KR101127159B1 - 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 카보프라틴의 도출과 다음 화학식 1로 표시되는 카보프라틴 화합물이 식물 병원성 그람음성 세균류에 대해 우수한 저해 활성을 나타내어 이를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제에 관한 것이다.
식물병원성 그람음성 세균, 분비체계, 카보프라틴 화합물, 식물병 방제제
Description
본 발명은 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제에 관한 것이다.
동ㆍ식물 병원성 세균류에 의한 감염증은 인체와 동물 및 식물에게 심각한 피해를 일으키는 것으로 알려져 있다. 지난 수십 년 동안 발견한 항생물질 덕분에 그동안 각종 세균 감염증에 의한 사망률이 감소 추세를 나타내었으나, 최근 들어 이러한 항생 물질의 반복 사용으로 인한 저항성 균주의 출현이 심각한 사회적인 문제로 대두되고 있어 새로운 항생물질에 대한 필요성이 점차 증대되고 있는 실정이다. 그러나, 이러한 사회적인 욕구가 증대되고 있는 데도 불구하고 새로운 항생물질의 개발 속도는 지연되고 있어, 기존에 널리 사용되어 온 세균의 생육을 저해하거나 사멸시키는 방법과는 달리 새로운 목표물로서 병원성을 일으키는 인자만을 공략하는 접근방식을 통해 새로운 항생물질을 개발하려는 노력이 시도되고 있 다. 이러한 병원성을 일으키는 대표적인 인자들 중의 하나인 분비체계는 동ㆍ식물에 병원성을 일으키는 그람음성 세균들에 광범위광범 분포되어 있는 강력한 병원성 유발 기작으로 병원성 유발 단백질(effector protein)을 기주 세포의 사이토졸(cytosol)로 주입시켜 병을 유발하는 것으로 알려지고 있다[Keyser, P. J., et al., Internal. Med., 264:17-29, 2008]. 세균의 분비체계는 제1 유형으로부터 제7 유형 분비체계에 이르기까지 다양한 형태가 존재하며[Buttner, D. et al., Trends Microbiol., 10: 186-192, 2002; Vidal, J. E. et al., Cell. Microbiol., 10: 1975-1986, 2008; Bonemann, G. et al., EMBO J., 28: 315-325, 2009; Bitter, W. et al., Trends Microbiol., 17: 337-338, 2009], 각종 인체 감염을 일으키는 그람음성 세균류 중에는 예르시니아(Y. pestis , Y. pseudo tuberculosis 및 Y. enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella species), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri ), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa ), 장 질환 대장균(enteropathogenic Escherichia coli ) 및 클라미디아 종(Chlamydia species) 등의 세균들이 제3유형 분비체계를 통해 감염을 일으키는 것으로 알려지고 있다. 또한, 식물체에 감염을 일으키는 그람음성 세균들로는 젠토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris ), 어위니아 종(Erwinia species), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 및 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum ) 등도 제3유형 분비 체계를 이용하여 기주 식물체에 병원성을 일으키는 것으로 보고되어져 있다[Kauppi, A. M., et al., Chem. Biol., 241-249, 2003]. 이러한 제3유형 분비 체계에는 20여종 이상의 서로 상이한 단백질들이 관여하고 있는 전위 채널(translocation channel)로 이들 단백질들은 병원성을 일으키는 그람 음성세균들 사이에서 상당한 염기 동등성이 있다고 보고하고 있다[Yip C. K., et al., Trends Biochem. Sci., 31: 223-230, 2006]. 이외에 이러한 병원성 유발 단백질(effector protein)들은 기주 세포의 방어기작과 연관된 신호들을 억제할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 세균의 병원성을 나타내기 위해서는 필수적인 요소라고 알려졌다[Grant, J. E., et al., Annu. Rev. Microbiol., 60: 425-449, 2006).
종전까지 각종 병원성 세균에 효과적인 항생물질의 개발은 세균의 생육에 필수적이면서 각 세균에 공통적으로 널리 보존된 대사경로를 저해하거나, 세포와 세포간의 신호전달 체계에 관여하는 목표물을 저해하여 병원성 세균을 사멸시키거나 저해하는 화합물의 개발에 주안점을 두어 왔다[Baron, C. et al., Infect. Disord. Drug Targets, 7: 19-27, 2007]. 그러나, 이러한 접근방식을 통해 개발된 항생물질들은 초기에는 우수한 약효를 나타내었으나 반복 사용 및 오남용으로 인해 내성 균주가 용이하게 출현하여 많은 문제점으로 대두되고 있어, 새로운 항생물질의 개발 필요성이 꾸준히 증대되고 있는 실정이다[Keyser, P., et al., J. Internal. Med., 264: 17-29, 2008; Baron, C. et al., Infect. Disord. Drug Targets, 7: 19-27, 2007].
