TW202214837A - 用於控制植物病害的假單胞菌株及其代謝產物 - Google Patents

Abstract

本揭示案係關於使用新型細菌菌株0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328、由該等細菌菌株產生且可抑制多種作物之多種微生物種類生長之細胞液及新型代謝產物的方法。該等方法包括使用由該等菌株產生之對應於具有式(I)、(II)、及(III)之化合物的新型強效抗微生物代謝產物：

、

、及

Description

用於控制植物病害的假單胞菌株及其代謝產物

本發明為生物性殺蟲劑領域。具體而言，本發明係關於七種新型假單胞菌屬( Pseudomonasspp)菌株0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328、由該細菌菌株產生且可抑制多種微生物種類生長之細胞液(cell broth)及新型代謝產物。假單胞菌菌株0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328已寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)且分別具有ATCC登錄號PTA-126796、PTA-126797、PTA-126798、PTA-126799、PTA-126800、PTA-126801、及PTA-126802。另外，假單胞菌菌株0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328已寄存於財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)且分別具有FIRDI登錄號BCRC911020、BCRC911021、BCRC911022、BCRC911023、BCRC911024、BCRC911025、及BCRC911026。

由病原微生物引起之植物病害以指數方式增加且成本高昂。植物病原性生物體包括真菌、細菌、黴漿菌、病毒、類病毒、線蟲、或寄生性開花植物。目前，存在14種由細菌生物體引起之常見植物病害，該等病害包括細菌斑點病、細菌光點病(bacterial light)及細菌凋萎病等。火燒病(解澱粉歐文氏菌( Erwinia amylovora))、柑橘潰瘍病[地毯草黃單胞菌柑橘變種( Xanthomonas axonopodis pv. citri) (Xac)]、細菌性葉斑病(BLS) [ 野油菜黃單胞菌 皰病變種 (Xanthomonas campestrispv. vesicatora，XV-16)]、橄欖節疤病[薩氏假單胞菌薩氏變種( Pseudomonas savastanoipv. Savastanoi， Psv)]及軟腐病(菊歐文氏菌( Dickeya dadantii)、土豆果膠桿菌( Pectobacterium parmentieri) 、黒腐果膠桿菌 (Pectobacterium atrosepticum) 、及胡蘿蔔果膠桿菌( Pectobacterium carotovorum))為毀滅性植物病害。在全國，控制火燒病之成本據估計超過$ 10000萬(Norelli等人(2003))。對於柑橘潰瘍病，僅在弗羅裡達，自1995年至2005年運行根除程序之成本加上對商業種植者及住宅柑橘受損之私房屋主之補償接近$ 10億。

火燒病為由革蘭陰性細菌解澱粉歐文氏菌之感染引起的對仁果之毀滅性病害，該細菌在世界許多地區諸如歐洲、德國、澳大利亞及瑞士影響梨及蘋果(Chen等人(2009))。雖然火燒病很少殺死整個果樹園，但該病害及其控制仍引起顯著經濟損失。在太平洋西北地區及北加利福尼亞州，自1991年起已每年出現小爆發，至少一些地區每3至4年出現大爆發。甚至小病害爆發可能成本高，因為去除受感染植物部分之修剪導致樹木受損及未來生產率降低。舉例而言，4歲蘋果園中根莖枯萎之10%發生率可導致每英畝多達$3,500之損失(Norelli等人(2003))。

微生物天然產物已提供大量作為殺蟲劑之生物化合物(Gwinn (2018))。但是，當前用於細菌植物病害之預防方法之效果有限。在感染風險高時，抗生素硫酸鏈黴素(FireWall, AgroSource, Inc.)及鹽酸土黴素(FireLine, AgroSource, Inc.)為用於對抗解澱粉歐文氏菌之主要產品。因為該等化合物亦用於管理人及動物的健康，因此在作物農業中使用該等相同抗生素可能有爭議(Stockwell (2012))。對於硫酸鏈黴素，關於抗生素抗性之問題已限制其用途(Vrancken等人(2013))。正在針對火燒病研究之另一種抗生素為春日黴素。一個缺點為春日黴素之頻繁劑量導致破壞植物之植物性毒素作用(Adaskaveg等人(2010))。另一個缺點為春日黴素與其他抗生素相比成本更高。因此，春日黴素需要與各種其他抗生素配對。

在最近幾十年，已開發許多非抗生素產品，該等產品已向環境保護署(Environmental Protection Agency，EPA)登記，得到國家有機項目(National Organic Program，NOP)核准，且向果樹栽培者銷售以用於控制火燒病(Tianna等人(2018))。在歷史上，在歐洲已登記基於枯草桿菌( Bacillus subtilis)之兩種產品以用於控制火燒病：基於菌株QST 713之Serenade®及基於菌株BD 170之Biopro® (Broggini等人(2005))。基於產孢子桿菌之生物調配物由於其長效生存力而提供生物控制之優點(Haas等人(2005))。兩種基於桿菌之生物調配物已在美國及德國的許多田間試驗中證實了適度的成功(Aldwinckle等人(2002)；Kunz等人(2011)；Laux等人(2003))。這表明桿菌屬在控制解澱粉歐文氏菌之開花感染中之可能潛力。然而，桿菌僅在低感染壓力下起作用。桿菌在中度及高感染壓力情況下無效。關於兩種生物產品所獲得之結果不穩定，在71%與0%病害抑制之間變化(Broggini等人(2005))。

預期的生物保護產品在一方面必須與解澱粉歐文氏菌有效競爭，且在另一方面必須能夠使相同生態區位定殖於靶標植物的不同器官上。保護性細菌產生影響病原體之二級代謝產物且競爭食物及空間，從而預防解澱粉歐文氏菌與植物相關之發病機理。在此情況下，來自假單胞菌屬之細菌適應上文所述之生物保護性因子(Haas等人(2005))。對使細菌定殖於各種植物中之物種組成物進行之分析顯示假單胞菌屬之螢光細菌的廣泛出現。

在法國，發現假單胞菌屬為居住於健康及患病蘋果樹、梨樹及山楂樹上之群體的主要組成且其中許多細菌顯示限制解澱粉歐文氏菌在體外生長之能力(Paulin等人(1978))。然而，幾乎未報告強效代謝產物之資訊。

在加利福尼亞州，Thomson等人(1976)選擇三種有效於保護梨花之螢光假單胞菌(Thomson等人(1976))。在20世紀80年代中期，在加利福尼亞州自梨樹分離之螢光假單胞菌菌株A506顯示限制澱粉歐文氏菌生長之獨特活性及保護蘋果樹及梨樹使其免於火燒病之保護能力(Lindow等人(1996))。已開發含有螢光假單胞菌之產品BlightBan® A506，其自1996年起可在市場上獲得。在加利福尼亞州、俄勒岡州及華盛頓州進行之許多實驗表明此製備物在各種蘋果及梨保護程序中有用(Johnson (2000))。

在英國，使用兩種螢光假單胞菌分離株保護山楂樹之花及枝(Wilson等人(1992))。

在意大利及新西蘭，已研究以符號BO 3371及BO G19表示之兩種假單胞菌屬之適合性(Galasso等人(2002))。在溫室條件下，該等細菌高度有效於保護蘋果及梨之花以及枝。舉例而言，菌株BO3371對梨枝之相對保護可達到87% (Galasso等人(2002))。然而，所獲得之結果並不總一致，這可能與和自花開放至開花結束之時間長度相結合之花纏繞枝之容易性相關。

在新西蘭，螢光假單胞菌屬IPV-BO G19菌株在田間條件下保護79%蘋果花。在另一個實驗園中，當在用澱粉歐文氏菌接種於「布瑞本(Braeburn)」蘋果花上之前24小時噴灑時，螢光假單胞菌屬IPV-BO G19及IPV-BO 3371使火燒病分別降低78%及58% (Biondi等人(2006))。

在西班牙，螢光假單胞菌屬菌株EPS62e在田間測定中在關於蘋果花、梨果實及梨花之測試中顯著限制火燒病。藉由將營養增強與滲透適應(osmoadaptation)組合之策略來獲得螢光假單胞菌EPS62e對抗火燒病之適合性及功效的改善。用生理上改善之螢光假單胞菌EPS62e對梨花進行田間處理所生成之效率可高達90%，然而，根據該測試，結果不同(Cabrefiga等人(2011)；Mikiciński等人(2020))。

在波蘭，已自蘋果葉圈及土壤中分離能夠降低火燒病對梨小果之作用的47個細菌菌落(Mikiciński等人(2008))。

已綜合評論由革蘭陰性假單胞菌種類所產生之代謝產物(Masschelein等人(2017))。假單胞菌代謝產物之類型可分類為酚類化合物、啡口井、脂肽等。假單胞菌種類及其代謝產物之功能包括以下者(Alsohim等人(2014))：1)產生激素或誘導全身抗性；2)許多天然存在之菌株亦顯著改善植物生長(植物生長調節劑，IAA，黏液菌素)；3)拮抗作用可節約產生螯鐵蛋白及界面活性劑諸如黏液菌素及黏液醯胺(viscosinamide)以及抗微生物化合物諸如氰化氫、啡口井、吡咯尼群(吡咯尼群)或2,4-二乙醯基間苯三酚(DAPG)。在工作中，鑑別細菌菌株，由細菌產生發酵產物及新型代謝產物，具體而言，RejuAgro A及RejuAgro B對多種病原微生物顯示更高效力，該等病原微生物包括尚未報告之細菌及真菌。

需要來源於新型菌株之新生物殺蟲劑、由此類菌株產生且可抑制多種引起作物病害之病原體之生長的細胞液及新型代謝產物。

在第一態樣中，提供一種使細菌生長以增強保護性代謝產物之產生之方法。該方法包括替代步驟。在一種方法，提供使假單胞菌細菌在容器內之液體培養基中生長以產生細菌發酵產物之步驟。培養基體積與容器體積之比率為約1:2與1:10之間且容器以約100與250 RPM之間之速率振動。根據一個交替步驟，該方法包括使假單胞菌細菌在發酵罐之液體培養基中生長以產生細菌發酵產物之步驟。發酵罐之空氣流速為約1與3 L/min之間。溶解氧之濃度為5 mg/L至12 mg/L之間。

在第二態樣中，提供包含細菌發酵物或保護性上清液之農業組成物。該農業組成物根據第一態樣及關於第一態樣揭示之任何方面之方法而產生。在第一方面，農業組成物進一步包括佐劑。關於此點，佐劑為界面活性劑。

在第三態樣中，提供一種控制細菌作物病害之方法。該方法包括若干步驟。第一步驟包括產生農業組成物，該農業組成物包含藉由第一態樣或其任何方面產生之細菌發酵產物或保護性上清液。第二步驟包括向作物施加該農業組成物以抑制病原微生物之生長。

在第四態樣中，提供一種控制細菌作物病害之方法。該方法包括一個步驟。步驟包括向作物施加包含每mL假單胞菌細菌約1.0 x 10 ⁵與1.0 x 10 ⁹cfu之間之農業組成物以抑制病原微生物之生長。

在第五態樣中，提供一種純化來自假單胞菌細菌之保護性代謝產物之方法。該方法包括若干步驟。第一步驟包括藉由第一態樣及其方面之方法產生細菌發酵產物或保護性上清液。第二步驟包括藉由具有類似極性或特徵之溶劑混合物來萃取細菌發酵產物或保護性上清液。第三步驟包括藉由使用己烷及乙酸乙酯之混合物溶離該細菌發酵產物或保護性上清液或藉由使用己烷及乙酸乙酯之混合物溶離細菌發酵產物或保護性上清液來產生含有保護性代謝產物之溶離物。

在第六態樣中，藉由第五態樣及其方面之方法純化來自假單胞菌細菌之包含保護性代謝產物之農業組成物。

在第七態樣中，提供一種控制細菌作物病害之方法。該方法包括若干步驟。第一步驟包括產生藉由第五態樣及其任何方面之方法純化之來自假單胞菌細菌之包含保護性代謝產物的農業組成物。第二步驟包括施加該農業組成物，保護性上清液或其代謝產物之調配物可為溶液(SL)、可溶性粉末(SP)、可溶性顆粒(SG)及封裝調配物。另外，細菌發酵產物及細胞之調配物之農業組成物可為懸浮液濃縮物(SC)、可潤濕粉末(WP)及水分散性顆粒(WG).

在第八態樣中，結晶化合物選自以下結構之一：

(式(I))、

(式(II))、及

(式(III))。

本發明係關於一種由本專利列出之七種假單胞菌菌株諸如0617-T307產生之新型代謝產物，該代謝產物表現出針對病原微生物(包括細菌及真菌)之抗微生物活性。由16S rRNA及其他持家基因序列，可將菌株鑒別為戀臭假單胞菌( Pseudomonas putida)組中之土壤假單胞菌( Pseudomonas soli)0617-T307。7種細菌菌株諸如0617-T307之細胞液包含如下所示之表示為RejuAgro A之新型強效6員雑環天然產物以及二聚物RejuAgro B。

RejuAgro A及

RejuAgro B。

該等化合物、其產生方法及其用於抑制植物微生物病原體之應用在本文中更詳細地揭示。 定義

當介紹本揭示案之態樣或具體實施例之元件時，冠詞「一(a/an)」及「該(the/said)」欲意謂存在一或多個元件。術語「包含(comprising)」、「包括(including)」及「具有(having)」意欲包括性的且意謂可能存在除所列元件以外之其他元件。除非另外指明，否則術語「或(or)」意指特定列表中之任一成員且亦包括該列表之成員之任何組合。

如本文預期的，術語「基本上(substantially)」、「大約(approximately)」及「約(about)」及類似術語意欲具有與本揭示案所屬技術範圍內之常見及公認用途一致的廣泛含義。評論本揭示案之熟悉此項技藝者應理解，該等術語意欲允許描述所述且所申請之某些特徵而不限制該等特徵之範疇至所提供之精確數值範圍。因此，該等術語應解釋為指示，對所述且所申請之主題的少量或不重要修改或改變被認為處於如隨附申請專利範圍所述之本發明的範疇內。

「生物控制劑(或BCA)」為安全、持久且成本有效地管理害蟲諸如病原體、雜草及昆蟲之方式。將該等劑引入環境中以靶向害蟲種類，其目標為降低環境中之害蟲群體或豐度。

「生物製劑」為在宿主上產生菌落之活微生物(細菌及酵母)之製備物。該等微生物主要被應用於在附生期期間延遲病原體積累(Tianna等人(2018))。

「生物合理性」為適用於基於微生物之生物殺蟲劑之術語。該等生物殺蟲劑通常藉由使微生物菌株發酵來製成。許多該等產品具有抗細菌及抗真菌活性(Tianna等人(2018))。

「生物殺蟲劑」由美國環境保護署(EPA)定義為來源於天然材料之殺蟲劑且將其分類為包含藉由無毒機制控制害蟲之物質的生物化學殺蟲劑、由通常產生生物活性天然產物(BNP)之微生物組成之微生物殺蟲劑或由於遺傳物質增加而具有由植物產生之活性的植物嵌入式保護劑 Gwinn K.D.(2018))。

稱為RejuAgro A、RejuAgro B及RejuAgro C之化合物對應於分別具有如下所示之式(I)、(II)及(III)的化學化合物：

(I)、

(II)及

(III)。

在第一態樣中，提供一種使細菌生長以增強保護性代謝產物之產生之方法。該方法包括替代步驟。在一種方法，提供使假單胞菌細菌在容器內之液體培養基中生長以產生細菌發酵產物之步驟。培養基體積與容器體積之比率為約1:2與1:10之間且容器以約100與250 RPM之間之速率振動。根據一個交替步驟，該方法包括使假單胞菌細菌在發酵罐之液體培養基中生長以產生細菌發酵產物之步驟。發酵罐之空氣流速為約1與3 L/min之間。在一個方面，該方法進一步包括在一段時間後將液體培養基與細菌分離以產生包含保護性代謝產物之保護性上清液之步驟。在第二方面，細菌包括選自以下項之假單胞菌菌株：0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328。在第三方面，生長溫度在約10℃與35℃之間。在第四方面，液體培養基為用於生產細胞之LB/YME培養基。在第五方面，液體培養基為用於產生RejuAgro A之YME培養基。在第六方面，培養基體積與容器體積之比率為約1:5與1:10之間。在第七方面，培養基體積與容器體積之比率為約1:7與1:9之間。在第八方面，培養基體積與容器體積之比率為約1:8。在第九方面，容器以約200與250 RPM之間之速率振動。在第十方面，容器以約210與230 RPM之間之速率振動。第十一方面，發酵罐之空氣流速為約1.5與2.5 L/min之間且溶解氧之濃度為5 mg/L至12 mg/L之間。在第十二方面，生長溫度為約10℃與20℃之間。在第十三方面，生長溫度為約15℃與17℃之間。在第十四方面，該細菌生長達18 h至7天之一段時間。在第十五方面，細胞生長達七天之一段時間。在第十六方面，細胞生長達一天與兩天之間的一段時間。

