KR20230079416A - 식물 질병을 방제하기 위한 슈도모나스 균주 및 이의 대사산물 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 다양한 작물에 대한 다양한 미생물 종의 성장을 억제할 수 있는 0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328의 신규 박테리아 균주, 박테리아 균주로부터 생산된 세포 배양액 및 신규 대사산물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 하기 화학식 (I), (II) 및 (III)을 갖는 화합물에 상응하는 균주로부터 생산된 신규하고 강력한 항균성 대사산물의 사용을 포함한다:

(I)

(II)

(III)

Description

식물 질병을 방제하기 위한 슈도모나스 균주 및 이의 대사산물

본 발명은 생물살충제 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다양한 미생물 종의 성장을 억제할 수 있는 슈도모나스 종, 0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328의 7개의 신규 균주, 박테리아 균주로부터 생산된 세포 배양액 및 신규 대사산물에 관한 것이다. 0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328의 슈도모나스 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁되었으며 각각 ATCC 수탁번호 PTA-126796, PTA-126797, PTA-126798, PTA-126799, PTA-126800, PTA-126801, 및 PTA-126802를 갖는다.

병원성 미생물에 의해 유발되는 식물 질병은 기하급수적으로 증가하고 있으며 비용이 많이 든다. 식물 병원성 유기체는 진균, 박테리아, 마이코플라스마, 바이러스, 바이로이드, 선충 또는 기생 꽃식물을 포함한다. 현재, 박테리아 유기체에 의해 발생하는 14종의 흔한 식물 질병은 박테리아 반점(bacterial spot), 박테리아 광병(bacterial light) 및 박테리아 시들음병(bacterial wilt) 등이다. 화상병(Fire blight) (에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)), 감귤 궤양병(citrus canker) [크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 (Xanthomonas axonopodis　pv.　citri)(Xac)], 박테리아 잎 반점(bacterial leaf spot) (BLS) [크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토라(Xanthomonas campestris　pv.　vesicatora) (XV-16)], 올리브 혹병(olive knot) [슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi) (Psv)]. 및 연근 (디케야 다단티(Dickeya dadantii), 펙토박테리움 파르멘티에리(Pectobacterium parmentieri) 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 및 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum))은 파괴적인 식물 질병이다. 전국적으로 화상병의 방제(controlling) 비용은 1억 달러 이상으로 추산된다(문헌[Norelli et al.(2003)]). 감귤 궤양병의 경우, 플로리다에서만 1995년부터 2005년까지 박멸 프로그램을 운영하는 비용과 파괴된 가정용 감귤에 대한 상업적 재배자 및 소유자에 대한 보상이 10억 달러에 육박하고 있다.

화상병은 유럽, 독일, 오스트리아 및 스위스와 같은 세계 여러 지역에서 배와 사과에 발병하는 그람 음성 박테리아 에르위니아 아밀로보라의 감염으로 인한 이과의 파괴적인 질병이다(문헌[Chen et al.(Chen et al.) 2009)]). 화상병이 전체 과수를 죽이는 경우는 거의 없지만 상기 질병과 그 방제는 여전히 상당한 경제적 손실을 초래한다. 태평양 북서부와 캘리포니아 북부에서는 1991년 이후 매년 소규모 발병이 있었으며 적어도 일부 지역에서는 3 내지 4년마다 대규모 발병이 발생했다. 감염된 식물 부분을 제거하기 위해 가지치기를 하면 나무가 손상되어 향후 생산성이 감소하기 때문에 소규모 질병 발생에도 비용이 많이 들 수 있다. 예를 들어, 4년 된 사과 과수에서 근경 마름병 발생률이 10%이면 에이커당 최대 $3,500의 손실이 발생할 수 있다(문헌[Norelli et al. (2003)]).

미생물 천연 산물은 농약으로서 다량의 생물학적 화합물을 제공하였다(문헌[Gwinn (2018)]). 그러나 박테리아 식물 질병에 대한 현재의 예방 방법은 효과가 제한적이다. 항생제 스트렙토마이신 술페이트(FireWall, AgroSource, Inc.) 및 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드(FireLine, AgroSource, Inc.)는 감염 위험이 높을 때 E. 아밀로보라를 퇴치하기 위해 사용되는 주요 산물이었다. 이러한 화합물은 인간과 동물의 건강 관리에도 사용되기 때문에 작물 농업에서 동일한 항생제를 사용하는 것은 논란의 여지가 있다(문헌[Stockwell (2012)]). 스트렙토마이신 술페이트의 경우 항생제 내성에 대한 우려로 인해 사용이 제한되었다(문헌[Vrancken et al. (2013)]). 화상병에 대해 연구되고 있는 또 다른 항생제는 카수가마이신(kasugamycin)이다. 한 가지 단점은 카수가마이신의 빈번한 투여가 식물을 파괴하는 식물 독성 효과로 이어진다는 것이다(문헌[Adaskaveg et al. (2010)]). 다른 단점은 다른 항생제와 비교하여 카수가마이신의 높은 비용이다. 따라서 카수가마이신은 다양한 다른 항생제와 함께 사용해야 한다.

지난 수십 년 동안, 수많은 비-항생제 산물이 개발되었고, 미국 환경 보호국(EPA)에 등록되었으며, 미국 국가 유기농 프로그램(NOP) 승인을 받았으며, 화상병 방제를 위해 과수 재배자에게 판매되었다(문헌[Tianna et al. (2018)]). 역사적으로 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis)에 기반한 두 가지 산물이 유럽에서 화상병 방제용으로 등록되었다: 균주 QST 713 기반 세레나데® 및 균주 BD 170 기반 Biopro®(문헌[Broggini et al. (2005)]). 포자 형성 바실루스 기반 생물 제형은 오래 지속되는 생존율으로 인해 생물방제에 이점을 제공한다(문헌[Haas et al. (2005)]). 두 가지 바실루스 기반 생물제형의 중간 정도의 성공은 미국과 독일의 수많은 현장 시험에서 입증되었다(문헌[Aldwinckle et al. (2002); Kunz et al. (2011); Laux et al. (2003)]). 이것은 E. 아밀로보라에 의한 꽃 감염 방제에서 바실루스 종의 가능한 잠재력을 시사한다. 그러나 바실루스는 낮은 감염 압력에서만 작용한다. 중간 및 높은 감염 압력 상황에서는 작용하지 못한다. 얻은 결과는 71% 내지 0% 질병 억제에서 변하는 두 가지 바이오산물에 대해 불규칙했다(문헌[Broggini et al. (2005)]).

유망한 생물학적 보호 산물은 한편으로는 E. 아밀로보라와 효과적으로 경쟁해야 하고, 다른 한편으로는 표적 식물의 다른 기관에서 동일한 적소를 콜로니화할 수 있어야 한다. 보호 박테리아는 병원체에 영향을 미치고 먹이와 공간을 놓고 경쟁하는 이차 대사산물을 생산하여 식물과 관련하여 E. 아밀로보라에 의한 병인 발생을 방지한다. 이 문제에서 슈도모나스 속의 박테리아는 위에서 기재한 생물학적 보호 요소에 적합하다(문헌[Haas et al. (2005)]). 다양한 식물의 콜로니 박테리아의 종 조성을 분석한 결과 슈도모나스속의 형광 박테리아가 광범위하게 분포하고 있는 것으로 나타났다.

프랑스에서는 슈도모나스 종은 건강한 사과나무와 병든 사과나무, 배, 산사나무 모두에 서식하는 집단의 지배적인 구성 요소였으며 이들 중 많은 수가 시험관내에서 E. 아밀로보라의 성장을 제한하는 기능을 나타냄이 발견되었다(문헌[Paulin et al. (1978)]). 그러나 강력한 대사산물에 대한 정보는 거의 보고되지 않았다.

캘리포니아에서 문헌[Thomson et al. (1976)]은 배꽃 보호에 효과적인 3종의 형광 슈도모나스를 선택하였다(문헌[Thomson et al. (1976)]). 1980년대 중반, 캘리포니아의 배나무 잎에서 단리된 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 A506은 E. 아밀로보라의 성장을 제한하는 고유한 활성과 화상병으로부터 사과와 배를 보호하는 보호 기능을 보여주었다(문헌[Lindow et al. (1996)]). P. 플루오레센스를 포함한 BlightBan® A506 산물이 개발되어 1996년부터 시장에 출시되었다. 캘리포니아, 오레곤 및 워싱턴 주에서 수행된 많은 실험은 다양한 사과 및 배 보호 프로그램에서 이 제제의 유용성을 입증했다(문헌[Johnson(2000)]).

영국에서는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 두 단리주가 산사나무의 꽃과 싹을 보호하는데 사용되었다(문헌[Wilson et al. (1992)]).

이탈리아와 뉴질랜드에서는 기호 BO 3371 및 BO G19의 슈도모나스 속의 두 균주의 적합성이 조사되었다(문헌[Galasso et al. (2002)]). 온실 조건에서 이는 사과와 배의 새싹뿐만 아니라 꽃을 보호하는데 매우 효과적이다. 예를 들어, 배 싹에 대한 균주 BO3371의 상대적 보호는 87%에 달할 수 있다(문헌[Galasso et al.(2002)]). 그러나 얻은 결과가 항상 일치하는 것은 아니었으며, 이는 개화에서 개화 종료까지의 기간과 관련된 꽃의 감응성과 관련될 수 있었다.

뉴질랜드에서는 형광 슈도모나스 종 IPV-BO G19 균주는 현장 조건에서 79% 사과 꽃을 보호했다. 또 다른 실험 과수에서는 'Braeburn' 사과 꽃에 E. 아밀로보라를 접종하기 24시간 전에 살포했을 때 형광 슈도모나스 종 IPV-BO G19 및 IPV-BO 3371은 화상병 발생률을 각각 78% 및 58% 감소시켰다(문헌[Biondi et al.(2006)]).

스페인에서, 균주 EPS62e P. 플루오레센스는 현장 분석에서 사과 꽃, 배 열매 및 배 꽃에 대한 시험에서 화상병을 상당히 제한하였다. P. 플루오레센스 EPS62e의 화상병 퇴치를 위한 적응도 및 효능의 개선은 영양 강화와 삼투 적응을 조합하는 전략에 의해 얻어졌다. 배꽃에 생리적으로 개선된 P. 플루오레센스 EPS62e를 사용한 현장 처리는 효율을 최대 90%까지 높일 수 있지만 시험에 따라 결과가 달랐다(문헌[Cabrefiga et al. (2011); Mikicineski et al. (2020)]).

폴란드에서는 배 열매에 대한 화상병의 발병을 감소시킬 수 있는 박테리아의 47개 콜로니가 사과 엽계 및 토양에서 단리되었다(문헌[Mikicineski et al. (2008)]).

그람 음성 슈도모나스 종에 의해 생산된 대사산물이 종합적으로 검토되었다(문헌[Masschelein et al. (2017)]). 슈도모나스 대사산물의 종류는 페놀 화합물, 페나진, 리포펩타이드 등으로 분류할 수 있다. 슈도모나스 종과 그 대사산물의 기능은 다음과 같다(문헌[Alsohim et al. (2014)]): 1) 호르몬을 생산하거나 전체 내성을 유도한다; 2) 많은 자연 발생 균주도 식물 성장을 상당히 개선한다(식물 성장 조절제, IAA, 비스코신(viscosin)); 3) 길항작용은 시안화수소, 페나진, 피롤니트린 또는 2,4-디아세틸플로로글루시놀(DAPG)과 같은 항미생물 화합물뿐만 아니라 비스코신 및 비스코신아미드와 같은 계면활성제 및 시데로포어(siderophore)의 생산에 의해 부여될 수 있다. 본 발명자들의 연구에서 박테리아 균주가 확인되었고 발효물과 새로운 대사산물이 박테리아에서 생산되었고; 특히, RejuAgro A와 RejuAgro B는 지금까지 보고되지 않은 박테리아, 진균을 포함하는 병원성 미생물에 대해 높은 효능을 나타낸다.

다양한 작물 및 질병-유발 병원체의 성장을 억제할 수 있는 신규 균주, 세포 배양액 및 이러한 균주로부터 생산된 신규 대사산물로부터 유래된 신규한 생물살충제가 필요하다.

제1 양상에서, 보호 대사산물(protective metabolite)의 생산을 향상시키기 위한 박테리아를 성장시키는 방법이 제공된다. 본 방법은 대안적 단계를 포함한다. 하나의 방법에서, 박테리아 발효물을 생산하기 위해 용기 내 액체 배지에서 슈도모나스 박테리아(Pseudomonas bacteria)를 성장시키는 단계가 제공된다. 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:2 내지 1:10이고, 용기는 약 100 내지 250 RPM의 속도(rate)에서 교반된다. 대안적 단계에 따르면, 본 방법은 발효기의 액체 배지에서 슈도모나스 박테리아를 성장시켜 박테리아 발효물을 생산하는 단계를 포함한다. 발효기의 공기 유속(air flow rate)은 약 1 내지 3 L/분이다. 용존 산소 농도는 5 mg/L 내지 12 mg/L이다.

제2 양상에서, 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 포함하는 농업용 조성물이 제공된다. 농업용 조성물은 제1 양상의 방법 및 제1 양상과 관련하여 개시된 임의의 양상에 따라 생산된다. 제1 양상에서, 농업용 조성물은 애주번트를 추가로 포함한다. 이와 관련하여 애주번트는 계면활성제이다.

제3 양상에서, 박테리아 작물 질병(bacterial crop disease)을 방제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 다수의 단계를 포함한다. 제1 단계는 제1 양상 또는 이의 임의의 형태에 의해 생산된 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 포함하는 농업용 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 제2 단계는 상기 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함한다.

제4 양상에서, 박테리아 작물 질병을 방제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 하나의 단계를 포함한다. 단계는 약 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁹ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함하는 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함한다.

제5 양상에서, 슈도모나스 박테리아로부터 보호 대사산물을 정제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 다수의 단계를 포함한다. 제1 단계는 제1 양상의 방법 및 이의 형태에 의해 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 생산하는 단계를 포함한다. 제2 단계는 유사한 극성 또는 특성을 가진 용매 혼합물에 의해 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 추출하는 단계를 포함한다. 제3 단계는 헥산 및 에틸 아세테이트를 사용하여 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 용출하거나 헥산 및 에틸 아세테이트를 사용하여 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 용출함으로써 보호 대사산물을 포함하는 용출물(eluate)을 생산하는 단계를 포함한다.

제6 양상에서, 제5 양상 및 이의 형태의 방법에 의해 정제된 슈도모나스 박테리아로부터의 보호 대사산물을 포함하는 농업용 조성물.

제7 양상에서, 박테리아 작물 질병을 방제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 다수의 단계를 포함한다. 제1 단계는 제5 양상 또는 이의 임의의 형태의 방법에 의해 정제된 슈도모나스 박테리아로부터의 보호 대사산물을 포함하는 농업용 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 제2 단계는 보호 상청액, 또는 이의 대사산물의 제형이 용액(SL), 가용성 분말(SP), 가용성 과립(SG) 및 캡슐화된 제형(encapsulated formulation)일 수 있는 상기 농업 조성물을 적용하는 단계를 포함한다. 또한, 박테리아 발효물 및 세포 제형의 농업용 조성물은 현탁액 농축물(SC), 습윤 가능한 분말(wettable powder; WP) 및 수분산성 과립(WG)일 수 있다.

제8 양상에서, 다음 구조 중 하나로부터 선택되는 결정질 화합물(crystalline compound):

(화학식 (I)),

(화학식 (II)) 및

(화학식 (III)).

도 1은 16S rDNA, gyrB, rpoB 및 rpoD의 연결된 정렬에 기반한 대표적인 슈도모나스 계통의 최대 우도 계통발생의 예시적인 그래프를 예시한다. 부트스트랩 지원 값은 100% 미만의 지원을 받은 4개의 내부 분기 아래에 표지되어 있다. 표지되지 않은 항목은 100% 지원을 나타낸다.
도 2는 균주 0617-T307의 에틸 아세테이트 추출물의 분석 유도 단리의 예를 도시한다.
도 3은 교반 플라스크 발효에서 RejuAgro A의 양을 보여주는 예시적인 배양 그래프를 도시하며, 세포 배양액, 상청액 및 세포에서 RejuAgro A의 분포(패널 A) 및 시간 경과에 따른 세포 발효로부터의 RejuAgro A 생산(패널 B)을 나타낸다.
도 4는 V. 이나에쿠알리스가 14일째에 첨가제 부재 하(플레이트 A); 0.25% 0.01M PBS(플레이트 B) 또는 0.8% DMSO(플레이트 C) 또는 1.6% DMSO(플레이트 D)의 존재 하에 PDA 단독으로 PDA 플레이트에서 성장할 수 있음을 보여주는 예시적인 한천 플레이트를 도시한다.
도 5는 14일째에 선택된 4개의 생물방제 박테리아를 포함하는 PDA 플레이트(플레이트 A: 0617-T307; 플레이트 B: 0118-T319; 플레이트 C: 0318-T327; 플레이트 D: 0418-T328)에서 V. 이나에쿠알리스가 성장할 수 없음을 보여주는 예시적인 한천 플레이트를 도시한다.
도 6은 V. 이나에쿠알리스가 14일째에 40 내지 80μg/mL RejuAgro A를 포함하는 PDA 플레이트(플레이트 A: PDA 플레이트에서 10μg/mL; 플레이트 B: PDA 플레이트에서 20μg/mL; 플레이트 C: PDA 플레이트에서 40μg/mL, 플레이트 D: PDA 플레이트에서 80μg/mL)에서 성장할 수 없음을 보여주는 예시적인 한천 플레이트를 도시한다.
도 7은 V. 이나에쿠알리스가 14일째에 10 내지 80μg/mL RejuAgro B를 포함하는 PDA 플레이트(플레이트 A: PDA 플레이트에서 10μg/mL; 플레이트 B: PDA 플레이트에서 20μg/mL; 플레이트 C: PDA 플레이트에서 40μg/mL, 플레이트 D: PDA 플레이트에서 80μg/mL)에서 성장할 수 있음을 보여주는 예시적인 한천 플레이트를 도시한다.
도 8은 V. 이나에쿠알리스가 14일째에 200 내지 1000μg/mL 황산구리를 포함하는 PDA 플레이트(플레이트 A: 500μg/mL CuSO₄를 포함하는 PDA 플레이트; 플레이트 B: 1000μg/mL CuSO₄를 포함하는 PDA 플레이트)에서 성장할 수 있음을 보여주는 예시적인 한천 플레이트를 도시한다.
도 9는 407 nm의 파장에서 HPLC로 분석한 RejuAgro A의 예시적인 양-피크 면적 곡선을 도시한다.
도 10은 상이한 박테리아 균주로부터의 RejuAgro A 생산에 대한 예시적인 데이터를 도시한다.
도 11은 보트리티스 시네레아 CA17에 대한 예시적인 항진균 분석을 도시하고, 패널 A는 (1) 50 mg/mL의 40 μL 니스타틴(Nystatin), (2) 40 μL DMSO를 도시하고; 패널 B는 (1) 24시간 동안 M9 배지, (2) 24시간 동안 M8 배지, (3) 24시간 동안 M7 배지, (4) 24시간 동안 M6 배지를 도시하고; 패널 C는 (1) 12시간 동안 M9 배지, (2) 12시간 동안 M8 배지, (3) 12시간 동안 M7 배지, 및 (4) 12시간 동안 M6 배지를 도시한다.
도 12는 600μg/mL의 RejuAgro A 존재 하에 억제 성장을 나타내지만(패널 A) 60μg/mL의 RejuAgro A 존재 하에(패널 B) 또는 RejuAgro A의 부재 하(패널 C)에 성장을 나타내는 M. 피지엔시스의 예시적인 한천 플레이트를 도시한다.
도 13a는 S-Me 기가 헤테로사이클에 대해 단지 8.7° 회전된 평면 구조를 갖는 것으로 RejuAgro A 분자를 도시한다. C4-C5 결합(1.531Å)에서 분자의 π-컨쥬게이트가 분명하게 절단되어 있으며, 이는 명확하게 몇 가지 궤도상의 이유 때문이다. sp² 탄소 원자에 연결된 Me-기는 2개 위치에 걸쳐 불규칙하게 회전된다.
도 13b는 N-H…O 상호작용을 통한 중심대칭 H-결합 이량체 결정 형태의 RejuAgro A 분자를 도시한다. 또한, 이들 이량체는 보다 약한 C-H…O 상호작용을 통해 [-3 0 1] 평면을 따라 2차원 층을 형성한다.
도 14a는 2개의 대칭적으로 독립적인 RejuAgro B 분자를 갖는 RejuAgro B 결정을 도시한다. 각 분자는 70.3°와 80.6°의 연결된 헤테로사이클의 평균 평면 사이의 2면각을 갖는 꼬인 구조를 가지고 있다. 2개의 인접한 카보닐 기 사이의 C(sp²)-C(sp²) 결합에서 각 헤테로사이클에서 π-컨쥬게이트가 분명하게 절단되어 있으며(결합 길이는 1.534 내지 1.539Å 범위임), 이는 명확하게 몇 가지 궤도상의 이유 때문이다.
도 14b는 N-H…O 상호작용을 통한 중심대칭 H-결합 이량체 결정 형태의 RejuAgro B 분자를 도시한다. 또한, 이들 이량체는 다른 N-H…O 상호작용을 통해 x 방향을 따라 적층으로 연결되어 있다. 마지막으로 적층은 제3 유형의 N-H…O 상호작용에 의해 [011]을 따라 층로 연결된다.
도 15a는 나머지 원자의 평면 밖으로 42° 회전된 아미드 기를 갖는 평면 파이-컨쥬게이트 형태를 갖는 RejuAgro C 분자를 도시한다.
도 15b는 x-축을 따라 적층된 결정의 RejuAgro C 분자를 도시한다. 적층은 H-결합 N-H…O를 통해 ab 평면을 따라 층으로 연결된다. 층은 용매화물 물 분자(3 mol. eq.)와 다중 수소 결합을 통해 3차원 네트워크로 연결된다.