한편, 기존의 접근방식은 세균의 생육이나 세균에 있는 공통적인 목표물을 대상으로 하기 때문에 병원성 세균뿐만 아니라 주변의 유익한 세균까지도 함께 사멸된다는 단점을 지니고 있다[Keyser, P., et al., J. Internal. Med., 264: 17-29, 2008]. 이에 비해 1980년대 중반 이후부터 등장하기 시작한 병원성 세균의 병원성을 일으키는 인자만을 대상으로 하는 전략은 세균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않고, 병원성을 일으키는 인자만을 저해하기 때문에 선택적으로 병원성 세균을 저해할 수 있고[Kauppi, A. M., et al., Chem. Biol., 10: 241-249, 2003], 내성 문제도 극복할 수 있을 것으로 예상되며[Clatworthy, A. E.,, et al., Nat. Chem. Biol., 3: 541-48, 2007], 기존의 항생물질에 저항성을 나타낸 병원성 세균에도 적용 가능하다는 장점이 있다고 알려졌다. 이러한 병원성 인자 중 제3 유형 분비체계를 저해하는 화합물에 대한 연구는 인체 병원성 그람음성 세균에 서 많이 보고되고 있으나[Nordfelth, R., et al., Infect. Immun., 73: 3104-3114, 2005; Hudson, D. L., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 51: 2631-2635, 2007; Keyser, P., et al., J. Internal. Med., 264: 17-29, 2008; Kauppi, A. M., et al., Chem. Biol., 241-249, 2003], 식물 병원성 그람음성 세균의 제3유형 분비체계를 대상으로 한 저해제에 대한 연구는 아직까지 활성화되고 있지 못한 실정이다. 또한, 기존의 항생물질에 저항성을 나타내는 내성균의 출현 빈도가 새로운 항생물질의 개발 속도보다 빠르게 나타나고 있고, 1996년부터 2004년까지 34개의 회사에서 60여개의 목포물로부터 발견한 125종 이상의 탐색 화합물 중 새로운 작용기작을 나타내는 화합물은 발견할 수 없었다고 보고하고 있다[Keyser, P., et al., J. Internal. Med., 264: 17-29, 2008].
이와 같이, 지난 수십 년 동안 새로운 항생물질의 개발로 인류의 건강에 지대한 공헌을 해왔으나, 항생물질의 반복 사용과 오남용으로 인한 내성균의 출현으로 새로운 작용기작과 기존의 내성균에 효과적인 새로운 항생물질의 필요성이 꾸준 히 요구되고 있는 실정이다.
이러한 시대적 요구에 부응하기 위하여 본 발명자들은 천연자원이나 화합물 라이브러리(chemical library)로부터 식물 병원성 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계를 저해하는 저해제를 탐색하고 개발하기 위하여 한국생명공학연구원 미생물 유전체사업단으로부터 분양받은 화합물 라이브러리로부터 분비체계를 강하게 저해하는 화합물을 발견하고 선별하였다. 이 화합물은 제2 세대 백금 화합물 중의 하나로 여러 종류의 종양에 효과적인 항암제로 알려진 화합물이나[Overbeck, T. L., et al., Mutation Res., 362: 249-259, 1996], 그람음성 세균의 병원성 인자를 저해한다는 보고는 아직 밝혀진 바가 없다.
따라서, 본 발명자들은 카보프라틴 화합물의 식물병원성 그람음성 세균의 분비체계에 대한 저해활성을 조사하고, 이를 유효성분으로 함유하는 식물 병원성 분비체계 저해제의 이용 가능성을 검증하고자 본 발명을 수행하였다.
이에, 본 발명자들은 식물 병원성 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계에 대한 저해활성이 우수한 카보프라틴 화합물을 탐색하고, in vitro 및 in vivo에서의 활성검정을 통해 이 화합물이 그람음성 세균의 분비체계 저해제로 활용 가능하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다
따라서, 본 발명은 식물 병원성 그람음성 세균의 병원성을 유발하는 분비체계를 저해하나, 식물 병원성 세균의 생육에는 전혀 영향이 없는 다음 화학식 1로 표시되는 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제를 제공하는 데 그 목적이 있다.