在第二態樣中，提供包含細菌發酵物或保護性上清液之農業組成物。該農業組成物根據第一態樣及關於第一態樣揭示之任何方面之方法而產生。在第一方面，農業組成物進一步包括佐劑。關於此點，佐劑為界面活性劑。

在第三態樣中，提供一種控制細菌及真菌作物病害之方法。該方法包括若干步驟。第一步驟包括產生農業組成物，該農業組成物包含藉由第一態樣或其任何方面產生之細菌發酵產物或保護性上清液。第二步驟包括向作物施加該農業組成物以抑制病原微生物之生長。

在第一方面，作物病害選自由以下項組成之群：番茄及辣椒火燒病、柑橘潰瘍病、橄欖節疤病、及軟腐病。在第二方面，病原微生物選自由以下項組成之群：香蕉黑條葉斑病菌、灰黴菌、解澱粉歐文氏菌(Ea)、地毯草黃單胞菌柑橘變種(Xac)、土豆果膠桿菌、黒腐果膠桿菌、胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種(Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis)、胡蘿蔔果膠桿菌胡蘿蔔子種(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)、菊歐文氏菌、薩氏假單胞菌薩氏變種(Psv)、丁香假單胞菌番茄變種(Pseudomonas syringae pv. tomato)、丁香假單胞菌丁香變種(Pseudomonas syringae pv syringae)、丁香假單胞菌黃瓜變種(Pseudomonas syringae pv. lachrymans)、野油菜黃單胞菌李變種(Xanthomonas campestris pv. pruni)、野油菜黃單胞菌皰病變種(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)、樹生黃單胞菌核桃變種(Xanthomonas arboricola pv. juglandis)、青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)、密西根棒形桿菌密西根子種(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)、馬鈴薯腐疫菌(Phytophthora infestans)、蘋果黑星病菌、稻黃單胞菌稻變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、稻黃單胞菌稻生變種(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola)、及柑桔黃單孢菌柑桔變種(Xanthomonas citri pv. citri)。在第三方面，作物選自以下項中之一或多者：香蕉、蘋果、梨、海棠、柑橘、馬鈴薯、南瓜、洋蔥、稻、非洲菫、蕓薹科、茄科、葫蘆科植物種類(包括胡蘿蔔、馬鈴薯、番茄、茄子、綠葉蔬菜、南瓜及瓜類)、辣椒及青椒、橄欖、核果及梨果植物(包括橄欖、桃、胡桃)。

在第四態樣中，提供一種控制細菌作物病害之方法。該方法包括一個步驟。步驟包括向作物施加包含每mL假單胞菌細菌約1.0 x 10 ⁵與1.0 x 10 ⁹cfu之間之農業組成物以抑制病原微生物之生長。

在第一方面，假單胞菌細菌為選自以下項之假單胞菌菌株：0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328。在第二方面，該組成物包含每mL假單胞菌細菌約5.0 x 10 ⁷與2.0 x 10 ⁸cfu之間。在第三方面，作物病害選自由以下項組成之群：黑葉斑病、灰黴病、火燒病、柑橘潰瘍病、軟腐病、橄欖節疤病、番茄細菌性斑點病、細菌性潰瘍病或稻瘟病(核果及梨果)、瓜類角斑病、桃細菌性斑點病、番茄細菌性斑點病、核桃黑腐病、細菌凋萎病、番茄潰瘍病、馬鈴薯晚疫病、蘋果黑星病、細菌性葉疫病、及細菌性葉條斑病。在第四方面，病原微生物選自由以下項組成之群：香蕉黑條葉斑病菌 、灰黴菌、解澱粉歐文氏菌( Ea) 、地毯草黃單胞菌柑橘變種( Xac) 、土豆果膠桿菌、黒腐果膠桿菌、胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種、胡蘿蔔果膠桿菌胡蘿蔔子種、菊歐文氏菌、薩氏假單胞菌薩氏變種( Psv)、丁香假單胞菌番茄變種、丁香假單胞菌丁香變種、丁香假單胞菌黃瓜變種、野油菜黃單胞菌李變種、野油菜黃單胞菌皰病變種、樹生黃單胞菌核桃變種、青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、馬鈴薯腐疫菌、蘋果黑星病菌、稻黃單胞菌稻變種、稻黃單胞菌稻生變種 、及柑桔黃單孢菌柑桔變種。在第五方面，作物選自以下項中之一或多者：香蕉、蘋果、梨、海棠、柑橘、馬鈴薯、南瓜、洋蔥、稻、非洲菫、蕓薹科、茄科、葫蘆科植物種類(包括胡蘿蔔、馬鈴薯、番茄、茄子、綠葉蔬菜、南瓜及瓜類)、辣椒及青椒、橄欖、核果及梨果植物(包括橄欖、桃、胡桃)。

在第五態樣中，提供一種純化來自假單胞菌細菌之保護性代謝產物之方法。該方法包括若干步驟。第一步驟包括藉由第一態樣及其方面之方法產生細菌發酵產物或保護性上清液。第二步驟包括藉由乙酸乙酯萃取來萃取細菌發酵產物或保護性上清液。第三步驟包括藉由使用己烷及乙酸乙酯之混合物，諸如例如50%己烷及50%乙酸乙酯之混合物溶離細菌發酵產物或保護性上清液或藉由使用己烷及乙酸乙酯之混合物，諸如例如25%己烷及75%乙酸乙酯之混合物溶離乙酸乙酯萃取物來產生含有保護性代謝產物之溶離物。

在第一方面，假單胞菌細菌為選自以下項之假單胞菌菌株：0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328。

在第六態樣中，藉由第五態樣及其方面之方法純化來自假單胞菌細菌之包含保護性代謝產物之農業組成物。

在第七態樣中，提供一種控制細菌作物病害之方法。該方法包括若干步驟。第一步驟包括產生藉由第五態樣及其任何方面之方法純化之來自假單胞菌細菌之包含保護性代謝產物的農業組成物。第二步驟包括向作物施加該農業組成物以抑制病原微生物之生長。

在第一方面，作物病害選自由以下項組成之群：番茄及辣椒火燒病、柑橘潰瘍病、橄欖節疤病、軟腐病。在第二方面，病原微生物選自由以下項組成之群：香蕉黑條葉斑病菌 、灰黴菌、解澱粉歐文氏菌( Ea)(尤其是鏈黴素抗性之解澱粉歐文氏菌菌株) 、地毯草黃單胞菌柑橘變種( Xac) 、土豆果膠桿菌、黒腐果膠桿菌、胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種、胡蘿蔔果膠桿菌胡蘿蔔子種、菊歐文氏菌、薩氏假單胞菌薩氏變種( Psv)、丁香假單胞菌番茄變種、丁香假單胞菌丁香變種、丁香假單胞菌黃瓜變種、野油菜黃單胞菌李變種、野油菜黃單胞菌皰病變種、樹生黃單胞菌核桃變種、青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、馬鈴薯腐疫菌、蘋果黑星病菌、稻黃單胞菌稻變種、稻黃單胞菌稻生變種 、及柑桔黃單孢菌柑桔變種。在第三方面，病原性解澱粉歐文氏菌為鏈黴素抗性解澱粉歐文氏菌。在第四方面，作物選自以下項中之一或多者：香蕉、蘋果、梨、海棠、柑橘、馬鈴薯、南瓜、洋蔥、稻、非洲菫、蕓薹科、茄科、葫蘆科植物種類(包括胡蘿蔔、馬鈴薯、番茄、茄子、綠葉蔬菜、南瓜及瓜類)、辣椒及青椒、橄欖、核果及梨果植物(包括橄欖、桃、胡桃)。在第五方面，病原細菌為柱狀黃桿菌( Flavobacterium columnare)#2、柱狀黃桿菌MS-FC-4。在第六方面，病原細菌為大腸桿菌O157:H7。

在第八態樣中，結晶化合物選自以下結構之一：

式(I)、

式(II)、及

式(III)。

在第一方面，結晶化合物為以下結構：

式(I)， 其中該結晶化合物包括至少一種物理特性，其選自表13-22。

在第二方面，結晶化合物為以下結構：

式(II)， 其中該結晶化合物包括至少一種物理特性，其選自表23-29。

在第三方面，結晶化合物為以下結構：

式(III)， 其中該結晶化合物包括至少一種物理特性，其選自表30-37。 生物寄存資訊

細菌菌株土壤假單胞菌0617-T307、土壤假單胞菌0917-T305、土壤假單胞菌0917-T306、土壤假單胞菌0917-T307、摩氏假單胞菌( Pseudomonas mosselii)0118-T319、摩氏假單胞菌0318-T327、及摩氏假單胞菌0418-T328在2020年6月25日提交至美國典型培養物保藏中心(ATCC®), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110 USA (「ATCC專利寄存處」)且分別授予非官方ATCC專利號PTA-126796、PTA-126797、PTA-126798、PTA-126799、PTA-126800、PTA-126801、及PTA-126802。在生存力測試後，ATCC專利寄存處向該等寄存細菌菌株授予以下登錄號，自2020年6月25日起效：土壤假單胞菌0617-T307 (登錄號PTA-126796)、土壤假單胞菌0917-T305 (登錄號PTA-126797)、土壤假單胞菌0917-T306 (登錄號PTA-126798)、土壤假單胞菌0917-T307 (登錄號PTA-126799)、摩氏假單胞菌0118-T319 (登錄號PTA-126800)、摩氏假單胞菌0318-T327 (登錄號PTA-126801)、及摩氏假單胞菌0418-T328 (登錄號PTA-126802)。另外，細菌菌株 土壤假單胞菌0617-T307、土壤假單胞菌0917-T305、土壤假單胞菌0917-T306、土壤假單胞菌0917-T307 、摩氏假單胞菌0118-T319、摩氏假單胞菌0318-T327、及摩氏假單胞菌0418-T328寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)，在生存力測試之後，FIRDI向該等細菌授予以下登錄號，自2020年9月18日有效： 土壤假單胞菌0617-T307 (登錄號BCRC 911020)、土壤假單胞菌0917-T305 (登錄號BCRC 911021)、土壤假單胞菌0917-T306 (登錄號BCRC 911022)、土壤假單胞菌0917-T307 (登錄號BCRC 911023)；自2020年9月17日有效： 摩氏假 單胞菌0118-T319 (登錄號BCRC 911024)、摩氏假單胞菌0318-T327 (登錄號BCRC 911025)、及 摩氏假 單胞菌0418-T328 (登錄號BCRC 911026) 實例實例1. 菌株0617-T307之鑑別及表徵。

分析來自16S rDNA、 gyrB、 rpoB及 rpoD之部分序列。該等四個基因為假單胞菌種類中用於多序列分析(MLSA)之經推薦標記(Peix等人(2018))。

對於種類評定，使用該四個序列針對NCBI非冗餘核苷酸資料庫運行BLASTN。基於結果，菌株0617-T307與螢光假單胞菌品系內之戀臭假單胞菌組中之假單胞菌種類緊密相關。使用(Peix等人(2018)；參見Peix等人(2018)中之圖2及表2)「MLSA物種發生」及「來自假單胞菌屬之模式菌株之基因組列表」作為用於進行分類單元取樣之指導(第1圖)。基於此資訊，基因組獲自GenBank。包括戀臭假單胞菌組內所有具有高品質基因組組件之種類。因為0617-T307與土壤假單胞菌具有最高 rpoD(亦即，對於假單胞菌種類命名具有最高分辨功能之基因)序列相似性，在取樣中包括土壤假單胞菌之所有四個可用基因組(包括土壤假單胞菌之模式菌株LMG 27941 ^T)。對於螢光假單胞菌品系內之其他種類，選擇一個種類作為各組之代表。包括銅綠假單胞菌( P. aeruginosa) (銅綠假單胞菌組；銅綠假單胞菌品系)作為固定樹木之外群。

由所取樣基因組萃取MLSA之四個基因。單獨比對各基因，然後使所有四個核苷酸比對串聯以進行種系發生分析。串聯比對含有9,912個經比對核苷酸位點。使用PhyML進行最大可能性推理(Guindon等人(2003))。藉由1,000次複製進行自舉支持。

基於多分子物種發生(第1圖)，0617-T307及所有四種具有可用基因組序列之土壤假單胞菌菌株形成具有100%自舉支持之單系分枝。此結果提供用於將0617-T307分配給土壤假單胞菌之強烈支持，據報告該土壤假單胞菌分離自西班牙內華達山脈國家公園之土壤樣品(Pascual等人 (2014))

另外，基於由García-Valdés及Lalucat提供至假單胞菌種類命名之指導((García-Valdés等人(2016))，包括用於將0617-T307分配給土壤假單胞菌之額外支持：(a) 16S rDNA ＞ 98.7-99%同一性。與土壤假單胞菌之模式菌株相比，0617-T307共享99.2%序列同一性。與蟲媒假單胞菌( P. entomophila)之姊妹種相比，0617-T307共享99.5%序列同一性。注意，已知16S rDNA缺乏用於在假單胞菌中進行種類鑑別之足夠分辨能力(García-Valdés等人(2016)；Peix等人(2018))；(b) rpoD基因＞ 95-96%同一性。與土壤假單胞菌之模式菌株相比，0617-T307共享96.5%序列同一性。與蟲媒假單胞菌之姊妹種相比，0617-T307僅共享89.1%序列同一性；及(c) MLSA ＞ 97%同一性。與土壤假單胞菌之模式菌株相比，0617-T307共享98.0%序列同一性。與蟲媒假單胞菌之姊妹種相比，0617-T307僅共享95.1%序列同一性。 實例2. 由菌株0617-T307之細胞液之乙酸乙酯萃取物製備、分離且表徵RejuAgro A及RejuAgro B。

RejuAgro A及B之製備物可藉由對來自發酵罐發酵之細胞液進行乙酸乙酯萃取，接著進行層析分離及純化來獲得。簡言之，將細菌假單胞菌屬0617-T307儲備液劃線接種到LB板(胰蛋白腖，10 g/L；酵母萃取物，5 g/L；NaCl，10 g/L；瓊脂，15 g/L；水)上，且使其在28℃溫育器中生長24 h。為了製備種子培養基，將單個0617-T307菌落接種到含有500 mL經高壓滅菌YME培養基(酵母萃取物，4 g/L；葡萄糖，4 g/L，及麥芽萃取物，10 g/L)之2.0 L燒瓶中且使其在28℃下在200 rpm振動速率下生長24 h。然後將種子培養基接種到含有12 L經高壓滅菌YME培養基之20 L NBS發酵罐中。將發酵在16℃下進行1-7天。攪拌速度及空氣流速分別為200 rpm及2 L/min。

在收穫後，藉由乙酸乙酯萃取細菌培養物四次。使用硫酸鈉分離乙酸乙酯層且使其水化，且藉由在35℃下進行旋轉蒸發來乾燥。這由菌株0617-T307之12 L培養物得到2.9 g粗萃取物。

將濃縮樣品溶解於乙酸乙酯中且將其與矽膠混合，將該矽膠作為注入管柱(φ3.0 X 20 cm)封裝且安裝於裝備有UV偵測器之急劇層析系統(Yamazen AI-580)之Universal管柱(4.8 x 18.5 cm)頂部。在裝載該樣品後，依次藉由280 mL具有逐漸增加的極性之各以下溶劑溶離該樣品：100%己烷、75%己烷/25%乙酸乙酯、50%己烷/50%乙酸乙酯、25%己烷/75%乙酸乙酯、100%乙酸乙酯、50%乙酸乙酯/50%丙酮、100%丙酮、及100%甲醇。以20 mL/min之流速溶離該樣品。在UV 254 nm下監測該溶離物，且藉由時間模式以20 mL/管收集流份。總之，由急劇層析法生成114個流份或管。

