암 시야에서 24시간 동안 반응시킨 후 청색으로부터 노란색으로 변화하는 화합물을 선발하였으며, 590 nm에서 흡광도를 측정하였고, 저해도(%)는 다음 수학식 1로부터 계산하였다. 상기 활성 검정의 대상으로 하기 천연물을 선택하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

분비체계 저해제 활성 검정의 예시
대상 천연물	최종 농도 (μg/ml)	분비체계 저해도(%)
서양칠엽수	100	56.5
파드득나물	400	14.5
황벽나무	400	6.6
흰새덕이	400	5.3

실시예 3 : 서양 칠엽수로부터 조 추출물의 제조와 에신 화합물의 분리정제

상기 실시예 2에서 재조합시킨 그람음성 세균인 Xag8ra의 분비체계에 저해활성을 나타낸 활성 저해 화합물을 분리정제하기 위하여, 자생식물이용기술개발사업단으로부터 서양 칠엽수(Aesculus hippocastanum)의 분말 500 g을 구입하고, 상기 분말에 메탄올 2.5 L를 가하여 실온에서 4일 동안 추출하였고, 진공 농축기를 이용하여 감압 농축하여 메탄올 조추출물 50 g을 얻었다. 상기 메탄올 조추출물에 1 L의 증류수를 가하여 용해시키고, HP-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 0 ~ 100%의 메탄올까지 20%씩 메탄을을 증가시키면서 차례로 용출시킨 후, 메탄올 50 ~ 80% 분획과 0%의 용출물 분획들을 모아 분비체계의 저해여부를 검정한 후 감압농축하였다.

상기 저해활성 검정을 통하여 저해활성을 나타낸 50 ~ 80% 용출 분획들을 대상으로 2차 HP-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였으며, 이 때 메탄올을 50 ~ 100%까지 10%씩 증가시키면서 용출하였다. 용출된 분획들을 모아 저해활성을 확인한 후, 3차 HP-20 컬럼 크로마토그래피를 행하고 나온 분획물들을 모아 세파덱스(Sephadex) LH-20 크로마토그래피를 행하고, 더욱 더 분리정제하기 위하여 30% 아세토니트릴과 Watchers 120 ODS-BP 컬럼(5μm, 4.6 × 250 mm)을 사용하여 고속액체크로마토그라피(HPLC)를 통해 머무름 시간(retention time)이 11.3분인 순수한 백색 단일 화합물 22.5 mg을 얻었다.

실시예 4 : 분리한 화합물의 구조분석

본 실험을 통해 분리된 화합물의 분자량 및 분자식을 결정하기 위하여 핵자기공명(Varian UNITY 300 MHz, 500 MHz NMR)과 ESI-MS을 이용하여 구조분석을 행한 결과, 이 화합물은 이미 보고된 표준물질인 분자량이 1130인 사포닌 계열의 β-에신 화합물과 분자량과 NMR data가 일치함을 확인할 수 있었다(Yoshikawa, M. et al. Chem. Pharm. Bull., 44: 1454-1464, 1996). 상기 ESI-MS 스펙트럼 및 NMR 스펙트럼을 도 2 내지 4에 나타내었다.

실시예 5: 분리한 에신 화합물의 분비체게 저해활성 검정

상기 실시예 2에 기술한 방법을 사용하여 순수 분리한 에신 화합물에 분비체계 저해활성을 검정한 결과, 이 화합물의 IC₅₀은 5.2 μg/ml이었으며 그 결과를 표 2에 나타내었다.

에신 화합물의 분비체계 저해활성
화합물	IC₅₀(μg/ml)
에신(escin)	5.2
나리디직산(Nalidixic acid)^*	3

* 양성 대조구(Positive control)