[화학식 1]
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제를 그 특징으로 한다.
[화학식 1]
본 발명에 따른 카보프라틴 화합물은 식물 병원성 그람 음성 세균류의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않고, 식물의 병원성 유발과 연관된 분비체계만을 선택적으로 저해하는 것으로 나타나, 그람음성 세균에 의한 식물병 방제에 활용할 수 있는 환경친화적 식물병 억제제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 기존에 항암제로 알려진 카보프라틴 화합물이 식물 병원성 그람음성 세균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않고, 그람음성 세균의 병원성과 연관된 분비체계에 대한 저해활성이 우수하여, 그람음성 세균에 의한 식물병 발생 억제에 활용할 수 있다는 것을 최초로 밝혀낸 발명이다.
상기 화학식 1의 카보프라틴 화합물은 식물병원성 그람음성 세균에 의해 발병하는 식물병, 구체적으로 콩 불마름병(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 토마토 얼룩병(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000), 벼 알마름병(Burkholdera glumae BGR1과 Burkholdera glumae mutant BGS6), 고추 청고병(Ralstonia solanacearum SL341 및 Ralstonia solanacearum SL2029), 벼 흰잎 마름병(Xanthomonas oryzae pv. oryzae KX085) 또는 고추 점무늬병(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)에 대한 방제 효과가 우수하였다.
따라서, 본 발명은 화학식 1의 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 식물 병해 방제제를 그 특징으로 한다.
이러한 식물병 방제제는 유효성분 외에 농약 제제로 사용가능한 담체를 함께 사용하여 제조될 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 농약 제형으로 허용 가능한 담체이면 모두 사용할 수 있으나, 특히 동결보존제 스킴밀크(skim milk), 효모 추출물(yeast extract), 전착제 SOF70, 트윈20, 계면활성제 TD20A, AS65D 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 유효성분은 전체 식물병 방제제 조성 100 중량%에 대하여 0.003 ~ 2.0 중량%가 바람직하며, 0.003 ~ 0.5 중량%를 사용하는 것이 더욱 바람직 하다. 상기 카보프라틴 화합물은 분말화해서 사용하거나 액상으로도 사용 가능하며, 사용 시 10 ~ 1000배로 희석하여 사용한다. 그러나, 상기 유효량은 적용 대상의 그람음성 세균의 종류나 병원균의 감염 정도 및 주변 환경 조건 등에 따라 조절될 수 있다. 이때, 희석제로는 정제수를 포함하여 통상적으로 사용되고 있는 것을 사용한다.
이렇게 제조된 식물병 방제제는 작물을 정식한 후 30 ~ 40일부터 또는 발병 직전 시기에 식물체 지상부에 경엽 처리 방법으로 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 카보프라틴을 유효성분으로 하는 특정 조성물을 그람음성 세균의 생육에는 전혀 영향을 미치지 않으면서도 그람음성 세균에 의한 식물병 방제에 효과적인 저해제로 활용할 수 있는 실질적인 기틀을 마련함에 그 의의가 있다.
이하, 본 발명을 다음 실시예에 의하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하고자하는 하나의 예일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변경되거나 축소되는 것은 아니다.
실시예
1: 화합물 라이브러리의 구입
본 발명에 사용한 화합물은 한국생명공학연구원 미생물유전체활용기술개발 사업단으로부터 화합물 라이브러리를 분양받아 사용하였다.
실시예
2: 분양받은 화합물 라이브러리로부터 그람음성 세균의 분비체계를 저해하 는 저해제의 활성 검정 및 도출
본 발명에서는 카보프라틴 화합물의 식물 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 여부를 검정하기 위하여, 콩에 세균성 불마름병을 일으키는 Xanthomonas axonopodis pv. glycines 균주로부터 분비체계에 관여한다고 알려진 하핀(harpin) 유전자의 일종인 HpaG 유전자[Kim, J. G. et al., J. Bacteriol., 185: 3155-3166, 2003]와 리포터 유전자로서 Gus를 융합시킨 Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra(Xag8ra) 검정체계를 확립하였다[도 1].