본 발명은 박테리아 및 진균을 포함하는 병원성 미생물에 대해 항균 활성을 나타내는 0617-T307과 같은 이 특허에 열거된 7종의 슈도모나스 균주에 의해 생산된 신규 대사산물에 관한 것이다. 16S rRNA 및 기타 하우스키핑(housekeeping) 유전자 서열로부터 균주를 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 그룹의 슈도모나스 솔라이(Pseudomonas soli) 0617-T307로 확인하였다. 0617-T307과 같은 7가지 박테리아 균주의 세포 배양액에는 아래에 도시된 이량체 RejuAgro B와 함께 RejuAgro A로 지정된 신규한 강력한 6원 헤테로사이클 천연 산물이 포함되어 있다:

RejuAgro A 및

RejuAgro B.

이들 화합물, 이의 생산 방법 및 식물 미생물 병원체를 억제하기 위한 적용은 본 명세서에서 보다 상세히 개시된다.

정의

본 개시내용의 양상 또는 특정 실시형태의 요소를 도입할 때, 단수형 관사 ("a", "an", "the" 및 "상기")는 하나 이상의 요소가 있음을 의미하도록 의도된다. "~를 포함하는", "~를 포괄하는" 및 "~를 갖는" 등의 용어는 포괄적인 것으로, 나열된 요소 외에 추가적인 요소가 존재할 수 있음을 의미한다. "또는"이라는 용어는 특정 목록의 한 구성원을 의미하며 달리 명시되지 않는 한 해당 목록의 구성원 조합도 포함한다.

본 명세서에서 의도된 바와 같이, 용어 "실질적으로", "대략" 및 "약" 및 유사한 용어는 본 개시내용의 대상이 속하는 기술 분야에서 일반적인 허용 가능한 용법과 조화되는 넓은 의미를 갖도록 의도된다. 본 명세서를 검토하는 당업자는 이들 용어가 이러한 특징의 범위를 제공된 정확한 수치 범위로 제한하지 않고 기재되고 청구된 특정 특징의 설명을 가능하게 하기 위한 것임을 이해해야 한다. 따라서, 이러한 용어는 기재되고 청구된 대상의 필수적이지 않거나 중요하지 않은 변형 또는 변경이 첨부된 청구범위에 인용된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려됨을 나타내는 것으로 해석되어야 한다.

"생물방제제(또는 BCA)"는 병원체, 잡초 및 곤충과 같은 해충을 안전하고 지속 가능하며 비용 효율적으로 관리하는 방법이다. 이러한 제제는 환경 내에 해충의 개체수 또는 존재량을 감소시키기 위한 목적으로 해충 종을 표적화하기 위해 환경에 도입된다.

"생물학적 제제"는 숙주에서 콜로니를 생산하는 살아있는 미생물(박테리아 및 효모)의 제제이다. 이러한 미생물은 주로 착생 단계 동안 병원체 축적을 늦추기 위해 적용된다(문헌[Tianna et al. (2018)]).

"생물학적 합리 살충제"는 미생물 기반 생물살충제에 적용되는 용어이다. 이러한 생물살충제는 종종 미생물 균주를 발효시켜 제조된다. 이러한 산물의 대부분은 항균 및 항진균 활성을 모두 가지고 있다(문헌[Tianna et al. (2018)]).

"생물살충제"는 미국 환경 보호국(EPA)에 의해 천연 물질로부터 유래된 살충제로 정의되고 이를 무독성 기전에 의해 해충을 방제하는 물질을 포함하는 생화학적 살충제, 일반적으로 생물학적 활성 천연 산물(BNP) 또는 추가된 유전 물질로 인해 식물이 생산하는 활성을 가진 식물 혼입 보호제를 생산하는 미생물로 구성된 미생물살충제로 분류하였다(문헌[Gwinn K.D. (2018)]).

RejuAgro A, RejuAgro B 및 RejuAgro C로 지칭되는 화합물은 하기 예시된 바와 같이 각각 화학식 (I), (II) 및 (III)을 갖는 화합물에 상응한다:

(I),

(II) 및

(III).

제1 양상에서, 보호 대사산물의 생산을 향상시키기 위한 박테리아를 성장시키는 방법이 제공된다. 본 방법은 대안적 단계를 포함한다. 하나의 방법에서, 박테리아 발효물을 생산하기 위해 용기 내 액체 배지에서 슈도모나스 박테리아를 성장시키는 단계가 제공된다. 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:2 내지 1:10이고, 용기는 약 100 내지 250 RPM의 속도에서 교반된다. 대안적 단계에 따르면, 본 방법은 발효기의 액체 배지에서 슈도모나스 박테리아를 성장시켜 박테리아 발효물을 생산하는 단계를 포함한다. 발효기의 공기 유속은 약 1 내지 3 L/분이다. 일 양상에서, 본 방법은 일정 시간 후에 박테리아로부터 액체 배지를 분리하여 보호 대사산물을 포함하는 보호 상청액을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 제2 양상에서, 박테리아는 0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328로부터 선택되는 슈도모나스 균주를 포함한다. 제3 양상에서, 성장 온도는 약 10℃ 내지 35℃이다. 제4 양상에서, 액체 배지는 세포의 생산을 위한 LB/YME 배지이다. 제5 양상에서, 액체 배지는 RejuAgro A의 생산을 위한 YME 배지이다. 제6 양상에서, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:5 내지 1:10이다. 제7 양상에서, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:7 내지 1:9이다. 제8 양상에서, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:8이다. 제9 양상에서, 용기는 약 200 내지 250 RPM의 속도에서 교반된다. 제10 양상에서, 용기는 약 210 내지 230 RPM의 속도에서 교반된다. 제11 양상에서, 발효기의 공기 유속은 약 1.5 내지 2.5 L/분이고, 용존 산소의 농도는 5 mg/L 내지 12 mg/L이다. 제12 양상에서, 성장 온도는 약 10℃ 내지 20℃이다. 제13 양상에서, 성장 온도는 약 15℃ 내지 17℃이다. 제14 양상에서, 박테리아는 18시간 내지 7일의 기간 동안 성장된다. 제15 양상에서, 박테리아는 7일 동안 성장한다. 제16 양상에서, 박테리아는 1일 내지 2일 동안 성장한다.

제2 양상에서, 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 포함하는 농업용 조성물이 제공된다. 농업용 조성물은 제1 양상 및 제1 양상과 관련하여 개시된 임의의 형태의 방법에 따라 생산된다. 제1 양상에서, 농업용 조성물은 애주번트를 추가로 포함한다. 이와 관련하여 애주번트는 계면활성제이다.

제3 양상에서, 박테리아 및 진균 작물 질병을 방제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 다수의 단계를 포함한다. 제1 단계는 제1 양상 또는 이의 임의의 형태에 의해 생산된 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 포함하는 농업용 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 제2 단계는 상기 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함한다.

제1 양상에서, 작물 질병은 화상병, 감귤 궤양병, 올리브 혹병, 및 무름병, 토마토 및 고추로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제2 양상에서, 병원성 미생물은 미코스파에렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis), 보트리티스 시네리얼(Botrytis cinereal), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora ) (Ea), 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리(Xanthomonas axonopodis pv. citri) (Xac), 펙토박테리움 파르멘티에리(Pectobacterium parmentieri), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis), 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 디케야 다단티(Dickeya dadantii), 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi) (Psv), 슈도모나스 시린자에 pv. 토마토(Pseudomonas syringae pv. tomato), 슈도모나스 시린자에 pv 시린자에(Pseudomonas syringae pv syringae), 슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니(Xanthomonas campestris pv. pruni), 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스(Xanthomonas arboricola pv. juglandis), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 벤튜리아 이나에쿠알리스(Venturia inaequalis), 크산토모나스 오리자에 pv. 오리자에(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) 및 크산토모나스 시트리 pv. 시트리(Xanthomonas citri pv. citri)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제3 양상에서, 작물은 바나나, 사과, 배, 크랩애플(crabapple), 감귤, 감자, 호박, 양파, 벼, 아프리칸 바이올렛(African violet), 십자화과의 식물 종, 가지과, 당근, 감자, 토마토, 가지, 잎이 많은 채소, 호박속(squashe) 및 조롱박, 고추 및 피망을 포함하는 박과, 올리브, 올리브, 복숭아, 호두나무를 포함하는 핵과 및 이과 식물(stone and pome fruit plant) 중 하나 이상으로부터 선택된다.

제4 양상에서, 박테리아 작물 질병을 방제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 하나의 단계를 포함한다. A 단계는 약 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁹ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함하는 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함한다.

제1 양상에서, 슈도모나스 박테리아는 0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328로부터 선택되는 슈도모나스 균주이다. 제2 양상에서, 본 조성물은 약 5.0 x 10⁷ 내지 2.0 x 10⁸ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함한다. 제3 양상에서, 작물 질병은 흑시가토카(Black sigatoka), 잿빛진균병(Grey mould), 화상병(Fire blight), 감귤 궤양병(Citrus canker), 무름병(soft rot), 올리브 혹병(Olive knot), 토마토 박테리아 반점(Tomato bacterial speck), 박테리아 궤양병(Bacterial canker) 또는 도열병(blast) (핵과 및 이과(stone and pome fruit)), 조롱박의 각진잎무늬병(Angular leaf Spot of Cucurbits), 복숭아의 박테리아 반점(Bacterial Spot of Peach), 토마토 박테리아 반점(Tomato bacterial spot), 호두나무 마름병(walnut blight), 박테리아 시들음병(bacterial wilt), 토마토 궤양병(Tomato canker), 감자 잎마름병(Potato late blight), 사과 부패병(apple scab), 박테리아 잎마름병(bacterial leaf blight), 및 박테리아 잎줄기병(bacterial leaf streak)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제4 양상에서, 병원성 미생물은 미코스파에렐라 피지엔시스, 보트리티스 시네리얼, 에르위니아 아밀로보라 (Ea), 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 (Xac), 펙토박테리움 파르멘티에리, 펙토박테리움 아트로셉티쿰, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸, 디케야 다단티, 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이 (Psv), 슈도모나스 시린자에 pv. 토마토, 슈도모나스 시린자에 pv 시린자에, 슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아, 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스, 랄스토니아 솔라나세아룸, 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스, 파이토프토라 인페스탄스, 벤튜리아 이나에쿠알리스, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리자에, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라, 및 크산토모나스 시트리 pv. 시트리로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제5 양상에서, 작물은 바나나, 사과, 배, 크랩애플, 감귤, 감자, 호박, 양파, 벼, 아프리칸 바이올렛, 십자화과의 식물 종, 가지과, 당근, 감자, 토마토, 가지, 잎이 많은 채소, 호박속 및 조롱박, 고추 및 피망을 포함하는 박과, 올리브, 올리브, 복숭아, 호두나무를 포함하는 핵과 및 이과 식물 중 하나 이상으로부터 선택된다.

제5 양상에서, 슈도모나스 박테리아로부터 보호 대사산물을 정제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 다수의 단계를 포함한다. A 제1 단계는 제1 양상 및 이의 형태의 방법에 의해 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 생산하는 단계를 포함한다. 제2 단계는 에틸 아세테이트 추출에 의해 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 추출하는 단계를 포함한다. 제3 단계는 예를 들어, 50% 헥산 및 50% 에틸 아세테이트의 혼합물과 같은 헥산 및 에틸 아세테이트의 혼합물을 사용하여 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 용출하거나 예를 들어, 25% 헥산 및 75% 에틸 아세테이트의 혼합물과 같은 헥산 및 에틸 아세테이트의 혼합물을 사용하여 에틸 아세테이트 추출물을 용출함으로써 보호 대사산물을 포함하는 용출물을 생산하는 단계를 포함한다.

제1 양상에서, 슈도모나스 박테리아는 0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328로부터 선택되는 슈도모나스 균주이다.

제6 양상에서, 제5 양상 및 이의 형태의 방법에 의해 정제된 슈도모나스 박테리아로부터의 보호 대사산물을 포함하는 농업용 조성물.

제7 양상에서, 박테리아 작물 질병을 방제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 다수의 단계를 포함한다. 제1 단계는 제5 양상 또는 이의 임의의 양상의 방법에 의해 정제된 슈도모나스 박테리아로부터의 보호 대사산물을 포함하는 농업용 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 제2 단계는 상기 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함한다.

제1 양상에서, 작물 질병은 화상병, 감귤 궤양병, 올리브 혹병, 무름병, 토마토 및 고추으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제2 양상에서, 병원성 미생물은 미코스파에렐라 피지엔시스, 보트리티스 시네리얼, 에르위니아 아밀로보라 (Ea) (특히 스트렙토마이신-내성 E. 아밀로보라 균주), 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 (Xac), 펙토박테리움 파르멘티에리, 펙토박테리움 아트로셉티쿰, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸, 디케야 다단티, 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이 (Psv), 슈도모나스 시린자에 pv. 토마토, 슈도모나스 시린자에 pv 시린자에, 슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아, 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스, 랄스토니아 솔라나세아룸, 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스, 파이토프토라 인페스탄스, 벤튜리아 이나에쿠알리스, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리자에, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라, 및 크산토모나스 시트리 pv. 시트리로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제3 양상에서, 병원성 E. 아밀로보라는 스트렙토마이신-내성 E. 아밀로보라이다. 제4 양상에서, 작물은 바나나, 사과, 배, 크랩애플, 감귤, 감자, 호박, 양파, 벼, 아프리칸 바이올렛, 십자화과의 식물 종, 가지과, 당근, 감자, 토마토, 가지, 잎이 많은 채소, 호박속 및 조롱박, 고추 및 피망을 포함하는 박과, 올리브, 올리브, 복숭아, 호두나무를 포함하는 핵과 및 이과 식물 중 하나 이상으로부터 선택된다. 제5 양상에서, 병원성 박테리아는 플라보박테리움 컬럼나레 #2, 플라보박테리움 컬럼나레 MS-FC-4이다. 제6 양상에서, 병원성 박테리아는 E. 콜라이 O157:H7이다.

제8 양상에서, 다음 구조 중 하나로부터 선택되는 결정질 화합물:

화학식 (I),

화학식 (II), 및

화학식 (III).

제1 양상에서, 결정질 화합물은 다음 구조이고:

화학식 (I),

결정질 화합물은 표 13 내지 표 22로부터 선택되는 적어도 하나의 물리적 특성을 포함한다.

제2 양상에서, 결정질 화합물은 다음 구조이고:

화학식 (II),

결정질 화합물은 표 23 내지 표 29로부터 선택되는 적어도 하나의 물리적 특성을 포함한다.

제3 양상에서, 결정질 화합물은 다음 구조이고:

화학식 (III),

결정질 화합물은 표 30 내지 표 37로부터 선택되는 적어도 하나의 물리적 특성을 포함한다.

생물기탁정보

박테리아 균주 슈도모나스 솔라이 0617-T307, 슈도모나스 솔라이 0917-T305, 슈도모나스 솔라이 0917-T306, 슈도모나스 솔라이 0917-T307, 슈도모나스 모셀리 0118-T319, 슈도모나스 모셀리 0318-T327, 및 슈도모나스 모셀리 0418-T328이 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 제출되었다(ATCC®, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110 USA ("ATCC Patent Depository" on June 25, 2020, 각각 비공식 ATCC 특허 번호 PTA-126796, PTA-126797, PTA-126798, PTA-126799, PTA-126800, PTA-126801, 및 PTA-126802가 부여됨). 생존율 시험 후, ATCC 특허 기탁소는 2020년 6월 25일로 인정된 다음 수탁번호를 기탁된 박테리아 균주에 부여하였다: 슈도모나스 솔라이 0617-T307 (수탁번호 PTA-126796), 슈도모나스 솔라이 0917-T305 (수탁번호 PTA-126797), 슈도모나스 솔라이 0917-T306 (수탁번호 PTA-126798), 슈도모나스 솔라이 0917-T307 (수탁번호 PTA-126799), 슈도모나스 모셀리 0118-T319 (수탁번호 PTA-126800), 슈도모나스 모셀리 0318-T327 (수탁번호 PTA-126801), 및 슈도모나스 모셀리 0418-T328 (수탁번호 PTA-126802).

실시예

실시예 1. 균주 0617-T307의 확인 및 특성화.

16S rDNA, gyrB, rpoB 및 rpoD의 부분 서열을 분석하였다. 이 4개의 유전자는 슈도모나스 종의 다중 유전자좌위 서열 분석(MLSA)에 권장되는 마커이다(문헌[Peix et al. (2018)]).

종 할당을 위해, 이들 4개의 서열을 사용하여 NCBI 비중복 뉴클레오타이드 데이터베이스에 대해 BLASTN을 실행하였다. 그 결과 균주 0617-T307은 P. 플루오레센스 계통 내 P. 푸티다 그룹의 슈도모나스 종과 매우 밀접하였다. (문헌[Peix et al. (2018); Peix et al. (2018)]의 도 2 및 표 2 참조)의 "MLSA 계통 발생" 및 "슈도모나스 종 유형 균주의 게놈 목록"을 분류군 샘플링을 위한 지침로 사용했다(도 1). 이 정보를 바탕으로 GenBank에서 게놈을 얻었다. 고특질 게놈 어셈블리를 가진 P. 푸티다 그룹의 모든 종을 포함시켰다. 0617-T307은 P. 솔라이와 가장 높은 rpoD(즉, 슈도모나스 종 할당에 대한 가장 높은 분해력을 가진 유전자) 서열 유사성을 가지고 있기 때문에 P. 솔라이의 4개의 이용 가능한 게놈이 모두 샘플링에 포함되었다(P. 솔라이의 유형 균주 포함, LMG 27941^T). P. 플루오레센스 계통의 다른 종의 경우 각 그룹의 대표 종으로 한 종을 선택하였다. P. 아에루기노사(P. aeruginosa) (P. 아에루기노사 그룹; P. 아에루기노사 계통)를 나무를 뿌리 내리게 하기 위한 외집단으로 포함시켰다.

MLSA에 대한 4개의 유전자를 샘플링된 게놈으로부터 추출하였다. 각 유전자를 개별적으로 정렬한 다음 계통 발생 분석을 위해 4개의 뉴클레오타이드 정렬을 모두 연결했다. 연결된 정렬에는 9,912개의 정렬된 뉴클레오타이드 부위가 포함되어 있다. 최대 우도 추론을 PhyML을 사용하여 수행하였다(문헌[Guindon et al. (2003)]). 부트스트랩 지원을 1,000회 이중반복 실험으로 평가하였다.

다중 위치 분자 계통발생수(도 1)에 기반하여, 이용가능한 게놈 서열을 갖는 0617-T307 및 모든 4개의 P. 솔라이 균주는 100% 부트스트랩 지원을 갖는 단일계통 분기군을 형성한다. 이 결과는 0617-T307을 P. 솔라이에 할당하는데 강력한 지원을 제공했으며, 이 유형 균주는 Spai 시에라 네바다 국립공원의 토양 샘플에서 단리된 것으로 보고되었다(문헌[Pascual et al. (2014)]).

또한, Garcia-Valdes 및 Lalucat(문헌[Garcia-Valdes et al. (2016)])에 의해 제공된 슈도모나스 종 할당에 대한 지침에 기반하여, 0617-T307을 P. 솔라이에 할당하기 위한 추가 지원은 다음을 포함한다: (a) 16S rDNA > 98.7 내지 99% 일치. P. 솔라이의 유형 균주와 비교하여 0617-T307은 99.2% 서열 동일성을 공유했다. 자매 종인 P. 엔토모필라(P. entomophila)와 비교하여 0617-T307은 99.5% 서열 동일성을 공유했다. 16S rDNA는 슈도모나스에서 종 확인을 위한 충분한 분해력이 부족한 것으로 알려져 있다(문헌[Garcia-Valdes et al. (2016); Peix et al. (2018)]); (b) rpoD 유전자 > 95 내지 96% 동일. P. 솔라이의 유형 균주와 비교하여, 0617-T307은 96.5%의 서열 동일성을 공유했다. 자매 종인 P. 엔토모필라와 비교할 때, 0617-T307은 단지 89.1%의 서열 동일성을 공유했다; (c) MLSA > 97% 동일. P. 솔라이의 유형 균주와 비교하여, 0617-T307은 98.0%의 서열 동일성을 공유하였다. 자매 종인 P. 엔토모필라와 비교하여 0617-T307은 단지 95.1%의 서열 동일성을 공유하였다.

