CN116367723A - 用于防治植物病害的假单胞菌属菌株及其代谢物 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及使用，可以抑制多种作物的多种微生物物种生长的，新的细菌菌株0617‑T307、0917‑T305、0917‑T306、0917‑T307、0118‑T319、0318‑T327和0418‑T328，由该细菌菌株产生的细胞肉汤和新代谢物的方法。所述方法包括使用所述菌株产生的新的、有效的抗微生物代谢物，其对应于具有式(I)、(II)和(III)的化合物：

Description

用于防治植物病害的假单胞菌属菌株及其代谢物

发明领域

本发明属于生物农药领域。特别地，本发明涉及可以抑制多种微生物物种生长的七种新的假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)菌株，0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328，由该细菌菌株产生的细胞肉汤和新代谢物。假单胞菌属菌株0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且分别具有ATCC登录号PTA-126796、PTA-126797、PTA-126798、PTA-126799、PTA-126800、PTA-126801和PTA-126802。

发明背景

由病原微生物引起的植物病害呈指数增长且成本高昂。植物病原生物包括真菌、细菌、支原体、病毒、类病毒、线虫或寄生开花植物。目前，存在14种由细菌生物引起的常见植物病害，包括细菌性斑点病、细菌性光点病(bacterial light)和细菌性枯萎病等。火疫病(解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、柑桔溃疡病(地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(Xac)]、细菌性叶斑病(BLS)[野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatora(XV-16)]、橄榄节疤病萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Pseudomonas Savastanoi pv.Savastanoi)(Psv)]和软腐病(甘薯软腐菌(Dickeya dadantii)、土豆果胶杆菌(Pectobacterium parmentieri)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum))是毁灭性植物病害。在全国内，防治火疫病的成本估计超过1亿美元(Norelli等人(2003))。对于柑桔溃疡病，仅在佛罗里达州，从1995年至2005年实施根除计划的成本加上对商业种植者和房主的损害的住宅柑桔的补偿接近10亿美元。

火疫病是一种仁果的毁灭性病害，其由革兰氏阴性菌解淀粉欧文氏菌的感染引起，其在世界许多地方如欧洲、德国、奥地利和瑞士影响梨和苹果(Chen等人(2009))。虽然火疫病很少杀死整个果园，但是该病害及其防治仍然引起显著的经济损失。在太平洋西北和北加州，自1991年以来每年都有小爆发(minor outbreaks)，其中至少一些地区每3至4年经历大爆发。甚至小病害爆发可能是昂贵的，因为修剪以去除受感染的植物部分导致树木受损，降低了未来生产力。例如，4年的苹果果园中根茎枯萎病的10％发病率可以导致每英亩高达3500美元的损失(Norelli等人(2003))。

微生物天然产物已提供了大量的生物化合物作为农药(Gwinn(2018))。然而，目前用于细菌性植物病害的预防方法的效果有限。当感染风险高时，抗生素硫酸链霉素(FireWall,AgroSource,Inc.)和盐酸土霉素(FireLine,AgroSource,Inc.)已经是用于对抗解淀粉欧文氏菌的主要产品。因为这些化合物也用于管理人和动物的健康，因此在作物农业中使用这些相同的抗生素可能是有争议的(Stockwell(2012))。对于硫酸链霉素，关于抗生素抗性的问题已限制了其使用(Vrancken等人(2013))。正在研究的针对火疫病的另一种抗生素是春雷霉素。一个缺点是春雷霉素的频繁剂量导致破坏植物的植物毒性作用(Adaskaveg等人(2010))。另一个缺点是与其它抗生素相比，春雷霉素的成本高。因此，春雷霉素需要配有各种其它抗生素。

在最近几十年中，已经开发了许多非抗生素产品，这些产品已经向环境保护局(EPA)登记，得到国家有机计划(National Organic Program,NOP)批准，并且销售给果树栽培者以防治火疫病(Tianna等人(2018))。历史上，在欧洲已经注册了基于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的两种产品用于火疫病防治：基于菌株QST 713的

和基于菌株BD 170的/>

(Broggini等人(2005))。基于孢子形成杆菌的生物制剂由于其持久的生存力而为生物防治提供了优势(Haas等人(2005))。在USA和德国的许多田间试验中已经证实了两种基于芽孢杆菌的生物制剂的适度成功(Aldwinckle等人(2002)；Kunz等人(2011)；Laux等人(2003))。这表明杆菌属在防治解淀粉欧文氏菌的花感染中的可能潜力。然而，芽孢杆菌属仅在低感染压力下起作用。其在中度和高度感染压力情况下无效。关于两种生物产品，得到的结果是不稳定的，在71％和0％病害抑制之间变化(Broggini等人(2005))。

预期的生物保护产品在一方面必须与解淀粉欧文氏菌有效竞争，且在另一方面必须能够定殖于靶植物的不同器官上的相同小环境(niches)。保护性细菌产生影响病原体且竞争食物和空间的次级代谢产物，从而防止解淀粉欧文氏菌与植物相关的发病机理。在此情况下，来自假单胞菌属的细菌适合上述的生物保护因子(Haas等人(2005))。对于各种植物的定殖细菌的物种组成的分析显示假单胞菌属的荧光细菌的广泛存在。

在法国，发现假单胞菌属物种是栖息在健康和患病苹果树、梨和山楂的群体的主要组分，并且其中许多细菌显示限制解淀粉欧文氏菌在体外生长的能力(Paulin等人(1978))。然而，几乎没有报道有效代谢物的信息。

在加州，Thomson等人(1976)选择了三种对梨花朵保护有效的荧光假单胞菌(Thomson等人(1976))。在20世纪80年代中期，从加州梨树叶中分离的荧光假单胞菌(P.fluorescens)菌株A506显示限制解淀粉欧文氏菌生长的独特活性以及针对火疫病保护苹果和梨的保护能力(Lindow等人(1996))。已经开发了含有荧光假单胞菌的产品

A506，自1996年以来市售可得。在加州、俄勒冈州和华盛顿州进行的许多实验证实了该制备物在各种苹果和梨保护计划中有用(Johnson(2000))。

在英国，使用荧光假单胞菌的两种分离株保护山楂的花和幼苗(Wilson等人(1992))。

在意大利和新西兰，已经研究了用符号BO 3371和BO G19表示的假单胞菌属的两种菌株的适用性(Galasso等人(2002))。在温室条件下，它们高度有效地保护苹果和梨的花以及幼苗。例如，菌株BO3371对梨幼苗的相对保护可以达到87％(Galasso等人(2002))。然而，得到的结果并不总是一致的，这可能与从花开到开花结束的时间段长度相结合的花易感性有关。

在新西兰，荧光假单胞菌属物种IPV-BO G19菌株在田间条件下保护79％的苹果花朵。在另一个实验果园中，当在接种解淀粉欧文氏菌前24小时喷洒在‘Braeburn’苹果花上时，荧光假单胞菌属物种IPV-BO G19和IPV-BO 3371分别降低了火疫病发病率78％和58％(Biondi等人(2006))。

在西班牙，在田间测定中，菌株EPS62e荧光假单胞菌在对苹果花朵、梨果实和梨花朵的测试中显著限制了火疫病。通过将营养增强和渗透适应(osmoadaptation)组合的策略获得荧光假单胞菌EPS62e对抗火疫病的适合度和功效的改善。用生理学改善的荧光假单胞菌EPS62e对梨花朵进行的田间处理产生的效率可以高达90％，然而，结果根据测试而不同(Cabrefiga等人(2011)；Mikiciński等人(2020))。

在波兰，已经从苹果叶际(phyllosphere)和土壤中分离出47种能够降低火疫病对梨小果的影响的细菌菌落(Mikiciński等人(2008))。

已经综合评论了由革兰氏阴性假单胞菌属物种产生的代谢物(Masschelein等人(2017))。假单胞菌属代谢物的类型可以分类为酚类化合物、吩嗪、脂肽等。假单胞菌属物种及其代谢物的功能包括以下(Alsohim等人(2014))：1)产生激素或诱导全身抗性；2)许多天然存在的菌株也显著地改善植物生长(植物生长调节剂、IAA、粘液菌素)；3)拮抗作用可以通过产生铁载体和表面活性剂(例如，粘液菌素和粘液菌素酰胺)以及抗微生物化合物(例如，氰化氢、吩嗪、硝吡咯菌素或2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG))来赋予。在我们的研究中，鉴定了细菌菌株，由细菌产生发酵物和新代谢物；特别是RejuAgro A和RejuAgro B，对多种病原微生物(包括尚未报道的细菌和真菌)显示较高的效力。

需要来源于新菌株的新的生物农药，由这样的菌株产生的细胞肉汤和新代谢物，其可以抑制多种引起作物病害的病原体生长。

发明简述

在第一方面，提供一种培养细菌以增强保护性代谢物的产生的方法。所述方法包括可替代步骤。在一种方法中，提供使假单胞菌属细菌在容器中的液体培养基中生长的步骤。培养基体积与容器体积的比例在约1:2至1:10之间，并且以在约100至250RPM之间的速率振荡容器。根据一个可替代步骤，所述方法包括使假单胞菌属细菌在发酵罐中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物。发酵罐的空气流速在约1至3L/min之间。溶解氧的浓度在5mg/L至12mg/L之间。

在第二方面，提供包含细菌发酵物或保护性上清液的农业组合物。农业组合物是根据第一方面和关于第一方面公开的任何方面的方法产生的。在第一方面，农业组合物进一步包括佐剂。在这点上，佐剂是表面活性剂。

在第三方面，提供一种防治细菌性作物病害的方法。所述方法包括若干步骤。第一步骤包括产生包含通过第一方面或其任何方面产生的细菌发酵物或保护性上清液的农业组合物。第二步骤包括向作物施用所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。

在第四方面，提供一种防治细菌性作物病害的方法。所述方法包括一个步骤。一个步骤包括向作物施用包含在约1.0×10⁵至1.0×10⁹cfu每mL之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制病原微生物的生长。

在第五方面，提供一种纯化来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的方法。所述方法包括几个步骤。第一步骤包括通过第一方面及其相关方面产生细菌发酵物或保护性上清液。第二步骤包括通过具有类似极性或特性的溶剂混合物来提取细菌发酵物或保护性上清液。第三步骤包括通过使用己烷和乙酸乙酯的混合物来洗脱细菌发酵物或保护性上清液或者通过使用己烷和乙酸乙酯的混合物来洗脱细菌发酵物或保护性上清液，产生含有保护性代谢物的洗脱液。

在第六方面，包含通过第五方面及其相关方面纯化的、来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的农业组合物。

在第七方面，提供一种防治细菌性作物病害的方法。所述方法包括几个步骤。第一步骤包括产生通过第五方面或其任何方面的方法纯化的、来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的农业组合物。第二步骤包括施用所述农业组合物，保护性上清液或其代谢物的制剂可以是溶液(SL)、可溶性粉末(SP)、可溶性颗粒(SG)和微囊制剂。另外，细菌发酵物和细胞的制剂的农业组合物可以是悬浮浓缩物(SC)、可湿性粉末(WP)和水可分散性颗粒(WG)。

在第八方面，结晶化合物选自以下结构之一：

附图简述

图1示例显示了基于16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD的串联比对的代表性假单胞菌谱系的最大可能性系统发生的示例性图。自引支持度值(bootstrap support values)标记在接受<100％支持度的四个内部分支下方。未标记的代表100％支持度。