HpaG-Gus 융합 단백질을 함유한 재조합 균주인 Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra 균주를 LB 배지(tetracycline 10 ㎍/㎖, rifampicin 50 ㎍/㎖) 10 ㎖에 하룻밤 동안 28 ℃에서 배양한 후, 최소 배지인 XVM2 배지(NaCl 20 mM, (NH4)2SO4 10 mM, MgSO4ㆍ7H2O 5 mM, CaCl2ㆍ2H2O 10 mM, CaCl2ㆍ2H2O 1 mM, KH2PO4 0.16 mM, K2HPO4 0.32 mM, FeSO4ㆍ7H2O 0.01 mM, casamino acid 0.03%, fructose 10 mM, sucrose 10 mM, tetracycline 10 ㎍/㎖, rifampicin 50 ㎍/㎖) 1 ㎖에 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 균액을 2% 접종하고, 시험하고자 하는 화합물을 첨가하여 28 ℃에서 10 ~ 12시간 동안 배양하였다. 배양한 Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra 균액을 eppendorf tube로 옮긴 후, 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리를 실시하고, 상등액을 새로운 eppendorf tube로 옮겨 잘 교반한 후, 100 ㎕를 취하여 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 첨가 후, Duchefa Co.에서 구입한 기질인 X-GIcA(cyclohexylammonium) 100 ㎕를 첨가하여, HpaG2-Gus 융합 단백질(fusion protein)이 저해되는지의 여부를 GUS 염색을 실시하고, 37 ℃ 암 시야에서 24시간 동안 반응시킨 후 청색으로부터 노란색으로 변화하는 화합물을 선발하였으며, 590 nm에서 흡광도를 측정하였고, 저해도(%)는 다음 수학식 1로부터 계산하여 다음 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
| 카보프라틴 화합물의 분비체계 저해활성 | |
| 화합물 | IC50(㎍/㎖) |
| 카보프라틴 | 0.3 |
| 나리디직산(Nalidixic acid)* | 3 |
삭제
* 양성 대조구(Positive control)
실시예
3:
카보프라틴
화합물이 식물 병원성 그람음성 세균에 대한 항균 활성 검정
식물 병원성 그람음성 세균의 분비체계를 저해하는 카보프라틴 화합물이 분비체계 이외에 세균의 생육이 저해되어 분비체계가 저해되는 것으로 나타나는지의 여부를 조사하기 위하여, 콩의 불마름병균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 토마토 얼룩병균(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000), 벼 알마름병균(Burkholdera glumae BGR1과 Burkholdera glumae mutant BGS6), 고추의 청고병균(Ralstonia solanacearum SL341 및 Ralstonia solanacearum SL2029), 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae KX085) 및 고추의 세균성 점무늬병균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria), 8종의 각종 식물 병원성 세균들을 30℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 660 nm에서의 흡광도가 1.0 되도록 균체수를 1.5×109 CFU(colony forming unit)/ml가 되게 하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 카보프라틴 화합물을 멸균된 증류수에 용해한 후 트립티케이스 소이 브로스 배지로 연속적으로 2배 희석 계열을 만든 후, 각 웰(well)당 최종 균체수가 3.0× 107 CFU/ml이 되도록 첨가한 후 30 ~ 37℃에서 1~2일 동안 배양하였다. 배양 후 균의 생육 여부를 육안으로 관찰하여 균이 생육하지 못하고, 투명한 상태로 그대로 유지하고 있는 최소 농도를 최소 생육 저지농도(MIC)로 판정하였다.
다음 표 2에 나타낸 바와 같이, 카보프라틴은 8종의 피검균 모두에 대해 512㎍/㎖의 농도에서도 항균력을 나타내지 않은 반면, 대조구로 이용한 나리디직산(nalidixic acid)은 8종의 피검균에 대해 각각 4 ~ 32 ㎍/㎖의 농도에서 항균력을 나타내어 카보프라틴과는 다른 양상을 나타내었다.