실시예 2. 균주 0617-T307의 세포 배양액의 에틸 아세테이트 추출물로부터의 RejuAgro A 및 RejuAgro B의 제조, 단리 및 특성화.

RejuAgro A 및 B의 제조를 발효기 발효로부터의 세포 배양액의 에틸 아세테이트 추출 후 크로마토그래피 단리 및 정제에 의해 획득할 수 있다. 간단히 말해서, 스톡 박테리아 슈도모나스 종 0617-T307을 LB 플레이트(트립톤, 10g/L; 효모 추출물, 5g/L; NaCl, 10g/L; 한천, 15g/L; 물)에 플레이팅하고 28℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 성장시켰다. 시드 배지의 제조를 위해, 0617-T307의 단일 콜로니를 500mL 오토클레이브에 배치된 YME 배지(효모 추출물, 4g/L; 글루코스 4g/L 및 맥아 추출물 10g/L)를 포함하는 2.0L 플라스크에 접종하고 200 rpm의 교반 속도로 24시간 동안 28℃에서 성장시켰다. 이어서 시드 배지를 12L 오토클레이브에 배치된 YME 배지를 포함하는 20L NBS 발효기에 접종하였다. 발효를 16℃에서 1 내지 7일간 진행하였다. 교반속도는 200rpm, 풍량은 2L/분으로 하였다.

수확 후, 박테리아 배양물을 에틸 아세테이트로 4회 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고 황산나트륨을 사용하여 탈수하고 35℃에서 회전 증발로 건조하였다. 이는 균주 0617-T307의 12L 배양물로부터 2.9g 미정제 추출물을 생산하였다.

농축된 샘플을 에틸아세테이트에 용해시키고 실리카겔과 혼합하여 주입 컬럼(φ3.0 X 20 cm)으로 충진하고 UV 감지기가 장착된 플래쉬 크로마토그래피 시스템(Yamazen AI-580) 상의 실리카겔 유니버설 컬럼(4.8 x 18.5 cm) 위에 장착하였다. 샘플을 부가한 후, 극성이 증가하는 순서로 다음 용매 100% 헥산, 75% 헥산/25% 에틸 아세테이트, 50% 헥산/50% 에틸 아세테이트, 25% 헥산/75% 에틸 아세테이트, 100% 에틸 아세테이트, 50% 에틸 아세테이트/50% 아세톤, 100% 아세톤 및 100% 메탄올 280 mL 각각에 의해 샘플을 용출시켰다. 샘플을 20 mL/분의 유속으로 용출시켰다. UV 254 nm에서 용출물을 모니터링하고 분획을 20 mL/튜브에서 시간 모드로 수집했다. 플래시 크로마토그래피에서 총 114개의 분획 또는 튜브를 생산하였다.

생산된 분획을 후속 플레이트 분석에 적용하였다. 각 분획 1mL를 1.5mL 시험 튜브에 집어넣고 Eppendorf 진공 농축기로 진공 건조했다. 건조된 샘플을 50 μL DMSO에 용해시키고, 이 중 2 μL를 플레이트 분석에 사용하였다. 간단히 말해서, 에르위니아 아밀로보라 273을 LB 플레이트에 플레이팅하여 28℃ 인큐베이터에서 성장시키고 24시간 후에 얻은 단일 콜로니를 5mL LB 배지에 접종하여 28℃ 교반기(shaker)에서 200rpm으로 밤새 성장하도록 했다. 박테리아를 멸균수에 1:100으로 희석하고 그 중 225μL를 50% LB 플레이트(트립톤, 5.0g/L; 효모 추출물, 2.5g/L; NaCl, 5.0g/L, 한천, 15g/L)에 플레이팅했다. 생물안전 캐비닛에서 10분 동안 건조시킨 후, 각 분획의 DMSO 용액을 미리 표지된 페트리 접시의 부분에 분배하고 추가로 10분 동안 건조되도록 두었다. 분석과 함께 DMSO와 카수가마이신을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했다. 그런 다음 플레이트를 28℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하고 억제 영역을 하루 후에 확인했다.

114개 분획에 대한 시험관내 플레이트 분석은 E. 아밀로보라 273의 성장을 억제하는 2개 분획을 나타내었다. 특히, 50% 헥산/50% 에틸 아세테이트에 의해 용출된 분획/튜브 38 내지 40(T3840 또는 플래시-RejuAgro A로 약칭함)은 추가 시험에서 유망할 수 있는 상대적으로 큰 제거 영역을 나타내었다. 이 분석에서 다른 생물활성 화합물은 분획 50 내지 52(T5052로 코딩됨)에 있었다. 이들 분획을 25% 헥산/75% 에틸 아세테이트에 의해 용출하였다.

분획 3840 및 5054의 분취 HPLC(Prep-HPLC) 정제에 의해 각각 15mg의 황색 화합물 RejuAgro A(Rt17.5) 및 103.3mg의 암녹색 화합물 RejuAgro B를 확인하였다. RejuAgro A는 메탄올과 클로로포름에 용해시킬 수 있다. RejuAgro B(Rt10.5)는 메탄올이나 클로로포름에는 잘 용해되지 않으나 암녹색의 디메틸 술폭사이드(DMSO)에는 아주 잘 용해된다. 두 화합물의 구조를 고분해력 질량 분석법(HR-MS), 적외선(IR), 자외선(UV), 1D 및 2D 핵 자기 공명(NMR) 및 X선 결정 구조 분석으로 조사하였다. 이 두 화합물은 구조적으로 유사하며 화합물 RejuAgro A는 7가지 유형의 탄소기(3가지 유형의 카보닐, 2가지 유형의 3차 탄소, 2가지 유형의 메틸 탄소)을 포함하지만 RejuAgro B는 1가지 유형의 메틸기가 부재하며, 이는 하기에 제시된 바와 같다:

RejuAgro A 및

RejuAgro B.

실온에서 클로로포름 용액을 천천히 증발시켜 RejuAgro A 결정을 추가로 얻었다. 결정을 주황색 정제로 확인하였다. 데이터 세트를 Cu(Kα) 선을 사용하는 Oxford SuperNova 회절계로 100K에서 수집하였다. 분자는 S-Me(메틸) 기가 헤테로사이클에 대해 단지 8.7° 회전된 평면 구조를 나타낸다. C4-C5 결합(1.531Å)에서 분자의 π-컨쥬게이트가 분명하게 절단되어 있으며, 이는 명확하게 몇 가지 궤도상의 이유 때문이다. sp² 탄소 원자에 연결된 Me-기가 2개 위치에 걸쳐 불규칙하게 회전된다. 결정의 분자는 N-H…O 상호작용을 통해 중심 대칭 H 결합 이량체를 형성한다. 또한, 이러한 이량체는 보다 더 약한 C-H…O 상호작용을 통해 [-3 0 1] 평면을 따라 2차원 층을 형성한다. RejuAgro A 분자는 6원 헤테로사이클 [-NH-C(=O)-C(-SMe)=C(-Me)-C(=O)-C(=O)-]를 나타낸다. RejuAgro B의 결정은 3차인 것으로 확인되었다. RejuAgro B의 구조는 두 개의 대칭적으로 독립적인 분자를 포함한다. 각 분자는 70.3°와 80.6°의 연결된 헤테로사이클의 평균 평면 사이의 2면각을 갖는 꼬인 구조를 가지고 있다. 2개의 인접한 카보닐기 사이의 C(sp²)-C(sp²) 결합에서 각 헤테로사이클에서 π-컨쥬게이트가 분명하게 절단되어 있으며(결합 길이는 1.534 내지 1.539Å 범위임), 이는 분명히 몇 가지 궤도상의 이유 때문이다. 결정의 분자는 N-H…O 상호작용을 통해 중심 대칭 H 결합 이량체를 형성한다. 이 이량체는 다른 N-H…O 상호작용에 의해 x 방향을 따라 적층으로 연결된다. 마지막으로 적층은 제3 유형의 N-H…O 상호작용에 의해 [0 1 1]을 따라 층으로 연결된다. 결정 성장을 위해 RejuAgro B 용액을 사용한 경우, 2개의 결정을 얻었고 RejuAgro B 및 RejuAgro C로 명명하였다. RejuAgro B 및 RejuAgro C 둘 모두의 결정은 매우 유사한 분자량을 갖는다(실시예 20 참조).

RejuAgro A, RejuAgro B 및 RejuAgro C의 결정 구조 정보는 실시예 20에 제시되어 있으며, 그 내용은 본 출원의 일부를 구성하고 그 전문이 참조로 포함된다.

RejuAgro A의 분자식은 C₇H₇NO₃S이고 분자량은 185.2004이다. 이는 HR-MS 데이터에서 [M+H] m/z 186.2177(이론 값 186.2083)에서 관찰된 분자 종과 일치한다. RejuAgro B의 분자식은 C₁₂H₈N₂O₆S이고 분자량은 276.2017이다. 이는 HR-MS 데이터에서 [M-H] m/z 275.0278(이론 값 275.1960)에서 관찰된 분자 종과 일치한다. 2020년 8월 4일자 CCDC 구조 데이터베이스 검색 결과 RejuAgro A, RejuAgro B 및 RejuAgro C의 결정 구조가 없는 것으로 나타난다. SciFinder, Reaxys 및 Google 특허와 같은 기타 화학 데이터베이스 및 특허 관련 데이터베이스 검색은 문헌[SciFinder and Reaxys(Knackmuss et al. (1968)]에서 RejuAgro B에 대한 하나의 참조를 제외하고 RejuAgro A 또는 RejuAgro C의 유사체가 없는 것으로 나타난다.

실시예 3. 균주 0617-T307로부터의 RejuAgro A 및 RejuAgro B의 시험관내 항균 활성

RejuAgro A 및 RejuAgro B의 MIC 값을 야생형 그람 음성 식물 병원성 박테리아, 스트렙토마이신 내성 E. 아밀로보라, 어류 질병 유발 박테리아, 그람 양성 및 그람 음성 인간 병원성 박테리아 및 RejuAgro A 생산체(균주 0617-T307)의 5가지 유형의 박테리아에 대해 결정하였다. 항균 분석을 CLSI 항균 감응성 시험(AST) 표준에 따라 수행하였다. 간략하게, 시험된 각 박테리아의 스톡을 LB(Luria-Bertani) 플레이트(트립톤, 10g/L; 효모 추출물, 5g/L; 나트륨염, 10g/L; 한천, 15g/L)에 플레이팅했다. 특수배양시 NA(영양 배양액+한천) 플레이트 (소고기 추출물, 3 g/L, 효모 추출물, 1 g/L, 폴리펩톤, 5 g/L, 수크로스, 10 g/L, 및 한천 15 g/L)를 Xac에 사용하였다. SHIEH (트립톤, 5 g/L; 효모 추출물, 0.5 g/L; 아세트산나트륨, 0.01 g/L; BaCl₂(H₂O)₂, 0.01 g/L; K₂HPO₄, 0.1 g/L; KH₂PO₄, 0.05 g/L; MgSO₄·7H₂O, 0.3 g/L; CaCl₂·2H₂O, 0.0067 g/L; FeSO₄·7H₂O, 0.001 g/L; NaHCO₃, 0.05 g/L; 한천, 10 g/L) 및 TYES (트립톤 4 g/L; 효모 추출물 0.4 g/L; MgSO4, 0.5 g/L; CaCl₂ 0.5 g/L; pH 7.2, 한천, 15 g/L)를 각각 플라보박테리움 컬럼나레 균주 MS-FC-4 및 #2에 대해 사용하였다. 그 후, 플레이트로부터의 단일 콜로니를 발췌하고 상응하는 액체 배지에 접종하여 밤새 성장시켰다. 배양물을 LB 또는 상응하는 배지에서 OD₅₉₀=0.01로 희석하고, 96웰 플레이트에 200μL/웰로 분배하였다. 화합물 RejuAgro A 및 RejuAgro B 및 스트렙토마이신을 희석하고 각 웰에 각 농도의 4 μL를 첨가하여 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2.5 μg/mL, 1.25 μg/mL, 0.625 μg/mL, 0.3125 μg/mL, 0.15625 μg/mL, 0.078 μg/mL의 최종 농도를 만들었다. 비히클 물(스트렙토마이신) 또는 DMSO(RejuAgro A 및 RejuAgro B)를 대조군으로 사용했다.

분석 결과는 RejuAgro B보다는 RejuAgro A가 균주 0617-T307의 가장 활성이 높은 대사산물임을 보여주었다. 그람 양성 MRSA(MIC>40μg/mL) 및 그람 음성 E. 콜라이 O157:H7(인간에서 설사, 출혈성 대장염 및 용혈-요독 증후군(HUS)을 유발하는 주요 식중독 및 수인성 병원체)에 대한 효과와 비교할 때(MIC=40 μg/mL), RejuAgro A는 5 내지 40 μg/mL의 MIC 값으로 시험된 박테리아에 대해 특히 효율적이다. RejuAgro A의 항균 활성은 균주 에르위니아 아밀로보라 1189, 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리, 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이, 펙토박테리움 파르멘티에리 UPP163 936, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라실렌시스 944, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 wpp14 945, 디케야 다단티 3937에 대한 스트렙토마이신과 균등하였고, E. 아밀로보라에 대한 MIC 값은 5 μg/mL이며, 기타 연질 병원성 박테리아에 대해서는 20 내지 40 μg/mL인 것으로 나타났다. 크산토모나스 박테리아는 0.16 μg/mL의 MIC 값으로 스트렙토마이신에 매우 감응성이며, 이는 RejuAgro A의 MIC 값 5 μg/mL보다 더 낮은 것이다. 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 40 μg/mL이다. 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스 219에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 6.25μg/mL이다. 랄스토니아 솔라나세아룸 K60 및 Pss4에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 각각 3.13 및 6.25μg/mL이다. 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 NCPPB382, Cmm 0317, Cmm 0690에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 각각 6.25, 1.56 및 12.5μg/mL이다. 랄스토니아 솔라나세아룸 K60 및 Pss4에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 40μg/mL이다.

RejuAgro A를 또한 1개의 독성 E. 아밀로보라 균주 및 3개의 스트렙토마이신 내성 E. 아밀로보라 균주를 포함하는 다른 E. 아밀로보라 균주에 대해 시험하였다. RejuAgro A는 E. 아밀로보라 110(MIC 값 5μg/mL)에 대해 스트렙토마이신과 동일한 효능을 보였다. 그러나 RejuAgro A는 스트렙토마이신보다 E. 아밀로보라 1189에 대해 더 효율적이다. E. 아밀로보라 1189에 대한 RejuAgro A 및 스트렙토마이신의 MIC 값은 각각 5μg/mL 및 10μg/mL이다. 또한, 스트렙토마이신의 MIC 값(>40 μg/mL)보다 더 낮은 MIC 값(10 μg/mL)이 RejuAgro A에 대해 관찰되었으므로, RejuAgro A는 스트렙토마이신 내성 E. 아밀로보라 CA11, DM1 및 898에 대해 훨씬 더 효율적이다. 이러한 결과는 RejuAgro A가 E. 아밀로보라에 대한 시험에서 가장 강력한 화합물이며 스트렙토마이신을 대체할 잠재적인 후보임을 나타낸다. 스트렙토마이신 내성 균주에서 RejuAgro A에 대한 교차 내성의 징후는 없다.

어류 칼럼나리스(칼럼나리스) 질병 유발 플라보박테리움에 대한 영향에 대해, RejuAgro A는 플라보박테리움 컬럼나레 균주 MS-FC-4 및 #2(야생 어류 및 양식 어류에서 칼럼나리스 질병을 유발함)에 대해 MIC 값이 5 μg/mL로, 스트렙토마이신의 MIC 값(균주 #2 및 MS-FC-4에 대해 각각 0.31 μg/mL 및 1.25 μg/mL)보다 더 높다.

균주 0617-T307에 대한 RejuAgro A의 영향을 시험하였다. 슈도모나스 솔라이 0617-T307(RejuAgro A 생산체)에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 시험된 LB 배지에서 40 μg/mL보다 더 큰 것으로 나타났으며, 이는 균주 0617-T307이 적어도 자체 생산된 40 μg/mL RejuAgro A에서 생존하고 내성일 수 있음을 의미한다.

RejuAgro A를 토마토 병원체 (P. 시린자에. pv. 토마토 PT30, P. 시린자에. pv 시린자에 7046, P. 시린자에. pv. 라크리만스 1188-1) 및 기타 감귤 궤양병 병원체 (크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아 XV-16)에 대해 스트렙토마이신과 함께 시험하였다. P. 시린자에에 대한 RejuAgro A의 MIC 값은 40 μg/mL이고 스트렙토마이신의 MIC 값은 2.5 내지 5 μg/mL이다. X. 캄페스트리스 종의 경우 RejuAgro A의 MIC 값은 2.5 μg/mL 또는 40 μg/mL로 스트렙토마이신의 MIC 값인 20 μg/mL 이상 또는 40 μg/mL 이상보다 더 작다. 이는 슈도모나스 유발 토마토 병원체와 비교할 때 크산토모나스 캄페스트리스 병원체가 스트렙토마이신보다 RejuAgro A에 더 감응성인 것으로 나타났다.

RejuAgro A는 시험된 모든 병원성 진균에 대해 효능을 나타내었다(표 1). RejuAgro A를 파이토프토라 인페스탄스, 벤튜리아 이나에쿠알리스 및 미코스파에렐라 피지엔시스에 대해 시험하였다. RejuAgro A는 P. 인페스탄스 및 V. 이나에쿠알리스에 대해 40μg/mL, 80μg/mL 및 600μg/mL에서 100% 억제를 보였다(표 1).

RejuAgro A의 항균 효과 요약

균주 (관련 질병)	MIC (μg/mL)
	RejuAgro A	스트렙토마이신
에르위니아 아밀로보라 1189 (사과/배의 화상병)	5	20
에르위니아 아밀로보라 110a (사과/배의 화상병)	5	5
에르위니아 아밀로보라 CA11b (사과/배의 화상병)	10	>40
에르위니아 아밀로보라 DM1b (사과/배의 화상병)	10	>40
에르위니아 아밀로보라 898c (사과/배의 화상병)	10	>40
크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리-미아미 XC2002-00010 (감귤 궤양병)	5	0.16
크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 N40-SO5 (감귤 궤양병)	5	0.16
메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 USA300 (피부 감염, 패혈증)	>40	10
펙토박테리움 파르멘티에리 UPP163 936 (다수의 작물에서 무름병 유발)	40	40
펙토박테리움 아트로셉티쿰 942 (다수의 작물에서 무름병 유발)	20	20
펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스 944 (다수의 작물에서 무름병 유발)	40	40
펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸 wpp14 945 (다수의 작물에서 무름병 유발)	40	40
디케야 다단티 3937 (다수의 작물에서 무름병 유발)	40	20
슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이 (올리브 혹병)	40	0.31
E 콜라이 O157:H7 (식중독)	40	20
플라보박테리움 컬럼나레 #2 (어류 칼럼나리스 질병)	5	0.31
플라보박테리움 컬럼나레 MS-FC-4 (어류 칼럼나리스 질병)	5	1.25
슈도모나스 솔라이 0617-T307 (RejuAgro A 생산체)	>40	>40
슈도모나스 시린자에 pv. 토마토 PT30 (토마토 박테리아 반점)	40	2.5
슈도모나스 시린자에 pv 시린자에 7046 (박테리아 궤양병 또는 도열병 (핵과 및 이과))	20	2.5
슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스 1188-1 (조롱박의 각진잎무늬병)	10	5
크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니 (복숭아의 박테리아 반점)	40	>40
크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아 XV-16 (토마토 박테리아 반점)	2.5	20
크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스 219 (호두나무 마름병)	6.25	0.39
랄스토니아 솔라나세아룸 K60 (박테리아 시들음병)	3.13	12.5
랄스토니아 솔라나세아룸 Pss4 (박테리아 시들음병)	6.25	12.5
클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 NCPPB382 (토마토 궤양병)	6.25	12.5
클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 Cmm 0317 (토마토 궤양병)	1.56	3.12
클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 Cmm 0690 (토마토 궤양병)	12.5	12.5
파이토프토라 인페스탄스 Pi 1306 (감자 잎마름병)	40	NA
파이토프토라 인페스탄스 Pi 88069 (감자 잎마름병)	40	NA
벤튜리아 이나에쿠알리스 (사과 부패병)	80	NAe
미코스파에렐라 피지엔시스 10CR-25 (바나나의 흑시가토카)	600	NA

^a Ea110은 미시간 주에서 현장 시험에 사용된 악성 변종이다.^b CA11 및 DM1은 모두 획득한 플라스미드 pEa34에 트랜스포존이 있는 Tn5393을 포함하는 스트렙토마이신 내성 균주이며 100μg/mL 스트렙토마이신 포함 배지에서 성장할 수 있다.

^cEa898은 염색체 rpsL 유전자에 돌연변이가 있는 자발적인 스트렙토마이신 내성 균주이며 2000μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 배지에서 성장할 수 있다.

^d구리 내성 박테리아; ^e양성 대조군 1000μg/mL의 구리 용액은 성장의 61%를 억제한다.

실시예 4. 교반 플라스크 발효에서 균주 0617-T307로부터의 RejuAgro A의 생산 및 안정성.