图2示例显示了菌株0617-T307的乙酸乙酯提取物的测定引导的分离的实例。

图3描绘了显示在其中RejuAgro A分布在细胞肉汤、上清液和细胞中的摇瓶发酵中RejuAgro A的量(图A)和随时间推移从细胞发酵中产生RejuAgro A(图3)的示例性培养图。

图4描绘了显示在第14天，苹果黑星菌可以在仅具有PDA而没有添加剂的PDA平板(A平板)；具有0.25％的0.01M PBS(B平板)或0.8％ DMSO(C平板)或1.6％ DMSO(D平板)的PDA平板上生长的示例性琼脂平板。

图5描绘了显示在第14天，苹果黑星菌在含有所选择的四种生物防治细菌的PDA平板(A平板：0617-T307；B平板：0118-T319；C平板：0318-T327；D平板：0418-T328)的PDA平板上不能生长的示例性琼脂平板。

图6描绘了在第14天，苹果黑星菌在含有40-80μg/mL的RejuAgro A的PDA平板(A板：在PDA平板中10μg/mL；B平板：在PDA平板中20μg/mL；C平板：在PDA平板中40μg/mL；D平板：在PDA平板中80μg/mL)中不能生长的示例性琼脂平板。

图7描绘了在第14天，苹果黑星菌在含有10-80μg/mL RejuAgro B的PDA平板(A平板：在PDA平板中10μg/mL；B平板：在PDA平板中20μg/mL；C平板：在PDA平板中40μg/mL；D平板：在PDA平板中80μg/mL)中可以生长的示例性琼脂平板。

图8描绘了在第14天，苹果黑星菌在含有200-1000μg/mL的硫酸铜的PDA平板(A平板：含有500μg/mL的CuSO₄的PDA平板；B平板：含有1000μg/mL的CuSO₄的PDA平板)上可以生长的示例性琼脂平板。

图9描绘了在407nm的波长处，通过HPLC分析的RejuAgro A的示例性量-峰面积曲线。

图10描绘了关于从不同细菌菌株产生RejuAgro A的示例性数据。

图11描绘了针对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)CA17的示例性抗真菌测定法，其中图A描绘了(1)以50mg/mL的40μL制霉菌素，(2)40μL的DMSO；图B描述了(1)M9培养基，24小时，(2)M8培养基，24小时，(3)M7培养基，24小时，(4)M6培养基，24小时；图C描绘了(1)M9培养基，12小时，(2)M8培养基，12小时，(3)M7培养基，12小时，和(4)M6培养基，12小时。

图12描绘了在600μg/mL的RejuAgro A的存在下(图A)显示抑制性生长，但是在60μg/mL的RejuAgro A的存在下(图B)或在没有RejuAgro A的存在下(图C)显示生长的斐济球腔菌(M.fijiensis)的示例性琼脂平板。

图13A描绘了如具有平面结构的RejuAgro A分子，其中S-Me基团相对于杂环仅旋转8.7°。分子中在C4-C5键处存在π-共轭的显著断裂

——显然，这是因为一些轨道原因。与sp²碳原子连接的Me-基团在2个位置上可旋转地无序化(disordered)。

图13B描绘了晶体中的RejuAgro A分子通过N-H...O相互作用形成中心对称的H-键合二聚体。此外，这些二聚体通过较弱的C-H...O相互作用沿[-3 0 1]平面形成二维层。

图14A描绘了具有两个对称独立的RejuAgro B分子的RejuAgro B晶体。每个分子具有扭转的结构，其中经连接杂环的平均平面之间的双面角为70.3°和80.6°。每个杂环中在两个邻近羰基之间的C(sp²)-C(sp²)键(键长为

范围)处存在π-共轭的显著断裂(键长在/>

范围内)—显然，这是因为一些轨道原因。

图14B描绘了晶体中的RejuAgro B分子通过N-H...O相互作用形成中心对称的H-键合二聚体。这些二聚体沿x方向通过其它N-H...O相互作用以堆叠连接。最后，堆叠通过第三种N-H..O相互作用沿着[011]连接成层。

图15A描绘了具有平面π共轭形状的RejuAgro C分子，其中酰胺基团从其余原子的平面旋转42°。

图15B描绘了晶体中的RejuAgro C分子沿着x-轴堆叠。堆叠沿着ab平面通过H-键N-H…O连接成层。层通过与溶剂化物水分子(3mol.eq.)的多个氢键连接成3-维网络。

详细说明

本发明涉及一种由本专利中列出的7种假单胞菌属菌株如0617-T307产生的新代谢物，其表现出针对病原微生物(包括细菌和真菌)的抗微生物活性。由16S rRNA和其他管家基因序列，可以将菌株鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)群中的土壤假单胞菌(Pseudomonas Soli)0617-T307。7种细菌菌株(例如0617-T307)的细胞肉汤含有新的、有效的6元杂环天然产物，其被命名为Rejuagro A，以及二聚体Rejuagro B，如下所示：

这些化合物、其制备方法和用于抑制植物微生物病原体的应用在本文中更详细地公开。

定义

当介绍本公开内容或特定实施方案的各个方面的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包含性的，并且意味着可能存在除所列要素之外的附加要素。除非另有说明，否则术语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。

如本文所预期的，术语“基本上”、“大约”和“约”以及类似术语旨在具有与本公开内容的主题所属领域中的常见和公认用法相一致的广泛含义。阅读本公开内容的本领域技术人员应当理解，这些术语旨在允许描述所述的和要求保护的某些特征，而不将这些特征的范围限制于所提供的精确数值范围。因此，这些术语应当被解释为指示对所述的和要求保护的主题的非实质性或无关紧要的修饰或改变被认为在如所附权利要求中所述的本发明的范围内。

“生物防治剂(或BCA)”是一种安全、可持续和成本有效地管理有害生物如病原体、杂草和昆虫的方式。将这些试剂引入环境中以靶向有害生物物种，目的是减少环境中有害生物的种群或丰度。

“生物制剂”是在宿主上产生菌落的活微生物(细菌和酵母)的制备物。这些微生物主要用于在附生阶段期间延缓病原体积累(Tianna等人(2018))。

“生物合理性”是应用于基于微生物的生物农药的术语。这些生物农药通常通过使微生物菌株发酵来制备。这些产品中的大多数同时具有抗细菌和抗真菌活性(Tianna等人(2018))。

“生物农药”被美国环境保护局(EPA)定义为来源于天然材料的农药，并且将其分类为含有通过无毒机制防治害虫的物质的生物化学农药，由通常产生生物活性天然产物(BNP)的微生物组成的微生物农药，或由于添加的遗传物质而具有由植物产生的活性的植物掺入保护剂Gwinn K.D.(2018))。

称为Rejuagro A、Rejuagro B和Rejuagro C的化合物分别对应于具有式(I)、(II)和(III)的化学化合物，如下所示：

在第一方面，提供一种培养细菌以增强保护性代谢物的产生的方法。所述方法包括可替代步骤。在一种方法中，提供使假单胞菌属细菌在容器中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物的步骤。培养基体积与容器体积的比例在约1:2至1:10之间，并且以在约100至250RPM之间的速率振荡容器。根据一个可替代步骤，所述方法包括使假单胞菌属细菌在发酵罐中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物。发酵罐的空气流速在约1至3L/min之间。在一个方面，所述方法进一步包括在一段时间之后，将液体培养基与细菌分离以产生包含保护性代谢物的保护性上清液的步骤。在第二方面，细菌包括选自0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328的假单胞菌属菌株。在第三方面，生长温度在约10℃和35℃之间。在第四方面，液体培养基是用于生产细胞的LB/YME培养基。在第五方面，液体培养基是用于生产Rejuagro A的YME培养基。在第六方面，培养基体积与容器体积的比例在约1:5和1:10之间。在第七方面，培养基体积与容器体积的比例在约1:7和1:9之间。在第八方面，培养基体积与容器体积的比例为约1:8。在第九方面，以约200至250rpm之间的速率振荡容器。在第十方面，以约210至230rpm的速率振荡容器。在第十一方面，发酵器的空气流速在约1.5至2.5L/min之间，并且溶解氧的浓度在5mg/L至12mg/L之间。在第十二方面，生长温度在约10℃至20℃之间。在第十三方面，生长温度在约15℃至17℃之间。在第十四方面，使细菌生长18小时至7天的时间段。在第十五方面，使细菌生长七天的时间段。在第十六方面，使细菌生长一至两天的时间段。

在第二方面，提供包含细菌发酵物或保护性上清液的农业组合物。农业组合物是根据第一方面和关于第一方面公开的任何方面的方法产生的。在第一方面，农业组合物进一步包括佐剂。在这点上，佐剂是表面活性剂。

在第三方面，提供一种防治细菌性和真菌性作物病害的方法。所述方法包括若干步骤。第一步骤包括产生包含通过第一方面或其任何方面产生的细菌发酵物或保护性上清液的农业组合物。第二步骤包括向作物施用所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。

在第一方面，作物病害选自由以下组成的组：番茄和胡椒的火疫病、柑桔溃疡病、橄榄节疤病和软腐病。在第二方面，病原微生物选自由以下组成的组：斐济球腔菌(Mycosphaerella fijiensis)、灰葡萄孢(Botrytis cinereal)、解淀粉欧文氏菌(Ea)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(Xac)、土豆果胶杆菌(Pectobacterium parmentieri)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(Pectobacteriumcarotovorum Subsp.brasiliensis)、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum Subsp.carotovorum)、甘薯软腐菌(Dickeya dadantii)、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Pseudomonas Savastanoipv.Savastanoi)(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas Syringaepv.tomato)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas Syringae pv.syringae)、丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas Syringae pv.lachrymans)、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种(Xanthomonas campestrispv.pruni)、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria)、居树黄单胞菌核桃致病变种(Xanthomonas arboricolapv.juglandis)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia Solanacearum)、密执安棍状杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis Subsp.michiganensis)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)、苹果黑星菌(Venturia inaequalis)、水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、水稻黄单孢菌条斑致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种(Xanthomonas citri pv.citri)。在第三方面，作物选自以下的一种或多种：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，南瓜，洋葱，稻，非洲紫罗兰，十字花科、茄科、葫芦科的植物物种包括胡萝卜、马铃薯、番茄、茄子、绿叶蔬菜、倭瓜和葫芦，胡椒和青椒，橄榄，核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。

在第四方面，提供一种防治细菌性作物病害的方法。所述方法包括一个步骤。步骤包括向作物施用包含在约1.0×10⁵至1.0×10⁹cfu每mL之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制病原微生物的生长。

在第一方面，假单胞菌属细菌是选自0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328的假单胞菌属菌株。在第二方面，组合物包含约5.0×10⁷至2.0×10⁸cfu每ml的假单胞菌属细菌。在第三方面，作物病害选自由以下组成的组：香蕉黑叶斑病、灰霉病、火疫病、柑桔溃疡病、软腐病、橄榄节疤病、番茄细菌性斑块病、细菌性溃疡病或瘟病(核果和仁果)、葫芦属的角斑病、桃的细菌性斑点病、番茄细菌性斑点病、核桃疫病、细菌性枯萎病、番茄溃疡病、马铃薯晚疫病、苹果黑星病、细菌性叶枯病和细菌性叶条斑病。在第四方面，病原微生物选自由以下组成组：斐济球腔菌、灰葡萄孢、解淀粉欧文氏菌(Ea)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xac)、土豆果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、甘薯软腐菌(Dickeyadadantii)、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌黄瓜致病变种、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种、居树黄单胞菌核桃致病变种、青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种、致病疫霉、苹果黑星菌、水稻黄单孢菌水稻致病变种、水稻黄单孢菌条斑致病变种和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种。在第五方面，作物选自以下的一种或多种：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，南瓜，洋葱，稻，非洲紫罗兰，十字花科、茄科、葫芦科的植物物种包括胡萝卜、马铃薯、番茄、茄子、绿叶蔬菜、倭瓜和葫芦，胡椒和青椒，橄榄，核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。