| 카보프라틴 화합물의 식물병원성 세균에 대한 최소생육저지 농도 | ||
| 피검균 | 나리디직산 (㎍/㎖) | 카보프라틴 (㎍/㎖) |
| Burkholderia glumae (BGR1) | 8 | 〉512 |
| Burkholderia glumae (BGS6) | 4 | 〉512 |
| Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 | 32 | 〉512 |
| Ralstonia solanacearum SL341 | 32 | 〉512 |
| Ralstonia solanacearum SL2029 | 16 | 〉512 |
| Xanthomonas oryzae pv. oryzae KX085 | 16 | 〉512 |
| Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria | 16 | 〉512 |
| Xanthomonas axonopodis pv. glycines | 32 | 〉512 |
삭제
실시예
4:
카보프라틴
화합물에 의한 식물 병원성 그람음성 세균에 대한 생육 억제 시험
카보프라틴 화합물이 분비체계 활성 검정에 이용되는 재조합 Xanthomonas axonopodis pv. glycines의 생육을 억제하는지의 여부를 재확인하기 위하여, MIC 결과를 토대로 트립티케이스 소이 브로스(Tyrpticase soy broth) 액체 배지에 카보프라틴을 128 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고 액체 배양하면서 2시간 간격으로 생육 억제 여부를 생균수로 조사하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
시간이 경과함에 따라 대조구와 화합물을 첨가한 군 모두에서 균의 생육이 증가하는 양상을 나타내었으며, 10시간 배양 후 생균수의 변화는 화합물을 첨가하지 않은 대조구에서는 6.2×108 CFU/㎖을 나타낸 반면 화합물을 첨가한 경우에는 6.0×108 CFU/㎖인 것으로 나타나 양자 간에 균체 수는 대등하였다. 이러한 결과로부터 카보프라틴 화합물이 분비체계를 저해하는 농도인 300 ng/㎖의 농도에서는 균의 생육에는 전혀 영향을 나타내지 않기 때문에 균의 생육 억제에 의해 GUS의 염색이 저해되는 것이 아니라 분비체계를 저해하는 것으로 사료되었다.
실시예
5:
웨스턴
블랏팅에
의한 식물 병원성 그람음성 세균의 분비체계 저해 시험
그람음성 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 카보프라틴이 실제로 분비체계를 통한 병원성 인자의 분비를 저해하는지의 여부를 조사하기 위하여, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 실시하였다.
먼저, 항생제를 함유한 10 ㎖의 LB 배지(tetracycline 10 ㎍/㎖, rifampicin 50 ㎍/㎖)에 X. axonopodis pv. glycines 균주를 접종하고 28 ℃에서 12시간 동안 진탕 배양한 후, 항생제를 첨가한 XVM2 배지(tetracycline 10 ㎍/㎖, rifampicin 50 ㎍/㎖ 함유) 100 ㎖에 LB 배지에서 배양한 균액을 2% 접종하고 다시 28 ℃에서 10시간 동안 진탕 배양하였다. 배양한 균을 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 한 후 상등액 90 ㎖에 100% TCA(trichloroacetic acid)를 10 ㎖ 첨가하여 얼음에서 30분 동안 정치시킨 후, 4 ℃에서 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리를 하고 상등액을 버린 다음, 2 ㎖의 아세톤을 첨가하여 4 ℃에서 10분 동안 다시 12,000 rpm으로 원심분리를 실시하였다. 원심분리한 다음 상등액을 버리고 다시 한 번 아세톤을 첨가한 후 4 ℃에서 12,000 rpm에서 원심분리를 행하여 상등액을 제거하고 충분히 건조하였다. 건조된 단백질을 크기 별로 분리하기 위해 SDS-PAGE를 실시한 후 겔 상의 단백질을 PVDF 막(pore : 0.45 μm, Millipore)으로 전이하였다. 단백질이 전이된 PVDF membrane을 5% 스킴 밀크에 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 진탕하여 블락킹(blocking)을 행하고 TBST(Tris-buffered saline Tween-20) 완충액으로 GUS 항체를 희석시킨 후 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 GUS 항체를 버리고 TBST를 사용하여 PVDF 막을 5분씩 3번 세척하고, TBST로 희석한 두 번째 항체(Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody)를 첨가하여 2시간 동안 교반하였다. 다시 두 번째 항체를 버리고 TBST를 사용하여 PVDF 막을 TBST로 5분씩 3번 세척하였다. Supersignal West Pico Chemiluminescent(Thermo Co.) 시약을 사용하여 PVDF 막에 일정하게 살포한 후 LAS-3000system(FujiFilm Co., Japan)을 사용하여 검출하였다[도 3].