RejuAgro A의 생산 및 제조를 위한 0617-T307의 발효는 교반 플라스크 발효 및 발효기 발효의 두 가지 접근법에 의해 얻어질 수 있다. 발효기 발효는 실시예 2에 기재되어 있다. 이 실시예에서 플라스크 발효는 아래와 같이 얻을 수 있다. 스톡 박테리아 슈도모나스 종 0617-T307을 YME 한천 플레이트(효모 추출물, 4g/L; 글루코스 4g/L 및 맥아 추출물 10g/L; 한천, 15g/L)에 플레이팅하고 28℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 성장시켰다. 시드 배지를 16℃ 및 220rpm에서 24시간 동안 50mL 멸균 YME 액체 배지를 포함하는 250mL 플라스크에서 0617-T307의 단일 콜로니를 성장시켜 제조하였다. 이어서 시드 배지를 0.5L 멸균 YME 배지를 포함하는 4L 플라스크에 4% 비율(v/v)로 접종하였다. 각각 2 L YME 배지를 포함하는 8개의 4-L 플라스크에 접종(2%, v/v)한 후, 박테리아를 1 내지 7일 동안 200 내지 220 rpm의 교반기에서 16℃에서 성장시켰다.

전개된 표준 곡선에 따라 LC-MS 분석에 의해 RejuAgro A 농도를 얻었다. LC-MS 분석을 위한 샘플 제조에는 두 가지 방법이 사용되었다. 한 가지 접근법은 에틸 아세테이트(1mL:1mL, 1분 동안 회전)로 세포 배양액을 추출하고 에틸 아세테이트 층을 원심분리 및 진공 건조하여 에틸 아세테이트 추출물을 얻는 것이다. 건조된 에틸 아세테이트 추출물을 40 μL 메탄올에 용해하고 2 μL 메탄올 용액을 LC-MS 분석에 사용했다. 또 다른 방법은 세포 배양액을 원심분리하여 상청액을 얻은 후 상청액을 동량의 메탄올과 혼합하여 50% 메탄올 용액을 만들고 10 μL 용액을 LC-MS에 주입하는 것이다. 제2 방법은 RejuAgro A 생산이 세포외 분비 과정이기 때문에 사용하였으며, 이는 세포 내부가 아닌 상청액에서 RejuAgro A가 다량 관찰됨으로써 입증되었다(도 3, 패널 A).

발효 7일 동안 RejuAgro A의 총 생산량은 1일째 최대 농도에 도달한 후 시간이 지남에 따라 감소하기 시작하였다(도 3, 패널 B). 교반 플라스크 발효에서 6시간마다 RejuAgro A의 생산 및 세포 농도에 대한 보다 상세한 연구를 수행하였다. RejuAgro A의 농도(RejuAgro A의 총량)는 18시간째에 최대값인 13.8 mg/L에 도달하고, 박테리아 세포의 농도는 12시간째에 최대값인 2x10¹¹ CFU/mL에 도달하는 것으로 나타났으며, 이는 RejuAgro A의 생산은 세포 성장 관련 생산 공정임을 나타낸다.

4-L 교반 플라스크에서 배지의 부피는 RejuAgro A의 생산에 영향을 미친다. YME 배지가 있는 4-L 플라스크에서, RejuAgro A의 생산은 500 mL 부피 크기에 대해서만 관찰되었고, 1.0 L 또는 1.5 L 부피 크기에 대해서는 관찰되지 않았다. 이 관찰은 RejuAgro A의 생산이 고도로 통기된 조건에서 유리하게 발생한다는 것을 나타낸다.

배지 유형 및 배양 온도는 RejuAgro A의 생산에 영향을 미친다. LB 배지를 16℃ 또는 28℃에서 YME 배지와 병행하여 시험하였다. RejuAgro A의 생산은 16℃에서 YME 배지에서 관찰되었으나 LB 배지에서는 관찰되지 않았다. 콜로니 형성 단위와 관련하여 균주 0617-T307은 16℃ 및 28℃의 LB 배지에서 잘 성장하고 28℃의 YME 배지에서 잘 성장한다. 이러한 결과는 RejuAgro A의 생산이 배지 특이적이고 온도 의존적이라는 것을 시사한다. 0617-T307의 산물에 대한 활성을 E. 아밀로보라에 대한 플레이트 분석으로 모니터링했으며, 이는 RejuAgro A의 생산과 일치한다.

RejuAgro A에 대한 생산 조건의 적용 가능성을 확인하기 위해, 10개의 다른 슈도모나스 균주를 슈도모나스 균주 0617-T307과 병행하여 동일한 조건에서 시험하였다. 하우스키핑 유전자 분석 결과 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307이 슈도모나스 솔라이로 확인되었고, 0118-T319, 0318-T327, 0418-T328이 슈도모나스 모셀리로 확인되었다. 두 슈도모나스의 유형 균주 솔라이 및 슈도모나스 모셀리가 보고된 바 있다(문헌[Daboussi et al. (2002); Pascual et al. (2014)]).

균주 0617-T307 및 이의 계통발생학적으로 밀접하게 관련된 종은 28℃ 및 220rpm에서 YME에서 RejuAgro A를 생산할 수 있음을 보여주었다. 이 결과는 이 방법이 RejuAgro A를 생산하는 균주 0617-T307 및 이와 밀접하게 관련된 일부 종에 대해 특이적임을 시사한다(표 2). RejuAgro A는 YME 배지에서 0617-T307을 16℃ 및 220rpm의 교반기에서 성장시켜 얻은 40시간 배양에 대해 LCMS로 시험한 바와 같이 실온에서 적어도 4주 동안 배양액에 존재하고 안정적일 수 있다.

16℃, 18시간, 220rpm에서 배지 YME에서 배양된 선택된 슈도모나스 균주에 대한 RejuAgro A 생산 기능의 요약.

균주 코드	상위 순위 분류군	RejuAgro A의 생산
0617-T307	슈도모나스 솔라이	예
0617-T318	슈도모나스 프로테겐스	아니요
0817-T317	슈도모나스 프로테겐스	아니요
0717-T327	슈도모나스 코레엔시스	아니요
0717-T314	슈도모나스 코레엔시스	아니요
0917-T305	슈도모나스 솔라이	예
0917-T306	슈도모나스 솔라이	예
0917-T307	슈도모나스 솔라이	예
0118-T319	슈도모나스 모셀리	예
0318-T327	슈도모나스 모셀리	예
0418-T328	슈도모나스 모셀리	예

실시예 5. 0617-T307 및 E. 아밀로보라에 대한 균주 0617-T307의 세포 배양액의 항균 활성.

0617-T307 세포 배양액 및 대사산물의 항균 시험을 위해 2가지 분석법을 사용하였다. 하나는 플레이트 확산 분석법이고 다른 하나는 마이크로플레이트 분석법이다. LB 플레이트를 E. 아밀로보라에 대한 RejuAgro A 포함 분획 및 세포 배양액의 항균 활성의 플레이트 확산 분석에 사용하였다(표 3). 0617-T307의 살아있는 세포를 포함하는 세포 배양액과 2 mg/mL의 현탁액을 포함하는 RejuAgro A 모두 E. 아밀로보라에 대한 항균 활성을 나타냈다. 그러나 세레나데®를 적용한 경우 억제 영역이 관찰되지 않았다.

LB 플레이트에서 E. 아밀로보라에 대한 0617-T307 세포 및 RejuAgro A의 활성

샘플	농도 (mg/mL)	억제 영역의 직경 (cm)
RejuAgro A	2	1.1
0617-T307 세포	NDa	0.8
RejuAgro B	2	0
세레나데	원 용액	0
스트렙토마이신	2	2.4
카수가마이신		1.3
DMSO		0

^a박테리아 세포의 농도는 결정되지 않았다.

0617-T307 세포와 활성 성분인 RejuAgro A로 구성된 생물방제 레시피를 찾기 위해 다음과 같은 실험을 수행했다. RejuAgro A를 포함하는 0617-T307의 40시간 세포 배양액의 상청액('상청액'으로 약칭함)을 생산체 0617-T307에 대한 항균 분석에 사용했다. 이것은 균주 0617-T307이 YME 배지보다는 LB 배지에서 상청액의 2배 희석에서 성장할 수 있음을 보여주었다. 추가 연구에 따르면 상청액의 억제 효과는 pH 값이 더 낮기 때문이다. 그러면 질문 1과 2는 pH를 6.5 내지 6.8로 조절하면 예로 나타날 수 있다.

생물활성 분획(미정제 추출물, 100μg/mL; 플래시-RejuAgro A, 20μg/mL; HPLC-RejuAgro A, 10μg/mL)을 균주 0617-T307, Ea 및 Xac에 대해 시험하였다. 생물 활성 분획이 균주 0617-T307의 성장을 억제할 수 없음을 보여주었으며, 이는 RejuAgro A가 생물방제제 제조를 위해 0617-T307 세포와 혼합될 수 있음을 나타낸다. RejuAgro A를 포함하는 생리활성 분획은 Ea 및 Xac에 대한 억제 효과를 나타냈고, 특히 플래시-RejuAgro A 및 HPLC-RejuAgro A는 시험 조건에서 Ea 및 Xac의 성장을 거의 억제하였다. 이것은 RejuAgro A 용액이 10 내지 20 μg/mL에서 화상병 및 감귤 궤양병의 생물방제에 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 6. 균주 0617-T307의 산성화된 상청액(pH 2.0)의 에틸 아세테이트 추출물로부터 생체활성 대사산물의 확인 및 특성화.

스톡 박테리아 슈도모나스 종 0617-T307을 LB 한천(트립톤, 10g/L; 효모 추출물, 5g/L; NaCl, 10g/L; 한천, 15g/L; 물) 플레이트에 접종하고 28℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 성장시켰다. 시드 배지를 제조하기 위해 0617-T307의 단일 콜로니를 500mL 오토클레이브 배치된 YME 배지(효모 추출물, 4g/L; 글루코스 4g/L 및 맥아 추출물 10g/L)에 접종하고 28℃에서 150rpm의 교반 속도에서 24시간 동안 성장시켰다. 그런 다음 시드 배지를 각각 2L 오토클레이브 배치된 YME 배지가 포함된 8개의 4L 플라스크에 접종했다. 발효를 16℃의 교반기에서 150rpm의 교반 속도로 7일간 진행하였다.

7일 성장 후, 박테리아 배양물을 4000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상청액을 얻었다. 상청액의 pH를 6N HCl을 첨가하여 2.0으로 조정하였다. 산성화된 상청액을 에틸 아세테이트 추출에 적용하였다. 이는 균주 0617-T307의 14L 배양물로부터 미정제 추출물 3.0g을 생산하였다.

농축된 샘플을 아세톤에 용해시키고 실리카겔과 혼합한 후 UV 검출기가 장착된 플래시 크로마토그래피 시스템(Yamazen AI-580)의 실리카겔 컬럼(φ3.0 X 20 cm)에 부가하였다. 샘플을 부가한 후, 극성이 증가하는 순서로 100% 헥산, 75% 헥산/25% 에틸 아세테이트, 50% 헥산/50% 에틸 아세테이트, 25% 헥산/75% 에틸 아세테이트, 100% 에틸 아세테이트, 50% 에틸 아세테이트 50% 아세톤, 100% 아세톤, 및 100% 메탄올 280 mL 각각에 의해 샘플을 용출시켰다. 샘플을 20 mL/분의 유속으로 용출시켰다. UV 254 nm에서 용출물을 모니터링하고 분획을 20 mL/튜브에서 시간 모드로 수집했다. 플래시 크로마토그래피에서 총 114개의 분획 또는 튜브를 생산하였다.

생산된 분획을 후속 플레이트 분석에 적용하였다. 각 분획 1mL를 1.5mL 시험 튜브에 집어넣고 Eppendorf 진공 농축기로 진공 건조했다. 건조된 샘플을 50 μL DMSO에 용해시키고, 이 중 2 μL를 플레이트 분석에 사용하였다. 간단히 말해서, 에르위니아 아밀로보라 273을 50% LB (트립톤, 5.0 g/L; 효모 추출물, 2.5 g/L; NaCl, 5.0 g/L) 플레이트에 접종하고, 단일 콜로니를 5 mL LB 배지에 접종한다. 박테리아를 멸균수에 1:100으로 희석하고 그 중 225μL를 50% LB 플레이트에 플레이팅했다. 생물안전 캐비닛에서 10분 동안 건조시킨 후, 각 분획의 DMSO 용액을 미리 표지된 페트리 접시의 부분에 분배하고 추가로 10분 동안 건조되도록 두었다. 분석과 함께 DMSO와 카수가마이신을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했다. 그런 다음 플레이트를 28℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하고 억제 영역을 하루 후에 확인했다.

114개 분획에 대한 시험관내 플레이트 분석은 E. 아밀로보라 273의 성장을 억제하는 3개 생물 활성 분획(T3234, T5058 및 T7882)을 나타내었다. 분획 3234 및 5258은 상대적으로 작은 제거 영역을 나타내었다. 분획 3234를 50% 헥산/50% 에틸 아세테이트에서 용출한다. 분획 5058을 25% 헥산/75% 에틸 아세테이트로 용출하였다. 음성 대조군의 경우 DMSO에는 억제 영역이 없었고 양성 대조군인 카수가마이신에는 억제 영역이 나타났다. 또 다른 플래시 분획 T7882를 아세톤/에틸 아세테이트(50%/50%)로 용출하였다. 이것은 E. 아밀로보라 활성의 성장도 억제했다.

추가 항-E. 아밀로보라 활성 유도 HPLC 단리 및 정제에 의해 T5058로부터 두 가지 항균 화합물(Rt22.9 및 Rt25.0)을 확인하고(화합물 화학식 0617_T307_5058_Rt22.9 및 0617_T307_5058_Rt25.0 참조), T7882로부터 하나의 항균 화합물 (Rt18.9)을 확인했다(화합물 화학식 0617_T307_7882_Rt18.9 참조). T307_5058_Rt22.9 및 T307_5058_Rt25.0은 트립토판 유래 천연물이며, 이의 구조는 Scifinder 데이터베이스에 보고되었지만 생물학적 활성은 보고되지 않았다(문헌[Loots et al. (2015)]). 0617_T307_7882_Rt18은 이전에 보고된(문헌[Osipov et al. (1978)]) 디푸릴의 유도체로 예측되었다. 이러한 천연 산물은 다음과 같다:

0617_T307_5258_Rt22.9,

0617_T307_5258_Rt25.0, 및

0617_T307_7882_Rt18.9.

실시예 7. LCMSMS 및 스펙트럼 라이브러리 검색을 사용한 균주 0617-T307로부터의 다른 대사산물의 확인.

pH가 조정되지 않은 세포 배양액 및 pH 조정된 세포 배양액(세포 배양액의 pH는 6N HCl에 의해 2.0으로 조정됨)의 미정제 추출물을 농축하고 내부 표준(m/z 311.08)을 포함하는 250μL 100% MeOH에 재현탁시키고, LC-MS/MS 분석에 사용하였다. LC 주입 부피: 5μL; LC 컬럼: Phenomenex C18 컬럼의 1.7μM C18, 100A, 50 X 2.1mm Kinetex, 12분 구배. Bruker Maxis Impact II의 5 내지 95% ACN. Bruker MaXis Impact II, UHR-QqTOF(Ultra-High Resolution Qq-Time-Of-Flight) 질량 분석기에서 데이터를 수집했다. 각각의 전체 MS 스캔 후 스펙트럼에서 가장 다량 존재하는 8개의 이온의 충돌 유도 해리(CID) 단편화를 사용하는 직렬 MS(MS/MS)를 수행하였다. 스캔 속도는 3Hz였다.

신규한 화합물과 확인된 화합물을 확인하기 위해 생물 정보학 분석 및 분자 네트워크 분석을 기반으로 정확한 스펙트럼 라이브러리 검색을 수행했다. 샘플의 MS/MS 스펙트럼을 다음 스펙트럼 라이브러리에 대해 검색하였다: 1) GNPS Community Library; 2) FDA Library; PhytoChemical Library; 3) NIH Clinical Collections; 4) NIH Natural　Products　 Library; 5) Pharamacologically Active NIH Small Molecule Repository; 6) Faulkner Legacy Library; 7) Pesticides; 8) Dereplicator Identified MS/MS Peptidic Natural　Products; 9) PNNL Lipids; 10) Massbank; 11) Massbank EU; 12) MoNA; 13) respect - Phytochemicals; 14) HMDB.

샘플의 MS/MS 스펙트럼을 위의 라이브러리에서 검색하고 참조 스펙트럼에 대한 오프셋과 정렬되도록 하였다. 일치 매개변수는 동일했다. 이러한 결과를 탐색하여 확인된 화합물의 구조적 유사체를 확인할 수 있다. 최소 클러스터 크기 = 2, 최소 에지 0.7 코사인, 6개의 최소 일치 피크로 생산된 MS/MS 분자 네트워크. 예를 들어, m/z 303.16의 신규한 분자 종은 활성 분획 0617-T307_5058_Rt25.0의 신규한 화합물에 상응하는 것으로 확인되었다. 식물 생장 촉진 인자인 인돌-3-카복실산과 크산톨리신 A(xantholysin A)를 포함하는 미정제 추출물에서 확인된 화합물 중 일부가 확인되었다. 1) P. 푸티다 BW11M1의 광범위한 항진균 활성은 주로 크산톨리신 생산에 좌우되고; 2) 크산톨리신은 군집 형성에 필요하며 생물막 형성에 관여하는 것으로 보고되었다(문헌[Li et al. (2013)]). 실제로, 0617-T307, 0418-T328 및 0318-T327을 28℃에서 배양함으로써 크산톨리신 A의 더 높은 농도가 관찰되었다. 따라서 생물활성 화합물인 RejuAgro A를 제외하고 크산톨리신 A는 생물방제 박테리아 0617-T307 및 이와 밀접하게 관련된 종 0318-T3027 및 0418-T328의 항균 활성에 대한 또 다른 관여 대사산물이다.

실시예 8. 균주 0617-T307 및 RejuAgro A를 생산하는 일부 밀접하게 관련된 종에 대한 온실 및 야외 감염 분석.

에르위니아 아밀로보라에 대한 0617-T307의 생물방제 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 위스콘신-밀워키 대학의 온실에서 크랩애플 나무에 대한 감염 분석을 수행하였다. 1.0 x 10⁸ cfu/mL를 포함하는 생물방제제(0617-T307, 0717-T327 및 0617-T318)를 여러 나무 그래프에서 꽃(만개할 때까지 80%)에 분무했다. 간략하게, 균주 0617-T307을 5mL LB 배지를 포함하는 26mL 유리관에서 밤새 성장시킨 후, 세포를 LB 배지에 접종(1:100)하고 교반기에서 28℃ 및 200rpm으로 14 내지 18시간 동안 성장시켰다. 세포를 수확하고 10x 물에 재현탁하여 10⁸ CFU/mL에 도달시켰다. 재현탁된 용액은 화상병 방제를 위한 온실 및 현장 분석에 사용할 수 있다. 대조군 꽃에 증류수를 뿌렸다. 이어서 모든 꽃에 E. 아밀로보라 균주 에르위니아 아밀로보라 273을 1.0 x 10⁶ cfu/mL를 분무하여 접종하였다. 0617-T307로의 처리를 2018년 9월 7일, 10월 9일 및 10월 19일에 3회 수행하였다. 표 4와 관련하여, 0617-T307(슈도모나스 솔라이)의 모든 분무 처리는 크랩애플 꽃에서 증류수의 0% 방제에 비해 꽃마름병 증상의 100% 방제를 제공했으며, 이는 0617-T307이 E. 아밀로보라에 의해 유발되는 화상병에 대한 유망한 생물방제제임을 시사한다. 다른 2종의 슈도모나스 종인 0717-T327(슈도모나스 코레엔시스) 및 0617-T318(슈도모나스 프로테겐스)의 방제율은 각각 16.7% 및 25%로 낮았다. 결론적으로 본 발명자들이 시험한 3가지 슈도모나스 종 중 0617-T307만이 크랩애플의 화상병에 대해 우수한 방제 효율을 보였다. 식물독성은 관찰되지 않았다.

온실 감염 분석의 요약

	2018년 9월 7일			2018년 10월 9일			2018년 10월 19일
생물방제제	처리 꽃의 수	감염된 꽃의 수	방제율 (%)	처리 꽃의 수	감염된 꽃의 수	방제율 (%)	처리 꽃의 수	감염된 꽃의 수	방제율 (%)
대조군	8	8	0	16	16	0	18	18	0
0617-T307	3	0	100	9	0	100	10	0	100
0717-T327	6	5	16.7
0617-T318	4	3	25

현장 분석을 위해, RejuAgro A를 생산하는 생물학적 대조군 박테리아(0617-T307, 0118-T319, 0318-T327, 0418-T328; 표 2 참조)를 2019년 5월 5일 및 5월 6일(40% 및 70% 사과 꽃 개화)에, 5x10⁸ CFU/mL 농도로 과수의 사과나무 꽃에 적용하였다. 박테리아 병원체 E. 아밀로보라 Ea110을 5x10⁶ CFU/mL의 농도로 5월 7일(90% 개화)에 접종하였다. 물 대조군, 스트렙토마이신, 0617-T307, 0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328에 대한 발병 꽃송이의 백분율은 각각 32.9%, 13.3%, 16.8%, 18.5%, 16.7%, 및 11.8%이다. 스트렙토마이신과 비교할 때, RejuAgro A를 생산하는 생물방제 박테리아는 사과 과수에서 화상병을 방제하는데 유사하거나 더 나은 효능을 보인다.