在第五个方面，提供纯化来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的方法。所述方法包括几个步骤。第一步骤包括通过第一方面及其相关方面的方法产生细菌发酵物或保护性上清液。第二步骤包括通过乙酸乙酯提取来提取细菌发酵物或保护性上清液。第三步骤包括通过使用己烷和乙酸乙酯的混合物(例如，50％己烷和50％乙酸乙酯的混合物)来洗脱细菌发酵物或保护性上清液或者通过使用己烷和乙酸乙酯的混合物(例如，25％己烷和75％乙酸乙酯的混合物)来洗脱乙酸乙酯提取物，产生含有保护性代谢物的洗脱液。

在第一方面，假单胞菌属细菌是选自0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328的假单胞菌属菌株。

在第六方面，包含通过第五方面及其相关方面纯化的、来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的农业组合物。

在第七方面，提供一种防治细菌性作物病害的方法。所述方法包括若干步骤。第一步骤包括产生包含通过第五方面或其任何方面纯化的、来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的农业组合物。第二步骤包括向作物施用所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。

在第一方面，作物病害选自由以下组成的组：番茄和胡椒的火疫病、柑桔溃疡病、橄榄节疤病和软腐病。在第二方面，病原微生物选自由以下组成的组：斐济球腔菌、灰葡萄孢、解淀粉欧文氏菌(Ea)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xac)、土豆果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、甘薯软腐菌(Dickeyadadantii)、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌黄瓜致病变种、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种、居树黄单胞菌核桃致病变种、青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种、致病疫霉、苹果黑星菌、水稻黄单孢菌水稻致病变种、水稻黄单孢菌条斑致病变种和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种。在第三方面，致病性解淀粉欧文氏菌是链霉素抗性解淀粉欧文氏菌。在第四方面，作物选自以下的一种或多种：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，南瓜，洋葱，稻，非洲紫罗兰，十字花科、茄科、葫芦科的植物物种包括胡萝卜、马铃薯、番茄、茄子、绿叶蔬菜、倭瓜和葫芦，胡椒和青椒，橄榄，核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。在第五方面，病原细菌是柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)#_2、柱状黄杆菌MS-FC-4。在第六方面，病原细菌是大肠杆菌O157:H7。

在第八方面，提供选自以下结构之一的结晶化合物：

在第一方面，结晶化合物是以下结构：:

其中结晶化合物包括选自表13-22的至少一种物理性质。

在第二方面，结晶化合物是以下结构：

其中结晶化合物包括选自表23-29的至少一种物理性质。

在第三方面，结晶化合物是以下结构：

其中结晶化合物包括选自表30-37的至少一种物理性质。

生物保藏信息

将细菌菌株土壤假单胞菌0617-T307、土壤假单胞菌0917-T305、土壤假单胞菌0917-T306、土壤假单胞菌0917-T307、摩氏假单胞菌0118-T319、摩氏假单胞菌0318-T327和摩氏假单胞菌0418-T328于2020年6月25日提交给美国典型培养物保藏中心

P.O.Box 1549,Manas Sas,VA 20110USA(“ATCC Patent Depository”)，并且分别被给予非官方ATCC专利号PTA-126796、PTA-126797、PTA-126798、PTA-126799、PTA-126800、PTA-126801和PTA-126802。在存活测试之后，ATCC专利保藏机构给予这些保藏的细菌菌株以下登录号，2020年6月25日生效：土壤假单胞菌0617-T307(登录号PTA-126796)、土壤假单胞菌0917-T305(登录号PTA-126797)、土壤假单胞菌0917-T306(登录号PTA-126798)、土壤假单胞菌0917-T307(登录号PTA-126799)、摩氏假单胞菌0118-T319(登录号PTA-126800)、摩氏假单胞菌0318-T327(登录号PTA-126801)和摩氏假单胞菌0418-T328(登录号PTA-126802)。

实施例

实施例1.菌株0617-T307的鉴定和表征

分析了来自16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD的部分序列。这四种基因是假单胞菌属物种中用于多基因座序列分析(MLSA)的推荐标志物(Peix等人(2018))。

对于物种分配，使用这四个序列针对NCBI非冗余核苷酸数据库运行BLASTN。基于该结果，菌株0617-T307与荧光假单胞菌谱系内恶臭假单胞菌群中的假单胞菌属物种密切相关。使用(Peix等人(2018)；参见Peix等人(2018)中的图2和表2)的“MLSA种系发生”和“来自假单胞菌属物种的模式菌株的基因组列表”作为用于分类单元采样的指导(图1)。基于该信息，从GenBank获得基因组。包括恶臭假单胞菌群中具有高质量基因组组装的所有物种。因为0617-T307与土壤假单胞菌具有最高的rpoD(即，对于假单胞菌属物种分配具有最高分辨功能的基因)序列相似性，所以在采样中包括所有四种可用的土壤假单胞菌基因组(包括土壤假单胞菌的模式菌株，LMG 27941^T)。对于荧光假单胞菌谱系中的其他物种，为各群选择一个物种作为代表。包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(铜绿假单胞菌群；铜绿假单胞菌谱系)作为对树寻根的外群。

从采样的基因组中提取MLSA的4个基因。单独比对每个基因，然后将所有四个核苷酸比对连接用于种系发生分析。串联的比对包含9,912个比对的核苷酸位点。使用PhyML进行最大可能性推断(Guindon等人(2003))。通过1,000次重复评估自引支持度。

基于多基因座分子种系发生(图1)，0617-T307和所有四种具有可获得的基因组序列的土壤假单胞菌属菌株形成具有100％自引支持度的单系分支。该结果提供用于将0617-T307分配给土壤假单胞菌(一种模式菌株)的强有力的支持，据报道该模式菌株是从来自西班牙内华达山脉国家公园的土壤样品中分离的(Pascual等人(2014))。

此外，基于由García-Valdés和Lalucat((García-Valdés等人(2016))提供的假单胞菌属物种分配指南，将0617-T307分配给土壤假单胞菌的其它支持包括：(a)16S rDNA>98.7-99％相同。与土壤假单胞菌的模式菌株相比，0617-T307共享99.2％的序列同一性。与姐妹种嗜虫假单胞菌(P.entomophila)相比，0617-T307共享99.5％的序列同一性。注意，已知16S rDNA缺乏用于假单胞菌属中物种鉴定的足够分辨能力(García-Valdés等人(2016)；Peix等人(2018))；(b)rpoD基因>95-96％相同。与土壤假单胞菌的模式菌株相比，0617-T307共享96.5％的序列同一性。与姐妹种嗜虫假单胞菌相比，0617-T307仅共享89.1％的序列同一性；和(c)MLSA>97％相同。与土壤假单胞菌的模式菌株相比，0617-T307共享98.0％的序列同一性。与姐妹种嗜虫假单胞菌相比，0617-T307仅共享95.1％的序列同一性。

实施例2.从菌株0617-T307的细胞肉汤的乙酸乙酯提取物中制备、分离和表征RejuAgro A和RejuAgro B.

Rejuagro A和B的制备物可以通过对来自发酵罐发酵的细胞肉汤进行乙酸乙酯萃取，接着进行色谱分离和纯化来获得。简而言之，将储备细菌假单胞菌属物种0617-T307划线在LB平板(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；NaCl，10g/L；琼脂，15g/L；水)上，并在28℃培养箱中生长24h。为了制备种子培养基，将单个0617-T307菌落接种到含有500ml高压灭菌的YME培养基(酵母提取物，4g/L；葡萄糖4g/L和麦芽提取物10g/L)的2.0L烧瓶中，并在28℃以200rpm的振荡速度生长24h。然后，将种子培养基接种到含有12L高压灭菌的YME培养基的20L NBS发酵罐中。发酵在16℃进行1-7天。搅拌速度和空气流速分别为200rpm和2L/min。

在收获之后，用乙酸乙酯提取细菌培养物4次。分离乙酸乙酯层，使用硫酸钠进行脱水，并在35℃通过旋转蒸发进行干燥。这从菌株0617-T307的12L培养物中得到2.9g粗提取物。

将浓缩的样品溶解在乙酸乙酯中，并与硅胶混合，将硅胶填充为注射柱

并安装在装备有UV检测器的快速色谱系统(Yamazen AI-580)上的硅胶Universal柱(4.8×18.5cm)顶部。在加载样品之后，通过280mL按照递增极性顺序的每种以下溶剂来洗脱样品：100％己烷、75％己烷/25％乙酸乙酯、50％己烷/50％乙酸乙酯、25％己烷/75％乙酸乙酯、100％乙酸乙酯、50％乙酸乙酯/50％丙酮、100％丙酮、和100％甲醇。以20mL/min的流速洗脱样品。在UV 254nm处监视洗脱液，并通过时间模式以20mL/管收集级分。总之，存在114个由快速色谱产生的级分或管。

将产生的级分用于随后的平板测定。将1mL的每种级分挑取到1.5mL试管中，并通过Eppendorf真空浓缩器进行真空干燥。将干燥的样品溶于50μL的DMSO中，其中2μL用于平板测定。简言之，将解淀粉欧文氏菌273划线到LB平板上，以在28℃培养箱中生长，并将24h后获得的单个菌落接种到5mL LB培养基中，以允许在28℃振荡器以200rpm过夜生长。将细菌在无菌水中以1:100稀释，将225μl铺板到50％的LB平板(胰蛋白胨，5.0g/L；酵母提取物，2.5g/L；NaCl，5.0g/L；琼脂，15g/L)上。在生物安全柜中干燥10min之后，然后将每个级分的DMSO溶液分配到培养皿的其预标记部分，并使其再干燥10min。与测定一起，DMSO和春雷霉素分别用作阴性和阳性对照。然后，将平板在28℃培养箱中孵育，并在一天后检查抑制区。

对114个级分的体外平板测定显示两个级分抑制解淀粉欧文氏菌273的生长。值得注意的是，通过50％己烷/50％乙酸乙酯洗脱的级分/管38-40(其缩写为T3840或Flash-Rejuagro A)具有相对大的清除区，这可能有前景进行进一步测试。该测定中的其他生物活性化合物在级分50-52中(其编码为T5052)。这些级分用25％己烷/75％乙酸乙酯进行洗脱。

级分3840和5054的制备型HPLC(Prep-HPLC)纯化导致分别发现15mg黄色化合物Rejuagro A(RTL 7.5)和103.3mg深绿色化合物Rejuagro B。可以将RejuAgro A溶于甲醇和氯仿中。RejuAgro B(Rt10.5)不能很好地溶于甲醇或氯仿中，但是其可以很好地溶于二甲亚砜(DMSO)中，呈深绿色。这两种化合物的结构已经通过高分辨率质谱(HR-MS)、红外(IR)、紫外(UV)、1D和2D核磁共振(NMR)以及X射线晶体结构分析进行研究。显示这两种化合物在结构上相似，化合物Rejuagro A含有7种类型的碳基团(三种类型的羰基、两种类型的叔碳、两种类型的甲基碳)，但Rejuagro B缺乏一种类型的甲基，如下所示：

