CN115747094B - 一种复合菌株组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开了一种复合菌株组合物，包括贝莱斯芽孢杆菌L‑1和菌株HC6‑11，所述贝莱斯芽孢杆菌L‑1和菌株HC6‑11均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为：CGMCCNo.14373和CGMCCNo.25338。本发明中的贝莱斯芽孢杆菌L‑1和菌株HC6‑11能够有效防控苹果腐烂病菌，贝莱斯芽孢杆菌L‑1与菌株HC6‑11等比例复配后制成的复合菌株组合物，在菌液浓度为OD600＝0.8时对苹果腐烂病的防效可达到94.64％，高于药剂(三唑酮)1000倍的处理，显著提高对苹果腐烂病的防治效果；本发明中使用贝莱斯芽孢杆菌L‑1和菌株HC6‑11制成的复合菌株组合物进行苹果腐烂病的防治，避免使用化学药剂，减少环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种复合菌株组合物及其应用。
背景技术
苹果树腐烂病(Apple Valsa canker)是由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)侵染引起的一种严重苹果树病害，又称臭皮病、烂皮病。该病害发病初期呈红褐色，水渍状，手压发病部位产生凹陷，流出黄褐色带酒糟味汁液，发病后期发病部位失水并干缩下陷，在发病部位散生黑色小粒点。目前，苹果树腐烂病在我国所有苹果种植区域均有发生，具有分布广、危害重、防治难的特性，被果农称为苹果树的“癌症”。
目前对苹果树腐烂病的防治方法中采用最多、效果最显著的就是刮除法，即刮除病斑及周围无症状组织中潜伏侵染的病原菌，配合戊唑醇、烯唑醇、菌毒清、瑞拉菌素等药剂涂抹或者喷施患病部位，虽然该方法对苹果树腐烂病的防治起到了一定的作用，但是，刮除法费时费力，而且化学药剂具有容易产生抗药性、造成人畜中毒和环境污染的缺点。因此，寻找持效、低毒、环境友好型的防治方法成为苹果树腐烂病防治的发展趋势。生物防治具有持效性和环境友好型的优点，目前已经成为植物病害防治的热点。在苹果树腐烂病的生物防治中，已经有大量研究者开展了相关工作，但是，在田间环境中由于天气等不可控的外界因素及生物防治的不稳定性，造成大部分生防菌均处于实验室研究阶段，在苹果腐烂病的防治实践中还无法得到广泛应用。选择抗逆性强、具有不同作用机制的生防、促生菌构建复合菌剂是提高生物防治效果和稳定性的一个主要手段。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的对于苹果腐烂病缺乏有效的生防菌株的问题，提供一种复合菌株组合物及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种复合菌株组合物，包括贝莱斯芽孢杆菌L-1和菌株HC6-11，所述菌株HC6-11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.25338。
优选地，所述菌株HC6-11的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌L-1和菌株HC6-11的复配比例为1:1。
本发明同时提供上述复合菌株组合物在制备苹果腐烂病的生防制剂中的应用。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明中的贝莱斯芽孢杆菌L-1和菌株HC6-11能够有效防控苹果腐烂病菌，贝莱斯芽孢杆菌L-1与菌株HC6-11等比例复配后制成的复合菌株组合物，在菌液浓度为OD600＝0.8时对苹果腐烂病的防效可达到94.64％，高于药剂(三唑酮)1000倍的处理，显著提高对苹果腐烂病的防治效果；
二)本发明中使用贝莱斯芽孢杆菌L-1和菌株HC6-11制成的复合菌株组合物进行苹果腐烂病的防治，避免使用化学药剂，减少环境污染。
附图说明
图1为本发明中菌株HC6-11的产嗜铁素(A)、解无机磷(B)、解有机磷(C)、固氮(D)和解钾(E)皿内测定结果图；
图2为本发明中菌株HC6-11在LB培养基上的形态特性(左侧图)及扫描电镜观察图(右侧图)；
图3为本发明中菌株HC6-11的16S rRNA序列构建进化树；
图4为本发明中菌株HC6-11在不同NaCl浓度的生长情况；
图5为本发明中菌株HC6-11在不同pH条件下的生长情况；
图6为本发明中贝莱斯芽孢杆菌L-1、菌株HC6-11及复合菌株组合物对苹果腐烂病在枝条上的抑制活性图。
本发明中的菌株HC6-11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为：2022年07月18日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.25338；分类命名为：韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1菌株分离、筛选及促生活性测定
1.土壤样品采集及菌株分离和筛选
从陕西省韩城市矿场(N°35.48，E°110.44)采集土壤样品。利用逐级稀释法分离土壤中的细菌，将形态差异明显的单个菌落在Luria-Bertani(LB)培养基上进行纯化和培养。将分离得到的菌株接种于CAS固体培养基(产嗜铁素)、孟金娜培养基(解磷)、Ashby(固氮)、解钾培养基(解钾)上，在28℃培养3-5天，菌株周围出现黄色或无色透明晕圈，说明具有产嗜铁素、解磷、固氮或解钾能力。量取菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算D/d，分离筛选出一株具有促生活性的菌株，命名为HC6-11。结果如附图1所示，菌株HC6-11具有产嗜铁素、解磷、固氮和解钾能力，其在CAS培养基上的D/d为2.26，孟金娜无机磷培养基的D/d为3.02，有机磷培养基的D/d为1.37，在固氮培养基上的D/d 为1.55，解钾培养基上无明显透明圈，但是也表现出一定的解钾活性。
2.菌株鉴定