실시예 9. 벤튜리아 이나에쿠알리스에 대한 RejuAgro A 및 B 및 이의 생산체의 항진균 활성.

사과 부패병을 유발하는 진균 벤투리아 이나쿠알리스를 실온(약 24℃)의 암소에서 PDA 한천에서 유지시켰다. 분생포자와 균사체 현탁액의 혼합물(0.01 M PBS 중)을 PDA(감자 덱스트로스 한천)에서 수확했다. 10 μL의 분생포자와 균사체 현탁액을 생물방제 박테리아, RejuAgro A 또는 RejuAgro A 수정 플레이트에 적가하였다. 대조군은 생물방제 박테리아 또는 RejuAgro A 또는 B가 첨가되지 않은 PDA 플레이트였다. 접시를 암소에서 실온에서 인큐베이션하고 V. 이나쿠알리스의 각 콜로니의 직경을 7일 후에 확인하였다.

대조군(도 4)과 비교할 때, 선택된 4개의 생물방제 박테리아 균주 0617-T307, 0118-T319, 0318-T327 및 0418-T328은 PDA 플레이트에서 V. 이나에쿠알리스의 성장을 억제할 수 있고(도 5); RejuAgro A는 40 내지 80 μg/mL에서 PDA 플레이트에서 V. 이나에쿠알리스의 성장을 억제할 수 있으나(도 6); V. 이나에쿠알리스의 성장에 대한 RejuAgro B의 억제 효과는 10 내지 80 μg/mL에서 PDA 플레이트에서 관찰되지 않았다(도 7). 마지막으로, V. 이나에쿠알리스의 억제는 200 내지 1000 μg/mL 황산구리를 포함하는 PDA 플레이트에서 관찰되지 않았다(도 8).

실시예 10. 슈도모나스 종에 의한 RejuAgro A의 생산.

RejuAgro A의 양을 24시간 후 배양액에 대해 HPLC-MS에 의해 분석하였다. 16℃ 및 220rpm 교반에서 500mL YME 배지를 포함하는 4L 플라스크에서 발효. HPLC 피크 면적과 RejuAgro A의 양과의 관계를 알아보기 위해 양-피크 면적 곡선을 작성하였다(도 9). 분석 방법: 1) 25mL 세포 배양액을 25mL 에틸 아세테이트로 추출하고; 2) 5mL 에틸 아세테이트 추출물을 건조시키고 0.1mL 메탄올에 용해시키고; 3) 4 μL를 HPLC-MS에 주입하였다.

7종의 박테리아 (0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 0917-T307, 0118-T319, 0318-T327, 0418-T328)를 RejuAgro A의 생산에 대해 평가하고, 시드 배지를 16℃, 220rpm에서 24시간 동안 YME 배지에서 박테리아를 성장시킴으로써 제조하였다. HPLC 분석 결과 7종의 박테리아 모두 RejuAgro A를 생산하는 것으로 나타났다(도 10).

실시예 11. RejuAgro A의 제형 및 온실 분석

RejuAgro A의 제형(용액, SL; 표 5 참조). 꽃에 적용하기 전에 10 μg/mL를 완화제로 1% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 4000과 탱크에 혼합했다. 이후 시험에서는 완화제로서 0.03%의 폴리비닐 알코올(PVA)이 꽃을 더 잘 보호하는 것으로 나타났다. 효능을 증가시키기 위해 계면활성제인 Alligare 90을 첨가할 수 있다(표 6).

RejuAgro-A 1% SL의 제형 ^a

성분	비율(%,w/w)	그램	설명
RejuAgro-A	1	5	활성 성분
Alligare 90 (폴리(알킬 EO/PO) 등)	10	50	습윤 & 분산제
에틸렌글리콜/프로필렌글리콜	5	25	동결방지제
PVA	30	150	안전제
물	균형량 (100%까지 첨가)	270	담체
합계	100	500

^aRejuAgro A 제형의 1% 용액(SL)

에르위니아 아밀로보라에 대한 RejuAgro A의 생물방제 활성을 평가하기 위해, 위스콘신-밀워키 대학에서 크랩애플 나무에 대한 온실 감염 분석을 수행하였다. 1% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 4000으로 10μg/mL를 보충하거나 1% PEG4000(음성 대조군)을 접종 3시간 전과 접종 24시간 후에 활짝 핀 나무 꽃에 적용했다. 물에 재현탁된 약 10⁸ CFU/mL의 E. 아밀로보라 110 균주를 접종원으로 사용했다. 감염율을 접종 후 약 6일째에 계산하였다. 실험을 2020년 1월 24일 내지 1월 31일까지의 한 주 동안 수행하였다. RejuAgro A는 꽃마름병을 효과적으로 억제할 수 있다(표 6).

1% PEG 4000을 포함하는 RejuAgro A의 꽃 마름병 분석

처리	감염율
1% PEG4000 (음성 대조군)	50.8%
1% PEG4000 10mg/mL의 RejuAgro A	12.3%
스트렙토마이신 200mg/mL	5.7%

실시예 12. 보트리티스 시네레아 CA17에 대한 0617-T307 세포 배지의 항진균 활성.

균주 0617-T307의 종자를 YME 배지에서 28℃ 및 180rpm에서 24시간 동안 박테리아 세포를 성장시켜 제조하였다. 그런 다음 4%(2mL 내지 50mL)를 50mL M8(IAA 배지) 또는 M9(CN 배지) 또는 M7(PRN 배지) 또는 M6(DAPG 배지) 배지가 포함된 250mL 플라스크에 접종하고 28℃ 및 180rpm에서 48시간 동안 성장시켰다. 세포 배양액 0.5mL 부피를 12시간과 24시간째에 수집하여 -20℃ 냉동고에 보관했다. 항진균 분석을 위해, 세포 배양액을 해동하고 보트리티스 시네레아로 접종된 중심에 대해 동일한 반경 거리를 갖는 PDA(감자 글루코스 한천) 플레이트의 샘플 웰에 5μL를 적용했다(도 11). 세포 배양액은 PDA(감자 덱스트로스 한천) 플레이트에서 보트리티스 시네레아 CA17에 대해 항진균 활성을 갖는 것으로 나타났다.

실시예 13. 미정제 추출물, RejuAgro A 및 RejuAgro B의 식물 병원성 박테리아에 대한 항균 활성.

박테리아 0917-T305, 0318-T327 및 0418-T328의 대사산물은 R. 솔라나세아룸, C. 미치가넨시스 아종 미치가넨시스, 및 X. 아르보리콜라 pv. 유글란디스에 대해 우수한 효능을 나타내었다(표 7). 박테리아 0917-T305, 0318-T327 및 0418-T328을 YME 배지에서 16 및 28 ℃에서 성장시켰다. 0917-T305, 0318-T327 및 0418-T328의 천연물 추출물을 5mg/mL로 제조하고 세 가지 다른 식물 병원체: 랄스토니아 솔라나세아룸, 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 및 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스에 대해 플레이트 확산 분석에 의해 시험하였다. 한천 플레이트 확산 분석에서, 16℃ 및 28℃에서 YME에서 성장한 박테리아 0917-T305, 0318-T327 및 0418-T328의 대사산물은 시험된 R. 솔라나세아룸, C. 미치가넨시스 아종 미치가넨시스, 및 X. 아르보리콜라 pv. 유글란디스에 대해 상대적으로 우수한 효능을 나타내었다(표 7). 이는 RejuAgro A와 함께 다른 대사산물도 랄스토니아 솔라나세아룸, 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 및 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스에 대해 우수한 효능을 나타냄을 보여준다. RejuAgro B는 랄스토니아 솔라나세아룸에 대해 우수한 효능을 보였다(표 7).

플레이트 분석에서 선택된 병원성 박테리아에 대한 박테리아 미정제 추출물의 효과

농도(mg/mL)	박테리아 균주 & 화합물	배지 및 온도	X. 아르보리콜라 pv. 유글란디스		R. 솔라나세아룸			C. 미치가넨시스 아종 미치가넨시스
			Xaj219	Xaj417		K60	Pss	Cmm382	Cmm0317	Cmm0690
5	0917-T305 미정제 추출물	YME 16 ℃	0 a	0.2		0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
5	0318-T327 미정제 추출물	YME 28 ℃	0.2	0.4		0.5	1.0	0.7	0.7	0.8
5	0418-T328 미정제 추출물	YME 28 ℃	0.2	0.4		0.5	1.0	0.7	0.8	0.8
5	0318-T327 미정제 추출물	YME 16 ℃	0.1	0.4		0.7	0.6	0.5	0.3	0.4
5	0418-T328 미정제 추출물	YME 16 ℃	0.2	0.4		0.8	0.9	0.5	0.5	0.5
5	반코마이신							3.0	3.0	3.0
0.1	스트렙토마이신		1.3	1.9		1.5	1.5
2	RejuAgro A		0.5	1.0		0.4	0.5
2	RejuAgro B		0.0	0.0		0.4	0.4

^a억제 영역의 직경(cm)

실시예 14. Rt 18.9, Rt 22.9 및 Rt 25.0의 항균 효과.

스톡 박테리아 슈도모나스 종 0617-T307을 LB 한천(트립톤, 10g/L; 효모 추출물, 5g/L; NaCl, 10g/L; 한천, 15g/L; 물) 플레이트에 접종하고 28℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 성장시켰다. 발효 및 미정제 추출물 제조를 실시예 6에 기재된 바와 동일하게 수행하였다.

슈도모나스 종 0617-T307의 산성화된 세포 배양액의 에틸 아세테이트 추출물의 HPLC 단리 및 정제에 의해 새로운 분획 T5058에서 2개의 항균 화합물(Rt22.9 및 Rt25.0)과 새로운 분획 T7882에서 1개의 항균 화합물(Rt18.9)을 확인했다. 이를 표 8에 나열된 박테리아 균주에 대한 항균 활성에 대해 시험하였다. 2μL의 DMSO, Rt18.9, Rt22.9 또는 Rt25.0을 한천 플레이트에 점적하고 각기 다른 박테리아 균주로 성장시키고 억제 영역을 추가로 검사했다(표 8).

Rt 18.9, Rt 22.9 및 Rt 25.0의 항균 효과

균주 (관련 질병)a	DMSO	Rt18.9 (5 mg/mL)	Rt22.9 (10 mg/mL)	Rt25.0 (5 mg/mL)	사용된 배지b
클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스 Cmm 0317 (토마토 궤양병)	아니요	예	예	예	LB
슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스 1188-1 (조롱박의 각진잎무늬병)	아니요	예	예	예	LB
크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 N40-SO5 (감귤 궤양병)	아니요	예	아니요	예	NA
에르위니아 아밀로보라 1189 (사과/배의 화상병)	아니요	예	아니요	아니요	LB
펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스 944 (다수의 작물에서 무름병 유발)	아니요	예	아니요	예	LB
랄스토니아 솔라나세아룸 K60 (박테리아 시들음병)	아니요	예	예	예	LB
크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스 417 (호두나무 마름병)	아니요	예	아니요	아니요	NA
슈도모나스 시린자에 pv. 토마토 PT30 (토마토 박테리아 반점)	아니요	예	예	예	LB
펙토박테리움 아트로셉티쿰 942 (다수의 작물에서 무름병 유발)	아니요	예	아니요	아니요	LB
펙토박테리움 파르멘티에리 UPP163 936 (다수의 작물에서 무름병 유발)	아니요	예	아니요	아니요	LB
슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이 (올리브 혹병) 01-26	아니요	예	예	예	LB
슈도모나스 시린자에 pv 시린자에 7046 (박테리아 궤양병 또는 도열병 (핵과 및 이과)	아니요	예	예	예	LB
크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스 219 (호두나무 마름병)	아니요	예	아니요	예	NA
크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리-미아미 XC2002-00010 (감귤 궤양병)	아니요	아니요	아니요	예	NA

^a억제 영역을 DMSO, Rt18.9, Rt22.9 또는 Rt25.0으로 점적한 후 2일 내지 5일 동안 조사하였다.^b박테리아 성장에 사용된 한천 배지 플레이트는 LB 배지 (10.0 g/L 트립톤, 5.0 g/L 효모 추출물, 10.0 g/L 나트륨염, 15.0 g/L 한천 및 수돗물(최종 부피 1.0 L)) 또는 NA 배지 (3.0 g/L 소고기 추출물, 1.0 g/L 효모 추출물, 5.0 g/L 폴리펩톤, 10.0 g/L 수크로스 및 15 g/L 한천 및 수돗물(최종 부피 1.0 L)였다.

표 14.2 LB 및 NA 한천 플레이트의 배지 조성

실시예 15. 미코스파에렐라 피지엔시스에 대한 RejuAgro A의 항균 효과

미코스파에렐라 피지엔시스에 대한 RejuAgro A의 항균 효과를 PDA 한천 배지에 각각 HPLC 정제된 RejuAgro A 60 및 600 μg/mL의 최종 농도를 첨가하여 조사하였다. 6웰 플레이트의 웰에 PDA 3.52mL에 0.5mg/mL 또는 5mg/mL RejuAgro A 480μL를 첨가하여 RejuAgro A의 최종 농도가 60(도 12, 중간 웰(패널) A)) 및 600μg/mL(도 12, 좌측 웰(패널 B))이 되도록 하였다. 플레이트를 저속 교반하여 화합물을 용해시켰다. 480 μL의 물과 3.52 mL의 PDA를 대조군 처리로 사용하였다(도 12, 우측 웰(패널 C). 한천이 응고된 후 M. 피지엔시스로 성장한 한천 조각을 한천 표면 중앙에 위치시켰다. M. 피지엔시스의 성장의 완전한 억제는 접종 2주 후 600μg/mL의 농도에서 RejuAgro A의 처리에서 관찰되었다(도 12).

실시예 16. 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라(Xon507)에 대한 RejuAgro A의 항균 효과.

크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라 (Xon507)에 대한 RejuAgro A의 항균 효과를 조사하였다. X. 오리자에 pv. 오리지콜라 (Xon507) 박테리아 현탁액(OD₆₀₀= 0.3)을 PSG 한천 플레이트에 분무하였다. 각각 5.5 μg/mL, 11.1 μg/mL, 22.1 μg/mL, 33.2 μg/mL, 55.4 μg/mL, 110.7 μg/mL 농도의 HPLC 정제 수용성 RejuAgro A의 50 μL 부가 부피가 부가된 종이 디스크를 한천 플레이트에 놓고 종이 디스크를 한천 플레이트에 놓고 44시간 후에 억제 영역을 측정하였다. RejuAgro A 현탁액으로 침지된 종이 디스크의 모든 농도에서 억제가 관찰되었다(표 9).

크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라 (Xon507)에 대한 RejuAgro A의 항균 효과.

RejuAgro A의 농도	물 대조군	5.5 μg/mL	11.1 μg/mL	22.1 μg/mL	33.2 μg/mL	55.4 μg/mL	110.7 μg/mL
억제 영역 (cm)	0	0.27±0.06	0.5±0.1	0.73±0.15	0.83±0.15	0.93±0.06	1.33±0.12

실시예 17. 크산토모나스 시트리 pv. 시트리 시트란지 (XW19)에 대한 RejuAgro A의 항균 효과.

크산토모나스 시트리 pv. 시트리 시트란지 (XW19)에 대한 RejuAgro A의 항균 효과를 조사하였다. X. 시트리 pv. 시트리 시트란지 (XW19)의 박테리아 현탁액(OD₆₀₀= 0.3)을 PSG 한천 플레이트에 분무하였다. 각각 5.5 μg/mL, 11.1 μg/mL, 22.1 μg/mL, 33.2 μg/mL, 55.4 μg/mL, 110.7 μg/mL 농도의 HPLC 정제 수용성 RejuAgro A의 50 μL 부가 부피가 부가된 종이 디스크를 한천 플레이트에 놓고 종이 디스크를 한천 플레이트에 놓고 44시간 후에 억제 영역을 측정하였다. RejuAgro A의 농도 55.37μg/mL 및 110.74μg/mL에서 억제가 관찰되었다(표 10).

크산토모나스 시트리 pv. 시트리 시트란지 (XW19)에 대한 RejuAgro A의 항균 효과.

RejuAgro A의 농도	물 대조군	5.5 μg/mL	11.1 μg/mL	22.1 μg/mL	33.2 μg/mL	55.4 μg/mL	110.7 μg/mL
억제 영역 (cm)	0	0	0	0	0	0.23±0.06	0.27±0.12

실시예 18. 실시예에 사용된 배지 배양 조성물.

표 11는 실시예에서 사용된 예시적인 배지 조성물을 포함한다.

배지 조성물.

No.	배지 명	조성물	g/리터	25℃에서의 pH	참조문헌
M1	YME	효모 추출물	4.0 g	NA	(Hamamoto, H., et. al. (2015))
		맥아 추출물	10 g
		글루코스	4.0 g
		수돗물	1.0 L
M6	DAPG 배지	맥아 추출물	15.0 g	NA	(Gnanamanickam, Samuel S. (2008))
		물
M7	PRN 배지	글리세롤	30.0 g	NA	(Gnanamanickam, Samuel S. (2008))
		K2HPO4	3.0 g
		NaCl	5.0 g
		MgSO4·7H2O	0.5 g
		D-트립토판	0.61 g
M8	IAA 배지	D-글루코스	5.0 g	NA	(Gnanamanickam, Samuel S. (2008))
		카사미노산	25.0 g
		MgSO4·7H2O	0.3 g
		K2HPO4	1.7 g
		NaH2PO4	2.0 g
M9	CN	카사미노산	10.0 g	NA	(Gavrish, E., et al. (2008))
		영양 배양액	10.0 g

실시예 19. 박테리아 균주, 천연물 및 이에 인용된 참조문헌.

본 출원에 기재되고 첨부된 청구범위에 제시된 박테리아 균주 및 천연 산물은 미생물학 문헌에 잘 공지되어 있다. 이들 참조문헌은 본 명세서에 개시된 각각의 인용된 박테리아 균주 및 천연 산물에 대해 하기 표 12에 제시되며, 그 내용은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

이용 가능성의 증거를 뒷받침하는 것으로서 인용된 박테리아 균주, 천연 산물 및 참조문헌.

박테리아 균주	참조문헌 인용
0617-T307, 0917-T305, 0917-T306, 및 0917-T307	Pascual, J., Garcia-Lopez, M., Carmona, C., Sousa, T. da S., de Pedro, N., Cautain, B., Martin, J., Vicente, F., Reyes, F., Bills, G. F., & Genilloud, O. (2014). Pseudomonas soli sp. nov., a novel producer of xantholysin congeners. Syst Appl Microbiol, 37: 412-416.
0118-T319, 0318-T327, 및 0418-T328	Dabboussi, F., Hamze, M., Singer, E., Geoffroy, V., Meyer, J., & Izard, D. (2002). Pseudomonas mosselii sp. nov., a novel species. Int J Syst Bacteriol, 52: 363-376.
천연물	참조문헌 인용
RejuAgro B	Knackmuss, H., Medizinische, M., & Chemie, I. (1968). Methyl-substituted 2,3,6-trihydroxypyridines and their oxidation products. Eur. J. Inorg. Chem. 2689: 2679-2689.
Rt22.9 및 Rt25.0	문헌[Loots, D. T., Erasmus, E., & Mienie, L. J. (2005). Identification of 19 new metabolites induced by abnormal amino acid conjugation in isovaleric acidemia. Clin Chem, 51: 1510-1512.
Rt18.9	Osipov, A. M., Metlova, L. P., Baranova, N. V, & Rudakov, E. S. (1978). New derivatives of difuryl: 2,2’-difuryl-5,5’-dicarbinol and 2,2’-difuryl-5,5’-dicarboxylic acid. Ukrainskii Khimicheskii Zhurnal (Russian Edition), 44: 398.

실시예 20. RejuAgro A, RejuAgro B 및 RejuAgro C의 결정 구조 정보.

A. RejuAgro A의 결정 구조 정보

RejuAgro A의 클로로포름 용액을 천천히 증발시켜 RejuAgro A의 단결정(C₇H₇NO₃S)을 얻었다. 주황색 정제를 얻었다. 적합한 결정을 선택하여 SuperNova, Dual, Cu at home/near, Atlas 회절계에 장착했다. 결정은 데이터 수집 중에 100.05(10) K로 유지되었다. Olex2(문헌[Dolomanov et al.(2009)])를 사용하여 Direct Methods(문헌[Sheldrick(2008)])를 사용하는 ShelXS 구조 확인 프로그램으로 구조를 확인하고 최소 제곱 최소화를 사용하여 ShelXL 정제 패키지(문헌[Sheldrick, G.M.(2015)])로 정제했다.

Cu(Kα) 선을 사용하는 Oxford SuperNova 회절계로 100K에서 데이터세트를 수집하였다.