通过于室温缓慢蒸发其氯仿溶液进一步获得Rejuagro A晶体。晶体被鉴定为橙色片状物。在100K处用Oxford SuperNova衍射仪使用Cu(Kα)辐射收集数据集。该分子具有平面结构-其中S-Me(甲基)基团相对于杂环仅旋转8.7°。该分子中在C4-C5键

处存在π-共轭的显著断裂—显然，这是因为一些轨道原因。与sp²碳原子连接的Me-基团在2个位置上可旋转地无序化。晶体中的分子通过N-H...O相互作用形成中心对称的H-键合二聚体。此外，这些二聚体通过较弱的C-H…O相互作用沿[-3 0 1]平面形成二维层。RejuAgro A分子表示6元杂环[-NH-C(＝O)-C(-SMe)＝C(-Me)-C(＝O)-C(＝O)-]。Rejuagro B的晶体被鉴定为三斜晶。Rejuagro B的结构含有两个对称独立的分子。每个分子具有扭曲的结构—在连接的杂环的平均平面之间的二面角为70.3和80.6°。每个杂环中在两个邻近羰基之间的C(sp²)-C(sp²)键(键长在/>

范围内)处存在π-共轭的显著断裂—显然，这是因为一些轨道原因。晶体中的分子通过N-H...O相互作用形成中心对称的H-键合二聚体。这些二聚体沿x方向通过其他N-H…O相互作用以堆叠连接。最后，堆叠通过第三种N-H…O相互作用沿[0 11]连接成层，当使用Rejuagro B溶液进行晶体生长时，获得两种晶体，并命名为RejuAgro B和RejuAgro C。RejuAgro B和RejuAgro C两者的晶体具有非常相似的分子质量(参见实施例20)。

RejuAgro A、RejuAgro B和RejuAgro C的晶体结构信息在实施例20中给出，其内容构成本申请的一部分，并通过引用整体并入本文。

RejuAgro A的分子式是C₇H₇NO₃S，分子量：185.2004。这与HR-MS数据中在m/z186.2177(理论值186.2083)处[M+H]的观察到的分子种类一致。RejuAgro B的分子式为C₁₂H₈N₂O₆S，分子量：276.2017。这与HR-MS数据中在m/z 275.0278(理论值275.1960)处[M-H]的观察到的分子种类一致。自从2020年8月4日的CCDC结构数据库检索表明没有RejuAgroA、RejuAgro B和RejuAgro C的晶体结构。其它化学数据库如SciFinder、Reaxys和GooglePatents和专利相关数据库检索证明没有RejuAgro A或RejuAgro C的类似物，除了从SciFinder和Reaxys中找到RejuAgro B的一个参考文献(Knackmus S等人(1968))。

实施例3.来自菌株0617-T307的RejuAgro A和RejuAgro B的体外抗微生物活性

测定了RejuAgro A和RejuAgro B对五种类型细菌的MIC值：野生型革兰氏阴性植物致病细菌、链霉素抗性解淀粉欧文氏菌、引起鱼病害的细菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性人类致病细菌和RejuAgro A的生产者(菌株0617-T307)。根据CLSI抗微生物敏感性测试(AST)标准进行抗微生物测定。简言之，将每种测试细菌的储备溶液划线在LB(Luria-Bertani)平板(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；钠盐，10g/L；琼脂，15g/L)上。对于特殊培养，使用NA(营养肉汤+琼脂)平板(牛肉提取物，3g/L；酵母提取物，1g/L；聚蛋白胨，5g/L；蔗糖，10g/L；和琼脂，15g/L)用于Xac。SHIEH(胰蛋白胨，5g/L；酵母提取物，0.5g/L；乙酸钠，0.01g/L；BaCl₂(H₂O)₂，0.01g/L；K₂HPO₄，0.1g/L；KH₂PO₄，0.05g/L；MgSO₄·7H₂O，0.3g/L；CaCl₂·2H₂O，0.0067g/L；FeSO₄·7H₂O，0.001g/L；NaHCO₃，0.05g/L；琼脂，10g/L)和TYES(胰蛋白胨4g/L；酵母提取物0.4g/L；MgSO₄，0.5g/L；CaCl₂ 0.5g/L；pH至7.2，琼脂，15g/L)分别用于柱状黄杆菌菌株MS-FC-4和#2。之后，从平板上挑取出单个菌落，并接种到相应的液体培养基中生长过夜。将培养物在LB或相应培养基中稀释至OD₅₉₀＝0.01，并且以200μL/孔分布在96孔板中。稀释化合物RejuAgro A和RejuAgro B和链霉素，并将4μL的各个浓度加入到各孔中，以制备以下最终浓度：40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.078μg/mL。使用媒介物水(用于链霉素)或DMSO(用于RejuAgro A和RejuAgro B)作为对照。

测定结果显示RejuAgro A而不是RejuAgro B是菌株0617-T307的最具活性的代谢物。当与对革兰氏阳性MRSA(MIC＞40μg/ml)和革兰氏阴性大肠杆菌O157:H7(一种引起人腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒症综合征(HUS)的重要食源性和水源性病原体)(MIC＝40μg/ml)的作用相比时，RejuAgro A针对试验细菌特别有效，MIC值为5-40μg/ml。对于菌株解淀粉欧文氏菌1189、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种、萨氏假单胞菌萨氏致病变种、土豆果胶杆菌UPP163 936、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种944、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种wpp14 945、甘薯软腐菌3937，RejuAgro A的抗微生物活性与链霉素相当，其对于解淀粉欧文氏菌，显示5μg/mL的MIC值，并且对于其它软致病细菌显示20-40μg/mL的MIC值。黄单胞菌属细菌对链霉素非常敏感，MIC值为0.16μg/mL，这低于对于RejuAgro A的MIC值5μg/mL。RejuAgro A对于萨氏假单胞菌萨氏致病变种的MIC值为40μg/mL。RejuAgro A对于居树黄单胞菌核桃致病变种219的MIC值为6.25μg/mL。RejuAgro A对于青枯雷尔氏菌K60和Pss4的MIC值分别为3.13和6.25μg/mL。RejuAgro A对于密执安棍状杆菌密执安亚种NCPPB382、Cmm0317、Cmm0690的MIC值分别为6.25、1.56和12.5μg/mL。RejuAgro A对于青枯雷尔氏菌K60和Pss4的MIC值为40μg/mL。

还针对其他解淀粉欧文氏菌菌株测试了RejuAgro A，所述菌株包括一种毒性解淀粉欧文氏菌和三种链霉素抗性解淀粉欧文氏菌菌株。RejuAgro A针对解淀粉欧文氏菌110显示出与链霉素相同的功效(MIC值为5μg/mL)。然而，RejuAgro A针对解淀粉欧文氏菌1189比链霉素更有效。RejuAgro A和链霉素对于解淀粉欧文氏菌1189的MIC值分别为5μg/mL和10μg/mL。另外，Rejuagro A针对链霉素抗性解淀粉欧文氏菌CA11、DM1和898更有效，其MIC值(10μg/mL)比链霉素的MIC值(>40μg/mL)更低。这些结果表明，RejuAgro A在测试中是针对解淀粉欧文氏菌的最有效的化合物，并且代表用于替代链霉素的潜在候选物。在链霉素抗性菌株中，没有对于RejuAgro A的交叉抗性的迹象。

关于对引起鱼柱形病的黄杆菌属的影响，RejuAgro A对于柱状黄杆菌菌株MS-FC-4和#_2(在野性和养殖鱼中引起柱形病)的MIC值为5μg/mL，其高于链霉素的MIC值(对于菌株#_2和MS-FC-4，分别为0.31μg/mL和1.25μg/mL)。

测试了RejuAgro A针对菌株0617-T307的影响。其表明，在测试的LB培养基中，RejuAgro A针对土壤假单胞菌0617-T307(Rejuagro A生产者)的MIC值大于40μg/ml，这意味着菌株0617-T307可以存活并对其自身产生的至少40μg/ml的RejuAgro A具有抗性。

测试了RejuAgro A与链霉素一起针对番茄病原体(丁香假单胞菌番茄致病变种PT30、丁香假单胞菌丁香致病变种7046、丁香假单胞菌黄瓜致病变种1188-1)和其它柑桔溃疡病病原体(野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种XV-16)。RejuAgro A针对丁香假单胞菌的MIC值为40μg/mL，而链霉素的MIC值为2.5-5μg/ml。关于野油菜黄单胞菌物种，RejuAgro A的MIC值为2.5μg/mL或40μg/mL，其小于链霉素的MIC值(为20μg/mL或大于40μg/mL)。这些表明，当与假单胞菌引起的番茄病原体相比，野油菜黄单胞菌病原体对于RejuAgro A比链霉素更敏感。

RejuAgro A显示对抗所有测试的致病真菌的功效(表1)。针对致病疫霉、苹果黑星菌或斐济球腔菌，测试了RejuAgro A。RejuAgro A显示在40μg/mL、80μg/mL和600μg/mL对致病疫霉和苹果黑星菌具有100％抑制(表1)。

表1.RejuAgro A的抗微生物作用的概述

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实施例4.在摇瓶发酵中来自菌株0617-T307的RejuAgro A的生产和稳定性。

用于生产和制备RejuAgro A的0617-T307的发酵可以通过两种方法获得：摇瓶发酵和发酵罐发酵。发酵罐发酵描述在实施例2中。在该实施例中，可以如下获得烧瓶发酵。将储备细菌假单胞菌物种0617-T307划线到YME琼脂平板(酵母提取物，4g/L；葡萄糖4g/L和麦芽提取物10g/L；琼脂，15g/L)上，并在28℃培养箱中生长24h。通过在16℃和220rpm，在含有50mL无菌YME液体培养基的250mL烧瓶中使0617-T307的单菌落生长24h来制备种子培养基。然后，将种子培养基以4％比例(v/v)接种到含有0.5L无菌YME培养基的4L烧瓶中。在接种(2％，v/v)到各自含有2L YME培养基的八个4-L烧瓶中之后，使细菌在16℃在振荡器中以200-220rpm生长1-7天。

通过LC-MS分析根据开发的标准曲线获得RejuAgro A浓度。使用两种方法制备样品用于LC-MS分析。一种方法是通过乙酸乙酯(1mL:1mL，涡旋1分钟)提取细胞肉汤，并通过离心和真空干燥乙酸乙酯层来获得乙酸乙酯提取物。将干燥的乙酸乙酯提取物溶于40μl的甲醇中，并将2μl的甲醇溶液用于LC-MS分析。另一种方法是通过离心细胞肉汤获得上清液，然后将上清液与等体积的甲醇混合以制备50％甲醇溶液，其中将10μL溶液注入LC-MS中。使用第二种方法是因为RejuAgro A产生是细胞外分泌过程，这通过观察到主要量的RejuagroA在上清液中而不是在细胞内部得到证明(图3，图A)。

在7天发酵期间，RejuAgro A的总产量在第一天达到峰值浓度，然后随着时间的增加开始降低(图3，图B)。在摇瓶发酵中每6小时进行关于RejuAgro A的生产和细胞浓度的进一步详细研究。其表明，RejuAgro A的浓度(RejuAgro A的总量)在18h达到最大值13.8mg/L，并且细菌细胞的浓度在12h达到最大值2×10¹¹CFU/mL，这表明RejuAgro A的产生是细胞生长相关的产生过程。