실시예 6 : 에신 화합물이 식물 병원성 그람음성 세균에 대한 항균 활성 검정

세균의 분비체계를 저해활성을 나타내는 것으로 확인된 상기 실시예 4에서 분리된 에신 화합물이 세균의 생육을 저해하여 분비체계에 영향을 미치는 것인지 여부를 조사하기 위하여, 콩의 불마름병균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 토마토 얼룩병균(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000), 벼 알마름병균(Burkholdera glumae BGR1과 Burkholdera glumae mutant BGS6), 고추의 청고병균(Ralstonia solanacearum SL341 및 Ralstonia solanacearum SL2029), 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae KX085) 및 고추의 세균성 점무늬병균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria), 8종의 각종 식물 병원성 세균에 대한 항균 활성을 확인하였다. 상기 식물 병원성 세균들을 30℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 660 nm에서의 흡광도가 1.0이 되도록 균체수를 1.5 × 10⁹CFU(colony forming unit)/ml 로 조절하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 에신 화합물을 멸균된 증류수에 용해한 후, 트립티케이스 소이 브로스 배지로 연속적으로 2배 희석 계열을 만든 후, 각 웰 당 최종 균체수가 3.0 × 10⁷CFU/ml이 되도록 첨가하여 30 ~ 37℃에서 1 ~ 2일 동안 배양하였다. 배양 후 균의 생육 여부를 육안으로 관찰하여 균이 생육하지 못하고, 투명한 상태로 그대로 유지하고 있는 최소 농도를 최소 생육 저지농도(MIC)로 판정하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이때 양성 대조군에는 나리디직산(nalidixic acid)을 사용하였다.

에신 화합물의 식물병원성 세균에 대한 최소생육저지 농도(μg/ml)
피검균	나리디직산	에신
Burkholderia glumae (BGR1)	8	〉512
Burkholderia glumae (BGS6)	4	〉512
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000	32	〉512
Ralstonia solanacearum SL341	32	〉512
Ralstonia solanacearum SL2029	16	〉512
Xanthomonas oryzae pv. oryzae KX085	16	〉512
Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria	16	〉512
Xanthomonas axonopodis pv. glycines	32	〉512

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 에신 화합물은 8종의 피검균 모두에 대해 512㎍/㎖의 농도에서도 항균력을 나타내지 않은 반면, 대조군에 사용된 나리디직산(nalidixic acid)은 8종의 피검균에 대해 각각 4 ~ 32 ㎍/㎖의 농도에서 항균력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 에신 화합물은 상기 식물병원성 세균의 생육에는 영향을 미치지 아니함을 확인할 수 있었다.

실시예 7 : 에신 화합물에 의한 식물 병원성 그람음성 세균에 대한 생육 억제 시험

에신 화합물이 분비체계 활성 검정에 이용되는 상기 Xag8ra 균주의 생육을 억제하는지의 여부를 확인하기 위하여, MIC 결과를 토대로 트립티케이스 소이 브로스(Tyrpticase soy broth) 액체 배지에 에신 화합물을 256 μg/ml의 농도로 첨가하고 액체 배양하면서 2시간 간격으로 생육 억제 여부를 생균수로 조사하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이 때, 대조군은 화합물을 첨가하지 않은 상태로 비교하였다.

시간이 경과함에 따라 대조군과 화합물을 첨가한 군 모두에서 균의 생육이 증가하는 양상을 나타내었으며, 10시간 배양 후 생균수의 변화는 화합물을 첨가하지 않은 대조군에서는 4.0 × 10⁸CFU/㎖을 나타낸 반면, 에신 화합물을 첨가한 경우에는 4.0 × 10⁸CFU/㎖인 것으로 나타나 양자 간에 균체 수는 대등한 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 에신 화합물이 분비체계를 저해하는 농도인 256 μg/㎖의 농도에서는 균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않기 때문에, 균의 생육 억제에 의해 GUS의 염색이 저해되는 것이 아니라는 점을 확인할 수 있었다.

실시예 8 : 웨스턴 블랏팅에 의한 식물 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 시험

그람음성 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 에신 화합물이 실제로 분비체계를 통한 병원성 인자의 분비를 저해하는지의 여부를 조사하기 위하여, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 실시하였다.