RejuAgro A (C₇H₇NO₃S) (M =185.20 g/mol)에 대한 결정 데이터: 단사정계, 공간군 P2₁/n (no. 14), a = 5.30391(6) Å, b = 13.97822(13) Å, c = 10.74471(13) Å, β = 101.5883(12)°, V = 780.367(15) ų, Z = 4, T = 100.05(10) K, μ(CuKα) = 3.429 mm^-1, Dcalc = 1.576 g/cm³, 13936 측정된 반사율 (10.522° ≤ 2Θ ≤ 140.8°), 1496 고유 값 (R_int = 0.0220, R_sigma = 0.0083)(모든 계산에 사용됨). 최종 R₁은 0.0253 (I > 2σ(I))이고, wR₂는 0.0702 (모든 데이터)이었다.

정제 모델 설명을 OlexSys에 대해 2018.05.29 svn.r3508에 컴파일된 Olex2로 생산하였다. 리스트레인(restrain) 수 - 0, 컨스트레인(constrain) 수 - 알 수 없음. 세부 사항: 1. 고정 Uiso: 모든 C(H,H,H,H,H,H) 기의 1.2배; 1.5배: 모든 C(H,H,H) 기; 2. 기타: Sof(H6A)=Sof(H6D)=Sof(H6F)=1-FVAR(1); Sof(H6B) = Sof(H6C) = Sof(H6E) = FVAR(1); 3.a 회전 기로 정제된 불규칙 Me: C6(H6A,H6B,H6C,H6D,H6E,H6F);.b 회전 기로 정제된 이론적 Me: C7(H7A,H7B,H7C).

도 13a와 관련하여, RejuAgro A 분자는 평면 구조를 가지고 있다- S-Me 기는 헤테로사이클에 대해 단지 8.7° 회전한다. C4-C5 결합(1.531Å)에서 분자의 π-컨쥬게이트가 분명하게 절단되어 있으며, 이는 명확하게 몇 가지 궤도상의 이유 때문이다. sp² 탄소 원자에 연결된 Me-기는 2개 위치에 걸쳐 불규칙하게 회전한다.

도 13b와 관련하여, 결정 형태의 RejuAgro A 분자는 N-H…O 상호작용을 통해 중심 대칭 H 결합 이량체를 형성한다. 또한, 이러한 이량체는 보다 더 약한 C-H…O 상호작용을 통해 [-3 0 1] 평면을 따라 2차원 층을 형성한다.

RejuAgro A의 화학 구조는 다음과 같다:

(화학식 (I))

RejuAgro A 분자의 추가적인 결정 데이터는 표 13 내지 표 21에 제시되어 있다.

RejuAgro A에 대한 결정 데이터 및 구조 정제

확인 코드	RejuAgro A
실험식	C7H7NO3S
화학식량	185.20
온도/K	100.05(10)
결정계	Monoclinic
공간군	P21/n
a/ÅÅ	5.30391(6)
b/Å	13.97822(13)
c/Å	10.74471(13)
α/°	90
β/°	101.5883(12)
γ/°	90
부피/Å3	780.367(15)
Z	4
ρcalcg/cm3	1.576
μ/mm-1	3.429
F(000)	384.0
결정 크기/mm3	0.874 Х 0.274 Х 0.118
조사	CuKα (λ = 1.54184)
데이터 수집을 위한 2Θ 범위/°	10.522 내지 140.8
지수 범위	-6 ≤ h ≤ 6, -17 ≤ k ≤ 17, -13 ≤ l ≤ 12
수집 반사율	13936
독립적인 반사율	1496 [Rint = 0.0220, Rsigma = 0.0083]
데이터/리스트레인/매개변수	1496/0/117
F2 적합도	1.067
최종 R 지수 [I>=2σ (I)]	R1 = 0.0253, wR2 = 0.0700
최종 R 지수 [모든 데이터]	R1 = 0.0254, wR2 = 0.0702
최대 차이 피크/홀/ e Å-3	0.33/-0.29

RejuAgro A에 대한 분율 원자 좌표(x10⁴) 및 균등 등방성 변위 매개변수(ŲХ10³). U_eq는 직교 U_IJ 텐서의 자취의 1/3로 정의된다.

원자	X	Y	z	U(eq)
S1	6015.2(6)	2181.9(2)	7360.1(3)	14.21(13)
O1	2838.4(18)	479.2(7)	5956.1(10)	21.0(2)
O2	-1864.8(19)	3816.9(7)	4920.5(10)	20.3(2)
O3	-4128.5(19)	2125.4(7)	3998.6(10)	19.1(2)
N1	-625(2)	1317.3(8)	5012.2(11)	14.8(2)
C1	1795(2)	1257.7(9)	5770.8(12)	14.1(3)
C2	3003(2)	2163.2(9)	6326.8(12)	12.9(3)
C3	1866(3)	3025.4(10)	6015.7(12)	14.5(3)
C4	-699(3)	3073.5(10)	5196.4(12)	14.7(3)
C5	-2010(3)	2140.2(9)	4672.1(13)	14.9(3)
C6	3049(3)	3965.2(10)	6489.7(14)	19.0(3)
C7	7080(3)	978.0(10)	7802.9(13)	17.9(3)

RejuAgro A에 대한 이방성 변위 매개변수(ŲХ10³). 이방성 변위 계수 지수는 -2ð²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…]의 형태이다.

원자	U 11	U 22	U 33	U 23	U 13	U 12
S1	12.06(19)	13.72(19)	14.8(2)	-0.65(11)	-2.16(13)	-1.00(10)
O1	18.6(5)	11.9(5)	27.2(5)	-1.4(4)	-7.8(4)	1.5(4)
O2	20.2(5)	15.0(5)	24.3(5)	2.8(4)	1.0(4)	4.3(4)
O3	13.9(5)	22.2(5)	18.4(5)	0.8(4)	-3.7(4)	2.2(4)
N1	13.8(6)	11.8(5)	16.4(6)	-1.3(4)	-2.8(4)	-1.4(4)
C1	13.7(6)	14.9(7)	12.8(6)	1.0(5)	0.3(5)	0.2(5)
C2	11.8(6)	15.1(7)	11.3(6)	-0.5(5)	1.1(5)	-0.6(5)
C3	15.4(6)	14.5(6)	13.4(6)	-0.4(5)	2.6(5)	-0.6(5)
C4	16.1(6)	14.9(6)	13.4(6)	1.7(5)	3.3(5)	2.3(5)
C5	14.9(6)	16.3(7)	13.1(6)	1.4(5)	1.9(5)	1.3(5)
C6	20.7(7)	12.3(6)	21.9(7)	-0.9(5)	-0.8(5)	0.7(5)
C7	15.9(6)	16.6(6)	18.3(7)	2.0(5)	-3.1(5)	2.0(5)

RejuAgro A에 대한 결합 길이

원자	원자	길이/Å		원자	원자	길이/Å
S1	C2	1.7529(13)		N1	C5	1.3742(17)
S1	C7	1.8082(14)		C1	C2	1.4886(17)
O1	C1	1.2190(16)		C2	C3	1.3593(18)
O2	C4	1.2150(17)		C3	C4	1.4658(18)
O3	C5	1.2083(18)		C3	C6	1.5002(18)
N1	C1	1.3778(17)		C4	C5	1.5314(18)

RejuAgro A에 대한 결합 각

원자	원자	원자	각/°		원자	원자	원자	각/°
C2	S1	C7	110.46(6)		C2	C3	C6	123.92(12)
C5	N1	C1	126.34(12)		C4	C3	C6	116.00(12)
O1	C1	N1	119.28(12)		O2	C4	C3	123.44(12)
O1	C1	C2	123.28(12)		O2	C4	C5	117.88(12)
N1	C1	C2	117.44(11)		C3	C4	C5	118.68(11)
C1	C2	S1	122.08(9)		O3	C5	N1	121.87(12)
C3	C2	S1	116.47(10)		O3	C5	C4	122.26(12)
C3	C2	C1	121.41(12)		N1	C5	C4	115.87(12)
C2	C3	C4	120.06(12)

RejuAgro A에 대한 수소 결합

D	H	A	d(D-H)/Å	d(H-A)/Å	d(D-A)/Å	D-H-A/°
N1	H1	O11	0.845(18)	2.032(19)	2.8768(15)	178.8(17)
C7	H7C	O22	0.98	2.58	3.5549(16)	175.3

¹-X,-Y,1-Z; ²3/2+X,1/2-Y,1/2+Z

RejuAgro A에 대한 비틀림 각

A	B	C	D	각/°		A	B	C	D	각/°
S1	C2	C3	C4	-177.63(9)		C1	C2	C3	C6	-176.67(12)
S1	C2	C3	C6	0.76(18)		C2	C3	C4	O2	177.16(13)
O1	C1	C2	S1	-2.63(19)		C2	C3	C4	C5	-1.90(19)
O1	C1	C2	C3	174.66(13)		C3	C4	C5	O3	179.49(12)
O2	C4	C5	O3	0.4(2)		C3	C4	C5	N1	-0.66(18)
O2	C4	C5	N1	-179.77(11)		C5	N1	C1	O1	-177.26(13)
N1	C1	C2	S1	177.32(9)		C5	N1	C1	C2	2.78(19)
N1	C1	C2	C3	-5.39(19)		C6	C3	C4	O2	-1.36(19)
C1	N1	C5	O3	179.92(13)		C6	C3	C4	C5	179.58(11)
C1	N1	C5	C4	0.07(19)		C7	S1	C2	C1	-8.68(13)
C1	C2	C3	C4	4.9(2)		C7	S1	C2	C3	173.90(10)

RejuAgro A에 대한 수소 원자 좌표(ÅХ10⁴) 및 등방성 변위 매개변수(ŲХ10³)

원자	X	y	z	U(eq)
H1	-1260(30)	789(13)	4721(17)	20(4)
H6A	2408.52	4468.05	5871.25	23
H6B	4925.78	3921.96	6602.43	23
H6C	2587.06	4119.49	7305.04	23
H6D	4205.71	3871.61	7314.56	23
H6E	1688.46	4417.71	6583.38	23
H6F	4027.18	4220.17	5880.78	23
H7A	7306.25	625.34	7044.62	27
H7B	5790.31	654.5	8190.27	27
H7C	8721.96	1001.76	8413.78	27

RejuAgro A에 대한 점유

원자	점유		원자	점유		원자	점유
H6A	0.485(15)		H6B	0.515(15)		H6C	0.515(15)
H6D	0.485(15)		H6E	0.515(15)		H6F	0.485(15)

B. RejuAgro B의 결정구조 정보

RejuAgro B의 메탄올 용액을 천천히 증발시켜 RejuAgro B(C₁₂H₈N₂O₆)의 단결정을 얻었다. 주황색 각뿔을 얻었다. 적합한 결정을 선택하여 SuperNova, Dual, Cu at home/near, Atlas 회절계에 장착했다. 결정은 데이터 수집 중에 100.05(10) K로 유지되었다. Olex2(문헌[Dolomanov et al.(2009)])를 사용하여 Direct Methods(문헌[Sheldrick(2008)])를 사용하는 ShelXS 구조 확인 프로그램으로 구조를 확인하고 최소 제곱 최소화를 사용하는 ShelXL 정제 패키지(문헌[Sheldrick(2015)])로 정제했다.

Cu(Kα) 선을 사용하는 Oxford SuperNova 회절계로 100K에서 데이터세트를 수집하였다.

RejuAgro B(C₁₂H₈N₂O₆)(M = 276.20g/mol)에 대한 결정 데이터: 삼사정계, 공간군 P-1(no. 2), a = 7.0528(3) Å, b = 11.7911(5) Å, c = 14.6888(6) Å, α = 72.249(4)°, β = 79.265(3)°, γ = 86.633(3)°, V = 1143.02(8) ų, Z = 4, T = 100.05(10) K, μ(CuKα) = 1.139 mm^-1, Dcalc = 1.605 g/cm³, 15292 측정된 반사율 (7.872° Å 2Θ ≤ 141.144°), 4304 고유 값 (R_int = 0.0258, R_sigma = 0.0234)(모든 계산에 사용됨). 최종 R₁은 0.0419 (I > 2σ(I))이고, wR₂는 0.1124 (모든 데이터)이었다.

정제 모델 설명을 OlexSys에 대해 2018.05.29 svn.r3508에 컴파일된 Olex2로 생산하였다. 리스트레인 수 - 0, 컨스트레인 수 - 알 수 없음. 세부 사항은 다음과 같다: 1. 고정 Uiso: 모든 N(H) 기의 1.2배; 1.5배: 모든 C(H,H,H) 기; 2.a 상위 후보로 정제된 방향족/아미드 H: N1(H1), N2(H2), N1A(H1A), N2A(H2A); 2.b 회전 기로서 정제된 이론적 Me: C6(H6A,H6B,H6C), C12(H12A,H12B,H12C), C6A(H6AC,H6AA,H6AB), C12A(H12D,H12E,H12F).

도 14a와 관련하여, RejuAgro B 결정은 2개의 대칭적으로 독립적인 RejuAgro B 분자를 포함한다. 각 분자는 70.3°와 80.6°의 연결된 헤테로사이클의 평균 평면 사이의 이면각을 갖는 꼬인 구조를 가지고 있다. 2개의 인접한 카보닐 기 사이의 C(sp²)-C(sp²) 결합에서 각 헤테로사이클에서 π-컨쥬게이트가 분명하게 절단되어 있으며(결합 길이는 1.534-1.539Å 범위임), 이는 명확하게 몇 가지 궤도상의 이유 때문이다.

도 14b와 관련하여, 결정의 RejuAgro B 분자는 N-H…O 상호작용을 통해 중심 대칭 H 결합 이량체를 형성한다. 이 이량체는 다른 N-H…O 상호작용에 의해 x 방향을 따라 적층으로 연결된다. 마지막으로 적층은 제3 유형의 N-H…O 상호작용에 의해 [011]을 따라 층에 연결된다.

RejuAgro B의 화학 구조는 다음과 같다:

(화학식 (II))

RejuAgro B 분자의 추가적인 결정 데이터는 표 22 내지 표 29에 제시되어 있다.

RejuAgro B에 대한 결정 데이터 및 구조 정제

확인 코드	RejuAgro B
실험식	C12H8N2O6
화학식량	276.20
온도/K	100.05(10)
결정계	triclinic
공간군	P-1
a/Å	7.0528(3)
b/Å	11.7911(5)
c/Å	14.6888(6)
α/°	72.249(4)
β/°	79.265(3)
γ/°	86.633(3)
부피/Å3	1143.02(8)
Z	4
ρcalcg/cm3	1.605
μ/mm-1	1.139
F(000)	568.0
결정 크기/mm3	0.3 Х 0.22 Х 0.2
조사	CuKα (λ = 1.54184)
데이터 수집을 위한 2Θ 범위/°	7.872 내지 141.144
지수 범위	-8 ≤ h ≤ 8, -12 ≤ k ≤ 14, -17 ≤ l ≤ 17
수집 반사율	15292
독립적인 반사율	4304 [Rint = 0.0258, Rsigma = 0.0234]
데이터/리스트레인/매개변수	4304/0/365
F2 적합도	1.044
최종 R 지수 [I>=2σ (I)]	R1 = 0.0419, wR2 = 0.1043
최종 R 지수 [모든 데이터]	R1 = 0.0517, wR2 = 0.1124
최대 차이 피크/홀/ e Å-3	0.31/-0.25

RejuAgro B에 대한 분율 원자 좌표(x10⁴) 및 균등 등방성 변위 매개변수(ŲХ10³). U_eq는 직교 U_IJ 텐서의 자취의 1/3로 정의된다.

원자	x	y	z	U(eq)
O1	2961(2)	7383.5(12)	2001.1(11)	31.9(3)
O2	-1826(2)	9293.7(13)	432.4(11)	35.5(4)
O3	-3044(2)	7134.9(13)	421.6(10)	34.1(3)
O4	182(2)	5943.5(11)	3820.2(9)	24.6(3)
O5	3410(2)	2456.2(11)	4624.7(9)	27.0(3)
O6	4494(2)	2636.3(12)	2701.7(10)	31.2(3)
N1	593(2)	8361.8(14)	1206.5(12)	25.6(4)
N2	1809(2)	4204.9(13)	4225.8(11)	22.5(3)
C1	1436(3)	5154.4(16)	2526.1(12)	19.3(4)
C2	1083(3)	5152.6(16)	3557.2(13)	20.0(4)
C3	2860(3)	3281.2(16)	4009.9(13)	21.6(4)
C4	3360(3)	3353.0(16)	2929.1(13)	22.3(4)
C5	2479(3)	4308.1(16)	2217.5(13)	21.0(4)
C6	2868(3)	4264.1(17)	1193.1(13)	27.0(4)
C7	537(3)	6175.3(16)	1875.4(12)	19.6(4)
C8	1477(3)	7336.7(16)	1708.5(13)	22.7(4)
C9	-1015(3)	8384.0(17)	814.7(13)	25.8(4)
C10	-1777(3)	7166.6(18)	869.1(13)	24.7(4)
C11	-992(3)	6069.0(16)	1488.2(13)	22.5(4)
C12	-2025(3)	4934.9(19)	1648.0(16)	33.7(5)
O1A	3249(2)	2542.2(12)	7353.0(10)	29.1(3)
O2A	6867(2)	4284.9(12)	4433.3(10)	33.3(3)
O3A	8705(2)	2165.5(13)	4475.5(11)	36.7(4)
O4A	7213(2)	37.3(12)	8198.9(10)	30.6(3)
O5A	2666(2)	-2784.5(13)	9706.4(10)	36.6(4)
O6A	580(2)	-1850.3(14)	8272.4(12)	42.8(4)
N1A	5218(2)	3432.4(14)	5950.6(11)	24.6(4)
N2A	4869(2)	-1309.3(14)	9003.5(11)	26.3(4)
C1A	4443(3)	197.8(16)	7467.5(13)	21.3(4)
C2A	5632(3)	-339.4(16)	8237.7(13)	23.9(4)
C3A	3220(3)	-1884.4(17)	9063.4(14)	27.5(4)
C4A	2026(3)	-1349.2(18)	8259.8(15)	27.9(4)
C5A	2747(3)	-250.9(17)	7474.9(14)	24.8(4)
C6A	1500(3)	238(2)	6728.1(15)	33.8(5)
C7A	5314(3)	1250.6(16)	6665.8(13)	20.2(4)
C8A	4511(3)	2434.0(16)	6711.8(13)	21.9(4)
C9A	6479(3)	3408.2(17)	5139.6(14)	25.0(4)
C10A	7408(3)	2197.3(17)	5129.5(14)	25.4(4)
C11A	6631(3)	1122.0(16)	5922.8(13)	23.0(4)
C12A	7343(3)	-57.7(18)	5817.8(15)	30.6(5)

RejuAgro B에 대한 이방성 변위 매개변수(ŲХ10³). 이방성 변위 인자 지수는 -2π²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…]의 형태이다.