在4-L摇瓶中培养基的体积影响RejuAgro A的产生。在具有YME培养基的4-L摇瓶中，仅在500mL体积大小时观察到Rejuagro A的产生，而在1.0L或1.5L体积大小时未观察到其产生。该观察结果表明，RejuAgro A的产生优选在高度充气的条件下发生。

培养基类型和培养温度影响Rejuagro A的产生。将LB培养基与YME培养基在16℃或28℃进行平行测试。在16℃，在YME培养基中观察到RejuAgro A的产生，但在LB培养基中未观察到RejuAgro A的产生。关于菌落形成单位，菌株0617-T307在16℃和28℃在LB培养基中生长良好，并且在28℃在YME培养基中生长良好。这些结果表明，RejuAgro A的产生是培养基特异性的和温度依赖性的。通过针对解淀粉欧文氏菌的平板测定监视来自0617-T307的产物的活性，这与RejuAgro A的产生一致。

为了检查RejuAgro A的生产条件的适用性，在相同条件下与假单胞菌属菌株0617-T307平行测试了10种其它假单胞菌属菌株。根据对管家基因的分析，将0917-T305、0917-T306和0917-T307鉴定为土壤假单胞菌，并且将0118-T319、0318-T327和0418-T328鉴定为摩氏假单胞菌。已经报道了土壤单胞菌和摩氏假单胞菌的模式菌株(Dabous Si等人(2002)；Pascual等人(2014))。

其显示菌株0617-T307及其种系发生密切相关的物种可以在28℃和220rpm在YME中产生RejuAgro A。该结果表明，所述方法对于菌株0617-T307及其一些密切相关的物种产生RejuAgro A是特异性的(表2)。对于通过使0617-T307在YME培养基中在振动器上在16°和220rpm生长获得的40-h培养物，通过LCMS所测试的，Rejuagro A可以于室温在培养物中存在并且稳定至少4周。

表2.在培养基YME中，在16℃、18小时、220rpm培养的所选择假单胞菌属菌株的RejuAgro A产生能力的概述。

实施例5.菌株0617-T307的细胞肉汤针对0617-T307和解淀粉欧文氏菌的抗微生物活性。

使用两种测定进行0617-T307细胞肉汤和代谢物的抗微生物测试。一种是平板扩散测定，另一种是微平板测定。使用LB平板进行含有RejuAgro A的级分和细胞肉汤针对解淀粉欧文氏菌的抗微生物活性的平板扩散测定(表3)。含有0617-T307活细胞的细胞肉汤和含有2mg/ml的RejuAgro A的悬浮液均显示出针对解淀粉欧文氏菌的抗微生物活性。然而，当应用

时，没有观察到抑制区。

表3.LB平板中0617-T307细胞和RejuAgro A针对解淀粉欧文氏菌的活性

^a细菌细胞的浓度尚未确定。

为了找到由0617-T307细胞和活性组分RejuAgro A组成的生物防治配方，进行以下实验。将含有Rejuagro A的0617-T307的40-h细胞肉汤的上清液(缩写为“上清液”)用于针对其生产者0617-T307的抗微生物测定。其显示菌株0617-T307能够在LB培养基中的上清液的2x稀释液中生长，而在YME培养基中不生长。进一步的研究表明，上清液的抑制作用是由于pH值较低。然后，可以通过将pH控制在6.5～6.8来使问题1和2得到解决。

针对菌株0617-T307、EA和Xac测试生物活性级分(粗提取物，100μg/ml；Flash-Rejuagro A，20μg/ml；HPLC-RejuAgro A，10μg/ml)。其表明，生物活性级分不能抑制菌株0617-T307的生长，这证实RejuAgro A可以与0617-T307细胞混合以制备生物防治试剂。含有RejuAgro A的生物活性级分显示针对Ea和Xac的抑制作用，特别是Flash-RejuAgro A和HPLC-RejuAgro A，在测试条件下几乎消除Ea和Xac的生长。这证实，RejuAgro A溶液可以以10-20μg/ml用于火疫病和柑桔溃疡病的生物防治。

实施例6.来自菌株0617-T307的酸化上清液(pH 2.0)的乙酸乙酯提取物的生物活性代谢物的鉴定和表征

将储备细菌假单胞菌属物种0617-T307接种到LB琼脂(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；NaCl，10g/L；琼脂，15g/L；水)平板上，并使其在28℃培养箱中生长24h。为了制备种子培养基，将单个菌落的0617-T307接种到500ml高压灭菌的YME培养基(酵母提取物，4g/L；葡萄糖4g/L和麦芽提取物10g/L)中，并在28℃以150rpm的振荡速度生长24h。然后，将种子培养基接种到八个4-L烧瓶中，每个烧瓶含有2L高压灭菌的YME培养基。在16℃在振荡器中以150rpm的振荡速度进行发酵7天。

在7天生长之后，通过以4000rpm离心细菌培养物15min来获得上清液。然后，通过加入6N HCl将上清液的pH调节至2.0。然后，将酸化的上清液进行乙酸乙酯提取。从菌株0617-T307的14L培养物中得到3.0g粗提取物。

将浓缩的样品溶于丙酮中，并与硅胶混合，将硅胶加载到装配有UV检测器的快速色谱系统(Yamazen AL 580)上的硅胶柱

上。在加载样品之后，通过280mL按照递增极性的每种以下溶剂来洗脱样品：100％己烷、75％己烷/25％乙酸乙酯、50％己烷/50％乙酸乙酯、25％己烷/75％乙酸乙酯、100％乙酸乙酯、50％乙酸乙酯50％丙酮、100％丙酮、和100％甲醇。以20mL/min的流速洗脱样品。在UV 254nm处监视洗脱液，并通过20mL/管的时间模式收集级分。总之，由快速色谱产生114个级分或管。

将产生的级分用于随后的平板测定。将1mL的每种级分挑取到1.5mL试管中，并通过Eppendorf真空浓缩器进行真空干燥。将干燥的样品溶于50μL的DMSO中，其中2μl用于平板测定。简言之，将解淀粉欧文氏菌273接种到50％ LB(胰蛋白胨，5.0g/L；酵母提取物，2.5g/L；NaCl，5.0g/L)平板中，并将单个菌落接种到5mL的LB培养基中。将细菌在无菌水中以1:100稀释，其中将225μL铺板到50％的LB平板上。在生物安全柜中干燥10min之后，然后将每个级分的DMSO溶液分配到培养皿的其预标记部分，并使其再干燥10min。与测定一起，分别使用DMSO和春雷霉素作为阴性和阳性对照。然后，将平板在28℃培养箱中孵育，并在一天后检查抑制区。

对114个快速级分(flash fractions)的体外平板测定表明三个生物活性级分(T3234、T5058和T7882)抑制解淀粉欧文氏菌273的生长。级分3234和5258显示相对小的清除区。通过50％己烷/50％乙酸乙酯来洗脱级分3234。通过25％己烷/75％乙酸乙酯来洗脱级分5058。对于阴性对照，DMSO没有抑制区，而阳性对照春雷霉素确实显示出抑制区。通过丙酮/乙酸乙酯(50％/50％)来洗脱另一个快速级分T7882。其也抑制解淀粉欧文氏菌活性的生长。

另一种抗-解淀粉欧文氏菌活性-指导的HPLC分离和纯化鉴定了来自T5058的两种抗微生物化合物(Rt22.9和Rt25.0)(参见化合物式0617_T307_5058_Rt22.9和0617_T307_5058_Rt25.0)，和来自T7882的一种抗微生物化合物(Rt18.9)(参见化合物式0617_T307_7882_Rt18.9)。T307_5058_Rt22.9和T307_5058_Rt25.0是色氨酸衍生的天然产物，并且它们的结构报道在Scifinder数据库中，但没有生物学活性(Loots等人(2015))。预测0617_T307_7882_Rt18是之前报道的二呋喃基衍生物(Osipov等人(1978))。这些天然产物如下所示：

实施例7.使用LCMSMS和光谱库搜索来鉴定菌株0617-T307的其它代谢物。

将未调节pH的细胞肉汤和调节pH的细胞肉汤(用6N HCl将细胞肉汤的pH调节至2.0)的粗提取物浓缩，并再悬浮于250μl含有内标准(m/z 311.08)的100％ MeOH中，并用于LC-MS/MS分析。LC注射体积：5μL；LC柱：来自Phenomenex C18柱的1.7μM C18，100A，50×2.1mm Kinetex，梯度为12min。在Bruker Maxis Impact II上的5-95％ ACN。在BrukerMaxis Impact II，UHR-QqTOF(Ultra-High Resolution Qq-Time-Of-Flight)质谱上获得数据。使用谱图中八种最富集离子的碰撞诱导解离(CID)裂解，进行每次完全MS扫描，之后是串联MS(MS/MS)。扫描速率为3Hz。

然后，基于用于鉴定新的且已知的化合物的生物信息学分析和分子网络分析，进行光谱文库搜索。针对以下光谱文库搜索样品的MS/MS光谱：1)GNPS社区文库；2)FDA文库；植物化学文库；3)NIH临床专辑；4)NIH天然产物文库；5)药理学活性NIH小分子储存库；6)Faulkner传统库；7)农药；8)Dereplicator鉴定的MS/MS肽天然产物；9)PNNL脂质；10)Massbank；11)Massbank EU；12)MoNA；13)ReSpect-Phytochemicals；14)HMDB。

在上述文库中搜索样品的MS/MS谱，并使其与参考谱的偏移进行比对。匹配参数相同。可以探索这些结果以鉴定已知化合物的结构类似物。产生的MS/MS分子网络具有最小簇大小＝2，最小边缘0.7余弦，6个最小匹配峰。作为一个实例，在m/z 303.16处的新分子种类被鉴定为对应于来自活性级分的新化合物0617-T307_5058_RT25.0。从粗提取物鉴定一些已知化合物，其包括吲哚-3-羧酸、植物生长促进因子和xantholysin A。据报道，1)恶臭假单胞菌BW11M1的广泛抗真菌活性主要依赖于Xantholysin产生；2)需要Xantholysin进行群集，且其有助于生物膜形成(Li等人(2013))。实际上，通过在28℃培养0617-T307、0418-T328和0318-T327观察到较高浓度的xantholysin A。因此，除了生物活性化合物RejuAgroA之外，Xantholysin A是生物防治细菌0617-T307及其密切相关种类0318-T3027和0418-T328的抗微生物活性的另一种贡献代谢产物。