먼저, 항생제를 함유한 10 ㎖의 LB 배지(tetracycline 10 μg/㎖, rifampicin 50 μg/㎖)에 Xag8ra 균주를 접종하고 28 ℃에서 12시간 동안 진탕 배양한 후, 항생제를 첨가한 XVM2 배지(tetracycline 10 μg/㎖, rifampicin 50 μg/㎖ 함유) 100 ㎖에 LB 배지에서 배양한 균액을 2% 접종한 다음, 28 ℃에서 10시간 동안 진탕 배양하였다. 배양한 균을 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 한 후, 상등액 90 ㎖에 100% TCA(trichloroacetic acid)를 10 ㎖ 첨가하여 얼음에서 30분 동안 정치시키고, 4 ℃에서 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 버린 다음, 2 ㎖의 아세톤을 첨가하여 4 ℃에서 10분 동안 다시 원심분리를 실시하였다. 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 다시 한 번 아세톤을 첨가한 후 원심분리를 행하여 상등액을 제거하고 충분히 건조하였다. 건조된 단백질을 크기 별로 분리하기 위해 SDS-PAGE를 실시한 후 겔 상의 단백질을 PVDF 막(pore : 0.45 μm, Millipore)으로 전이하였다. 단백질이 전이된 PVDF 막을 5% 스킴 밀크에 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 진탕하여 블락킹(blocking)을 행하고 TBST(Tris-buffered saline Tween-20) 완충액으로 GUS 항체를 희석시킨 후 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 GUS 항체를 버리고 TBST를 사용하여 PVDF 막을 5분씩 3번 세척하고, TBST로 희석한 두 번째 항체(Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody)를 첨가하여 2시간 동안 교반하였다. 다시 두 번째 항체를 버리고 TBST를 사용하여 PVDF 막을 TBST로 5분씩 3번 세척하였다. Supersignal West Pico Chemiluminescent(Thermo Co.) 시약을 사용하여 PVDF 막에 일정하게 살포한 후 LAS-3000 system(FujiFilm Co., Japan)을 사용하여 검출하였다[도 6].

그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우 세포질에서 분비체계를 통해 XVM2 배지 밖으로 분비되는 HpaG-GUS 융합 단백질이 정상적으로 분비되어 진한 밴드가 검출된 반면, 에신 화합물로 처리한 경우에는 25μM로 처리 시 HpaG-GUS 융합 단백질의 밴드가 대조군에 비해 크게 감소하였고, 50μM 이상의 농도에서는 검출되지 않아, 농도 의존적으로 HpaG-GUS 융합 단백질이 감소된다는 것을 알 수 있었다. 결국 에신 화합물이 세균의 분비체계 저해하는 것을 분명하게 확인할 수 있었다.

실시예 9 : 벼를 이용한 in vivo 활성 검정

상기와 같이 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 것으로 나타난 에신 화합물이 in vivo에서도 저해 활성을 나타내는 지의 여부를 조사하기 위하여, 5주 이상 pot에서 재배한 동진 벼를 이용하여 활성 검정을 하였다.

먼저, 5주 동안 키운 동진 벼에 트윈-20(트윈-20의 최종 농도가 200 ppm 이 되도록 혼합)과 혼합한 에신 화합물을 각각 300, 600 및 900 ppm의 농도로 분무하였고, 음성 대조군에는 증류수를 분무하고 24시간 방치하였다. 24시간 경과 후 미리 벼 흰잎마름병의 원인균인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 균주를 28 ℃에서 48시간 배양하여 균 농도가 2 × 10⁶ cfu/ml 되도록 제조한 균액에 멸균한 가위를 담근 다음, 동진 벼를 잘라 균을 접종하였다. 한편 양성 대조군의 경우에는 가위를 잘 멸균하여 동진 벼 끝을 잘라서 균이 접종되지 않게 하였다.

균을 접종하고 48시간 경과 후에, 다시 한번 동일한 농도로 에신을 분무하였으며, 양성 대조군과 음성 대조군에는 증류수만을 분무하였다. 배양기 습도를 70%로 유지시키고, 28 ℃에서 빛을 16시간, 암흑 상태로 25 ℃에서 8시간 동안 동진 벼를 배양하고, 2주 후 동진 벼 잎에 발생한 병반의 길이를 측정하였다.

그 결과, 증류수로 처리하고 벼흰잎마름병 균주를 접종하지 않은 양성 대조군에서는 벼 잎의 끝부분이 약간 마르고 병이 발병하지 않았다. 그리고, 벼흰잎마름병 균주를 접종하고 에신 화합물 대신 증류수로 처리한 음성 대조군에서는 벼 잎 끝에서부터 완전히 노랗게 변색되기 시작하여 발병된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 에신 화합물을 각각 300, 600 및 900 ppm으로 처리한 벼의 경우 병이 발병하였으나, 음성 대조군에 비해 발병부위가 감소하였으며, 특히 600 ppm 이상에서는 발병부위가 크게 감소하는 것을 알 수 있었다[도 7].