원자	U 11	U 22	U 33	U 23	U 13	U 12
O1	33.5(8)	24.6(7)	37.9(8)	-5.9(6)	-12.5(6)	-2.0(6)
O2	38.2(8)	25.5(8)	32.6(8)	3.8(6)	-4.8(6)	7.4(6)
O3	39.2(8)	37.3(8)	28.2(7)	-9.7(6)	-15.1(6)	8.0(7)
O4	34.1(7)	21.0(7)	17.2(6)	-5.5(5)	-3.2(5)	6.3(6)
O5	40.0(8)	19.7(7)	21.1(7)	-3.3(5)	-11.5(6)	5.2(6)
O6	41.1(8)	23.2(7)	25.3(7)	-5.6(6)	-2.6(6)	10.7(6)
N1	30.1(9)	15.4(8)	28.0(9)	-2.9(6)	-3.1(7)	0.5(6)
N2	34.8(9)	19.1(8)	12.8(7)	-4.1(6)	-5.5(6)	5.0(7)
C1	23.4(9)	17.5(9)	15.2(8)	-2.4(7)	-3.1(7)	-1.0(7)
C2	23.7(9)	17.6(9)	17.2(9)	-3.0(7)	-3.7(7)	-0.5(7)
C3	26.6(10)	17.2(9)	20.6(9)	-4.0(7)	-5.6(7)	-1.3(7)
C4	28.7(10)	16.2(9)	19.8(9)	-3.5(7)	-2.9(7)	1.3(7)
C5	24.8(9)	18.4(9)	17.6(9)	-2.8(7)	-3.0(7)	0.1(7)
C6	37.7(11)	23.1(10)	19.0(9)	-6.5(8)	-4.0(8)	7.2(8)
C7	25.6(9)	18.4(9)	12.8(8)	-4.1(7)	-0.3(7)	3.2(7)
C8	28.1(10)	18.4(9)	19.3(9)	-3.6(7)	-2.9(7)	2.8(7)
C9	30.7(10)	23.1(10)	17.2(9)	-0.2(8)	0.7(7)	4.0(8)
C10	28.7(10)	29.8(10)	14.7(9)	-6.4(8)	-3.6(7)	5.9(8)
C11	27.1(10)	21.4(9)	17.4(9)	-5.2(7)	-2.1(7)	3.4(8)
C12	36.9(12)	28.6(11)	37.8(12)	-7.7(9)	-15.5(9)	-1.4(9)
O1A	32.5(8)	26.5(7)	25.4(7)	-7.3(6)	-0.5(6)	6.2(6)
O2A	40.9(8)	21.2(7)	29.3(8)	0.0(6)	2.0(6)	-1.0(6)
O3A	39.6(9)	29.7(8)	33.2(8)	-7.5(6)	9.6(7)	-1.9(6)
O4A	32.5(8)	28.8(8)	30.1(8)	-5.3(6)	-10.7(6)	0.1(6)
O5A	46.2(9)	28.2(8)	25.3(8)	2.1(6)	1.6(6)	-0.1(7)
O6A	36.0(9)	34.1(9)	49.6(10)	1.6(7)	-7.1(7)	-7.7(7)
N1A	31.8(9)	16.0(8)	24.2(8)	-5.0(6)	-2.8(7)	2.3(6)
N2A	34.6(9)	22.7(8)	17.8(8)	-1.0(6)	-6.1(7)	6.9(7)
C1A	27.1(10)	17.8(9)	16.7(9)	-4.0(7)	-1.4(7)	4.1(7)
C2A	30.6(10)	19.3(9)	20.4(9)	-4.8(7)	-3.9(8)	4.6(8)
C3A	32.7(11)	23.7(10)	21.9(10)	-6.4(8)	3.9(8)	3.7(8)
C4A	27.6(10)	25.1(10)	27.8(10)	-6.4(8)	0.4(8)	1.3(8)
C5A	28.8(10)	22.0(10)	21.0(9)	-4.6(8)	-1.3(8)	0.6(8)
C6A	30.4(11)	39.5(12)	28.2(11)	-3.0(9)	-7.5(8)	-5.5(9)
C7A	22.8(9)	18.2(9)	19.1(9)	-2.7(7)	-7.0(7)	0.0(7)
C8A	25.6(9)	20.7(9)	18.5(9)	-3.5(7)	-6.1(7)	1.4(7)
C9A	26.2(10)	24.4(10)	22.8(10)	-4.9(8)	-3.2(8)	-2.2(8)
C10A	26.5(10)	24.8(10)	23.7(10)	-7.3(8)	-0.9(8)	-2.1(8)
C11A	25.5(9)	20.3(9)	22.7(9)	-5.1(7)	-5.4(7)	-0.1(7)
C12A	33.3(11)	25.6(10)	30.4(11)	-9.9(9)	3.0(8)	-0.3(8)

RejuAgro B에 대한 결합 길이

원자	원자	길이/Å		원자	원자	길이/Å
O1	C8	1.213(2)		O1A	C8A	1.202(2)
O2	C9	1.214(2)		O2A	C9A	1.222(2)
O3	C10	1.212(2)		O3A	C10A	1.205(2)
O4	C2	1.217(2)		O4A	C2A	1.209(2)
O5	C3	1.210(2)		O5A	C3A	1.213(2)
O6	C4	1.208(2)		O6A	C4A	1.203(3)
N1	C8	1.390(2)		N1A	C8A	1.394(2)
N1	C9	1.360(3)		N1A	C9A	1.354(2)
N2	C2	1.388(2)		N2A	C2A	1.388(2)
N2	C3	1.366(2)		N2A	C3A	1.356(3)
C1	C2	1.488(2)		C1A	C2A	1.496(3)
C1	C5	1.344(3)		C1A	C5A	1.333(3)
C1	C7	1.483(2)		C1A	C7A	1.495(2)
C3	C4	1.538(3)		C3A	C4A	1.534(3)
C4	C5	1.480(3)		C4A	C5A	1.488(3)
C5	C6	1.495(3)		C5A	C6A	1.491(3)
C7	C8	1.489(3)		C7A	C8A	1.491(3)
C7	C11	1.338(3)		C7A	C11A	1.335(3)
C9	C10	1.537(3)		C9A	C10A	1.539(3)
C10	C11	1.481(3)		C10A	C11A	1.486(3)
C11	C12	1.494(3)		C11A	C12A	1.493(3)

RejuAgro B에 대한 결합 각

원자	원자	원자	각/°		원자	원자	원자	각/°
C9	N1	C8	125.07(16)		C9A	N1A	C8A	125.23(16)
C3	N2	C2	125.15(15)		C3A	N2A	C2A	125.18(17)
C5	C1	C2	122.84(16)		C5A	C1A	C2A	122.52(17)
C5	C1	C7	123.43(16)		C5A	C1A	C7A	121.91(17)
C7	C1	C2	113.73(15)		C7A	C1A	C2A	115.53(16)
O4	C2	N2	120.22(16)		O4A	C2A	N2A	120.41(17)
O4	C2	C1	122.04(16)		O4A	C2A	C1A	122.03(17)
N2	C2	C1	117.74(15)		N2A	C2A	C1A	117.55(17)
O5	C3	N2	122.60(17)		O5A	C3A	N2A	123.6(2)
O5	C3	C4	121.02(17)		O5A	C3A	C4A	119.50(19)
N2	C3	C4	116.37(15)		N2A	C3A	C4A	116.89(17)
O6	C4	C3	117.92(16)		O6A	C4A	C3A	118.93(18)
O6	C4	C5	123.19(17)		O6A	C4A	C5A	122.62(19)
C5	C4	C3	118.87(16)		C5A	C4A	C3A	118.42(17)
C1	C5	C4	118.55(16)		C1A	C5A	C4A	119.10(18)
C1	C5	C6	125.01(17)		C1A	C5A	C6A	125.12(18)
C4	C5	C6	116.43(16)		C4A	C5A	C6A	115.74(17)
C1	C7	C8	113.48(16)		C8A	C7A	C1A	115.80(16)
C11	C7	C1	123.39(16)		C11A	C7A	C1A	121.49(17)
C11	C7	C8	123.12(17)		C11A	C7A	C8A	122.54(16)
O1	C8	N1	121.37(17)		O1A	C8A	N1A	120.00(17)
O1	C8	C7	121.04(17)		O1A	C8A	C7A	122.46(17)
N1	C8	C7	117.59(17)		N1A	C8A	C7A	117.48(16)
O2	C9	N1	123.67(19)		O2A	C9A	N1A	123.12(18)
O2	C9	C10	120.36(19)		O2A	C9A	C10A	120.17(17)
N1	C9	C10	115.97(16)		N1A	C9A	C10A	116.70(16)
O3	C10	C9	118.81(17)		O3A	C10A	C9A	118.60(17)
O3	C10	C11	121.85(19)		O3A	C10A	C11A	123.38(18)
C11	C10	C9	119.32(17)		C11A	C10A	C9A	118.00(16)
C7	C11	C10	117.85(17)		C7A	C11A	C10A	119.31(17)
C7	C11	C12	125.55(17)		C7A	C11A	C12A	123.69(17)
C10	C11	C12	116.58(17)		C10A	C11A	C12A	116.97(17)

RejuAgro B에 대한 수소 결합

D	H	A	d(D-H)/Å	d(H-A)/Å	d(D-A)/Å	D-H-A/°
N1	H1	O21	0.88	2.51	3.104(2)	125.1
N1	H1	O4A2	0.88	2.17	2.928(2)	143.6
N2	H2	O43	0.88	2.09	2.909(2)	154.7
N1A	H1A	O2A2	0.88	2.14	2.940(2)	150.8
N2A	H2A	O34	0.88	2.08	2.892(2)	153.8

¹-X,2-Y,-Z; ²1-X,1-Y,1-Z; ³-X,1-Y,1-Z; ⁴1+X,-1+Y,1+Z

RejuAgro B에 대한 비틀림 각

A	B	C	D	각/°		A	B	C	D	각/°
O2	C9	C10	O3	9.1(3)		O2A	C9A	C10A	O3A	10.0(3)
O2	C9	C10	C11	-169.03(18)		O2A	C9A	C10A	C11A	-169.05(18)
O3	C10	C11	C7	173.21(18)		O3A	C10A	C11A	C7A	173.9(2)
O3	C10	C11	C12	-8.5(3)		O3A	C10A	C11A	C12A	-8.1(3)
O5	C3	C4	O6	-8.1(3)		O5A	C3A	C4A	O6A	-1.6(3)
O5	C3	C4	C5	173.42(17)		O5A	C3A	C4A	C5A	-179.46(18)
O6	C4	C5	C1	-171.34(18)		O6A	C4A	C5A	C1A	-174.5(2)
O6	C4	C5	C6	7.3(3)		O6A	C4A	C5A	C6A	3.5(3)
N1	C9	C10	O3	-170.34(17)		N1A	C9A	C10A	O3A	-171.13(19)
N1	C9	C10	C11	11.5(2)		N1A	C9A	C10A	C11A	9.8(3)
N2	C3	C4	O6	170.50(17)		N2A	C3A	C4A	O6A	178.04(19)
N2	C3	C4	C5	-7.9(2)		N2A	C3A	C4A	C5A	0.2(3)
C1	C7	C8	O1	7.7(3)		C1A	C7A	C8A	O1A	0.3(3)
C1	C7	C8	N1	-172.31(16)		C1A	C7A	C8A	N1A	-176.82(16)
C1	C7	C11	C10	178.53(16)		C1A	C7A	C11A	C10A	178.16(17)
C1	C7	C11	C12	0.4(3)		C1A	C7A	C11A	C12A	0.3(3)
C2	N2	C3	O5	-177.67(18)		C2A	N2A	C3A	O5A	174.19(19)
C2	N2	C3	C4	3.7(3)		C2A	N2A	C3A	C4A	-5.5(3)
C2	C1	C5	C4	-1.8(3)		C2A	C1A	C5A	C4A	-1.9(3)
C2	C1	C5	C6	179.67(17)		C2A	C1A	C5A	C6A	-179.68(19)
C2	C1	C7	C8	70.3(2)		C2A	C1A	C7A	C8A	-103.24(19)
C2	C1	C7	C11	-108.6(2)		C2A	C1A	C7A	C11A	81.3(2)
C3	N2	C2	O4	-179.02(17)		C3A	N2A	C2A	O4A	-172.19(18)
C3	N2	C2	C1	1.4(3)		C3A	N2A	C2A	C1A	6.9(3)
C3	C4	C5	C1	7.0(3)		C3A	C4A	C5A	C1A	3.3(3)
C3	C4	C5	C6	-174.34(16)		C3A	C4A	C5A	C6A	-178.77(18)
C5	C1	C2	O4	177.87(18)		C5A	C1A	C2A	O4A	176.18(19)
C5	C1	C2	N2	-2.6(3)		C5A	C1A	C2A	N2A	-2.9(3)
C5	C1	C7	C8	-109.5(2)		C5A	C1A	C7A	C8A	78.8(2)
C5	C1	C7	C11	71.6(3)		C5A	C1A	C7A	C11A	-96.6(2)
C7	C1	C2	O4	-2.0(3)		C7A	C1A	C2A	O4A	-1.8(3)
C7	C1	C2	N2	177.59(16)		C7A	C1A	C2A	N2A	179.16(16)
C7	C1	C5	C4	178.00(16)		C7A	C1A	C5A	C4A	175.89(17)
C7	C1	C5	C6	-0.5(3)		C7A	C1A	C5A	C6A	-1.9(3)
C8	N1	C9	O2	175.24(18)		C8A	N1A	C9A	O2A	169.92(19)
C8	N1	C9	C10	-5.4(3)		C8A	N1A	C9A	C10A	-8.9(3)
C8	C7	C11	C10	-0.3(3)		C8A	C7A	C11A	C10A	3.0(3)
C8	C7	C11	C12	-178.45(18)		C8A	C7A	C11A	C12A	-174.84(18)
C9	N1	C8	O1	176.67(18)		C9A	N1A	C8A	O1A	-172.43(18)
C9	N1	C8	C7	-3.3(3)		C9A	N1A	C8A	C7A	4.8(3)
C9	C10	C11	C7	-8.7(3)		C9A	C10A	C11A	C7A	-7.1(3)
C9	C10	C11	C12	169.60(17)		C9A	C10A	C11A	C12A	170.89(17)
C11	C7	C8	O1	-173.40(18)		C11A	C7A	C8A	O1A	175.71(19)
C11	C7	C8	N1	6.6(3)		C11A	C7A	C8A	N1A	-1.4(3)

RejuAgro B에 대한 수소 원자 좌표(ÅХ10⁴) 및 등방성 변위 매개변수(ŲХ10³)

원자	x	y	z	U(eq)
H1	1115.22	9049.78	1137.02	31
H2	1572.72	4198.81	4837.04	27
H6A	4232.36	4076.12	1013.7	40
H6B	2564.31	5038.79	758.38	40
H6C	2062.97	3648.38	1135.45	40
H12A	-1685.96	4670.99	1066.64	51
H12B	-3421.18	5067.41	1777.57	51
H12C	-1645.33	4322.49	2204.55	51
H1A	4812.5	4134.48	6001.06	30
H2A	5506.16	-1572.03	9488.94	32
H6AC	1266.79	-381.27	6443.7	51
H6AA	2147.29	916.19	6217.2	51
H6AB	266.47	500.23	7032.58	51
H12D	6459.43	-365.46	5507.86	46
H12E	7403.89	-616.99	6460.59	46
H12F	8633.15	35.4	5415.92	46

C. RejuAgro C의 결정구조 정보.

RejuAgro B와 RejuAgro C의 메탄올 용액을 천천히 증발시켜 RejuAgro C(C₁₀H₁₆N₂O₇)의 단결정을 얻었다. RejuAgro B와 함께 오는 무색 바늘을 얻었다. 적합한 결정을 선택하여 SuperNova, Dual, Cu at home/near, Atlas 회절계에 장착했다. 결정은 데이터 수집 중에 100.05(10) K로 유지되었다. Olex2(문헌[Dolomanov et al. (2009)])를 사용하여 Charge Flipping을 사용하는 olex2.solve 구조 확인 프로그램(문헌[Bourhis et al. (2015)])으로 구조를 확인하고 ShelXL로 정제하고 ShelXL 정제 패키지(문헌[Sheldrick( 2015)])로 정제하였으며, 최소 제곱 최소화를 사용하였다.

Cu(Kα) 방사선을 사용하는 Oxford SuperNova 회절계로 100K에서 데이터세트를 수집하였다.

RejuAgro C (C₁₀H₁₆N₂O₇) (M =276.25 g/mol)에 대한 결정 데이터: 삼사정계, 공간군 P-1 (no. 2), a = 7.0334(4) Å, b = 10.2354(7) Å, c = 10.4693(7) Å, α = 116.426(7)°, β = 104.722(5)°, γ = 97.680(5)°, V = 625.72(8) ų, Z = 2, T = 100.00(10) K, μ(CuKα) = 1.081 mm^-1, Dcalc = 1.466 g/cm³, 7480 측정된 반사율 (10.068° Å 2Θ ≤ 140.528°), 2353 고유 값 (R_int = 0.0405, R_sigma = 0.0373)(모든 계산에 사용됨). 최종 R₁은 0.0504 (I > 2σ(I))이고, wR₂는 0.1388 (모든 데이터)였다.

정제 모델 설명을 OlexSys에 대해 2018.05.29 svn.r3508에 컴파일된 Olex2로 생산하였다. 리스트레인 수 - 0, 컨스트레인 수 - 알 수 없음. 세부 사항: 1. 고정 Uiso: 모든 C(H,H,H) 기의 1.5배; 2.a 회전 기로 정제된 이론적 Me: C9(H9A,H9B,H9C), C10(H10A,H10B,H10C).

도 15a와 관련하여, RejuAgro C 분자는 42°에 의해 나머지 원자의 평면 밖으로 42° 회전된 아미드 기를 갖는 평면 파이-컨쥬게이트 형태를 갖는다.

도 15b와 관련하여, 결정의 RejuAgro C 분자는 x축을 따라 적층된다. 적층은 H-결합 N-H…O를 통해 ab 평면을 따라 층으로 연결된다. 층은 용매화물 물 분자(3 mol. eq.)와 다중 수소 결합을 통해 3차원 네트워크로 연결된다.

RejuAgro C의 화학 구조는 다음과 같다:

(화학식 (III))

RejuAgro C 분자의 추가적인 결정 데이터는 표 30 내지 표 37에 제시되어 있다.

RejuAgro C에 대한 결정 데이터 및 구조 정제

확인 코드	RejuAgro C
실험식	C10H16N2O7
화학식량	276.25
온도/K	100.00(10)
결정계	triclinic
공간군	P-1
a/Å	7.0334(4)
b/Å	10.2354(7)
c/Å	10.4693(7)
α/°	116.426(7)
β/°	104.722(5)
γ/°	97.680(5)
부피/Å3	625.72(8)
Z	2
ρcalcg/cm3	1.466
μ/mm-1	1.081
F(000)	292.0
결정 크기/mm3	0.461 Х 0.063 Х 0.021
조사	CuKα (λ = 1.54184)
데이터 수집을 위한 2Θ 범위/°	10.068 내지 140.528
지수 범위	-8 ≤ h ≤ 6, -11 ≤ k ≤ 12, -12 ≤ l ≤ 12
수집 반사율	7480
독립적인 반사율	2353 [Rint = 0.0405, Rsigma = 0.0373]
데이터/리스트레인/매개변수	2353/0/214
F2 적합도	1.047
최종 R 지수 [I>=2σ (I)]	R1 = 0.0504, wR2 = 0.1270
최종 R 지수 [모든 데이터]	R1 = 0.0622, wR2 = 0.1388
최대 차이 피크/홀/ e Å-3	0.41/-0.27

RejuAgro C에 대한 분수 원자 좌표(x10⁴) 및 균등 등방성 변위 매개변수(ŲХ10³). U_eq는 직교 U_IJ 텐서의 자취의 1/3로 정의된다.

원자	x	y	z	U(eq)
O1	999(2)	3453.7(16)	3219.0(16)	25.9(3)
O1W	5100(2)	8599(2)	11132.3(18)	30.5(4)
O2	5632(2)	8416.1(16)	8638.5(17)	28.9(4)
O2W	1123(3)	6910(2)	10264(2)	38.6(4)
O3	3742(2)	8669.8(16)	6246.1(17)	28.8(4)
O3W	-137(3)	3837.8(19)	7792.6(18)	32.3(4)
O4	2491(2)	2183.1(18)	6934.3(18)	31.4(4)
N1	2349(3)	6104.7(19)	4717(2)	24.2(4)
N2	2874(3)	441(2)	4805(2)	34.3(5)
C1	1129(3)	2223(2)	3453(3)	28.0(5)
C2	2308(3)	2755(2)	4951(2)	25.9(5)
C3	2976(3)	4407(2)	5702(2)	23.6(4)
C4	4286(3)	5669(2)	7152(2)	23.7(4)
C5	4459(3)	7096(2)	7326(2)	24.7(4)
C6	3504(3)	7361(2)	6092(2)	24.9(4)
C7	2121(3)	4717(2)	4574(2)	23.4(4)
C8	2582(3)	1776(2)	5638(3)	26.6(5)
C9	-4(4)	717(3)	2106(3)	32.4(5)
C10	5482(3)	5460(3)	8426(2)	29.8(5)

RejuAgro C에 대한 이방성 변위 매개변수(ŲХ10³). 이방성 변위 계수 지수는 -2π²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…]의 형태이다.