实施例8.产生Rejuagro A的菌株0617-T307及其一些密切相关物种的温室和田间感染分析。

为了评价0617-T307针对解淀粉欧文氏菌的生物防治活性，我们在威斯康辛大学-密尔沃基分校(University of Wisconsin-Milwaukee)的温室对海棠树进行了感染测定。将含有1.0×10⁸CFU每ml的生物防治试剂(0617-T307、0717-T327和0617-T318)喷洒到多树样地中的花上(80％至完全开花)。简言之，使菌株0617-T307在含有5mL LB培养基的26mL玻璃管中生长过夜，然后将细胞接种(1:100)到LB培养基中，并使其在28℃和200rpm的振荡器上生长14-18h。收获细胞并再悬浮于10x水中以达到10⁸CFU/mL。再悬浮的溶液可用于针对火疫病防治的温室和田间测定。用蒸馏水喷雾对照花。然后，通过喷洒1.0×10⁶cfu每ml解淀粉欧文氏菌菌株解淀粉欧文氏菌273来接种所有花。在2018年9月7日、10月9日和10月19日用0617-T307进行处理三次。参考表4，在海棠花上，相对于蒸馏水的0％防治，0617-T307(土壤假单胞菌)的所有喷洒处理提供了对花枯病症状的100％防治，表明0617-T307是用于由解淀粉欧文氏菌引起的火疫病的有希望的生物防治试剂。另外两种假单胞菌属物种0717-T327(韩国假单胞菌)和0617-T318(防御假单胞菌)的防治率低，分别为16.7％和25％。总之，在三种假单胞菌属物种中，我们测试了只有0617-T307对海棠火疫病表现出良好的防治效果。我们没有观察到植物毒性。

表4.温室感染测定的概述

对于田间测定，在2019年5月5日和5月6日，将产生RejuAgro A的生物防治细菌(0617-T307、0118-T319、0318-T327、0418-T328；参见表2)以5×10⁸CFU/mL的浓度施用在果园中苹果树的花上(苹果花的40％和70％开花)。在5月7日，以5x10⁶ CFU/mL的浓度接种细菌病原体解淀粉欧文氏菌Ea110(90％开花)。水对照、链霉素、0617-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328的患病花簇的百分比分别为32.9％、13.3％、16.8％、18.5％、16.7％和11.8％。与链霉素相比，产生RejuAgro A的生物防治细菌在防治苹果园中的火疫病方面具有类似的或更好的功效。

实施例9.RejuAgro A和B及其产生者对苹果黑星菌的抗真菌活性

将引起苹果黑星病的真菌苹果黑星菌于室温(～24℃)避光维持在PDA琼脂上。从PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)收获分生孢子和菌丝体悬浮液(在0.01M PBS中)的混合物。将10μl分生孢子和菌丝体悬浮液滴加到生物防治细菌、RejuAgro A或RejuAgro A修饰的平板上。对照是不添加生物防治细菌或RejuAgro A或B的PDA平板。将培养皿于室温在黑暗中孵育，7天后检查每个苹果黑星菌菌落的直径。

当与对照比较时(图4)，所选择的四种生物防治细菌菌株0617-T307、0118-T319、0318-T327和0418-T328可以抑制PDA平板上的苹果黑星菌的生长(图5)；RejuAgro A可以以40-80μg/ml抑制PDA平板上的苹果黑星菌的生长(图6)；然而，在PDA平板上没有观察到10-80μg/ml的Rejuagro B对苹果黑星菌生长的抑制作用(图7)。最后，在含有200-1000μg/ml硫酸铜的PDA平板上没有观察到对苹果黑星菌的抑制(图8)。

实施例10.通过假单胞菌属物种产生RejuAgro A

在含有500mL YME培养液的4L烧瓶中在16℃和220rpm振荡下发酵24小时之后，通过HPLC-MS对肉汤分析RejuAgro A的量。制备量-峰面积曲线以研究HPLC峰面积与RejuAgroA的量之间的关系(图9)。分析方法：1)用25ml乙酸乙酯提取25mL细胞肉汤；2)将5ml乙酸乙酯萃取物干燥，并溶解于0.1ml甲醇中；3)将4μl注入HPLC-MS中。

针对RejuAgro A的生产评价7种细菌(0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、0418-T328)，通过使细胞在YME培养基中在16℃、220rpm下培养24h来制备种子培养基。HPLC分析显示所有七种细菌都产生Rejuagro A(图10)。

实施例11.RejuAgro A的制剂和温室测定

RejuAgro A的制剂(溶液，SL；参见表5)。在施用于花之前，将10μg/ml与作为安全剂的1％聚乙二醇(PEG)4000在罐内混合。后续测试表明，0.03％的聚乙烯醇(PVA)作为安全剂实现了对花更好的保护。可以加入表面活性剂Alligare 90以增加功效(表6)。

表5.Rejuagro-A 1％SL的制剂^a

^aA RejuAgro A制剂的1％溶液(SL)。

为了评价RejuAgro A针对解淀粉欧文氏菌的生物防治活性，在威斯康辛大学-密尔沃基分校对海棠树进行温室感染测定。在接种前3小时和接种后24小时，将补充有1％聚乙二醇(PEG)4000或1％PEG4000(阴性对照)的10μg/ml施用于完全开花树的花上。将再悬浮于水中的约10⁸CFU/ml的解淀粉欧文氏菌110菌株用作接种物。在接种后约6天计算感染率。在2020年1月24日至1月31日一周期间进行该试验。RejuAgro A可以有效地抑制花枯病(表6)。

表6.具有1％ PEG 4000的RejuAgro A的花枯病测定

实施例12. 0617-T307细胞肉汤针对灰葡萄孢CA17的抗真菌活性

通过使细菌细胞在YME培养基中在28℃和180rpm下生长24h来制备菌株0617-T307的种子。然后，将4％(2mL至50mL)接种到含有50mL M8(IAA培养基)或M9(CN培养基)或M7(PRN培养基)或M6(DAPG培养基)培养基的250mL烧瓶中，并且使其在28℃和180rpm下生长48h。在12h和24h收集0.5ml体积的细胞肉汤，并储存在-20℃冰箱中。对于抗真菌测定，将细胞肉汤解冻，并将5μL施加到PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上的样品孔上，所述PDA平板具有与接种灰葡萄孢的中心相等的半径距离(图11)。其表明，所述细胞肉汤对PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上的灰葡萄孢CAI7具有抗真菌活性。

实施例13.粗提取物、RejuAgro A和RejuAgro B针对植物病原细菌的抗微生物活性。

细菌0917-T305、0318-T327和0418-T328的代谢物显示出对青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种和居树黄单胞菌核桃致病变种的良好效力。使细菌0917-T305、0318-T327和0418-T328在YME培养基中，分别在16和28℃生长。以5mg/mL制备来自0917-T305、0318-T327和0418-T328的天然产物提取物，并通过平板扩散测定将它们针对三种不同的植物病原体进行测试：青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种和居树黄单胞菌核桃致病变种。在琼脂平板扩散测定中，在16℃和28℃在YME中生长的细菌0917-T305、0318-T327和0418-T328的代谢物显示出针对测试的青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种和居树黄单胞菌核桃致病变种相对良好的功效(表7)。这表明，与RejuAgro A一起，其他代谢物也针对青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种和居树黄单胞菌核桃致病变种具有良好的功效。RejuAgro B显示出对青枯雷尔氏菌的良好功效(表7)。

表7.在平板测定中细菌粗提取物对所选病原菌的作用

^a抑制区的直径(cm)

实施例14.Rt 18.9、Rt 22.9和Rt 25.0的抗微生物作用

将储备细菌假单胞菌属物种0617-T307接种到LB琼脂(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；NaCl，10g/L；琼脂，15g/L；水)平板上，并在28℃培养箱中生长24h。与实施例6中所述相同地进行发酵和粗提取物制备。

假单胞菌属物种0617-T307的酸化细胞肉汤的乙酸乙酯提取物的HPLC分离和纯化鉴定了来自快速级分T5058的两种抗微生物化合物(RT 22.9和RT 25.0)和来自快速级分T7882的一种抗微生物化合物(RT 18.9)。测试它们对表8中列出的细菌菌株的抗微生物活性。将2μl的DMSO、RT 18.9、RT 22.9或RT 25.0分别点样到与不同细菌菌株生长的琼脂平板上，并进一步检查抑制区(表8)。

表8.Rt 18.9、Rt 22.9和Rt 25.0的抗微生物作用

/>

^a在用DMSO、Rt18.9、Rt22.9或Rt25.0点样后2至5天之间检查抑制区

^b用于使细菌生长的琼脂培养基平板是LB培养基(10.0g/L胰蛋白胨、5.0g/L酵母提取物、10.0g/L钠盐、15.0g/L琼脂和至最终体积1.0L的自来水)或NA培养基(3.0g/L牛肉提取物、1.0g/L酵母提取物、5.0g/L聚蛋白胨、10.0g/L蔗糖和15g/L琼脂和至最终体积1.0L的自来水)

实施例15.RejuAgroA对斐济球腔菌的抗微生物作用

通过将最终浓度为60和600μg/ml的HPLC纯化的RejuAgro A分别加入PDA琼脂培养基中，检测RejuAgro A对斐济球腔菌的抗微生物作用。将480μl的0.5mg/ml或5mg/mlRejuAgro A加入到6孔板的孔中的3.52ml PDA中，使RejuAgro A的最终浓度分别为60(图12，中间孔(图A))和600μg/ml(图12，左孔(图B))。轻轻振荡平板以使化合物溶解。使用480μl的水和3.52ml的PDA作为对照处理(图12，右孔(图C))。在琼脂固化后，将生长有斐济球腔菌的琼脂片置于琼脂表面的中间。在接种后两周，在600μg/ml浓度的RejuAgro A处理中观察到对斐济球腔菌的生长完全抑制(图12)。

实施例16.RejuAgro A对水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xon507)的抗微生物作用

检查RejuAgro A对水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xon507)的抗微生物作用。将水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xon507)细菌悬浮液(OD₆₀₀＝0.3)喷洒到PSG琼脂平板上。将装载有50μL装载体积的HPLC纯化的水性RejuAgro A(浓度分别为5.5μg/mL、11.1μg/mL、22.1μg/mL、33.2μg/mL、55.4μg/mL、110.7μg/mL)的纸盘置于琼脂平板上，并在将纸盘置于琼脂平板上后44小时测量抑制区。在用RejuAgro A悬浮液浸泡的纸盘的所有浓度下观察到抑制(表9)。

表9.RejuAgro A对水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xon507)的抗微生物作用.

实施例17.RejuAgro A对柑桔黄单胞菌枳橙变种(XW19)的抗微生物作用

RejuAgro A对柑桔黄单胞菌枳橙变种(XW19)的抗微生物作用。将柑桔黄单胞菌枳橙变种(XW19)的细菌悬浮液(OD₆₀₀＝0.3)喷洒在PSG琼脂平板上。将装载有50μl加载体积的HPLC纯化的水性RejuAgro A水溶液(浓度分别为5.5μg/ml、11.1μg/ml、22.1μg/ml、33.2μg/ml、55.4μg/ml、110.7μg/ml)的纸盘置于琼脂平板上，并在将纸盘置于琼脂平板上44小时后测量抑制区。在55.37μg/ml和110.74μg/ml的RejuAgro A浓度下观察到抑制(表10)。

表10.RejuAgro A对柑桔黄单胞菌枳橙变种(XW19)的抗微生物作用

实施例18.实施例中使用的培养基组合物

表11包括实施例中示例性的培养基组合物。

表11.培养基组合物

实施例19.细菌菌株、天然产物及其引用的参考文献

本申请中描述的和所附权利要求书中呈现的细菌菌株和天然产物在微生物学文献中是众所周知的。对于本文公开的各种引用的细菌菌株和天然产物，这些参考文献在下表12中呈现，将其内容通过引用整体并入本文。

表12.细菌菌株、天然产物和作为其可用性证据的支持引用的参考文献

细菌菌株引用的参考文献

0617-T307、0917-T305、Pascual,J.,García-López,M.,Carmona,C.,Sousa,T.daS.,de

0917-T306和0917-T307 Pedro,N.,Cautain,B.,Martín,J.,Vicente,F.,Reyes,F.,Bills,G.F.,&Genilloud,O.(2014).Pseudomonas Soli sp.nov.,a novel producerof xantholysin congeners.Syst Appl Microbiol,37:412–416.