도 8에는 발병 부위의 길이를 그래프로 나타낸 바, 양성 대조군의 벼 잎에 발병한 병의 길이는 0.07cm로 나타났으며, 음성 대조군에서는 발병한 길이가 15.52 cm로 가장 길었다. 이에 비해 에신 화합물을 각 각 300과 600 ppm으로 처리한 군에서는 각각 12.38 cm와 7.73 cm로 나타났으며, 900 ppm으로 처리 시에는 7.34 ppm으로 나타나, 에신 화합물이 벼흰잎마름병균에 의한 발병을 억제하거나 지연시키는 데 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 10 : 물벼룩을 이용한 에신 화합물의 독성검정

TTSS를 저해하는 화합물들의 물벼룩에 대한 급성 유영 독성을 평가하기 위하여 국립환경과학원 고시 제 2009-57호(2009 11월 24일), "화학물질유해성시험연구기관의 지정 등에 관한 규정"의 [별표5] 제2장 제2항의 "물벼룩류 급성독성시험"과 "OECD guidelines for Testing of Chemicals"의 No. 202 "Daphnia sp., Acute Immobilisation Test (adopted: April 13, 2004)"에 준하여 실시하였다.

시험 용액의 수온, pH 및 용존 산소는 물벼룩을 노출시키기 전과 후에 100% 치사영향이 나타나지 않은 모든 농도에서 측정하였으며, 결과는 평균값으로 정리하였으며, 독성시험에 사용한 물벼룩(Daphnia magna)은 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소의 사육실에서 3회 (3 brood) 이상 계대배양한 24시간 미만의 어린 개체들을 사용하였다. 또한 물벼룩의 사육과 시험에 희석수로 사용된 배지는 OECD Guideline(1996)에서 제시된 방법에 따라 조제한 M4 배지이었으며, 경도는 245 mg/l (CaCO₃), 알카리는 43.4 mg/l (CaCO₃)이었다.

시험용액으로는 에신 화합물을 희석수로 희석하여 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 mg/l 되도록 조제하여 사용하였으며, 대조군에는 희석수만을 사용하였다. 시험기간 동안 시험용액을 교체해주지 않는 정체식(static system)으로 하였으며, 노출 수조로 100 ml 용량의 비이커를 사용하였고, 시험용액은 100 ml로 하였으며, 시험 농도 당 물벼룩은 무작위로 5마리씩 4반복으로 처리하여 48시간 동안 노출시킨 후 24 시간과 48시간동안 치사 또는 영향을 받은 개체수를 관찰하였다. 실험기간 동안 광주기는 형광등으로 광조건 16시간, 암조건 8시간으로 조절하였고, 실험실의 조도는 약 520-660 lux를 유지하였으며, 관찰방법은 시험용액을 가볍게 저어준 다음 약 15초후에 물의 흐름을 벗어나지 못하는 개체를 영향을 받은 것으로 간주하였다. 통계 처리는 CETIS v1.7.0(Tidepool, California, USA)를 이용하였으며, 선형 회귀법을 사용하여 독성값 EC₅₀ 및 95% 신뢰한계를 계산하였다. 그 결과 에신 화합물은 24시간 후의 EC₅₀은 16.74, 48시간 후의 EC₅₀은 11.93을 나타내어 살균제로 사용할 수 있는 범주 안에 들어있다는 것을 확인할 수 있었으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

노출시간	에신(escin, mg/l)
노출시간	24 시간	48 시간
EC₅₀ values	16.74	11.93
95% confidence limits	13.47 ~ 20.71	9.99 ~ 14.24

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.
[화학식 1]
제 1 항에 있어서, 상기 식물병은 식물병원성 그람음성 세균에 의해 발병하는 것임을 특징으로 하는 식물병 방제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물병은 콩 불마름병, 토마토 얼룩병, 벼 알마름병, 고추 청고병, 벼 흰잎 마름병 또는 고추 점무늬병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.
제 2 항에 있어서, 식물병원성 그람음성 세균의 분비 체계를 저해하여 방제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.