將所生成之流份用於後續板檢定。將一mL各流份移液到1.5 mL測試管中且藉由Eppendorf真空濃縮器進行真空乾燥。將經乾燥樣品溶解於50 µL DMSO中，其中2 µL用於板檢定中。簡言之，將解澱粉歐文氏菌273劃線接種到LB板上以使其在28℃溫育器中生長且將在24 h之後獲得之單個菌落接種到5 mL LB培養基中以允許在28℃振動器中在200 rpm下生長隔夜。將細菌以無菌水1:100稀釋，將其中225 µL鋪板到50% LB板(胰蛋白腖，5.0 g/L；酵母萃取物，2.5 g/L；NaCl，5.0 g/L，瓊脂，15 g/L)上。在生物安全櫃中乾燥10 min，然後將各流份之DMSO溶液分佈於培養皿之預標記區段且允許其再乾燥10 min。連同該檢定，DMSO及春日黴素分別用作陰性及陽性對照。然後將該等板在28℃溫育器中溫育且在一天後檢查抑制區域。

114個流份之體外板檢定顯示兩個流份抑制解澱粉歐文氏菌273之生長。值得注意的是，藉由50%己烷/50%乙酸乙酯溶離之流份/管38-40 (其縮寫為T3840或Flash-RejuAgro A)具有相對大的清除區域，該區域有效地在進一步測試情況下可為有前景的。在此檢定中其他生物活性化合物為處於流份50-52中(其可編碼為T5052)。藉由25%己烷/75%乙酸乙酯溶離該等流份。

製備型HPLC (Prep-HPLC)純化流份3840及5054，分別發現15 mg黃色化合物RejuAgro A (Rt17.5)及103.3 mg深綠色化合物RejuAgro B。可將RejuAgro A溶解於甲醇及氯仿中。RejuAgro B (Rt10.5)不易溶解於甲醇或氯仿中，但其極易溶於二甲基亞碸(DMSO)中，呈深綠色。已藉由高分辨率質譜法(HR-MS)、紅外(IR)、紫外(UV)、1D及2D核磁共振(NMR)以及X-射線晶體結構分析來研究該兩種化合物之結構。已顯示，該兩種化合物為結構上類似的，化合物RejuAgro A含有7個類型之碳基(三個類型的羰基、兩個類型的三級碳、兩個類型的甲基碳)，但RejuAgro B缺乏一個類型的甲基，如下所示：

RejuAgro A及

RejuAgro B。

藉由在室溫下緩慢蒸發氯仿溶液來進一步獲得RejuAgro A晶體。將該等晶體鑑別為橙色錠劑。在100K下使用Oxford SuperNova繞射計使用Cu(Kα)輻射收集資料集。該分子具有平面結構，其中S-Me(甲基)基團相對於雑環僅旋轉8.7°。該分子在C4-C5鍵(1.531 Å)處之π-共軛顯著破裂，顯然，這是因為一些軌道原因。連接至sp ²碳原子之Me基團在2個位置上可旋轉地紊亂。晶體中之分子透過N-H…O相互作用形成中心對稱H鍵合之二聚物。此外，該等二聚物藉由較弱C-H…O相互作用沿著[-3 0 1]平面形成2維層。RejuAgro A分子表示6員雜環[-NH-C(=O)-C(-SMe)=C(-Me)-C(=O)-C(=O)-]。RejuAgro B之晶體被鑑別為三斜晶胞。RejuAgro B之結構含有兩個對稱獨立的分子。每個分子具有螺旋結構，其中經連接雑環之平均平面之間的雙面角為70.3°及80.6°。每個雑環在兩個相鄰羰基基團之間的C(sp ²)-C(sp ²)鍵(鍵長度為1.534-1.539 Å範圍內)處π共軛顯著破裂，顯然，這是因為一些軌道原因。晶體中之分子透過N-H…O相互作用形成中心對稱H鍵合之二聚物。該等二聚物在堆疊中沿著x方向藉由其他N-H…O相互作用來連接。最後，該等堆疊藉由第三種N-H…O相互作用沿著[0 1 1]連接到層中。當將RejuAgro B溶液用於晶體生長時，獲得兩種晶體且將其命名為RejuAgro B及RejuAgro C。RejuAgro B及RejuAgro C二者之晶體具有極其類似的分子質量(參見實例20)。

RejuAgro A、RejuAgro B、及RejuAgro C之晶體結構資訊呈現於實例20中，該實例之內容形成本申請之一部分且以引用方式整體併入。

RejuAgro A之分子式為C ₇H ₇NO ₃S，且分子量：185.2004。這與在HR-MS資料中在 m/ z186.2177 (理論值186.2083)下之[M+H]的經觀測分子種類一致。RejuAgro B分子式為C ₁₂H ₈N ₂O ₆S，且分子量：276.2017。這與在HR-MS資料中在 m/ z275.0278 (理論值275.1960)下之[M-H]的經觀測分子種類一致。自2020年8月4日起CCDC結構資料庫搜索指示，不存在RejuAgro A、RejuAgro B及RejuAgro C之晶體結構。其他化學資料庫諸如SciFinder、Reaxys、及Google專利及專利相關資料庫搜索表明，不存在RejuAgro A或RejuAgro C之類似物，除了自SciFinder及Reaxys發現RejuAgro B之一個參考(Knackmuss等人(1968))。 實例3. 來自菌株0617-T307之RejuAgro A及RejuAgro B之體外抗微生物活性

決定五種類型之細菌之RejuAgro A及RejuAgro B之MIC值：野生型革蘭陰性植物致病性細菌、鏈黴素抗性解澱粉歐文氏菌、引起魚病之細菌、革蘭陽性及革蘭陰性人類致病性細菌、及RejuAgro A產生者(菌株0617-T307)。根據CLSI抗微生物易感性測試(Antimicrobial Susceptibility Testing，AST)標準進行抗微生物檢定。簡言之，將各測試細菌之儲備溶液劃線接種到LB (Luria-Bertani)板(胰蛋白腖，10 g/L；酵母萃取物，5 g/L；鈉鹽，10 g/L；瓊脂，15 g/L)上。對於特殊培養，將NA (營養液+瓊脂)板(牛肉萃取物，3 g/L；酵母萃取物，1 g/L；聚蛋白腖，5 g/L；蔗糖，10 g/L；及瓊脂，15 g/L)用於 Xac。將SHIEH (胰蛋白腖，5 g/L；酵母萃取物，0.5 g/L；乙酸鈉，0.01 g/L；BaCl ₂(H ₂O) ₂，0.01 g/L；K ₂HPO ₄，0.1 g/L；KH ₂PO ₄，0.05 g/L；MgSO ₄∙7H ₂O，0.3 g/L；CaCl ₂∙2H ₂O，0.0067 g/L；FeSO ₄∙7H ₂O，0.001 g/L；NaHCO ₃，0.05 g/L；瓊脂，10 g/L)及TYES (胰蛋白腖，4 g/L；酵母萃取物，0.4 g/L；MgSO4，0.5 g/L；CaCl ₂0.5 g/L；pH至7.2，瓊脂，15 g/L)分別用於柱狀黃桿菌菌株MS-FC-4及#2。此後，將來自該板之單個菌落挑出且接種到對應液體培養基中，以使其生長隔夜。將培養物在LB或對應培養基中稀釋至OD ₅₉₀=0.01，且以200 µL/孔分佈於96孔板中。稀釋化合物RejuAgro A及RejuAgro B及鏈黴素且將4 µL各濃度添加到各孔中以製成以下最終濃度：40 µg/mL、20 µg/mL、10 µg/mL、5 µg/mL、2.5 µg/mL、1.25 µg/mL、0.625 µg/mL、0.3125 µg/mL、0.15625 µg/mL、0.078 µg/mL。將媒劑水(用於鏈黴素)或DMSO (用於RejuAgro A及RejuAgro B)用作對照。

檢定結果顯示，RejuAgro A而非RejuAgro B為菌株0617-T307之最具活性代謝產物。當與對革蘭陽性MRSA (MIC＞40 µg/mL)及革蘭陰性大腸桿菌O157:H7 (在人類中引起腹瀉、出血性結腸炎、及溶血性尿毒性症候群(HUS)之重要食源性及水源性病原體) (MIC=40 µg/mL)之作用相比時，RejuAgro A對於所測試細菌特別有效，其中MIC值為5-40 µg/mL。RejuAgro A之抗微生物活性等效於鏈黴素對於菌株解澱粉歐文氏菌1189 、地毯草黃單胞菌柑橘變種、薩氏假單胞菌薩氏變種、土豆果膠桿菌UPP163 936、胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種944、胡蘿蔔果膠桿菌胡蘿蔔子種wpp14 945、菊歐文氏菌3937之活性，其對於解澱粉歐文氏菌顯示5 µg/mL之MIC值且對於其他軟致病性細菌顯示20-40 µg/mL之MIC值。黃單胞菌屬細菌對鏈黴素非常敏感，其MIC值為0.16 µg/mL，這低於RejuAgro A之MIC值5 µg/mL。薩氏假單胞菌薩氏變種之RejuAgro A之MIC值為40 µg/mL。樹生黃單胞菌核桃變種219之RejuAgro A之MIC值為6.25 µg/mL。青枯雷爾氏菌K60及Pss4之RejuAgro A之MIC值分別為3.13及6.25 µg/mL。密西根棒形桿菌密西根子種NCPPB382、Cmm 0317、Cmm 0690之RejuAgro A之MIC值分別為6.25、1.56、及12.5 µg/mL。青枯雷爾氏菌K60及Pss4之RejuAgro A之MIC值為40 µg/mL。

還針對其他解澱粉歐文氏菌菌株測試RejuAgro A，該等菌株包括一種病毒性解澱粉歐文氏菌及三種鏈黴素抗性解澱粉歐文氏菌菌株。RejuAgro A針對解澱粉歐文氏菌110顯示與鏈黴素相同之功效(MIC值5 µg/mL)。然而，RejuAgro A針對解澱粉歐文氏菌1189比鏈黴素更有效。RejuAgro A及鏈黴素對於解澱粉歐文氏菌1189之MIC值分別為5 µg/mL及10 µg/mL。另外，RejuAgro A針對鏈黴素抗性解澱粉歐文氏菌CA11、DM1及898更有效，因為對於RejuAgro A觀測到低於鏈黴素MIC值(＞40 µg/mL)之MIC值(10 µg/mL)。該等結果表明RejuAgro A在測試中為針對解澱粉歐文氏菌之最強效化合物且代表用於代替鏈黴素之潛在候選物。在鏈黴素抗性菌株中無對RejuAgro A之交叉抗性。

關於對引起柱狀魚病之黃桿菌之作用，RejuAgro A對柱狀黃桿菌菌株MS-FC-4及#2(在野生及經培養魚中引起柱狀疾病)之MIC值為5 µg/mL，該值高於鏈黴素之MIC值(對於菌株#2及MS-FC-4分別為0.31 µg/mL及1.25 µg/mL)。

測試RejuAgro A針對菌株0617-T307之影響。其顯示，RejuAgro A針對土壤假單胞菌0617-T307 (RejuAgro A產生者)之MIC值在經測試LB培養基中大於40 µg/mL，這意味著菌株0617-T307可存在且對本身產生之至少40 µg/mL RejuAgro A具有抗性。

針對番茄病原體(丁香假單胞菌番茄變種PT30、丁香假單胞菌丁香變種7046、丁香假單胞菌黃瓜變種1188-1)及其他柑橘潰瘍病病原體( 野油菜黃單胞菌李變種、野油菜黃單胞菌皰病變種XV-16)測試RejuAgro A連同鏈黴素。RejuAgro A針對丁香假單胞菌之MIC值為40 µg/mL，而鏈黴素之MIC值為2.5-5 µg/mL。關於針對野油菜黃單胞菌，RejuAgro A之MIC值為2.5 µg/mL或40 µg /mL，其小於鏈黴素之MIC值，該等鏈黴素之MIC值為20 µg/mL或大於40 µg/mL。該等值表明，當與經假單胞菌引起之番茄病原體相比時，野油菜黃單胞菌病原體對RejuAgro A比對鏈黴素更敏感。

RejuAgro A顯示針對所有經測試致病性真菌之功效(表1)。針對馬鈴薯腐疫菌、蘋果黑星病菌及香蕉黑條葉斑病菌測試RejuAgro A。RejuAgro A在40 µg/mL、80 µg/mL及600 µg/mL下顯示針對馬鈴薯腐疫菌及蘋果黑星病菌之100%抑制(表1)。

表1. RejuAgro A之抗微生物作用之匯總

菌株(相關病害)	MIC (µg/mL)
RejuAgro A	鏈黴素
解澱粉歐文氏菌1189 (蘋果/梨火燒病)	5	20
解澱粉歐文氏菌110 a(蘋果/梨火燒病)	5	5
解澱粉歐文氏菌CA11 b(蘋果/梨火燒病)	10	＞40
解澱粉歐文氏菌DM1 b(蘋果/梨火燒病)	10	＞40
解澱粉歐文氏菌898 c(蘋果/梨火燒病)	10	＞40
地毯草黃單胞菌柑橘變種 -Miami XC2002-00010 (柑橘潰瘍病)	5	0.16
地毯草黃單胞菌柑橘變種N40-SO5 (柑橘潰瘍病)	5	0.16
二甲苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌USA300 (皮膚感染、敗血症)	＞40	10
土豆果膠桿菌UPP163 936 (在多種作物中產生軟腐病)	40	40
黒腐果膠桿菌942 (在多種作物中產生軟腐病)	20	20
胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種944 (在多種作物中產生軟腐病)	40	40
胡蘿蔔果膠桿菌胡蘿蔔子種wpp14 945 (在多種作物中產生軟腐病)	40	40
菊歐文氏菌3937 (在多種作物中產生軟腐病)	40	20
薩氏假單胞菌薩氏變種(橄欖節疤病)	40	0.31
大腸桿菌O157:H7 (食源性疾病)	40	20
柱狀黃桿菌#2 (柱狀魚病)	5	0.31
柱狀黃桿菌MS-FC-4 (柱狀魚病)	5	1.25
土壤假單胞菌0617-T307 (RejuAgro A產生者)	＞40	＞40
丁香假單胞菌番茄變種PT30 (番茄細菌性斑點)	40	2.5
丁香假單胞菌丁香變種7046 (細菌性Ba潰瘍病或稻瘟病(核果及梨果))	20	2.5
丁香假單胞菌黃瓜變種1188-1 (瓜類角斑病)	10	5
野油菜黃單胞菌李變種(桃細菌性斑點病)	40	＞40
野油菜黃單胞菌皰病變種XV-16 (番茄細菌性斑點病)	2.5	20
樹生黃單胞菌核桃變種219 (核桃黑腐病)	6.25	0.39
青枯雷爾氏菌K60 (細菌凋萎病)	3.13	12.5
青枯雷爾氏菌Pss4 (細菌凋萎病)	6.25	12.5
密西根棒形桿菌密西根子種NCPPB382 (番茄潰瘍病)	6.25	12.5
密西根棒形桿菌密西根子種Cmm 0317 (番茄潰瘍病)	1.56	3.12
密西根棒形桿菌密西根子種Cmm 0690 (番茄潰瘍病)	12.5	12.5
馬鈴薯腐疫菌Pi 1306 (馬鈴薯晚疫病)	40	NA
馬鈴薯腐疫菌Pi 88069 (馬鈴薯晚疫病)	40	NA
蘋果黑星病菌(蘋果黑星病)	80	NA e
香蕉黑條葉斑病菌10CR-25 (香蕉黑葉斑病)	600	NA

^aEa110為用於密西根州進行田間試驗之病毒性菌株； ^bCA11及DM1為含有在獲得性質體pEa34上具有轉位子之Tn5393之鏈黴素抗性菌株且可在含有100 µg/mL鏈黴素之培養基中生長； ^cEa898為在染色體 rpsL基因中具有突變之自發性鏈黴素抗性菌株且可在含有2000 µg/mL鏈黴素之培養基中生長； ^d銅抗性細菌； ^e在1000 µg/mL下之陽性對照銅溶液抑制61%之生長。 實例4. 在搖瓶發酵中來自菌株0617-T307之RejuAgro A的產生及穩定性