원자	U 11	U 22	U 33	U 23	U 13	U 12
O1	26.2(7)	28.8(8)	26.6(8)	15.3(6)	10.5(6)	12.1(6)
O1W	33.2(8)	29.8(9)	28.5(8)	14.4(7)	10.2(7)	11.1(7)
O2	33.7(8)	27.5(8)	26.0(8)	13.9(6)	10.5(6)	8.5(6)
O2W	37.4(10)	43.6(10)	34.9(9)	18.6(8)	15.5(8)	10.1(8)
O3	35.1(8)	28.0(8)	32.5(8)	19.1(7)	15.4(7)	15.1(6)
O3W	34.3(8)	42.2(9)	31.9(9)	22.2(8)	16.0(7)	22.5(7)
O4	36.4(8)	36.7(8)	35.0(8)	23.6(7)	18.6(7)	19.6(7)
N1	26.1(9)	28.6(9)	26.8(9)	17.9(8)	12.0(7)	13.7(7)
N2	45.3(12)	36.3(11)	38.6(11)	25.3(9)	23.0(9)	22.9(9)
C1	27.0(10)	30.6(11)	36.2(11)	19.6(9)	18.2(9)	13.3(9)
C2	24.5(10)	28.7(11)	32.3(11)	17.4(9)	15.0(9)	12.7(8)
C3	23.1(9)	28.6(10)	28.4(10)	17.8(9)	13.2(8)	14.4(8)
C4	22.7(10)	29.7(10)	25.8(10)	16.4(9)	11.7(8)	12.7(8)
C5	22.9(10)	29.4(11)	26.0(10)	14.7(9)	11.8(8)	11.2(8)
C6	25.6(10)	30.2(11)	30.7(11)	19.3(9)	16.3(9)	15.7(9)
C7	24.1(10)	28.0(10)	26.2(10)	16.1(9)	13.2(8)	13.9(8)
C8	23.9(10)	30.7(11)	33.0(11)	19.1(9)	13.5(9)	12.5(8)
C9	34.4(12)	30.8(11)	33.5(12)	16.3(10)	13.2(10)	10.5(9)
C10	31.7(11)	33.1(11)	28.1(11)	17.7(9)	8.8(9)	14.3(9)

RejuAgro C에 대한 결합 길이

원자	원자	길이/Å		원자	원자	길이/Å
O1	C1	1.396(3)		C1	C9	1.472(3)
O1	C7	1.353(3)		C2	C3	1.455(3)
O2	C5	1.367(3)		C2	C8	1.478(3)
O3	C6	1.258(3)		C3	C4	1.431(3)
O4	C8	1.252(3)		C3	C7	1.371(3)
N1	C6	1.365(3)		C4	C5	1.373(3)
N1	C7	1.343(3)		C4	C10	1.505(3)
N2	C8	1.332(3)		C5	C6	1.453(3)
C1	C2	1.379(3)

RejuAgro C에 대한 결합 각

원자	원자	원자	각/°		원자	원자	원자	각/°
C7	O1	C1	105.97(16)		C5	C4	C10	120.77(19)
C7	N1	C6	119.61(17)		O2	C5	C4	124.31(18)
O1	C1	C9	114.99(19)		O2	C5	C6	112.35(18)
C2	C1	O1	109.38(19)		C4	C5	C6	123.24(19)
C2	C1	C9	135.6(2)		O3	C6	N1	120.46(18)
C1	C2	C3	107.33(18)		O3	C6	C5	122.8(2)
C1	C2	C8	123.9(2)		N1	C6	C5	116.74(18)
C3	C2	C8	128.4(2)		O1	C7	C3	113.39(18)
C4	C3	C2	138.62(19)		N1	C7	O1	120.70(17)
C7	C3	C2	103.93(19)		N1	C7	C3	125.9(2)
C7	C3	C4	117.30(19)		O4	C8	N2	122.2(2)
C3	C4	C10	122.16(18)		O4	C8	C2	120.68(18)
C5	C4	C3	117.05(18)		N2	C8	C2	117.1(2)

RejuAgro C에 대한 수소 결합

D	H	A	d(D-H)/Å	d(H-A)/Å	d(D-A)/Å	D-H-A/°
O2	H2	O1W	0.94(3)	1.73(3)	2.659(2)	169(3)
N2	H2A	O31	0.96(3)	1.92(3)	2.863(2)	168(3)
N1	H1	O3W2	0.97(4)	1.76(4)	2.723(2)	169(3)
O2W	H2WA	O3W	0.86(4)	2.03(4)	2.866(3)	164(3)
N2	H2B	O33	0.94(3)	2.36(3)	3.057(3)	130(2)
O1W	H1WA	O24	0.79(4)	2.46(3)	3.080(2)	136(3)
O1W	H1WA	O34	0.79(4)	2.01(4)	2.727(2)	151(3)
O1W	H1WB	O45	0.89(4)	1.88(4)	2.770(2)	175(3)
O2W	H2WB	O1W	0.92(5)	1.87(5)	2.767(3)	165(4)
O3W	H3WA	O4	0.85(3)	1.88(3)	2.724(2)	173(3)
O3W	H3WB	O2W6	0.91(4)	1.77(4)	2.677(2)	175(3)

¹+X,-1+Y,+Z; ²-X,1-Y,1-Z; ³1-X,1-Y,1-Z; ⁴1-X,2-Y,2-Z; ⁵1-X,1-Y,2-Z; ⁶-X,1-Y,2-Z

RejuAgro C에 대한 비틀림 각

A	B	C	D	각/°		A	B	C	D	각/°
O1	C1	C2	C3	-0.6(2)		C4	C3	C7	O1	176.52(16)
O1	C1	C2	C8	173.11(17)		C4	C3	C7	N1	-2.2(3)
O2	C5	C6	O3	-0.5(3)		C4	C5	C6	O3	-176.94(18)
O2	C5	C6	N1	178.06(16)		C4	C5	C6	N1	1.6(3)
C1	O1	C7	N1	178.17(16)		C6	N1	C7	O1	-179.40(16)
C1	O1	C7	C3	-0.6(2)		C6	N1	C7	C3	-0.7(3)
C1	C2	C3	C4	-174.7(2)		C7	O1	C1	C2	0.8(2)
C1	C2	C3	C7	0.2(2)		C7	O1	C1	C9	179.80(16)
C1	C2	C8	O4	-136.2(2)		C7	N1	C6	O3	179.69(17)
C1	C2	C8	N2	42.2(3)		C7	N1	C6	C5	1.1(3)
C2	C3	C4	C5	179.1(2)		C7	C3	C4	C5	4.6(3)
C2	C3	C4	C10	1.0(4)		C7	C3	C4	C10	-173.53(18)
C2	C3	C7	O1	0.3(2)		C8	C2	C3	C4	11.9(4)
C2	C3	C7	N1	-178.46(18)		C8	C2	C3	C7	-173.13(19)
C3	C2	C8	O4	36.2(3)		C9	C1	C2	C3	-179.4(2)
C3	C2	C8	N2	-145.5(2)		C9	C1	C2	C8	-5.7(4)
C3	C4	C5	O2	179.50(17)		C10	C4	C5	O2	-2.3(3)
C3	C4	C5	C6	-4.5(3)		C10	C4	C5	C6	173.71(18)

RejuAgro C에 대한 수소 원자 좌표(ÅХ10⁴) 및 등방성 변위 매개변수(ŲХ10³).

원자	x	y	z	U(eq)
H9A	-1263.03	784.93	1500.56	49
H9B	-356.49	-12.41	2434.48	49
H9C	851.94	376.04	1484.45	49
H10A	4654.31	5449.72	9047.62	45
H10B	6747.93	6301.33	9062.81	45
H10C	5824.37	4494.45	7996.93	45
H2	5530(40)	8390(30)	9510(30)	39(7)
H2A	2960(40)	-250(30)	5200(30)	43(7)
H1	1690(50)	6240(40)	3870(40)	60(9)
H2WA	840(50)	6070(40)	9430(40)	53(9)
H2B	3190(50)	290(30)	3940(40)	43(7)
H1WA	5240(50)	9470(40)	11680(40)	49(9)
H1WB	5840(60)	8290(40)	11710(40)	66(10)
H2WB	2360(80)	7470(50)	10400(50)	91(14)
H3WA	770(50)	3390(30)	7570(30)	46(8)
H3WB	-500(60)	3520(40)	8410(50)	67(11)

인용

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참조문헌의 포함

본 명세서에 인용된 모든 문헌, 간행물, 특허, 특허 출원 및 관련 자료는 본 명세서에 전문이 기재된 것처럼 참조로 포함된다.

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126796 20200625 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126797 20200625 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126798 20200625 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126799 20200625 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126800 20200625 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126801 20200625 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA-126802 20200625

Claims (53)

1. 보호 대사산물(protective metabolite)의 생산을 향상시키기 위한 박테리아를 성장시키는 방법으로서,
   i. 박테리아 발효물을 생산하기 위해 용기 내 액체 배지에서 슈도모나스 박테리아(Pseudomonas bacteria)를 성장시키는 단계로서, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:2 내지 1:10이고 용기는 약 100 내지 250 RPM의 속도로 교반되는 단계
   또는
   ii. 발효기의 액체 배지에서 슈도모나스 박테리아를 성장시켜 박테리아 발효물을 생산하는 단계로서, 발효기의 공기 유속(air flow rate)은 약 1 내지 3 L/분인 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 보호 대사산물을 포함하는 보호 상청액을 생산하기 위해 일정 시간 후에 박테리아로부터 액체 배지를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아는 슈도모나스 솔라이 0617-T307 (수탁번호 PTA-126796), 슈도모나스 솔라이 0917-T305 (수탁번호 PTA-126797), 슈도모나스 솔라이 0917-T306 (수탁번호 PTA-126798), 슈도모나스 솔라이 0917-T307 (수탁번호 PTA-126799), 슈도모나스 모셀리 0118-T319 (수탁번호 PTA-126800), 슈도모나스 모셀리 0318-T327 (수탁번호 PTA-126801), 및 슈도모나스 모셀리 0418-T328 (수탁번호 PTA-126802)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 온도는 약 10℃ 내지 35℃인, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 배지는 세포의 생산을 위한 LB 배지인, 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 배지는 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 생산을 위한 YME 배지인, 방법:
   

   

   (I) 및

   

   (II).
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 교반기(shaker) 또는 발효기 중 어느 하나를 사용할 수 있는, 방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 교반기를 사용하는 경우, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:5 내지 1:10인, 방법.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 교반기를 사용하는 경우, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:7 내지 1:9인, 방법.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 교반기를 사용하는 경우, 배지 부피 대 용기 부피의 비율은 약 1:8인, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용기는 약 200 내지 250 RPM의 속도(rate)에서 교반되는, 방법.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용기는 약 210 내지 230 RPM의 속도에서 교반되는, 방법.
13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발효기를 사용하는 경우, 발효기의 공기 유속은 약 1.5 내지 2.5 L/분이거나, 산소 농도는 5 mg/L 내지 12 mg/L인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 온도는 약 10℃ 내지 20℃인, 방법.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 온도는 약 15℃ 내지 17℃인, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 18시간 내지 7일의 기간 동안 성장되는, 방법.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 적어도 7일 동안 성장되는, 방법.
18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 1일 내지 2일의 기간 동안 성장되는, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 포함하는 농업용 조성물.
20. 제19항에 있어서, 보호 상청액, 또는 이의 대사산물의 제형은 용액(SL), 가용성 분말(SP), 가용성 과립(SG) 및 캡슐화된 제형(encapsulated formulation)으로부터 선택되는, 농업용 조성물.
21. 제19항에 있어서, 박테리아 발효물 및 세포의 제형은 현탁액 농축물(SC), 습윤 가능한 분말(wettable powder; WP) 및 수분산성 과립(WG)으로부터 선택되는, 농업용 조성물.
22. 제19항에 있어서, 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 농업용 조성물.
23. 제22항에 있어서, 애주번트는 계면활성제인, 농업용 조성물.
24. 제19항에 있어서, 애주번트는 선택된 활성 성분, 물 및 극성 용매인, 농업용 조성물.
25. 제23항에 있어서, 계면활성제는 습윤제 및 분산제로부터 선택되는, 농업용 조성물.
26. 제25항에 있어서, 계면활성제는 알킬 폴리에틸렌 옥사이드 또는 폴리프로필렌 옥사이드에 의한 습윤제인, 농업용 조성물.
27. 박테리아 작물 질병(bacterial crop disease)을 방제(controlling)하는 방법으로서,
    i. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 생산된 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 포함하는 농업용 조성물, 또는 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항의 농업용 조성물을 생산하는 단계; 및
    ii. 상기 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
28. 제27항에 있어서, 작물 질병은 흑시가토카(Black sigatoka), 잿빛진균병(Grey mould), 화상병(Fire blight), 감귤 궤양병(Citrus canker), 무름병(soft rot), 올리브 혹병(Olive knot), 토마토 박테리아 반점(Tomato bacterial speck), 박테리아 궤양병(Bacterial canker) 또는 도열병(blast) (핵과 및 이과(stone and pome fruit)), 조롱박의 각진잎무늬병(Angular leaf Spot of Cucurbits), 복숭아의 박테리아 반점(Bacterial Spot of Peach), 토마토 박테리아 반점(Tomato bacterial spot), 호두나무 마름병(walnut blight), 박테리아 시들음병(bacterial wilt), 토마토 궤양병(Tomato canker), 감자 잎마름병(Potato late blight), 사과 부패병(apple scab), 박테리아 잎마름병(bacterial leaf blight), 및 박테리아 잎줄기병(bacterial leaf streak)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 병원성 미생물은 미코스파에렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis), 보트리티스 시네리얼(Botrytis cinereal), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora ) (Ea) (특히 스트렙토마이신-내성 E. 아밀로보라 균주(streptomycin-resistant E. amylovora strains)), 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리(Xanthomonas axonopodis pv. citri) (Xac), 펙토박테리움 파르멘티에리(Pectobacterium parmentieri), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis), 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 디케야 다단티(Dickeya dadantii), 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi) (Psv), 슈도모나스 시린자에 pv. 토마토(Pseudomonas syringae pv. tomato), 슈도모나스 시린자에 pv 시린자에(Pseudomonas syringae pv syringae), 슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니(Xanthomonas campestris pv. pruni), 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스(Xanthomonas arboricola pv. juglandis), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 벤튜리아 이나에쿠알리스(Venturia inaequalis), 크산토모나스 오리자에 pv. 오리자에(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) 및 크산토모나스 시트리 pv. 시트리(Xanthomonas citri pv. citri)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 작물은 바나나, 사과, 배, 크랩애플(crabapple), 감귤, 감자, 호박, 양파, 벼, 아프리칸 바이올렛(African violet), 십자화과의 식물 종, 가지과, 당근, 감자, 토마토, 가지, 잎이 많은 채소, 호박속(squashe) 및 조롱박, 고추 및 피망을 포함하는 박과, 올리브, 올리브, 복숭아, 호두나무를 포함하는 핵과 및 이과 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
31. 어류 질병을 방제하는 방법으로서, 병원성 미생물은 플라보박테리움 컬럼나레 #2, 플라보박테리움 컬럼나레 MS-FC-4이다. 사료 첨가제, 수족관 소독제, 임의의 제형, 배열(configuration) 또는 구성(construction)에 의한 박테리아 고정 물질 (예컨대, 상기 균주를 다량 포함하는 원예 블록(gardening block))인, 방법.
32. 인간 병원성 박테리아 유발 질병을 방제하는 방법으로서, 박테리아는 E. 콜라이 O157:H7인, 방법.
33. 박테리아 작물 질병을 방제하는 방법으로서,
    약 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁹ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함하는 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
34. 제33항에 있어서, 슈도모나스 박테리아는 슈도모나스 솔라이 0617-T307 (수탁번호 PTA-126796), 슈도모나스 솔라이 0917-T305 (수탁번호 PTA-126797), 슈도모나스 솔라이 0917-T306 (수탁번호 PTA-126798), 슈도모나스 솔라이 0917-T307 (수탁번호 PTA-126799), 슈도모나스 모셀리 0118-T319 (수탁번호 PTA-126800), 슈도모나스 모셀리 0318-T327 (수탁번호 PTA-126801), 및 슈도모나스 모셀리 0418-T328 (수탁번호 PTA-126802)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 조성물은 약 5.0 x 10⁷ 내지 2.0 x 10⁸ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함하는, 방법.
36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 작물 질병은 흑시가토카, 잿빛진균병, 화상병, 감귤 궤양병, 무름병, 올리브 혹병, 토마토 박테리아 반점, 박테리아 궤양병 또는 도열병 (핵과 및 이과), 조롱박의 각진잎무늬병, 복숭아의 박테리아 반점, 토마토 박테리아 반점, 호두나무 마름병, 박테리아 시들음병, 토마토 궤양병, 감자 잎마름병, 사과 부패병, 박테리아 잎마름병, 및 박테리아 잎줄기병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 병원성 미생물은 미코스파에렐라 피지엔시스, 보트리티스 시네리얼, 에르위니아 아밀로보라 (Ea) (특히 스트렙토마이신-내성 E. 아밀로보라 균주), 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 (Xac), 펙토박테리움 파르멘티에리, 펙토박테리움 아트로셉티쿰, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸, 디케야 다단티, 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이 (Psv), 슈도모나스 시린자에 pv. 토마토, 슈도모나스 시린자에 pv 시린자에, 슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아, 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스, 랄스토니아 솔라나세아룸, 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스, 파이토프토라 인페스탄스, 벤튜리아 이나에쿠알리스, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리자에, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라 및 크산토모나스 시트리 pv. 시트리로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 작물은 바나나, 사과, 배, 크랩애플, 감귤, 감자, 호박, 양파, 벼, 아프리칸 바이올렛, 십자화과의 식물 종, 가지과, 당근, 감자, 토마토, 가지, 잎이 많은 채소, 호박속 및 조롱박, 고추 및 피망을 포함하는 박과, 올리브, 올리브, 복숭아, 호두나무를 포함하는 핵과 및 이과 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
39. 슈도모나스 박테리아로부터 보호 대사산물을 정제하는 방법으로서,
    i. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 박테리아 발효물 또는 보호 상청액, 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 의해 생산된 이의 제형을 생산하는 단계;
    ii. 에틸 아세테이트 추출에 의해 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 추출하는 단계; 및
    iii. 50% 헥산 및 50% 에틸 아세테이트를 사용하여 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 용출하거나 25% 헥산 및 75% 에틸 아세테이트를 사용하여 박테리아 발효물 또는 보호 상청액을 용출함으로써 보호 대사산물을 포함하는 용출물(eluate)을 생산하는 단계
    를 포함하는, 방법.
40. 제39항에 있어서, 슈도모나스 박테리아는 슈도모나스 솔라이 0617-T307 (수탁번호 PTA-126796), 슈도모나스 솔라이 0917-T305 (수탁번호 PTA-126797), 슈도모나스 솔라이 0917-T306 (수탁번호 PTA-126798), 슈도모나스 솔라이 0917-T307 (수탁번호 PTA-126799), 슈도모나스 모셀리 0118-T319 (수탁번호 PTA-126800), 슈도모나스 모셀리 0318-T327 (수탁번호 PTA-126801), 및 슈도모나스 모셀리 0418-T328 (수탁번호 PTA-126802)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
41. 박테리아 작물 질병을 방제하는 방법으로서,
    i. 제33항 또는 제34항의 방법에 의해 정제된 슈도모나스 박테리아로부터의 보호 대사산물을 포함하는 농업용 조성물을 생산하는 단계, 및
    ii. 상기 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
42. 제41항에 있어서, 작물 질병은 흑시가토카, 잿빛진균병, 화상병, 감귤 궤양병, 무름병, 올리브 혹병, 토마토 박테리아 반점, 박테리아 궤양병 또는 도열병 (핵과 및 이과), 조롱박의 각진잎무늬병, 복숭아의 박테리아 반점, 토마토 박테리아 반점, 호두나무 마름병, 박테리아 시들음병, 토마토 궤양병, 감자 잎마름병, 사과 부패병, 박테리아 잎마름병, 및 박테리아 잎줄기병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 병원성 미생물은 미코스파에렐라 피지엔시스, 보트리티스 시네리얼, 에르위니아 아밀로보라 (Ea) (특히 스트렙토마이신-내성 E. 아밀로보라 균주), 크산토모나스 액소노포디스 pv. 시트리 (Xac), 펙토박테리움 파르멘티에리, 펙토박테리움 아트로셉티쿰, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 브라질리엔시스, 펙토박테리움 카로토보룸 아종 카로토보룸, 디케야 다단티, 슈도모나스 사바스타노이 pv. 사바스타노이 (Psv), 슈도모나스 시린자에 pv. 토마토, 슈도모나스 시린자에 pv 시린자에, 슈도모나스 시린자에 pv. 라크리만스, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 프루니, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아, 크산토모나스 아르보리콜라 pv. 유글란디스, 랄스토니아 솔라나세아룸, 클라비박터 미치가넨시스 아종 미치가넨시스, 파이토프토라 인페스탄스, 벤튜리아 이나에쿠알리스, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리자에, 크산토모나스 오리자에 pv. 오리지콜라 및 크산토모나스 시트리 pv. 시트리로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
44. 제41항에 있어서, 병원성 미생물은 스트렙토마이신-내성 E. 아밀로보라인 병원성 E. 아밀로보라인, 방법.
45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 작물은 바나나, 사과, 배, 크랩애플, 감귤, 감자, 토마토, 가지, 잎이 많은 채소, 호박속 및 조롱박, 고추 및 피망, 올리브, 올리브, 복숭아, 호두나무를 포함하는 핵과 및 이과 식물(stone and pome fruit plant)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
46. 제41항에 있어서, 병원성 미생물은 플라보박테리움 컬럼나레 #2 및 플라보박테리움 컬럼나레 MS-FC-4로부터 선택되는, 방법.
47. 제41항에 있어서, 병원성 미생물은 E. 콜라이 O157:H7인, 방법.
48. 제41항에 있어서, 약 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁹ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함하는 상기 농업용 조성물을 작물에 적용하여 병원성 미생물의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 제48항에 있어서, 농업용 조성물은 약 5.0 x 10⁷ 내지 2.0 x 10⁸ cfu/mL 슈도모나스 박테리아를 포함하는, 방법.
50. 다음 구조 중 하나로부터 선택되는 결정질 화합물(crystalline compound):
    

    

    화학식 (I),
    
    

    

    화학식 (II), 및
    

    

    화학식 (III).
51. 제50항에 있어서, 결정질 화합물은 다음 구조이고:
    

    

    화학식 (I),
    결정질 화합물은 표 13 내지 표 22로부터 선택되는 적어도 하나의 물리적 특성을 포함하는, 결정질 화합물.
52. 제50항에 있어서, 결정질 화합물은 다음 구조이고:
    

    

    화학식 (II),
    결정질 화합물은 표 23 내지 표 29로부터 선택되는 적어도 하나의 물리적 특성을 포함하는, 결정질 화합물.
53. 제59항에 있어서, 결정질 화합물은 다음 구조이고:
    

    

    화학식 (III),
    결정질 화합물은 표 30 내지 표 37로부터 선택되는 적어도 하나의 물리적 특성을 포함하는, 결정질 화합물.
    
    
    
    
    
    
    
    

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