0118-T319、0318-T327 Dabboussi,F.,Hamze,M.,Singer,E.,Geoffroy,V.,Meyer,J.,&

和0418-T328 Izard,D.(2002).Pseudomonas mosselii sp.nov.,a novelspecies.Int J Syst Bacteriol,52:363–376.

天然产物引用的参考文献

RejuAgro B Knackmuss,H.,Medizinische,M.,&Chemie,I.(1968).Methyl-substituted 2,3,6-trihydroxypyridines and their oxidationproducts.Eur.J.Inorg.Chem.2689:2679–2689.

Rt22.9和Rt25.0 Loots,D.T.,Erasmus,E.,&Mienie,L.J.(2005).Identification of19new metabolites induced by abnormal amino acidconjugation in isovaleric acidemia.Clin Chem,51:1510–1512.

Rt18.9 Osipov,A.M.,Metlova,L.P.,Baranova,N.V,&Rudakov,E.S.(1978).Newderivatives of difuryl:2,2’-difuryl-5,5’-dicarbinol and2,2’-difuryl-5,5’-dicarboxylic acid.Ukrainskii Khimicheskii Zhurnal(Russian Edition),44:398.

实施例20.RejuAgro A、RejuAgro B和RejuAgro C的晶体结构信息A.RejuAgro A的晶体结构信息

通过缓慢蒸发RejuAgro A的氯仿溶液获得RejuAgro A(C₇H₇NO₃S)的单晶体。获得橙色片状物。选择合适的晶体并将其安装在SuperNova,Dual,Cu at home/near,Atlas衍射仪上。在数据收集期间将晶体保持在100.05(10)K。使用Olex2(Dolomanov等人(2009))，用ShelXS结构解析程序，使用直接法(Sheldrick(2008))解析结构，并使用ShelXL精修包(Sheldrick,G.M.(2015))使用最小二乘方最小化进行精修。

在100K下，使用OxfordSuperNova衍射仪，使用Cu(Kα)辐射收集数据集。

RejuAgro A(C₇H₇NO₃S)(M＝185.20g/mol)的晶体数据：单斜晶，空间群P2₁/n(no.14)，

β＝101.5883(12)°，

Z＝4，T＝100.05(10)K，μ(CuKα)＝3.429mm^-1，Dcalc＝1.576g/cm³，13936个测量的反射(10.552°≤2Θ≤140.8°)，1496个独特值(R_int＝0.0220，R_sigma＝0.0083)，其用于所有计算中。最终R₁为0.0253(I>2σ(I))，且wR₂为0.0702(所有数据)。

使用Olex2创建精修模型描述，在OlexSys的2018.05.29Svn.r3508上编译。约束数量-0，限制数量-未知。详述：1.Fixed Uiso：在所有C(H,H,H,H,H,H)基团的1.2倍处；在所有C(H,H,H)基团的1.5倍处；2.其它：Sof(H6A)＝Sof(H6D)＝Sof(H6F)＝1-FVAR(1)；Sof(H6B)＝Sof(H6C)＝Sof(H6E)＝FVAR(1)；3.a无序的Me，精修为旋转基团：C6(H6A,H6B,H6C,H6D,H6E,H6F)；b理想的Me，精修为旋转基团；C7(H7A,H7B,H7C)。

参考图13A，RejuAgro A分子具有平面结构，其中S-Me基团相对于杂环仅旋转8.7°。分子中在C4-C5键

处存在π-共轭的显著断裂，显然，这是因为一些轨道原因。连接到sp²碳原子的Me-基团在两个位置上可旋转地无序化。/>

参考图13B，晶体中的RejuAgro A分子通过N-H...O相互作用形成中心对称的H-键合二聚体。此外，这些二聚体通过较弱的C-H...O相互作用沿[-3 0 1]平面形成二维层。

RejuAgro A的化学结构如下所示：

RejuAgro A分子的另外的晶体学数据呈现在表13-21中。

表13.RejuAgro A的晶体数据和结构精修

/>

表14.RejuAgro A.的级分原子坐标(×10⁴)和等效各向同性位移参数

U_eq定义为正交U_IJ张量的痕量的1/3。

表15.RejuAgro A的各向异性位移参数

各向异性位移因子指数采用以下形式：-2π²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…]

/>

表16.RejuAgro A的键长

表17.RejuAgro A的键角

表18.RejuAgro A的氢键

表19.RejuAgro A的扭转角

表20.RejuAgro A的氢原子坐标

和各向同性位移参数/>

表21.RejuAgro A的占有率

B.RejuAgro B的晶体结构信息

通过缓慢蒸发RejuAgro B的氯仿溶液获得RejuAgro B(C₁₂H₈N₂O₆)的单晶体。获得橙色锥体。选择合适的晶体并将其安装在SuperNova,Dual,Cu at home/near,Atlas衍射仪上。在数据收集期间将晶体保持在100.05(10)K。使用Olex2(Dolomanov等人(2009))，用ShelXS结构解析程序，使用直接法(Sheldrick(2008))解析结构，并使用ShelXL精修包(Sheldrick,G.M.(2015))使用最小二乘方最小化进行精修。

在100K下，使用OxfordSuperNova衍射仪，使用Cu(Kα)辐射收集数据集。

RejuAgro B(C₁₂H₈N₂O₆)(M＝276.20g/mol)的晶体数据：三斜晶，空间群P-1(no.2)，

α＝72.249(4)°，β＝79.265(3)°，γ＝86.633(3)°，/>

Z＝4，T＝100.05(10)K，μ(CuKα)＝1.139mm^-1，Dcalc＝1.605g/cm³，15292个测量的反射(7.872°≤2Θ≤141.144°)，4304个独特值(R_int＝0.0258，R_sigma＝0.0234)，其用于所有计算中。最终R₁为0.0419(I>2σ(I))，且wR₂为0.1124(所有数据)。

使用Olex2创建精修模型描述，在OlexSys的2018.05.29Svn.r3508上编译。约束数量-0，限制数量-未知。详述如下；1.Fixed Uiso；在所有的N(H)基团1.2倍处；在所有C(H,H,H)基团的1.5倍处；2.a芳香族/酰胺H，用骑跨坐标精修：N1(H1)、N2(H2)、N1A(H1A)、N2A(H2A)；2.b理想的Me，精修为旋转基团；C6(H6A,H6B,H6C)、C12(H12A,H12B,H12C)、C6A(H6AC,H6AA,H6AB)、C12A(H12D,H12E,H12F)。

参考图14A，RejuAgro B晶体含有两个对称独立的RejuAgro B分子。每个分子具有螺旋结构-在连接的杂环的平均平面之间的二面角为70.3°和80.6°。每个杂环中在两个相邻羰基之间的C(sp²)-C(sp²)键处存在π-共轭的显著断裂，显然，这是因为一些轨道原因。

参考图14B，晶体中的RejuAgro B分子通过N-H...O相互作用形成中心对称的H-键合二聚体。这些二聚体沿X轴方向通过其它N-H...O相互作用以堆叠连接，最后，堆叠通过第三种N-H..O相互作用沿着[011]连接成层。

RejuAgro B的化学结构如下所示：

RejuAgro B分子的另外的晶体学数据呈现在表22-29中。

表22.RejuBgro B的晶体数据和结构精修

/>

表23.RejuAgro B的级分原子坐标(×10⁴)和等效各向同性位移参数

U_eq定义为正交U_IJ张量的痕量的1/3。

/>

表24.RejuAgro B的各向异性位移参数

各向异性位移因子指数采用以下形式：-2π²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…].

/>

表25.RejuAgro B的键长

表26.RejuAgro B的键角

/>

表27.RejuAgro B的氢键

表28.RejuAgro B的扭转角

/>

表29.RejuAgro B的氢原子坐标

和各向同性位移参数/>

C.RejuAgro C的晶体结构信息

通过缓慢蒸发RejuAgro B和RejuAgro C的甲醇溶液获得RejuAgro C(C₁₀H₁₆N₂O₇)的单晶体。获得连同RejuAgro B一起的无色针晶。选择合适的晶体并将其安装在SuperNova,Dual,Cu at home/near,Atlas衍射仪上。在数据收集期间将晶体保持在100.05(10)K。使用Olex2(DolomCnov等人(2009))，用olex2.solve结构解析程序(Bourhis等人(2015))，使用正负交替反转法(Charge Flipping)解析结构，并使用ShelXL精修且使用ShelXL精修包(Sheldrick(2015))使用最小二乘方最小化进行精修。

在100K下，使用OxfordSuperNova衍射仪，使用Cu(Kα)辐射收集数据集。

RejuAgro C(C₁₀H₁₆N₂O₇)(M＝276.25g/mol)的晶体数据：三斜晶，空间群P-1(no.2)，

α＝116.426(7)°，β＝104.722(5)°，γ＝97.680(5)°，/>

Z＝2，T＝100.00(10)K，μ(CuKα)＝1.081mm^-1，Dcalc＝1.466g/cm³，7480个测量的反射(10.068°≤2Θ≤140.528°)，2353个独特值(R_int＝0.0405，R_sigma＝0.0373)，其用于所有计算中。最终R₁为0.0504(I>2σ(I))且wR₂为0.1388(所有数据)。

使用Olex2创建精修模型描述，在OlexSys的2018.05.29SvC.r3508上编译。约束数量-0，限制数量-未知。详述；1.Fixed Uiso；在所有的C(H,H,H)基团1.5倍处；2.理想的Me，精修为旋转基团；C9(H9A,H9B,H9C),C10(H10A,H10B,H10C)。

参考图15A，RejuAgro C分子具有平面π-共轭结构，其中酰胺基从其余原子的平面旋转42°。

参考图15B，晶体中的RejuAgro C分子沿着x-轴堆叠。所述堆叠沿着ab平面通过H-键N-H…O连接成层。所述层通过与溶剂化物水分子(3mol.eq.)的多个氢键连接成3-维网络。

RejuAgro C的化学结构如下所示：

RejuAgro C分子的另外的晶体学数据呈现在表30-37中。

表30.RejuBgro C的晶体数据和结构精修.

表31.RejuAgro C的级分原子坐标(×10⁴)和等效各向同性位移参数

U_eq定义为正交U_IJ张量的痕量的1/3/>

表32.RejuAgro C的各向异性位移参数

各向异性位移因子指数采用以下形式：-2π²[h²a*²U₁₁+2hka*b*U₁₂+…]

/>

表33.RejuAgro C的键长

表34.RejuAgro C的键角

/>

表35.RejuAgro C的氢键.