用於產生且製備RejuAgro A之0617-T307發酵可藉由兩種方式搖瓶發酵及發酵罐發酵來獲得。在實例2中描述該發酵罐發酵。在此實例中，可如下獲得搖瓶發酵。將細菌假單胞菌屬0617-T307儲備液劃線接種到YME瓊脂板(酵母萃取物，4 g/L；葡萄糖，4 g/L，及麥芽萃取物，10 g/L；瓊脂，15 g/L)上且使其在28℃溫育器中生長24 h。藉由使單個0617-T307菌落在含有50 mL無菌YME液體培養基之250 mL燒瓶中在16℃及220 rpm下生長24 h來製成種子培養基。然後，將該種子培養基接種到含有4%比率( v/ v)之0.5 L無菌YME培養基的4 L燒瓶中。在接種(2%， v/ v)到各自含有2 L YME培養基之八個4-L燒瓶中之後，在16℃下在振動器中在200-220 rpm下使細菌生長達1-7天。

藉由LC-MS分析根據所開發標準曲線獲得RejuAgro A濃度。將兩種方法用於製備樣品以進行LC-MS分析。一種方法為藉由乙酸乙酯(1 mL:1 mL，渦動1 min)萃取細胞液且藉由對乙酸乙酯層進行離心及真空乾燥來獲得乙酸乙酯萃取物。將經乾燥乙酸乙酯萃取物溶解於40 µL甲醇中且將2 µL甲醇溶液用於LC-MS分析。另一種方法為藉由使該細胞液離心來獲得上清液，然後將該上清液與等體積甲醇混合以製成50%甲醇溶液，將其中10 µL溶液注入到LC-MS中。使用第二種方法，因為RejuAgro A產生為細胞外分泌過程，其藉由觀測上清液而非細胞內部RejuAgro A之主要量來證明(第3圖，圖A)。

在7天發酵期間，RejuAgro A之總產生在第一天達到峰值濃度，然後開始隨著時間增加而降低(第3圖，圖B)。在搖瓶發酵中每6小時進行關於RejuAgro A產生及細胞濃度之進一步詳細研究。其顯示，RejuAgro A之濃度(RejuAgro A之總量)在18 h達到最大值13.8 mg/L，且細菌細胞之濃度在12 h達到最大值2x10 ¹¹CFU/mL，這表明RejuAgro A之產生為細胞生長相關產生過程。

4-L搖瓶中培養基之體積影響RejuAgro A之產生。在具有YME培養基之4-L燒瓶中，對於500 mL體積大小僅觀測到RejuAgro A產生，且對於1.0 L或1.5 L體積大小未觀測到該產生。此觀測表明，RejuAgro A之產生優選發生於高充氣條件下。

培養基類型及培養溫度影響RejuAgro A之產生。將LB培養基與YME培養基平行地在16℃或28℃下測試。在16℃下在YME培養基中觀測到RejuAgro A之產生，但在LB培養基中未觀測到。關於菌落形成單位，菌株0617-T307在LB培養基中在16℃及28℃下以及在YME培養基中在28℃下生長良好。該等結果表明，RejuAgro A之產生為培養基特定且溫度依賴性的。藉由針對解澱粉歐文氏菌之板檢定來監測來自0617-T307之產物之活性，這與RejuAgro A之產生一致。

為了檢查RejuAgro A之產生條件的適用性，在相同條件下與假單胞菌菌株0617-T307平行地測試十種其他假單胞菌菌株。根據持家基因之分析，將0917-T305、0917-T306及0917-T307鑒別為土壤假單胞菌，且將0118-T319、0318-T327及0418-T328鑒別為摩氏假單胞菌。已報告土壤假單胞菌及摩氏假單胞菌之模式菌株(Daboussi等人(2002)；Pascual等人(2014))。

其顯示，菌株0617-T307及其種系發生密切相關種類可在YME中在28℃及220 rpm下產生RejuAgro A。此結果表明，該方法對菌株0617-T307及其密切相關種類具有特異性以產生RejuAgro A (表2)。對於藉由使0617-T307在YME培養基中在振動器上在16°及220 rpm下生長而獲得之40-h培養物，如藉由LCMS測試，RejuAgro A在室溫下達至少4週之培養物中呈現且為穩定的。

表2. 在培養基YME中在16℃、18小時、220 rpm下培養之所選假單胞菌菌株之RejuAgro A產生能力的匯總。

菌株編碼	熱門分類單元	RejuAgro A之產生
0617-T307	土壤假單胞菌	是
0617-T318	防禦假單胞菌 (Pseudomonas protegens)	否
0817-T317	防禦假單胞菌	否
0717-T327	韓國假單胞菌 (Pseudomonas koreensis)	否
0717-T314	韓國假單胞菌	否
0917-T305	土壤假單胞菌	是
0917-T306	土壤假單胞菌	是
0917-T307	土壤假單胞菌	是
0118-T319	摩氏假單胞菌	是
0318-T327	摩氏假單胞菌	是
0418-T328	摩氏假單胞菌	是

實例5. 針對0617-T307之菌株0617-T307及解澱粉歐文氏菌之細胞液的抗微生物活性。

將兩種檢定用於0617-T307細胞液及代謝產物之抗微生物測試中。一種檢定為板擴散檢定且另一種檢定為微板檢定。將LB板用於含有RejuAgro A之流份及細胞液針對解澱粉歐文氏菌之抗微生物活性之板擴散檢定中(表3)。含有0617-T307活細胞之細胞液及含有2 mg/mL RejuAgro A之懸浮液顯示針對解澱粉歐文氏菌之抗微生物活性。然而，當應用Serenade ^®時，未觀測到抑制區域。

表3. 在LB板中0617-T307細胞及RejuAgro A針對解澱粉歐文氏菌之活性

樣品	濃度(mg/mL)	抑制區域之直徑(cm)
RejuAgro A	2	1.1
0617-T307細胞	ND a	0.8
RejuAgro B	2	0
Serenade	初始溶液	0
鏈黴素	2	2.4
春日黴素		1.3
DMSO		0

^a細菌細胞之濃度尚未決定。

為了發現由0617-T307細胞及活性組分RejuAgro A組成之生物對照配方，進行以下實驗。將含有RejuAgro A之0617-T307之40-h細胞液的上清液(縮寫為’上清液)用於針對其產生者0617-T307之抗微生物檢定。其顯示，菌株0617-T307能夠在LB培養基中而非YME培養基中在上清液之2x稀釋液中生長。進一步研究顯示，上清液之抑制作用係由於較低pH值。然後藉由將pH控制至6.5~6.8來使問題1及2之答案為是。

針對菌株0617-T307、 Ea及 Xac測試生物活性流份(粗萃取物，100 µg/mL；flash-RejuAgro A，20 µg/mL；HPLC-RejuAgro A，10 µg/mL)。其顯示，生物活性流份不能抑制菌株0617-T307之生長，這表明RejuAgro A可與0617-T307細胞混合以用於製備生物控制劑。含有RejuAgro A之生物活性流份顯示針對 Ea及 Xac之抑制作用，尤其是flash-RejuAgro A及HPLC-RejuAgro A在經測試條件下幾乎消除 Ea及 Xac之生長。這表明，RejuAgro A溶液可用於在10-20 µg/mL下生物控制火燒病及柑橘潰瘍病。 實例6. 來自菌株0617-T307之酸化上清液(pH 2.0)的乙酸乙酯萃取物之生物活性代謝產物的鑑別及表徵。

將細菌假單胞菌屬0617-T307儲備液接種到LB瓊脂(胰蛋白腖，10 g/L；酵母萃取物，5 g/L；NaCl，10 g/L；瓊脂，15 g/L；水)板上，且使其在28℃溫育器中生長24 h。為了製備種子培養基，將單個0617-T307菌落接種到含有500 mL經高壓滅菌YME培養基(酵母萃取物，4 g/L；葡萄糖，4 g/L，及麥芽萃取物，10 g/L)中且使其在28℃下在150 rpm振動速率下生長24 h。然後將種子培養基接種到各自含有2 L經高壓滅菌YME培養基之八個4 L燒瓶中。在16℃下在振動器中以150 rpm振動速率進行發酵達7天。

在7天生長後，藉由使細菌培養物在4000 rpm下離心15 min來獲得上清液。然後藉由添加6N HCl來將上清液之pH調節至2.0。然後使經酸化上清液經歷乙酸乙酯萃取。這由菌株0617-T307之14 L培養物得到3.0 g粗萃取物。

將濃縮樣品溶解於丙酮中且將其與矽膠混合，將該矽膠裝載於裝備有UV偵測器之急劇層析系統(Yamazen AI-580)之矽膠管柱(φ3.0 X 20 cm)。在裝載該樣品後，依次藉由280 mL具有逐漸增加的極性之各以下溶劑溶離該樣品：100%己烷、75%己烷/25%乙酸乙酯、50%己烷/50%乙酸乙酯、25%己烷/75%乙酸乙酯、100%乙酸乙酯、50%乙酸乙酯/50%丙酮、100%丙酮、及100%甲醇。以20 mL/min之流速溶離該樣品。在UV 254 nm下監測該溶離物，且藉由時間模式以20 mL/管收集流份。總之，由急劇層析法生成114個流份或管。

將所生成之流份用於後續板檢定。將一mL各流份移液到1.5 mL測試管中且藉由Eppendorf真空濃縮器進行真空乾燥。將經乾燥樣品溶解於50 µL DMSO中，其中2 µL用於板檢定中。簡言之，將解澱粉歐文氏菌273接種到50% LB (胰蛋白腖，5.0 g/L；酵母萃取物，2.5 g/L；NaCl, 5.0 g/L)板且將單個菌落接種到5 mL LB培養基中。將細菌以無菌水1:100稀釋，將其中225 µL鋪板到50% LB板上。在生物安全櫃中乾燥10 min，然後將各流份之DMSO溶液分佈於培養皿之預標記區段且允許其再乾燥10 min。連同該檢定，DMSO及春日黴素分別用作陰性及陽性對照。然後將該等板在28℃溫育器中溫育且將在一天後檢查抑制區域。

114個急劇流份之體外板檢定顯示三個生物活性流份(T3234、T5058及T7882)抑制解澱粉歐文氏菌273之生長。流份3234及5258顯示相對小的清除區域。藉由50%己烷/50%乙酸乙酯溶離流份3234。藉由25%己烷/75%乙酸乙酯溶離流份5058。對於陰性對照，DMSO不具有抑制區域且陽性對照春日黴素未顯示抑制區域。藉由丙酮/乙酸乙酯(50%/50%)溶離另一個急劇流份T7882。該流份亦抑制解澱粉歐文氏菌活性之生長。

另一種抗解澱粉歐文氏菌活性指導之HPLC分離及純化鑑別來自T5058 (參見化合物式0617_T307_5058_Rt22.9及0617_T307_5058_Rt25.0)之兩種抗微生物化合物(Rt22.9及Rt25.0)以及來自T7882 (參見化合物式0617_T307_7882_Rt18.9)之一種抗微生物化合物(Rt18.9)。T307_5058_Rt22.9及T307_5058_Rt25.0為色胺酸衍生性天然產物，且其結構而非其生物活性報告於Scifinder資料庫中(Loots等人(2015))。經預測0617_T307_7882_Rt18為先前已報告之二呋喃基衍生物(Osipov等人(1978))。下文描繪該等天然產物：

及

實例7. 使用LCMSMS及光譜文庫搜索對來自菌株0617-T307之其他代謝產物的鑑別。

將pH未經調節細胞液及pH經調節細胞液(細胞液之pH藉由6N HCl調節至2.0)之粗萃取物濃縮且重懸浮於含有內部標準物( m/ z311.08)之250 µL 100% MeOH中且將其用於LC-MS/MS分析。LC注入體積：5 µL；LC管柱：來自Phenomenex C18管柱之1.7 µM C18, 100A, 50 X 2.1 mm Kinetex，梯度為12 min。在Bruker Maxis Impact II上之5-95% ACN。在Bruker MaXis Impact II, UHR-QqTOF (Ultra-High Resolution Qq-Time-Of-Flight)質譜儀上採集資料。使用譜圖中八種最豐富離子之碰撞誘導解離(CID)片段化，完全MS掃描接著串聯MS (MS/MS)。掃描速率為3 Hz。

然後基於用於鑑別新的及已知的化合物之生物資訊分析及分子網路分析進行光譜文庫搜索。針對以下光譜文庫搜索樣品之MS/MS光譜：1) GNPS社區文庫；2) FDA文庫；PhytoChemical文庫；3) NIH臨牀集合；4) NIH天然產物文庫；5)藥理學活性NIH小分子寄存處；6) Faulkner遺留文庫；7)殺蟲劑；8) Dereplicator經鑑別MS/MS肽天然產物；9) PNNL脂質；10) Massbank；11) Massbank EU；12) MoNA；13) ReSpect – Phytochemicals；14) HMDB。

在以上文庫中搜索MS/MS光譜且將其與參考光譜之偏離比對。匹配參數相同。可以探索該等結果以鑑別已知化合物之結構類似物。MS/MS分子網絡生成為具有最小簇大小= 2、最小邊緣0.7餘弦、6個最小匹配峰。作為一實例，在 m/ z303.16下之新分子種類經鑑別為對應於來自活性流份之新化合物0617-T307_5058_Rt25.0.自粗萃取物中鑑別一些已知化合物，該萃取物包括吲哚-3-羧酸、植物生長促進因子、及xantholysin A。據報告，1)戀臭假單胞菌BW11M1之廣泛抗真菌活性主要依賴於Xantholysin產生；2)需要Xantholysin進行群遊且其有助於生物膜形成(Li等人(2013))。實際上，藉由在28℃下培養0617-T307、0418-T328及0318-T327來觀測到較高濃度之xantholysin A。因此，除了生物活性化合物RejuAgro A，Xantholysin A為生物控制細菌0617-T307及其緊密相關種類0318-T3027及0418-T328之抗微生物活性的另一種貢獻代謝產物。 實例8. 產生RejuAgro A之菌株0617-T307及其一些緊密相關種類的溫室及田間感染檢定。

為了評價0617-T307針對解澱粉歐文氏菌之生物控制活性，在威斯康星大學密爾沃基分校(University of Wisconsin-Milwaukee)之溫室中對海棠進行感染檢定。將含有1.0 x 10 ⁸cfu/mL之生物控制劑(0617-T307、0717-T327、及0617-T318)噴霧到多樹樣地之花(80%至完全開花)上。簡言之，使菌株0617-T307在含有5 mL LB培養基之26 mL玻璃管中生長隔夜，然後將細胞接種(1:100)到LB培養基中且使其在振動器上在28℃及200 rpm下生長14-18 h。收穫細胞且將其重懸浮於10x水中以達到10 ⁸CFU/mL。重懸浮溶液可用於溫室及田間檢定以控制火燒病。用蒸餾水噴霧對照花。然後藉由噴霧1.0 x 10 ⁶cfu/mL解澱粉歐文氏菌菌株解澱粉歐文氏菌273來接種所有花。在2018年9月7日、10月9日及10月19日用0617-T307進行三次處理。參考表4，0617-T307 (土壤假單胞菌)之所有噴霧處理在海棠花上相對於蒸餾水之0%控制提供對花枯病症狀之100%控制，這表明0617-T307為用於由解澱粉歐文氏菌引起之火燒病之有前景的生物控制劑。兩種其他假單胞菌屬0717-T327 (韓國假單胞菌)及0617-T318 (防禦假單胞菌)之控制率較低，分別為16.7%及25%。總之，在經測試之三種假單胞菌屬中，僅0617-T307顯示對海棠火燒病之良好控制效率。未觀測到植物毒性。

表4. 溫室感染檢定之匯總

	2018年9月7日	2018年10月9日	2018年10月19日
生物控制劑	經處理花之#	經感染花之#	控制率(%)	經處理花之#	經感染花之#	控制率(%)	經處理花之#	經感染花之#	控制率(%)
對照	8	8	0	16	16	0	18	18	0
0617-T307	3	0	100	9	0	100	10	0	100
0717-T327	6	5	16.7
0617-T318	4	3	25

對於田間檢定，在2019年5月6日將產生RejuAgro A之生物控制細菌(0617-T307、0118-T319、0318-T327、0418-T328；參見表2)以5x10 ⁸CFU/mL濃度施加在果園中之蘋果樹之花上(蘋果花40%及70%開花)。在5月7日以5x10 ⁶CFU/mL濃度接種細菌病原體解澱粉歐文氏菌Ea110 (90%開花)。水對照、鏈黴素、0617-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328之患病花簇之百分比分別為32.9%、13.3%、16.8%、18.5%、16.7%、及11.8%。與鏈黴素相比，產生RejuAgro A之生物控制細菌在控制蘋果園內之火燒病方面具有類似或更好的功效。 實例9. RejuAgro A及B及其產生者對蘋果黑星病菌之抗真菌活性。