그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조구의 경우 세포질에서 분비체계를 통해 XVM2 배지 밖으로 분비되는 HpaG-GUS 융합 단백질이 정상적으로 분비되어 진한 밴드가 검출된 반면, 카보프라틴으로 처리한 경우에는 1 μM 농도로 처리 시 HpaG-GUS 융합 단백질의 밴드가 대조구에 비해 크게 감소하기 시작하여 50 μM에서는 현저하게 감소하여, 농도 의존적으로 HpaG-GUS 융합 단백질이 감소되는 것을 알 수 있었다.
실시예
6: 벼를 이용한
in
vivo
활성 검정
그람음성 세균의 분비체계를 강하게 저해하는 것으로 나타난 카보프라틴 화합물이 in vivo에서도 저해 활성을 나타내는 지의 여부를 조사하기 위하여, 5주 이상 pot에서 재배한 동진 벼를 이용하여 활성 검정을 하였다.
먼저, 5주 동안 키운 동진 벼에 Tween-20 전착제를 함유한 카보프라틴을 각각 10, 30 및 100 ppm 분무하였고, 양성 대조구와 음성 대조군에는 증류수를 분무하고 24시간 방치하였다. 24시간 경과 후 미리 벼의 흰잎 마름병의 원인균인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 균주를 28 ℃에서 48시간 배양해서 균 농도가 2 × 106 cfu/ml 되도록 제조한 균액에 멸균한 가위를 담근 다음, 동진 벼를 잘라 균을 접종하였으며, 대조군의 경우에는 가위를 잘 멸균하여 동진 벼 끝을 잘라서 균이 접종되지 않게 하였다. 균을 접종하고 48시간 경과 후에 다시 한번 동일한 농도로 카보프라틴을 분무하였으며, 양성 대조군과 음성 대조군에는 증류수만을 분무하였다. 배양기 습도를 70%로 유지시키고, 28 ℃에서 빛을 16시간, 암흑 상태로 25 ℃에서 8시간 동안 동진 벼를 배양하고, 2주 후 동진 벼 잎에 발생한 병반의 길이를 측정하였다.
그 결과, 증류수로 처리하고 X. oryzae pv. oryzae 균주를 접종하지 않은 양성 대조군에서는 벼 잎의 끝부분이 약간 마르고 병이 발병하지 않았다. 그러나, 카보프라틴 대신 증류수로 처리하고 X. oryzae pv. oryzae 균주로 처리한 음성 대조군에서는 벼 잎 끝에서부터 완전히 노랗게 변색되기 시작하여 발병된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 카보프라틴을 각각 10, 30 및 100 ppm으로 처리한 벼의 경우 병이 발병하였으나, 음성 대조군에 비해 발병부위가 많이 감소한 것을 알 수 있었다[도 4a].
도 4b에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군에서는 벼 잎에 발병한 병의 길이가 0.25 cm로 나타났으며, 음성 대조군에서는 발병한 길이가 13.5 cm로 가장 길었다. 이에 비해 카보프라틴을 10, 30 및 100 ppm으로 처리한 군에서는 각각 12.6 cm, 9.4 cm 및 4.2 cm로 나타나, 이러한 결과로부터 카보프라틴은 X. oryzae pv. oryzae에 의한 벼의 흰잎 마름병의 발병을 억제하거나 지연시키는 데 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
도 1은 HpaG와 Gus 유전자를 함유한 벡터의 구성과 분비체계 저해제 탐색의 한 예를 나타낸 도식도이다.
도 2는 트립티케이스 소이 브로스(Trypticase soy broth) 배지를 이용한 콩의 불마름병균 생육에 미치는 카보프라틴의 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 카보프라틴 처리에 의한 GUS 융합 단백질의 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다[분비된 GUS 융합 단백질은 SDS-PAGE로 분리한 후 웨스턴 블랏팅을 행하였음].
도 4a는 벼 잎에 흰잎 마름병균으로 접종한 후 카보프라틴으로 처리한 벼 잎의 병반 증상을 나타낸 것이다[병반은 접종 후 14일 후 관찰].
도 4b는 벼 잎에 흰잎 마름병균으로 접종한 후 카보프라틴으로 처리한 벼 잎의 병반 길이를 비교한 것이다.
Claims (3)
- 다음 화학식 1로 표시되는 카보프라틴 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병원성 그람음성 세균에 의해 유발되는 식물병 방제제.[화학식 1]
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 식물병은 콩 불마름병, 토마토 얼룩병, 벼 알마름병, 고추 청고병, 벼 흰잎 마름병 또는 고추 점무늬병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.
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|---|---|---|---|---|
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