表34.RejuAgro C的扭转角

/>

表37.RejuAgro C的氢原子坐标

和各向同性位移参数/>

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通过引用并入

将本文引用的所有文献、出版物、专利、专利申请和相关材料通过引用并入，如同本文完全阐述一样。

Claims (53)

1.一种培养细菌以增强保护性代谢物的产生的方法，其包括：

i.使假单胞菌属细菌在容器中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物，其中培养基体积与容器体积的比例在约1:2至1:10之间，并且其中以在约100至250RPM之间的速率振荡容器，

或

ii.使假单胞菌属细菌在发酵罐中的液体培养基中生长以产生细菌发酵物，其中发酵罐的空气流速在约1至3L/min之间。

2.权利要求1的方法，进一步包括在一段时间之后，将液体培养基与细菌分离以产生包含保护性代谢物的保护性上清液。

3.权利要求1或2的方法，其中细菌选自由以下组成的组：土壤假单胞菌0617-T307(登录号PTA-126796)、土壤假单胞菌0917-T305(登录号PTA-126797)、土壤假单胞菌0917-T306(登录号PTA-126798)、土壤假单胞菌0917-T307(登录号PTA-126799)、摩氏假单胞菌0118-T319(登录号PTA-126800)、摩氏假单胞菌0318-T327(登录号PTA-126801)和摩氏假单胞菌0418-T328(登录号PTA-126802)。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中生长温度在约10℃至35℃之间。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中液体培养基是用于产生细胞的LB培养基。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中液体培养基是用于产生式(I)和式(II)的YME培养基：

7.权利要求1-6中任一项的方法，其可以使用振荡器或发酵罐进行。

8.根据权利要求1-6中任一项的方法，当使用振荡器时，其中培养基体积与容器体积的比例在约1:5至1:10之间。

9.根据权利要求1-6中任一项的方法，当使用振荡器时，其中培养基体积与容器体积的比例在约1:7至1:9之间。

10.根据权利要求1-6中任一项的方法，当使用振荡器时，其中培养基体积与容器体积的比例为约1:8。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中容器以约200至250RPM之间的速率进行振荡。

12.权利要求1-10中任一项的方法，其中容器以约210至230RPM之间的速率进行振荡。

13.权利要求1-6中任一项的方法，当使用发酵罐时，其中发酵罐的空气流速在约1.5至2.5L/min之间，或氧浓度在5mg/L至12mg/L之间。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中生长温度在约10℃至20℃之间。

15.权利要求1-13中任一项的方法，其中生长温度在约15℃至17℃之间。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中使细菌生长18小时至7天的时间段。

17.权利要求1-15中任一项的方法，其中使细菌生长至少7天的时间段。

18.权利要求1-15中任一项的方法，其中使细菌生长1天至2天的时间段。

19.农业组合物，其包含通过权利要求1-18中任一项的方法产生的细菌发酵物或保护性上清液。

20.权利要求19的农业组合物，其中保护性上清液或其代谢物的制剂选自溶液(SL)、可溶性粉末(SP)、可溶性颗粒(SG)和微囊制剂。

21.权利要求19的农业组合物，其中细菌发酵物或细胞的制剂选自悬浮浓缩物(SC)、可湿性粉末(WP)和水分散性颗粒(WG)。

22.权利要求19的农业组合物，进一步包含佐剂。

23.权利要求22的农业组合物，其中佐剂是表面活性剂。

24.权利要求19的农业组合物，其中佐剂是选择的活性成分、水和极性溶剂。

25.权利要求23的农业组合物，其中表面活性剂选自润湿剂和铺展剂。

26.权利要求25的农业组合物，其中表面活性剂是包含烷基聚氧化乙烯或聚氧化丙烯的润湿剂。

27.一种防治细菌性作物病害的方法，包括步骤：

i.产生农业组合物，其包含通过权利要求1-18中任一项产生的细菌发酵物或保护性上清液或者权利要求19-27中任一项的农业组合物；和

ii.向作物施用所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。

28.权利要求27的方法，其中作物病害选自由以下组成的组：香蕉黑叶斑病、灰霉病、火疫病、柑桔溃疡病、软腐病、橄榄节疤病、番茄细菌性斑块病、细菌性溃疡病或瘟病(核果和仁果)、葫芦属的角斑病、桃的细菌性斑点病、番茄细菌性斑点病、核桃疫病、细菌性枯萎病、番茄溃疡病、马铃薯晚疫病、苹果黑星病、细菌性叶枯病和细菌性叶条斑病。

29.权利要求27或28的方法，其中病原微生物选自由以下组成的组：斐济球腔菌、灰葡萄孢、解淀粉欧文氏菌(Ea)(特别是链霉素抗性解淀粉欧文氏菌菌株)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xac)、土豆果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、甘薯软腐菌、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌黄瓜致病变种、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种、居树黄单胞菌核桃致病变种、青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种、致病疫霉、苹果黑星菌、水稻黄单孢菌水稻致病变种、水稻黄单孢菌条斑致病变种和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种。

30.根据权利要求27-29中任一项的方法，其中作物选自由以下组成的组：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，南瓜，洋葱，稻，非洲紫罗兰，十字花科、茄科、葫芦科的植物物种包括胡萝卜、马铃薯、番茄、茄子、绿叶蔬菜、倭瓜和葫芦，胡椒和青椒，橄榄，核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。

31.一种防治鱼病害的方法，其中病原微生物为柱状黄杆菌#_2、柱状黄杆菌MS-FC-4、饲料添加剂、水族箱消毒剂、具有任何形式、构造或结构的细菌固定材料(例如富含所述菌株的园艺用块体)。

32.一种防治人病原细菌引起的病害的方法，其中细菌为大肠杆菌O157:H7。

33.一种防治细菌性作物病害的方法，包括：

向作物施用包含在约1.0×10⁵至1.0×10⁹cfu每mL之间的假单胞菌属细菌的农业组合物以抑制病原微生物的生长。

34.权利要求33的方法，其中假单胞菌属细菌选自由以下组成的组：土壤假单胞菌0617-T307(登录号PTA-126796)、土壤假单胞菌0917-T305(登录号PTA-126797)、土壤假单胞菌0917-T306(登录号PTA-126798)、土壤假单胞菌0917-T307(登录号PTA-126799)、摩氏假单胞菌0118-T319(登录号PTA-126800)、摩氏假单胞菌0318-T327(登录号PTA-126801)和摩氏假单胞菌0418-T328(登录号PTA-126802)。

35.根据权利要求33或34的方法，其中组合物包含在约5.0×10⁷至2.0×10⁸cfu每mL之间的假单胞菌属细菌。

36.根据权利要求33-35中任一项的方法，其中作物病害选自由以下组成的组：香蕉黑叶斑病、灰霉病、火疫病、柑橘溃疡病、软腐病、橄榄节疤病、番茄细菌性斑块病、细菌性溃疡病或瘟病(核果和仁果)、葫芦属的角斑病、桃的细菌性斑点病、番茄细菌性斑点病、核桃疫病、细菌性枯萎病、番茄溃疡病、马铃薯晚疫病、苹果黑星病、细菌性叶枯病和细菌性叶条斑病。

37.根据权利要求33-36中任一项的方法，其中病原微生物选自由以下组成的组：斐济球腔菌、灰葡萄孢、解淀粉欧文氏菌(Ea)(特别是链霉素抗性解淀粉欧文氏菌菌株)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xac)、土豆果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、甘薯软腐菌、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌黄瓜致病变种、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种、居树黄单胞菌核桃致病变种、青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种、致病疫霉、苹果黑星菌、水稻黄单孢菌水稻致病变种、水稻黄单孢菌条斑致病变种和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种。

38.根据权利要求33-37中任一项的方法，其中所述作物选自由以下组成的组：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，南瓜，洋葱，稻，非洲紫罗兰，十字花科、茄科、葫芦科的植物物种包括胡萝卜、马铃薯、番茄、茄子、绿叶蔬菜、倭瓜和葫芦属，胡椒和青椒，橄榄、核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。

39.一种纯化来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的方法，包括：

i.通过权利要求1-17中任一项的方法产生细菌发酵物或保护性上清液或通过权利要求18-20中任一项产生其制剂；

ii.通过乙酸乙酯提取来提取细菌发酵物或保护性上清液；和

iii.通过使用50％己烷和50％乙酸乙酯来洗脱细菌发酵物或保护性上清液或者通过使用25％己烷和75％乙酸乙酯来洗脱细菌发酵物或保护性上清液，产生含有保护性代谢物的洗脱液。

40.权利要求39的方法，其中假单胞菌属细菌选自由以下组成的组：土壤假单胞菌0617-T307(登录号PTA-126796)、土壤假单胞菌0917-T305(登录号PTA-126797)、土壤假单胞菌0917-T306(登录号PTA-126798)、土壤假单胞菌0917-T307(登录号PTA-126799)、摩氏假单胞菌0118-T319(登录号PTA-126800)、摩氏假单胞菌0318-T327(登录号PTA-126801)和摩氏假单胞菌0418-T328(登录号PTA-126802)。

41.一种防治细菌性作物病害的方法，包括：

i.生产包含通过权利要求33和34中一项的方法纯化的、来自假单胞菌属细菌的保护性代谢物的农业组合物，和

ii.向作物施用所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。

42.权利要求41的方法，其中作物病害选自由以下组成的组：香蕉黑叶斑病、灰霉病、火疫病、柑橘溃疡病、软腐病、橄榄节疤病、番茄细菌性斑块病、细菌性溃疡病或瘟病(核果和仁果)、葫芦属的角斑病、桃的细菌性斑点病、番茄细菌性斑点病、核桃疫病、细菌性枯萎病、番茄溃疡病、马铃薯晚疫病、苹果黑星病、细菌性叶枯病和细菌性叶条斑病。

43.根据权利要求41或42的方法，其中病原微生物选自由以下组成的组：斐济球腔菌、灰葡萄孢、解淀粉欧文氏菌(Ea)(特别是链霉素抗性解淀粉欧文氏菌菌株)、地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(Xac)、土豆果胶杆菌、黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、甘薯软腐菌、萨氏假单胞菌萨氏致病变种(Psv)、丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香假单胞菌丁香致病变种、丁香假单胞菌黄瓜致病变种、野油菜黄单胞菌桃穿孔致病变种、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种、居树黄单胞菌核桃致病变种、青枯雷尔氏菌、密执安棍状杆菌密执安亚种、致病疫霉、苹果黑星菌、水稻黄单孢菌水稻致病变种、水稻黄单孢菌条斑致病变种和柑桔黄单胞菌柑桔致病变种。

44.权利要求41的方法，其中病原微生物是病原性解淀粉欧文氏菌，其是链霉素抗性解淀粉欧文氏菌。

45.权利要求41-44中任一项的方法，其中作物选自由以下组成的组：香蕉，苹果，梨，海棠，柑桔，马铃薯，番茄，茄子，绿叶蔬菜，倭瓜和葫芦，胡椒和青椒，橄榄，核果和仁果植物包括橄榄、桃、核桃。

46.权利要求41的方法，其中病原微生物选自柱状黄杆菌#2和柱状黄杆菌MS-FC-4。

47.权利要求41的方法，其中病原微生物为大肠杆菌O157:H7。

48.权利要求41的方法，包括：

向作物施用包含在约1.0×10⁵至1.0×10⁹cfu每mL之间的假单胞菌属细菌的所述农业组合物以抑制病原微生物的生长。

49.根据权利要求48的方法，其中农业组合物包含在约5.0×10⁷至2.0×10⁸cfu每mL之间的假单胞菌属细菌。

50.结晶化合物，选自以下结构之一：

51.权利要求50的结晶化合物，其中结晶化合物是以下结构：

其中结晶化合物包括选自表13-22的至少一种物理性质。

52.权利要求50的结晶化合物，其中结晶化合物是以下结构：

其中结晶化合物包括选自表23-29的至少一种物理性质。

53.权利要求59的结晶化合物，其中结晶化合物是以下结构：

其中结晶化合物包括选自表30-37的至少一种物理性质。

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