將引起蘋果黑星病之真菌蘋果黑星病菌在暗處在室溫(約24℃)下保持在PDA瓊脂上。自PDA (馬鈴薯右旋糖瓊脂)收穫分生孢子及菌絲體懸浮液(在0.01 M PBS中)。將十µL分生孢子及菌絲體懸浮液滴到生物控制細菌、RejuAgro A、或RejuAgro A修訂板上。對照為未添加生物控制細菌或RejuAgro A或B之PDA板。將皿在室溫下在黑暗中溫育，且在7天後檢查各蘋果黑星病菌菌落之直徑。

當與對照(第4圖)相比時，所選四種生物控制細菌0617-T307、0118-T319、0318-T327、及0418-T328可以抑制蘋果黑星病菌在PDA板上之生長(第5圖)；RejuAgro A可以在40-80 µg/mL下抑制蘋果黑星病菌在PDA板上之生長(第6圖)；然而，在PDA板上未觀測到在10-80 µg/mL下RejuAgro B對蘋果黑星病菌之生長的抑制作用(第7圖)。最後，在漢語200-1000 µg/mL硫酸銅之PDA板上未觀測到蘋果黑星病菌之抑制(第8圖)。 實例10. 由假單胞菌種類產生RejuAgro A。

在含有500 mL YME培養基、在16℃及220 rpm振動線下之4 L燒瓶中發酵24 h後，藉由HPLC-MS分析細胞液中RejuAgro A之量。準備量-峰面積曲線以研究HPLC峰面積與RejuAgro A之量之間的關係(第9圖)。分析方法：1)用25 mL乙酸乙酯萃取25 mL細胞液；2)將5 mL乙酸乙酯萃取物乾燥且溶解於0.1 mL甲醇中；3)將4 µL注入HPLC-MS中。

評價七種細菌(0617-T307、0917-T305、0917-T306、0917-T307、0118-T319、0318-T327、0418-T328)之RejuAgro A產生，藉由使細菌在YME培養基、16℃、220 rpm下生長24 h來製備種子培養基。HPLC分析顯示所有七種細菌均產生RejuAgro A (第10圖)。 實例11. RejuAgro A之調配及溫室檢定。

RejuAgro A之調配(溶液，SL；參見表5)。在向花施加之前，將10 μg/mL與作為安全劑之1%聚乙二醇(PEG) 4000在罐內混合。後續測試顯示，0.03%作為安全劑之聚乙烯醇(PVA)達成對花之更好保護。可以添加界面活性劑Alligare 90以增加功效(表6)。

表5. RejuAgro-A 1%SL ^a之調配

組分	比率(%， w/ w)	公克	注意
RejuAgro-A	1	5	活性成分
Alligare 90 (聚(烷基EO/PO)等)	10	50	潤溼劑及擴散劑
乙二醇/丙二醇	5	25	防凍劑
PVA	30	150	安全劑
水	衡量 (添加至100%)	270	載劑
總計	100	500

^aRejuAgro A調配物之1%溶液(SL)。

為了評價RejuAgro A針對解澱粉歐文氏菌之生物控制活性，在威斯康星大學密爾沃基分校對海棠進行溫室感染檢定。在接種前3小時及接種後24小時，向十μg/mL中補充1%聚乙二醇(PEG) 4000或將1% PEG4000 (陰性對照)施加在完全開花樹的花上。將重懸浮於水中之約10 ⁸CFU/mL解澱粉歐文氏菌110菌株用作接種物。在接種後約6天計算感染率。在2020年1月24日至1月31日之週期內進行該等實驗。RejuAgro A可有效抑制花枯病(表6)。

表6. 具有1% PEG 4000之RejuAgro A之花枯病檢定

處理	感染率
1% PEG4000 (陰性對照)	50.8%
具有1% PEG4000之RejuAgro A 10μg/mL	12.3%
鏈黴素200μg/mL	5.7%

實例12. 0617-T307細胞液針對灰黴菌CA17之抗真菌活性。

藉由使細菌細胞在YME培養基中在28℃及180 rpm下生長24 h來製備菌株0617-T307之種子。然後將4% (2 mL至50 mL)接種到含有50 mL M8 (IAA培養基)或M9 (CN培養基)或M7 (PRN培養基)或M6 (DAPG培養基)培養基之250 mL燒瓶中且使其在28℃及180 rpm下生長48 h。在12 h及24 h收集0.5 mL體積之細胞液，且將其保存於-20℃冷凍器中。對於抗真菌檢定，將細胞液解凍且將5 μL施加到PDA (馬鈴薯右旋糖瓊脂)板上之樣品孔上，該等孔具有距用灰黴菌接種之中心的等半徑距離(第11圖)。其顯示，細胞液針對PDA (馬鈴薯右旋糖瓊脂)板上之灰黴菌CA17具有抗真菌活性。 實例13. 粗萃取物、RejuAgro A及RejuAgro B針對植物致病細菌之抗微生物活性。

細菌0917-T305、0318-T327及0418-T328之代謝產物針對青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、及樹生黃單胞菌核桃變種顯示良好功效(表7)。使細菌0917-T305、0318-T327及0418-T328在YME培養基中分別在16℃及28℃下生長。以5 mg/mL製備來自0917-T305、0318-T327及0418-T328之天然產物萃取物，且藉由板擴散檢定將該等萃取物針對三種不同植物病原體進行測試：青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、及樹生黃單胞菌核桃變種。在瓊脂板擴散檢定上，在YME中在16℃及28℃下生長之細菌0917-T305、0318-T327及0418-T328之代謝產物針對經測試青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、及樹生黃單胞菌核桃變種顯示相對良好的功效(表7)。這表明，連同RejuAgro A，其他代謝產物亦針對青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、及樹生黃單胞菌核桃變種具有良好功效。RejuAgro B針對青枯雷爾氏菌顯示良好功效(表7)。

表7. 在板檢定中細菌粗萃取物對所選致病細菌之作用

濃度 (mg/mL)	細菌菌株及化合物	培養基及溫度	樹生黃單胞菌核桃變種	青枯雷爾氏菌	密西根棒形桿菌密西根子種
			Xaj219	Xaj417	K60	Pss	Cmm382	Cmm0317	Cmm0690
5	0917-T305粗萃取物	YME 16℃	0 a	0.2	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
5	0318-T327粗萃取物	YME 28 ℃	0.2	0.4	0.5	1.0	0.7	0.7	0.8
5	0418-T328粗萃取物	YME 28 ℃	0.2	0.4	0.5	1.0	0.7	0.8	0.8
5	0318-T327粗萃取物	YME 16℃	0.1	0.4	0.7	0.6	0.5	0.3	0.4
5	0418-T328粗萃取物	YME 16℃	0.2	0.4	0.8	0.9	0.5	0.5	0.5
5	萬古黴素					3.0	3.0	3.0
0.1	鏈黴素		1.3	1.9	1.5	1.5
2	RejuAgro A		0.5	1.0	0.4	0.5
2	RejuAgro B		0.0	0.0	0.4	0.4

^a抑制區域之直徑(cm) 實例14. Rt 18.9、Rt 22.9及Rt 25.0之抗微生物作用。

將細菌假單胞菌屬0617-T307儲備液接種到LB瓊脂(胰蛋白腖，10 g/L；酵母萃取物，5 g/L；NaCl，10 g/L；瓊脂，15 g/L；水)板上且使其在28℃溫育器中生長24 h。與實例6所述相同地進行發酵及粗萃取物製備。

假單胞菌屬0617-T307之經酸化細胞液之乙酸乙酯萃取物的HPLC分離及純化鑑別來自急劇流份T5058之兩種抗微生物化合物(Rt22.9及Rt25.0)以及來自急劇流份T7882之一種抗微生物化合物(Rt18.9)。測試其對表8中所列出之細菌菌株之抗微生物活性。將兩µL DMSO、Rt18.9、Rt22.9或Rt25.0分別點樣到不同細菌菌株生長之瓊脂板上，且進一步檢查該抑制區域(表8)。

表8. Rt 18.9、Rt 22.9及Rt 25.0之抗微生物作用

菌株(相關病害) a	DMSO	Rt18.9 (5 mg/mL)	Rt22.9 (10 mg/mL)	Rt25.0 (5 mg/mL)	所用培養基 b
密西根棒形桿菌密西根子種Cmm 0317 (番茄潰瘍病)	否	是	是	是	LB
丁香假單胞菌黃瓜變種1188-1 (瓜類角斑病)	否	是	是	是	LB
地毯草黃單胞菌柑橘變種N40-SO5 (柑橘潰瘍病)	否	是	否	是	NA
解澱粉歐文氏菌1189 (蘋果/梨火燒病)	否	是	否	否	LB
胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種944 (在多種作物中產生軟腐病)	否	是	否	是	LB
青枯雷爾氏菌K60 (細菌凋萎病)	否	是	是	是	LB
樹生黃單胞菌核桃變種417 (核桃黑腐病)	否	是	否	否	NA
丁香假單胞菌番茄變種PT30 (番茄細菌性斑點)	否	是	是	是	LB
黒腐果膠桿菌942 (在多種作物中產生軟腐病)	否	是	否	否	LB
土豆果膠桿菌UPP163 936 (在多種作物中產生軟腐病)	否	是	否	否	LB
薩氏假單胞菌薩氏變種(橄欖節疤病) 01-26	否	是	是	是	LB
丁香假單胞菌丁香變種7046 (細菌性Ba潰瘍病或稻瘟病(核果及梨果)	否	是	是	是	LB
樹生黃單胞菌核桃變種219 (核桃黑腐病)	否	是	否	是	NA
地毯草黃單胞菌柑橘變種 -Miami XC2002-00010 (柑橘潰瘍病)	否	否	否	是	NA

^a在用DMSO、Rt18.9、Rt22.9或Rt25.0點樣後2至5天之間檢查抑制區域。 ^b用於使細菌生長之瓊脂培養板為LB培養基(10.0 g/L胰蛋白腖、5.0 g/L酵母萃取物、10.0 g/L鈉鹽、15.0 g/L瓊脂及至最終體積1.0 L之自來水)或NA培養基(3.0 g/L牛肉萃取物、1.0 g/L酵母萃取物、5.0 g/L聚蛋白腖、10.0 g/L蔗糖、及15 g/L瓊脂及至最終體積1.0 L之自來水)表14.2 LB及NA瓊脂板之培養基組成 實例15. nRejuAgro A對香蕉黑條葉斑病菌之抗微生物作用

藉由將最終濃度60及600 µg/mL之經HPLC純化RejuAgro A分別添加到PDA瓊脂培養基中來檢查RejuAgro A對香蕉黑條葉斑病菌之抗微生物作用。將480 µL 0.5 mg/mL或5 mg/mL RejuAgro A添加到6孔板之孔中的3.52 mL PDA中，以使RejuAgro A之最終濃度分別為60 (第12圖，中間孔(圖A))及600 µg/mL (第12圖，左孔(圖B))。輕輕振動該板以使該化合物溶解。將480 µL水及3.52 mL PDA用作對照處理(第12圖，右孔(圖C)。在使瓊脂固化後，將香蕉黑條葉斑病菌生長之瓊脂片置於瓊脂表面中心。在接種後兩週在600 µg/mL濃度之RejuAgro A處理中觀測到香蕉黑條葉斑病菌之完全抑制(第12圖)。 實例16. RejuAgro A對稻黃單胞菌稻生變種(Xon507)之抗微生物作用

檢查RejuAgro A對稻黃單胞菌稻生變種(Xon507)之抗微生物作用。將稻黃單胞菌稻生變種(Xon507)細菌懸浮液(OD ₆₀₀= 0.3)噴霧在PSG瓊脂板上。將裝載有50 µL裝載體積且濃度分別為5.5 µg/mL、11.1 µg/mL、22.1 µg/mL、33.2 µg/mL、55.4 µg/mL、110.7 µg/mL之經HPLC純化水性RejuAgro A之紙盤放置在瓊脂板上且在將該等紙盤放置在瓊脂板上之後44小時測量該抑制區域。在以RejuAgro A懸浮液浸漬紙盤之所有濃度下觀測到抑制(表9)。

表9. RejuAgro A對稻黃單胞菌稻生變種(Xon507)之抗微生物作用。

RejuAgro A之濃度	水對照	5.5 µg/mL	11.1 µg/mL	22.1 µg/mL	33.2 µg/mL	55.4 µg/mL	110.7 µg/mL
抑制區域(cm)	0	0.27±0.06	0.5±0.1	0.73±0.15	0.83±0.15	0.93±0.06	1.33±0.12

實例17. RejuAgro A對柑桔黃單孢菌柑桔枳橙變種(XW19)之抗微生物作用

檢查RejuAgro A對柑桔黃單孢菌柑桔枳橙變種(XW19)之抗微生物作用。將柑桔黃單孢菌柑桔枳橙變種(XW19)之細菌懸浮液(OD ₆₀₀= 0.3)噴霧在PSG瓊脂板上。將裝載有50 µL裝載體積且濃度分別為5.5 µg/mL、11.1 µg/mL、22.1 µg/mL、33.2 µg/mL、55.4 µg/mL、110.7 µg/mL之經HPLC純化水性RejuAgro A之紙盤放置在瓊脂板上且在將該等紙盤放置在瓊脂板上之後44小時測量該抑制區域。在RejuAgro A之55.37 µg/mL及110.74 µg/mL濃度下觀測到抑制(表10)。

表10. RejuAgro A對柑桔黃單孢菌柑桔枳橙變種(XW19)之抗微生物作用。

RejuAgro A之濃度	水對照	5.5 µg/mL	11.1 µg/mL	22.1 µg/mL	33.2 µg/mL	55.4 µg/mL	110.7 µg/mL
抑制區域(cm)	0	0	0	0	0	0.23±0.06	0.27±0.12

實例18. 實例中所用之培養基組成。

表11包括實例中所用之示範性培養基組成。

表11. 培養基組成。

編號	培養基名稱	組成	g/L	在25℃下之pH	參考文獻
M1	YME	酵母萃取物	4.0 g	NA	(Hamamoto, H.等人(2015))
		麥芽萃取物	10 g
		葡萄糖	4.0 g
		自來水	1.0 L
M6	DAPG培養基	麥芽萃取物	15.0 g	NA	(Gnanamanickam, Samuel S. (2008))
		水
M7	PRN培養基	甘油	30.0 g	NA	(Gnanamanickam, Samuel S. (2008))
		K 2HPO 4	3.0 g
		NaCl	5.0 g
		MgSO 4∙7H 2O	0.5 g
		D-色胺酸	0.61 g
M8	IAA培養基	D-葡萄糖	5.0 g	NA	(Gnanamanickam, Samuel S. (2008))
		酪蛋白胺基酸	25.0 g
		MgSO 4∙7H 2O	0.3 g
		K 2HPO 4	1.7 g
		NaH 2PO 4	2.0 g
M9	CN	酪蛋白胺基酸	10.0 g	NA	(Gavrish, E.等人(2008))
		營養肉湯	10.0 g

實例19. 細菌菌株、天然產物、及對其所引用之參考文獻。

本申請案中所述及所附申請專利範圍中呈現之細菌菌株及天然產物為微生物文獻中熟知的。下表12中呈現該等參考文獻以用於本文所揭示之各經引用細菌菌株及天然產物，該等參考文獻之內容以引用方式整體併入本文。

表12. 細菌菌株、天然產物、及作為其可用性之證據準備引用之參考文獻。

細菌菌株	參考文獻引用
0617-T307、0917-T305、0917-T306、及0917-T307	Pascual, J., García-López, M., Carmona, C., Sousa, T. da S., de Pedro, N., Cautain, B., Martín, J., Vicente, F., Reyes, F., Bills, G. F., & Genilloud, O. (2014). Pseudomonas solisp. nov., a novel producer of xantholysin congeners. Syst Appl Microbiol, 37: 412–416。
0118-T319、0318-T327、及0418-T328	Dabboussi, F., Hamze, M., Singer, E., Geoffroy, V., Meyer, J., & Izard, D. (2002). Pseudomonas mosseliisp . nov ., a novel species. Int J Syst Bacteriol, 52: 363–376。
天然產物	參考文獻引用
RejuAgro B	Knackmuss, H., Medizinische, M., & Chemie, I. (1968). Methyl-​substituted 2,​3,​6-​trihydroxypyridines and their oxidation products. Eur. J. Inorg. Chem.2689: 2679–2689。
Rt22.9及Rt25.0	Loots, D. T., Erasmus, E., & Mienie, L. J. (2005)。Identification of 19 new metabolites induced by abnormal amino acid conjugation in isovaleric acidemia. Clin Chem, 51: 1510–1512。
Rt18.9	Osipov, A. M., Metlova, L. P., Baranova, N. V, & Rudakov, E. S. (1978). New derivatives of difuryl: 2,2’-difuryl-5,5’-dicarbinol and 2,2’-difuryl-5,5’-dicarboxylic acid. Ukrainskii Khimicheskii Zhurnal(俄羅斯版), 44: 398。