将步骤1分离得到的菌株HC6-11在LB固体培养基上划线培养，28℃培养24h，观察菌落形状、透明度及菌落颜色等菌落特征。使用Ezup柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒对菌株DNA进行提取。使用通用引物7F和1492R对菌株HC6-11 的16S rRNA序列进行PCR扩增，通用引物7F和1492R的序列如SEQ ID No.2 和SEQ ID No.3所示。反应体系如下：2×M5Hipper超光速Mix 10μL，ddH2O 7μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL；反应条件：94℃5min；94℃45s， 55℃45s，72℃90s，30个循环；72℃10min。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(SK8131)回收目的条带，送交上海生工测序。使用Vector NTI Advance 11软件将测序结果进行校正和拼接，用BLASTn对拼接的序列进行同源序列检索，确定其分类地位。
结果如图2和图3所示，图2为HC6-11在LB培养基上的形态特性(左侧图)及扫描电镜观察图(右侧图)，菌株HC6-11在LB上呈现典型的细菌菌落形态，菌落浅黄色。图3为利用16S rRNA序列构建进化树，菌株HC6-11与Pseudomo nas koreensis聚到一枝，置信率为99％，形态学结合分子序列确定菌株HC6- 11为韩国假单胞菌。
3.菌株HC6-11的稳定性
耐盐能力：将不同量的NaCl加入到LB培养液中，配制成含0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％、12.0％、15.0％的NaCl(W/V)的LB培养液，接种菌株HC6-11 的种子液，180r/min、32℃培养48h，以未处理发酵液为对照，测定OD600，每组处理重复3次。比较其在不同盐浓度下的生长速率，评估活性菌株的耐盐性。
耐酸碱能力：将LB培养液用1mol/LNaOH或HCl分别调整pH值为2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12，每瓶接种0.5mL菌株HC6-11的种子液，180r/min、 32℃培养48h，以未处理发酵液为对照，测定OD600，每组处理重复3次，评估筛选菌株耐酸碱能力。
结果如图4所示，菌株HC6-11能在含盐量5％的条件下生长，含盐量为10％及以上时菌株停止生长，因此HC6-11可耐10％以下的NaCl浓度。图5显示，菌株HC6-11在PH为5以下或者11以上时生长缓慢，在pH为6-10的条件下均能生长，因此更能适应偏碱性的环境条件。
实施例2复合菌株组合物对苹果腐烂病的活体防效
贝莱斯芽孢杆菌L-1分离自兴城果树资源圃的梨树根际土壤中，已于2017 年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14373。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为：淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
苹果腐烂病菌(C.mali QH2)分离自内蒙古呼和浩特市谦和果园感染了苹果树腐烂病的‘金红’树，保藏于内蒙古农业大学园艺与植物保护学院果树病害病原生物学及综合防控研究室，保藏编号为QH2。
复合菌株组合物的制备方法如下：将贝莱斯芽孢杆菌L-1与HC6-11分别接种于LB液体培养基中，28℃，180r/min摇床上振荡24h。无菌蒸馏水调整OD600 为0.8，分别制得贝莱斯芽孢杆菌L-1与HC6-11的菌液；将贝莱斯芽孢杆菌L-1 与菌株HC6-11的菌液等比例混合制成复合菌株组合物。
分别测定贝莱斯芽孢杆菌L-1、菌株HC6-11及复合菌株组合物(贝莱斯芽孢杆菌L-1与菌株HC6-11等比例混合菌液)的防效，以三唑酮可湿性粉剂1000 倍液为药剂对照，以只接种C.mali QH2的作为阳性对照，以不接种的枝条作为阴性对照。具体测定方法如下：
将健康苹果树枝条切成10cm长，于0.1％次氯酸钠浸泡5min，酒精浸泡3min，用无菌水冲洗3次，风干后，两端用石蜡封紧。用直径6mm的钉帽烫伤树皮后用待测定菌液(贝莱斯芽孢杆菌L-1、菌株HC6-11、复合菌株组合物)浸泡枝条30s，将苹果腐烂病病原菌(C.maliQH2)的菌饼(直径6mm)放置在焦痕的上方，并用湿润的无菌吸水棉和保鲜膜覆包住接种部位，以不接种菌饼的枝条为对照将枝条放入容器中，保持湿度放入25℃的恒温光照培养箱中保湿培养，菌株在恒温培养箱中28℃培养10d后将敷于果枝上方的菌饼去掉观察发病情况，并测量病斑长度。防治效果(％)＝[1–(处理病斑直径/对照病斑直径)]× 100％。
结果如图6和表1所示，当接种菌液OD600为0.8时，贝莱斯芽孢杆菌L-1 对C.maliQH2在枝条上的抑制率为85.75％；菌株HC6-11的抑制率为64.3％；贝莱斯芽孢杆菌L-1与菌株HC6-11等比例混合形成的复合菌株组合物的抑制率达到94.64％，高于药剂防控效果。
表1贝莱斯芽孢杆菌L-1、菌株HC6-11及复合菌株组合物对苹果腐烂病的防治效果
注：*不同字母表示在P＝0.05水平差异显著
综上所述，本发明中贝莱斯芽孢杆菌L-1与菌株HC6-11等比例复配后制成的复合菌株组合物，在菌液浓度为OD600＝0.8时对苹果腐烂病的防效可达到 94.64％，高于药剂(三唑酮)1000倍的处理，显著提高对苹果腐烂病的防治效果，可广泛用于制备苹果腐烂病防治的生物制剂，在苹果种植中具有广泛的应用前景。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种复合菌株组合物，其特征在于，包括贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）L-1和菌株HC6-11，所述菌株HC6-11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.25338，分类命名为：韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis）；所述贝莱斯芽孢杆菌L-1的保藏编号为CGMCC No.14373。
2.根据权利要求1所述的一种复合菌株组合物，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌L-1和菌株HC6-11的复配比例为1:1。
3.如权利要求1或2所述的复合菌株组合物在制备苹果腐烂病的生防制剂中的应用。
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