實例20. RejuAgro A、RejuAgro B及RejuAgro C之晶體結構資訊。 A. RejuAgro A之晶體結構資訊

藉由緩慢蒸發RejuAgro A之氯仿溶液來獲得RejuAgro A (C ₇H ₇NO ₃S)之單晶。獲得橙色錠劑。選擇合適晶體且將其安裝在SuperNova, Dual, Cu at home/near, Atlas繞射計上。在資料收集期間將晶體保持在100.05(10) K下。使用Olex2 (Dolomanov等人(2009))，使用ShelXS結構解析程式使用直接方法(Sheldrick (2008))解析結構且使用ShelXL細化包裝(Sheldrick, G.M. (2015))使用最小平方最小化來細化。

在100K下使用Oxford SuperNova繞射計使用Cu(Kα)輻射收集資料集。

RejuAgro A (C ₇H ₇NO ₃S) ( M=185.20 g/mol)之晶體資料：單斜晶，空間群P2 ₁/n (no. 14)， a= 5.30391(6) Å, b= 13.97822(13) Å， c= 10.74471(13) Å， β= 101.5883(12)°， V= 780.367(15) Å ³， Z= 4， T= 100.05(10) K，μ(CuKα) = 3.429mm ^-1， D 計算= 1.576 g/cm ³，13936個經量測反射(10.522° ≤ 2Θ ≤ 140.8°)，1496個獨特( R _int= 0.0220，R _Σ= 0.0083)，其用於所有計算中。最終 R ₁為0.0253 (I ＞ 2σ(I))且 wR ₂為0.0702 (所有資料)。

使用Olex2創建細化模型描述，在OlexSys之2018.05.29 svn.r3508上編譯。約束(restraint)數- 0，限制(constraint)數-未知。詳情：1. 固定軟碟通(Fixed Uiso)：在所有C(H,H,H,H,H,H)基團之1.2倍處；在所有C(H,H,H)基團之1.5倍處；2。其他：Sof(H6A)=Sof(H6D)=Sof(H6F)=1-FVAR(1)；Sof(H6B) = Sof(H6C) = Sof(H6E) = FVAR(1)；3.a 紊亂的Me，經細化為旋轉基團：C6(H6A,H6B,H6C,H6D,H6E,H6F)；b理想的Me，經細化為旋轉基團：C7(H7A,H7B,H7C)。

參考第13A圖，RejuAgro A分子具有平面結構，其中S-Me基團相對於雑環僅旋轉8.7°。該分子在C4-C5鍵(1.531 Å)處之π-共軛顯著破裂，顯然，這是因為一些軌道原因。連接至sp ²碳原子之Me基團在2個位置上可旋轉地紊亂。

參考第13B圖，晶體中之RejuAgro A分子透過N-H…O相互作用形成中心對稱H鍵合之二聚物。此外，該等二聚物藉由較弱C-H…O相互作用沿著[-3 0 1]平面形成2維層。

以下顯示RejuAgro A之化學結構：

(式(I))

RejuAgro A分子之附加結晶結構資料呈現於表13-21中。

表13. RejuAgro A之晶體資料及結構細化

識別碼	RejuAgro A
經驗式	C 7H 7NO 3S
式量	185.20
溫度/K	100.05(10)
晶系	單斜晶
空間群	P2 1/n
a/Å	5.30391(6)
b/Å	13.97822(13)
c/Å	10.74471(13)
α/°	90
β/°	101.5883(12)
γ/°	90
體積/Å 3	780.367(15)
Z	4
ρ 計算g/cm 3	1.576
μ/mm -1	3.429
F(000)	384.0
晶體大小/mm 3	0.874 × 0.274 × 0.118
輻射	CuKα (λ = 1.54184)
資料收集之2Θ範圍/°	10.522至140.8
指數範圍	-6 ≤ h ≤ 6、-17 ≤ k ≤ 17、-13 ≤ l ≤ 12
經收集之反射	13936
獨立反射	1496 [R int= 0.0220, R Σ= 0.0083]
資料/約束/參數	1496/0/117
關於F 2之擬合優度	1.067
最終R指數[I＞=2σ (I)]	R 1= 0.0253，wR 2= 0.0700
最終R指數[所有資料]	R 1= 0.0254，wR 2= 0.0702
最大差：峰/孔/ e Å -3	0.33/-0.29

表14. RejuAgro A之部分原子座標(×10 ⁴)及等效各向同性位移參數(Å ²×10 ³)。U _eq經定義為經正交U _IJ張量之痕量的1/3。

原子	X	Y	z	U(eq)
S1	6015.2(6)	2181.9(2)	7360.1(3)	14.21(13)
O1	2838.4(18)	479.2(7)	5956.1(10)	21.0(2)
O2	-1864.8(19)	3816.9(7)	4920.5(10)	20.3(2)
O3	-4128.5(19)	2125.4(7)	3998.6(10)	19.1(2)
N1	-625(2)	1317.3(8)	5012.2(11)	14.8(2)
C1	1795(2)	1257.7(9)	5770.8(12)	14.1(3)
C2	3003(2)	2163.2(9)	6326.8(12)	12.9(3)
C3	1866(3)	3025.4(10)	6015.7(12)	14.5(3)
C4	-699(3)	3073.5(10)	5196.4(12)	14.7(3)
C5	-2010(3)	2140.2(9)	4672.1(13)	14.9(3)
C6	3049(3)	3965.2(10)	6489.7(14)	19.0(3)
C7	7080(3)	978.0(10)	7802.9(13)	17.9(3)

表15. RejuAgro A之各向異性位移參數(Å ²×10 ³)。各向異性位移因子指數採用以下形式：-2π ²[h ²a* ²U ₁₁+2hka*b*U ₁₂+…].

原子	U 11	U 22	U 33	U 23	U 13	U 12
S1	12.06(19)	13.72(19)	14.8(2)	-0.65(11)	-2.16(13)	-1.00(10)
O1	18.6(5)	11.9(5)	27.2(5)	-1.4(4)	-7.8(4)	1.5(4)
O2	20.2(5)	15.0(5)	24.3(5)	2.8(4)	1.0(4)	4.3(4)
O3	13.9(5)	22.2(5)	18.4(5)	0.8(4)	-3.7(4)	2.2(4)
N1	13.8(6)	11.8(5)	16.4(6)	-1.3(4)	-2.8(4)	-1.4(4)
C1	13.7(6)	14.9(7)	12.8(6)	1.0(5)	0.3(5)	0.2(5)
C2	11.8(6)	15.1(7)	11.3(6)	-0.5(5)	1.1(5)	-0.6(5)
C3	15.4(6)	14.5(6)	13.4(6)	-0.4(5)	2.6(5)	-0.6(5)
C4	16.1(6)	14.9(6)	13.4(6)	1.7(5)	3.3(5)	2.3(5)
C5	14.9(6)	16.3(7)	13.1(6)	1.4(5)	1.9(5)	1.3(5)
C6	20.7(7)	12.3(6)	21.9(7)	-0.9(5)	-0.8(5)	0.7(5)
C7	15.9(6)	16.6(6)	18.3(7)	2.0(5)	-3.1(5)	2.0(5)

表16. RejuAgro A之鍵長度。

原子	原子	長度/Å		原子	原子	長度/Å
S1	C2	1.7529(13)		N1	C5	1.3742(17)
S1	C7	1.8082(14)		C1	C2	1.4886(17)
O1	C1	1.2190(16)		C2	C3	1.3593(18)
O2	C4	1.2150(17)		C3	C4	1.4658(18)
O3	C5	1.2083(18)		C3	C6	1.5002(18)
N1	C1	1.3778(17)		C4	C5	1.5314(18)

表17. RejuAgro A之鍵角。

原子	原子	原子	角度/˚		原子	原子	原子	角度/˚
C2	S1	C7	110.46(6)		C2	C3	C6	123.92(12)
C5	N1	C1	126.34(12)		C4	C3	C6	116.00(12)
O1	C1	N1	119.28(12)		O2	C4	C3	123.44(12)
O1	C1	C2	123.28(12)		O2	C4	C5	117.88(12)
N1	C1	C2	117.44(11)		C3	C4	C5	118.68(11)
C1	C2	S1	122.08(9)		O3	C5	N1	121.87(12)
C3	C2	S1	116.47(10)		O3	C5	C4	122.26(12)
C3	C2	C1	121.41(12)		N1	C5	C4	115.87(12)
C2	C3	C4	120.06(12)

表18. RejuAgro A之氫鍵。

D	H	A	d(D-H)/Å	d(H-A)/Å	d(D-A)/Å	D-H-A/°
N1	H1	O1 1	0.845(18)	2.032(19)	2.8768(15)	178.8(17)
C7	H7C	O2 2	0.98	2.58	3.5549(16)	175.3

¹-X,-Y,1-Z; ²3/2+X,1/2-Y,1/2+Z

表19. RejuAgro A之扭轉角。

A	B	C	D	角度/˚		A	B	C	D	角度/˚
S1	C2	C3	C4	-177.63(9)		C1	C2	C3	C6	-176.67(12)
S1	C2	C3	C6	0.76(18)		C2	C3	C4	O2	177.16(13)
O1	C1	C2	S1	-2.63(19)		C2	C3	C4	C5	-1.90(19)
O1	C1	C2	C3	174.66(13)		C3	C4	C5	O3	179.49(12)
O2	C4	C5	O3	0.4(2)		C3	C4	C5	N1	-0.66(18)
O2	C4	C5	N1	-179.77(11)		C5	N1	C1	O1	-177.26(13)
N1	C1	C2	S1	177.32(9)		C5	N1	C1	C2	2.78(19)
N1	C1	C2	C3	-5.39(19)		C6	C3	C4	O2	-1.36(19)
C1	N1	C5	O3	179.92(13)		C6	C3	C4	C5	179.58(11)
C1	N1	C5	C4	0.07(19)		C7	S1	C2	C1	-8.68(13)
C1	C2	C3	C4	4.9(2)		C7	S1	C2	C3	173.90(10)

表20. RejuAgro A之氫原子坐標(Å×10 ⁴)及等效各向同性位移參數(Å ²×10 ³)。

原子	X	y	z	U(eq)
H1	-1260(30)	789(13)	4721(17)	20(4)
H6A	2408.52	4468.05	5871.25	23
H6B	4925.78	3921.96	6602.43	23
H6C	2587.06	4119.49	7305.04	23
H6D	4205.71	3871.61	7314.56	23
H6E	1688.46	4417.71	6583.38	23
H6F	4027.18	4220.17	5880.78	23
H7A	7306.25	625.34	7044.62	27
H7B	5790.31	654.5	8190.27	27
H7C	8721.96	1001.76	8413.78	27

表21. RejuAgro A之佔有率。

原子	佔有率		原子	佔有率		原子	佔有率
H6A	0.485(15)		H6B	0.515(15)		H6C	0.515(15)
H6D	0.485(15)		H6E	0.515(15)		H6F	0.485(15)

B. RejuAgro B之晶體結構資訊。

藉由緩慢蒸發RejuAgro B甲醇溶液來獲得RejuAgro B (C ₁₂H ₈N ₂O ₆)之單晶。獲得橙色錐體。選擇合適晶體且將其安裝在SuperNova, Dual, Cu at home/near, Atlas繞射計上。在資料收集期間將晶體保持在100.05(10) K下。使用Olex2 (Dolomanov等人(2009))，使用ShelXS結構解析程式使用直接方法(Sheldrick (2008))解析結構且使用ShelXL細化包裝(Sheldrick (2015))使用最小平方最小化來細化。

在100K下使用Oxford SuperNova繞射計使用Cu(Kα)輻射收集資料集。

RejuAgro B (C ₁₂H ₈N ₂O ₆) ( M=276.20 g/mol)之晶體資料：三斜晶，空間群P-1 (編號2)， a= 7.0528(3) Å， b= 11.7911(5) Å, c= 14.6888(6) Å， α= 72.249(4)°， β= 79.265(3)°， γ= 86.633(3)°， V= 1143.02(8) Å ³， Z= 4， T= 100.05(10) K, μ(CuKα) = 1.139 mm ^-1， D 計算= 1.605 g/cm ³，15292個經量測反射(7.872° ≤ 2Θ ≤ 141.144°)，4304個獨特( R _int= 0.0258, R _Σ= 0.0234)，其用於所有計算中。最終 R ₁為0.0419 (I ＞ 2σ(I))且 wR ₂為0.1124 (所有資料)。

使用Olex2創建細化模型描述，在OlexSys之2018.05.29 svn.r3508上編譯。約束(restraint)數- 0，限制(constraint)數-未知。詳情如下：1.固定軟碟通：在所有N(H)基團之1.2倍處；在所有C(H,H,H)基團之1.5倍處；2.a 芳族/醯胺H，以滑動坐標細化：N1(H1)、N2(H2)、N1A(H1A)、N2A(H2A)；2.b理想的Me，經細化位旋轉基團：C6(H6A,H6B,H6C)、C12(H12A,H12B,H12C)、C6A(H6AC,H6AA,H6AB)、C12A(H12D,H12E,H12F)。

參考第14A圖，RejuAgro B晶體含有兩個對稱獨立的RejuAgro B分子。每個分子具有螺旋結構，其中經連接雑環之平均平面之間的雙面角為70.3°及80.6°。每個雑環在兩個相鄰羰基基團之間的C(sp ²)-C(sp ²)鍵(鍵長度為1.534-1.539 Å範圍內)處π共軛顯著破裂，顯然，這是因為一些軌道原因。

參考第14B圖，晶體中之RejuAgro B分子透過N-H…O相互作用形成中心對稱H鍵合之二聚物。該等二聚物在堆疊中沿著x方向藉由其他N-H…O相互作用來連接。最後，該等堆疊藉由第三種N-H…O相互作用沿著[011]連接到層中。

以下顯示RejuAgro B之化學結構：

(式(II))

RejuAgro B分子之附加結晶結構資料呈現於表22-29中。

表22. RejuAgro B之晶體資料及結構細化。

識別碼	RejuAgro B
經驗式	C 12H 8N 2O 6
式量	276.20
溫度/K	100.05(10)
晶系	三斜晶
空間群	P-1
a/Å	7.0528(3)
b/Å	11.7911(5)
c/Å	14.6888(6)
α/°	72.249(4)
β/°	79.265(3)
γ/°	86.633(3)
體積/Å 3	1143.02(8)
Z	4
ρ 計算g/cm 3	1.605
μ/mm -1	1.139
F(000)	568.0
晶體大小/mm 3	0.3 × 0.22 × 0.2
輻射	CuKα (λ = 1.54184)
資料收集之2Θ範圍/°	7.872至141.144
指數範圍	-8 ≤ h ≤ 8、-12 ≤ k ≤ 14、-17 ≤ l ≤ 17
經收集之反射	15292
獨立反射	4304 [R int= 0.0258, R Σ= 0.0234]
資料/約束/參數	4304/0/365
關於F 2之擬合優度	1.044
最終R指數[I＞=2σ (I)]	R 1= 0.0419，wR 2= 0.1043
最終R指數[所有資料]	R 1= 0.0517，wR 2= 0.1124
最大差：峰/孔/ e Å -3	0.31/-0.25

表23. RejuAgro B之部分原子座標(×10 ⁴)及等效各向同性位移參數(Å ²×10 ³)。U _eq經定義為經正交U _IJ張量之痕量的1/3。

原子	x	y	z	U(eq)
O1	2961(2)	7383.5(12)	2001.1(11)	31.9(3)
O2	-1826(2)	9293.7(13)	432.4(11)	35.5(4)
O3	-3044(2)	7134.9(13)	421.6(10)	34.1(3)
O4	182(2)	5943.5(11)	3820.2(9)	24.6(3)
O5	3410(2)	2456.2(11)	4624.7(9)	27.0(3)
O6	4494(2)	2636.3(12)	2701.7(10)	31.2(3)
N1	593(2)	8361.8(14)	1206.5(12)	25.6(4)
N2	1809(2)	4204.9(13)	4225.8(11)	22.5(3)
C1	1436(3)	5154.4(16)	2526.1(12)	19.3(4)
C2	1083(3)	5152.6(16)	3557.2(13)	20.0(4)
C3	2860(3)	3281.2(16)	4009.9(13)	21.6(4)
C4	3360(3)	3353.0(16)	2929.1(13)	22.3(4)
C5	2479(3)	4308.1(16)	2217.5(13)	21.0(4)
C6	2868(3)	4264.1(17)	1193.1(13)	27.0(4)
C7	537(3)	6175.3(16)	1875.4(12)	19.6(4)
C8	1477(3)	7336.7(16)	1708.5(13)	22.7(4)
C9	-1015(3)	8384.0(17)	814.7(13)	25.8(4)
C10	-1777(3)	7166.6(18)	869.1(13)	24.7(4)
C11	-992(3)	6069.0(16)	1488.2(13)	22.5(4)
C12	-2025(3)	4934.9(19)	1648.0(16)	33.7(5)
O1A	3249(2)	2542.2(12)	7353.0(10)	29.1(3)
O2A	6867(2)	4284.9(12)	4433.3(10)	33.3(3)
O3A	8705(2)	2165.5(13)	4475.5(11)	36.7(4)
O4A	7213(2)	37.3(12)	8198.9(10)	30.6(3)
O5A	2666(2)	-2784.5(13)	9706.4(10)	36.6(4)
O6A	580(2)	-1850.3(14)	8272.4(12)	42.8(4)
N1A	5218(2)	3432.4(14)	5950.6(11)	24.6(4)
N2A	4869(2)	-1309.3(14)	9003.5(11)	26.3(4)
C1A	4443(3)	197.8(16)	7467.5(13)	21.3(4)
C2A	5632(3)	-339.4(16)	8237.7(13)	23.9(4)
C3A	3220(3)	-1884.4(17)	9063.4(14)	27.5(4)
C4A	2026(3)	-1349.2(18)	8259.8(15)	27.9(4)
C5A	2747(3)	-250.9(17)	7474.9(14)	24.8(4)
C6A	1500(3)	238(2)	6728.1(15)	33.8(5)
C7A	5314(3)	1250.6(16)	6665.8(13)	20.2(4)
C8A	4511(3)	2434.0(16)	6711.8(13)	21.9(4)
C9A	6479(3)	3408.2(17)	5139.6(14)	25.0(4)
C10A	7408(3)	2197.3(17)	5129.5(14)	25.4(4)
C11A	6631(3)	1122.0(16)	5922.8(13)	23.0(4)
C12A	7343(3)	-57.7(18)	5817.8(15)	30.6(5)

表24. RejuAgro B之各向異性位移參數(Å ²×10 ³)。各向異性位移因子指數採用以下形式：-2π ²[h ²a* ²U ₁₁+2hka*b*U ₁₂+…].

原子	U 11	U 22	U 33	U 23	U 13	U 12
O1	33.5(8)	24.6(7)	37.9(8)	-5.9(6)	-12.5(6)	-2.0(6)
O2	38.2(8)	25.5(8)	32.6(8)	3.8(6)	-4.8(6)	7.4(6)
O3	39.2(8)	37.3(8)	28.2(7)	-9.7(6)	-15.1(6)	8.0(7)
O4	34.1(7)	21.0(7)	17.2(6)	-5.5(5)	-3.2(5)	6.3(6)
O5	40.0(8)	19.7(7)	21.1(7)	-3.3(5)	-11.5(6)	5.2(6)
O6	41.1(8)	23.2(7)	25.3(7)	-5.6(6)	-2.6(6)	10.7(6)
N1	30.1(9)	15.4(8)	28.0(9)	-2.9(6)	-3.1(7)	0.5(6)
N2	34.8(9)	19.1(8)	12.8(7)	-4.1(6)	-5.5(6)	5.0(7)
C1	23.4(9)	17.5(9)	15.2(8)	-2.4(7)	-3.1(7)	-1.0(7)
C2	23.7(9)	17.6(9)	17.2(9)	-3.0(7)	-3.7(7)	-0.5(7)
C3	26.6(10)	17.2(9)	20.6(9)	-4.0(7)	-5.6(7)	-1.3(7)
C4	28.7(10)	16.2(9)	19.8(9)	-3.5(7)	-2.9(7)	1.3(7)
C5	24.8(9)	18.4(9)	17.6(9)	-2.8(7)	-3.0(7)	0.1(7)
C6	37.7(11)	23.1(10)	19.0(9)	-6.5(8)	-4.0(8)	7.2(8)
C7	25.6(9)	18.4(9)	12.8(8)	-4.1(7)	-0.3(7)	3.2(7)
C8	28.1(10)	18.4(9)	19.3(9)	-3.6(7)	-2.9(7)	2.8(7)
C9	30.7(10)	23.1(10)	17.2(9)	-0.2(8)	0.7(7)	4.0(8)
C10	28.7(10)	29.8(10)	14.7(9)	-6.4(8)	-3.6(7)	5.9(8)
C11	27.1(10)	21.4(9)	17.4(9)	-5.2(7)	-2.1(7)	3.4(8)
C12	36.9(12)	28.6(11)	37.8(12)	-7.7(9)	-15.5(9)	-1.4(9)
O1A	32.5(8)	26.5(7)	25.4(7)	-7.3(6)	-0.5(6)	6.2(6)
O2A	40.9(8)	21.2(7)	29.3(8)	0.0(6)	2.0(6)	-1.0(6)
O3A	39.6(9)	29.7(8)	33.2(8)	-7.5(6)	9.6(7)	-1.9(6)
O4A	32.5(8)	28.8(8)	30.1(8)	-5.3(6)	-10.7(6)	0.1(6)
O5A	46.2(9)	28.2(8)	25.3(8)	2.1(6)	1.6(6)	-0.1(7)
O6A	36.0(9)	34.1(9)	49.6(10)	1.6(7)	-7.1(7)	-7.7(7)
N1A	31.8(9)	16.0(8)	24.2(8)	-5.0(6)	-2.8(7)	2.3(6)
N2A	34.6(9)	22.7(8)	17.8(8)	-1.0(6)	-6.1(7)	6.9(7)
C1A	27.1(10)	17.8(9)	16.7(9)	-4.0(7)	-1.4(7)	4.1(7)
C2A	30.6(10)	19.3(9)	20.4(9)	-4.8(7)	-3.9(8)	4.6(8)
C3A	32.7(11)	23.7(10)	21.9(10)	-6.4(8)	3.9(8)	3.7(8)
C4A	27.6(10)	25.1(10)	27.8(10)	-6.4(8)	0.4(8)	1.3(8)
C5A	28.8(10)	22.0(10)	21.0(9)	-4.6(8)	-1.3(8)	0.6(8)
C6A	30.4(11)	39.5(12)	28.2(11)	-3.0(9)	-7.5(8)	-5.5(9)
C7A	22.8(9)	18.2(9)	19.1(9)	-2.7(7)	-7.0(7)	0.0(7)
C8A	25.6(9)	20.7(9)	18.5(9)	-3.5(7)	-6.1(7)	1.4(7)
C9A	26.2(10)	24.4(10)	22.8(10)	-4.9(8)	-3.2(8)	-2.2(8)
C10A	26.5(10)	24.8(10)	23.7(10)	-7.3(8)	-0.9(8)	-2.1(8)
C11A	25.5(9)	20.3(9)	22.7(9)	-5.1(7)	-5.4(7)	-0.1(7)
C12A	33.3(11)	25.6(10)	30.4(11)	-9.9(9)	3.0(8)	-0.3(8)

表25. RejuAgro B之鍵長度。

原子	原子	長度/Å		原子	原子	長度/Å
O1	C8	1.213(2)		O1A	C8A	1.202(2)
O2	C9	1.214(2)		O2A	C9A	1.222(2)
O3	C10	1.212(2)		O3A	C10A	1.205(2)
O4	C2	1.217(2)		O4A	C2A	1.209(2)
O5	C3	1.210(2)		O5A	C3A	1.213(2)
O6	C4	1.208(2)		O6A	C4A	1.203(3)
N1	C8	1.390(2)		N1A	C8A	1.394(2)
N1	C9	1.360(3)		N1A	C9A	1.354(2)
N2	C2	1.388(2)		N2A	C2A	1.388(2)
N2	C3	1.366(2)		N2A	C3A	1.356(3)
C1	C2	1.488(2)		C1A	C2A	1.496(3)
C1	C5	1.344(3)		C1A	C5A	1.333(3)
C1	C7	1.483(2)		C1A	C7A	1.495(2)
C3	C4	1.538(3)		C3A	C4A	1.534(3)
C4	C5	1.480(3)		C4A	C5A	1.488(3)
C5	C6	1.495(3)		C5A	C6A	1.491(3)
C7	C8	1.489(3)		C7A	C8A	1.491(3)
C7	C11	1.338(3)		C7A	C11A	1.335(3)
C9	C10	1.537(3)		C9A	C10A	1.539(3)
C10	C11	1.481(3)		C10A	C11A	1.486(3)
C11	C12	1.494(3)		C11A	C12A	1.493(3)

表26. RejuAgro B之鍵角。

原子	原子	原子	角度/˚		原子	原子	原子	角度/˚
C9	N1	C8	125.07(16)		C9A	N1A	C8A	125.23(16)
C3	N2	C2	125.15(15)		C3A	N2A	C2A	125.18(17)
C5	C1	C2	122.84(16)		C5A	C1A	C2A	122.52(17)
C5	C1	C7	123.43(16)		C5A	C1A	C7A	121.91(17)
C7	C1	C2	113.73(15)		C7A	C1A	C2A	115.53(16)
O4	C2	N2	120.22(16)		O4A	C2A	N2A	120.41(17)
O4	C2	C1	122.04(16)		O4A	C2A	C1A	122.03(17)
N2	C2	C1	117.74(15)		N2A	C2A	C1A	117.55(17)
O5	C3	N2	122.60(17)		O5A	C3A	N2A	123.6(2)
O5	C3	C4	121.02(17)		O5A	C3A	C4A	119.50(19)
N2	C3	C4	116.37(15)		N2A	C3A	C4A	116.89(17)
O6	C4	C3	117.92(16)		O6A	C4A	C3A	118.93(18)
O6	C4	C5	123.19(17)		O6A	C4A	C5A	122.62(19)
C5	C4	C3	118.87(16)		C5A	C4A	C3A	118.42(17)
C1	C5	C4	118.55(16)		C1A	C5A	C4A	119.10(18)
C1	C5	C6	125.01(17)		C1A	C5A	C6A	125.12(18)
C4	C5	C6	116.43(16)		C4A	C5A	C6A	115.74(17)
C1	C7	C8	113.48(16)		C8A	C7A	C1A	115.80(16)
C11	C7	C1	123.39(16)		C11A	C7A	C1A	121.49(17)
C11	C7	C8	123.12(17)		C11A	C7A	C8A	122.54(16)
O1	C8	N1	121.37(17)		O1A	C8A	N1A	120.00(17)
O1	C8	C7	121.04(17)		O1A	C8A	C7A	122.46(17)
N1	C8	C7	117.59(17)		N1A	C8A	C7A	117.48(16)
O2	C9	N1	123.67(19)		O2A	C9A	N1A	123.12(18)
O2	C9	C10	120.36(19)		O2A	C9A	C10A	120.17(17)
N1	C9	C10	115.97(16)		N1A	C9A	C10A	116.70(16)
O3	C10	C9	118.81(17)		O3A	C10A	C9A	118.60(17)
O3	C10	C11	121.85(19)		O3A	C10A	C11A	123.38(18)
C11	C10	C9	119.32(17)		C11A	C10A	C9A	118.00(16)
C7	C11	C10	117.85(17)		C7A	C11A	C10A	119.31(17)
C7	C11	C12	125.55(17)		C7A	C11A	C12A	123.69(17)
C10	C11	C12	116.58(17)		C10A	C11A	C12A	116.97(17)

表27. RejuAgro B之氫鍵。

D	H	A	d(D-H)/Å	d(H-A)/Å	d(D-A)/Å	D-H-A/°
N1	H1	O2 1	0.88	2.51	3.104(2)	125.1
N1	H1	O4A 2	0.88	2.17	2.928(2)	143.6
N2	H2	O4 3	0.88	2.09	2.909(2)	154.7
N1A	H1A	O2A 2	0.88	2.14	2.940(2)	150.8
N2A	H2A	O3 4	0.88	2.08	2.892(2)	153.8

¹-X,2-Y,-Z； ²1-X,1-Y,1-Z； ³-X,1-Y,1-Z； ⁴1+X,-1+Y,1+Z

表28. RejuAgro B之扭轉角。

A	B	C	D	角度/˚		A	B	C	D	角度/˚
O2	C9	C10	O3	9.1(3)		O2A	C9A	C10A	O3A	10.0(3)
O2	C9	C10	C11	-169.03(18)		O2A	C9A	C10A	C11A	-169.05(18)
O3	C10	C11	C7	173.21(18)		O3A	C10A	C11A	C7A	173.9(2)
O3	C10	C11	C12	-8.5(3)		O3A	C10A	C11A	C12A	-8.1(3)
O5	C3	C4	O6	-8.1(3)		O5A	C3A	C4A	O6A	-1.6(3)
O5	C3	C4	C5	173.42(17)		O5A	C3A	C4A	C5A	-179.46(18)
O6	C4	C5	C1	-171.34(18)		O6A	C4A	C5A	C1A	-174.5(2)
O6	C4	C5	C6	7.3(3)		O6A	C4A	C5A	C6A	3.5(3)
N1	C9	C10	O3	-170.34(17)		N1A	C9A	C10A	O3A	-171.13(19)
N1	C9	C10	C11	11.5(2)		N1A	C9A	C10A	C11A	9.8(3)
N2	C3	C4	O6	170.50(17)		N2A	C3A	C4A	O6A	178.04(19)
N2	C3	C4	C5	-7.9(2)		N2A	C3A	C4A	C5A	0.2(3)
C1	C7	C8	O1	7.7(3)		C1A	C7A	C8A	O1A	0.3(3)
C1	C7	C8	N1	-172.31(16)		C1A	C7A	C8A	N1A	-176.82(16)
C1	C7	C11	C10	178.53(16)		C1A	C7A	C11A	C10A	178.16(17)
C1	C7	C11	C12	0.4(3)		C1A	C7A	C11A	C12A	0.3(3)
C2	N2	C3	O5	-177.67(18)		C2A	N2A	C3A	O5A	174.19(19)
C2	N2	C3	C4	3.7(3)		C2A	N2A	C3A	C4A	-5.5(3)
C2	C1	C5	C4	-1.8(3)		C2A	C1A	C5A	C4A	-1.9(3)
C2	C1	C5	C6	179.67(17)		C2A	C1A	C5A	C6A	-179.68(19)
C2	C1	C7	C8	70.3(2)		C2A	C1A	C7A	C8A	-103.24(19)
C2	C1	C7	C11	-108.6(2)		C2A	C1A	C7A	C11A	81.3(2)
C3	N2	C2	O4	-179.02(17)		C3A	N2A	C2A	O4A	-172.19(18)
C3	N2	C2	C1	1.4(3)		C3A	N2A	C2A	C1A	6.9(3)
C3	C4	C5	C1	7.0(3)		C3A	C4A	C5A	C1A	3.3(3)
C3	C4	C5	C6	-174.34(16)		C3A	C4A	C5A	C6A	-178.77(18)
C5	C1	C2	O4	177.87(18)		C5A	C1A	C2A	O4A	176.18(19)
C5	C1	C2	N2	-2.6(3)		C5A	C1A	C2A	N2A	-2.9(3)
C5	C1	C7	C8	-109.5(2)		C5A	C1A	C7A	C8A	78.8(2)
C5	C1	C7	C11	71.6(3)		C5A	C1A	C7A	C11A	-96.6(2)
C7	C1	C2	O4	-2.0(3)		C7A	C1A	C2A	O4A	-1.8(3)
C7	C1	C2	N2	177.59(16)		C7A	C1A	C2A	N2A	179.16(16)
C7	C1	C5	C4	178.00(16)		C7A	C1A	C5A	C4A	175.89(17)
C7	C1	C5	C6	-0.5(3)		C7A	C1A	C5A	C6A	-1.9(3)
C8	N1	C9	O2	175.24(18)		C8A	N1A	C9A	O2A	169.92(19)
C8	N1	C9	C10	-5.4(3)		C8A	N1A	C9A	C10A	-8.9(3)
C8	C7	C11	C10	-0.3(3)		C8A	C7A	C11A	C10A	3.0(3)
C8	C7	C11	C12	-178.45(18)		C8A	C7A	C11A	C12A	-174.84(18)
C9	N1	C8	O1	176.67(18)		C9A	N1A	C8A	O1A	-172.43(18)
C9	N1	C8	C7	-3.3(3)		C9A	N1A	C8A	C7A	4.8(3)
C9	C10	C11	C7	-8.7(3)		C9A	C10A	C11A	C7A	-7.1(3)
C9	C10	C11	C12	169.60(17)		C9A	C10A	C11A	C12A	170.89(17)
C11	C7	C8	O1	-173.40(18)		C11A	C7A	C8A	O1A	175.71(19)
C11	C7	C8	N1	6.6(3)		C11A	C7A	C8A	N1A	-1.4(3)

表29. RejuAgro B之氫原子坐標(Å×10 ⁴)及等效各向同性位移參數(Å ²×10 ³)。

原子	x	y	z	U(eq)
H1	1115.22	9049.78	1137.02	31
H2	1572.72	4198.81	4837.04	27
H6A	4232.36	4076.12	1013.7	40
H6B	2564.31	5038.79	758.38	40
H6C	2062.97	3648.38	1135.45	40
H12A	-1685.96	4670.99	1066.64	51
H12B	-3421.18	5067.41	1777.57	51
H12C	-1645.33	4322.49	2204.55	51
H1A	4812.5	4134.48	6001.06	30
H2A	5506.16	-1572.03	9488.94	32
H6AC	1266.79	-381.27	6443.7	51
H6AA	2147.29	916.19	6217.2	51
H6AB	266.47	500.23	7032.58	51
H12D	6459.43	-365.46	5507.86	46
H12E	7403.89	-616.99	6460.59	46
H12F	8633.15	35.4	5415.92	46

C. RejuAgro C之晶體結構資訊。

藉由緩慢蒸發RejuAgro B及RejuAgro C之甲醇溶液來獲得RejuAgro C (C ₁₀H ₁₆N ₂O ₇)之單晶。獲得連同RejuAgro B一起出現之無色針狀物。選擇合適晶體且將其安裝在SuperNova, Dual, Cu at home/near, Atlas繞射計上。在資料收集期間將晶體保持在100.05(10) K下。使用Olex2 (Dolomanov等人(2009))，使用olex2.solve結構解析程式(Bourhis等人(2015))使用正負交替(Charge Flipping)解析結構且使用ShelXL細化包裝(Sheldrick (2015))使用最小平方最小化來細化。

在100K下使用Oxford SuperNova繞射計使用Cu(Kα)輻射收集資料集。

RejuAgro C (C ₁₀H ₁₆N ₂O ₇) ( M=276.25 g/mol)之晶體資料：三斜晶，空間群P-1 (編號2)， a= 7.0334(4) Å， b= 10.2354(7) Å， c= 10.4693(7) Å， α= 116.426(7)°， β= 104.722(5)°， γ= 97.680(5)°， V= 625.72(8) Å ³， Z= 2， T= 100.00(10) K，μ(CuKα) = 1.081 mm ^-1， D 計算= 1.466 g/cm ³，7480經量測反射(10.068° ≤ 2Θ ≤ 140.528°)，2353個獨特( R _int= 0.0405, R _Σ= 0.0373)，其用於所有計算中。最終 R ₁為0.0504 (I ＞ 2σ(I))且 wR ₂為0.1388 (所有資料)。

使用Olex2創建細化模型描述，在OlexSys之2018.05.29 svn.r3508上編譯。約束(restraint)數- 0，限制(constraint)數-未知。詳情：1.固定軟碟通；在所有C(H,H,H)基團之1.5倍處；2.a 理想的Me，經定義為旋轉基團：C9(H9A,H9B,H9C)、C10(H10A,H10B,H10C)

參考第15A圖，RejuAgro C分子具有平面π共軛形狀，其中醯胺基團自其餘原子之平面旋轉42°。

參考第15B圖，晶體中之RejuAgro C分子沿著x軸堆疊。該等堆疊沿著ab平面透過H-鍵N-H…O連接到層中。該等層透過與溶劑化物水分子(3莫耳當量)之多個氫鍵連接到3維綱路中。

以下顯示RejuAgro C之化學結構：

(式(III))

RejuAgro C分子之附加結晶結構資料呈現於表30-37中。

表30. RejuAgro C之晶體資料及結構細化。

識別碼	RejuAgro C
經驗式	C 10H 16N 2O 7
式量	276.25
溫度/K	100.00(10)
晶系	三斜晶
空間群	P-1
a/Å	7.0334(4)
b/Å	10.2354(7)
c/Å	10.4693(7)
α/°	116.426(7)
β/°	104.722(5)
γ/°	97.680(5)
體積/Å 3	625.72(8)
Z	2
ρ 計算g/cm 3	1.466
μ/mm -1	1.081
F(000)	292.0
晶體大小/mm 3	0.461 × 0.063 × 0.021
輻射	CuKα (λ = 1.54184)
資料收集之2Θ範圍/°	10.068至140.528
指數範圍	-8 ≤ h ≤ 6、-11 ≤ k ≤ 12、-12 ≤ l ≤ 12
經收集之反射	7480
獨立反射	2353 [R int= 0.0405, R Σ= 0.0373]
資料/約束/參數	2353/0/214
關於F 2之擬合優度	1.047
最終R指數[I＞=2σ (I)]	R 1= 0.0504，wR 2= 0.1270
最終R指數[所有資料]	R 1= 0.0622，wR 2= 0.1388
最大差：峰/孔/ e Å -3	0.41/-0.27

表31. RejuAgro C之部分原子座標(×10 ⁴)及等效各向同性位移參數(Å ²×10 ³)。U _eq經定義為經正交U _IJ張量之痕量的1/3。

原子	x	y	z	U(eq)
O1	999(2)	3453.7(16)	3219.0(16)	25.9(3)
O1W	5100(2)	8599(2)	11132.3(18)	30.5(4)
O2	5632(2)	8416.1(16)	8638.5(17)	28.9(4)
O2W	1123(3)	6910(2)	10264(2)	38.6(4)
O3	3742(2)	8669.8(16)	6246.1(17)	28.8(4)
O3W	-137(3)	3837.8(19)	7792.6(18)	32.3(4)
O4	2491(2)	2183.1(18)	6934.3(18)	31.4(4)
N1	2349(3)	6104.7(19)	4717(2)	24.2(4)
N2	2874(3)	441(2)	4805(2)	34.3(5)
C1	1129(3)	2223(2)	3453(3)	28.0(5)
C2	2308(3)	2755(2)	4951(2)	25.9(5)
C3	2976(3)	4407(2)	5702(2)	23.6(4)
C4	4286(3)	5669(2)	7152(2)	23.7(4)
C5	4459(3)	7096(2)	7326(2)	24.7(4)
C6	3504(3)	7361(2)	6092(2)	24.9(4)
C7	2121(3)	4717(2)	4574(2)	23.4(4)
C8	2582(3)	1776(2)	5638(3)	26.6(5)
C9	-4(4)	717(3)	2106(3)	32.4(5)
C10	5482(3)	5460(3)	8426(2)	29.8(5)

表32. RejuAgro C之各向異性位移參數(Å ²×10 ³)。各向異性位移因子指數採用以下形式：-2π ²[h ²a* ²U ₁₁+2hka*b*U ₁₂+…].

原子	U 11	U 22	U 33	U 23	U 13	U 12
O1	26.2(7)	28.8(8)	26.6(8)	15.3(6)	10.5(6)	12.1(6)
O1W	33.2(8)	29.8(9)	28.5(8)	14.4(7)	10.2(7)	11.1(7)
O2	33.7(8)	27.5(8)	26.0(8)	13.9(6)	10.5(6)	8.5(6)
O2W	37.4(10)	43.6(10)	34.9(9)	18.6(8)	15.5(8)	10.1(8)
O3	35.1(8)	28.0(8)	32.5(8)	19.1(7)	15.4(7)	15.1(6)
O3W	34.3(8)	42.2(9)	31.9(9)	22.2(8)	16.0(7)	22.5(7)
O4	36.4(8)	36.7(8)	35.0(8)	23.6(7)	18.6(7)	19.6(7)
N1	26.1(9)	28.6(9)	26.8(9)	17.9(8)	12.0(7)	13.7(7)
N2	45.3(12)	36.3(11)	38.6(11)	25.3(9)	23.0(9)	22.9(9)
C1	27.0(10)	30.6(11)	36.2(11)	19.6(9)	18.2(9)	13.3(9)
C2	24.5(10)	28.7(11)	32.3(11)	17.4(9)	15.0(9)	12.7(8)
C3	23.1(9)	28.6(10)	28.4(10)	17.8(9)	13.2(8)	14.4(8)
C4	22.7(10)	29.7(10)	25.8(10)	16.4(9)	11.7(8)	12.7(8)
C5	22.9(10)	29.4(11)	26.0(10)	14.7(9)	11.8(8)	11.2(8)
C6	25.6(10)	30.2(11)	30.7(11)	19.3(9)	16.3(9)	15.7(9)
C7	24.1(10)	28.0(10)	26.2(10)	16.1(9)	13.2(8)	13.9(8)
C8	23.9(10)	30.7(11)	33.0(11)	19.1(9)	13.5(9)	12.5(8)
C9	34.4(12)	30.8(11)	33.5(12)	16.3(10)	13.2(10)	10.5(9)
C10	31.7(11)	33.1(11)	28.1(11)	17.7(9)	8.8(9)	14.3(9)

表33. RejuAgro C之鍵長度。

原子	原子	長度/Å		原子	原子	長度/Å
O1	C1	1.396(3)		C1	C9	1.472(3)
O1	C7	1.353(3)		C2	C3	1.455(3)
O2	C5	1.367(3)		C2	C8	1.478(3)
O3	C6	1.258(3)		C3	C4	1.431(3)
O4	C8	1.252(3)		C3	C7	1.371(3)
N1	C6	1.365(3)		C4	C5	1.373(3)
N1	C7	1.343(3)		C4	C10	1.505(3)
N2	C8	1.332(3)		C5	C6	1.453(3)
C1	C2	1.379(3)

表34. RejuAgro C之鍵角。

原子	原子	原子	角度/˚		原子	原子	原子	角度/˚
C7	O1	C1	105.97(16)		C5	C4	C10	120.77(19)
C7	N1	C6	119.61(17)		O2	C5	C4	124.31(18)
O1	C1	C9	114.99(19)		O2	C5	C6	112.35(18)
C2	C1	O1	109.38(19)		C4	C5	C6	123.24(19)
C2	C1	C9	135.6(2)		O3	C6	N1	120.46(18)
C1	C2	C3	107.33(18)		O3	C6	C5	122.8(2)
C1	C2	C8	123.9(2)		N1	C6	C5	116.74(18)
C3	C2	C8	128.4(2)		O1	C7	C3	113.39(18)
C4	C3	C2	138.62(19)		N1	C7	O1	120.70(17)
C7	C3	C2	103.93(19)		N1	C7	C3	125.9(2)
C7	C3	C4	117.30(19)		O4	C8	N2	122.2(2)
C3	C4	C10	122.16(18)		O4	C8	C2	120.68(18)
C5	C4	C3	117.05(18)		N2	C8	C2	117.1(2)

表35. RejuAgro C之氫鍵。

D	H	A	d(D-H)/Å	d(H-A)/Å	d(D-A)/Å	D-H-A/°
O2	H2	O1W	0.94(3)	1.73(3)	2.659(2)	169(3)
N2	H2A	O3 1	0.96(3)	1.92(3)	2.863(2)	168(3)
N1	H1	O3W 2	0.97(4)	1.76(4)	2.723(2)	169(3)
O2W	H2WA	O3W	0.86(4)	2.03(4)	2.866(3)	164(3)
N2	H2B	O3 3	0.94(3)	2.36(3)	3.057(3)	130(2)
O1W	H1WA	O2 4	0.79(4)	2.46(3)	3.080(2)	136(3)
O1W	H1WA	O3 4	0.79(4)	2.01(4)	2.727(2)	151(3)
O1W	H1WB	O4 5	0.89(4)	1.88(4)	2.770(2)	175(3)
O2W	H2WB	O1W	0.92(5)	1.87(5)	2.767(3)	165(4)
O3W	H3WA	O4	0.85(3)	1.88(3)	2.724(2)	173(3)
O3W	H3WB	O2W 6	0.91(4)	1.77(4)	2.677(2)	175(3)

¹+X,-1+Y,+Z; ²-X,1-Y,1-Z; ³1-X,1-Y,1-Z; ⁴1-X,2-Y,2-Z; ⁵1-X,1-Y,2-Z; ⁶-X,1-Y,2-Z

表36. RejuAgro C之扭轉角。

A	B	C	D	角度/˚		A	B	C	D	角度/˚
O1	C1	C2	C3	-0.6(2)		C4	C3	C7	O1	176.52(16)
O1	C1	C2	C8	173.11(17)		C4	C3	C7	N1	-2.2(3)
O2	C5	C6	O3	-0.5(3)		C4	C5	C6	O3	-176.94(18)
O2	C5	C6	N1	178.06(16)		C4	C5	C6	N1	1.6(3)
C1	O1	C7	N1	178.17(16)		C6	N1	C7	O1	-179.40(16)
C1	O1	C7	C3	-0.6(2)		C6	N1	C7	C3	-0.7(3)
C1	C2	C3	C4	-174.7(2)		C7	O1	C1	C2	0.8(2)
C1	C2	C3	C7	0.2(2)		C7	O1	C1	C9	179.80(16)
C1	C2	C8	O4	-136.2(2)		C7	N1	C6	O3	179.69(17)
C1	C2	C8	N2	42.2(3)		C7	N1	C6	C5	1.1(3)
C2	C3	C4	C5	179.1(2)		C7	C3	C4	C5	4.6(3)
C2	C3	C4	C10	1.0(4)		C7	C3	C4	C10	-173.53(18)
C2	C3	C7	O1	0.3(2)		C8	C2	C3	C4	11.9(4)
C2	C3	C7	N1	-178.46(18)		C8	C2	C3	C7	-173.13(19)
C3	C2	C8	O4	36.2(3)		C9	C1	C2	C3	-179.4(2)
C3	C2	C8	N2	-145.5(2)		C9	C1	C2	C8	-5.7(4)
C3	C4	C5	O2	179.50(17)		C10	C4	C5	O2	-2.3(3)
C3	C4	C5	C6	-4.5(3)		C10	C4	C5	C6	173.71(18)

表37. RejuAgro C之氫原子坐標(Å×10 ⁴)及等效各向同性位移參數(Å ²×10 ³)。

原子	x	y	z	U(eq)
H9A	-1263.03	784.93	1500.56	49
H9B	-356.49	-12.41	2434.48	49
H9C	851.94	376.04	1484.45	49
H10A	4654.31	5449.72	9047.62	45
H10B	6747.93	6301.33	9062.81	45
H10C	5824.37	4494.45	7996.93	45
H2	5530(40)	8390(30)	9510(30)	39(7)
H2A	2960(40)	-250(30)	5200(30)	43(7)
H1	1690(50)	6240(40)	3870(40)	60(9)
H2WA	840(50)	6070(40)	9430(40)	53(9)
H2B	3190(50)	290(30)	3940(40)	43(7)
H1WA	5240(50)	9470(40)	11680(40)	49(9)
H1WB	5840(60)	8290(40)	11710(40)	66(10)
H2WB	2360(80)	7470(50)	10400(50)	91(14)
H3WA	770(50)	3390(30)	7570(30)	46(8)
H3WB	-500(60)	3520(40)	8410(50)	67(11)

引用

以引用的方式併入

所有文獻、出版物、專利、專利申請案、及所引用之相關材料在此以引用方式併入，如同在本文中完全陳述一般。

無

第1圖展示基於16S rDNA、 gyrB、 rpoB及 rpoD之串聯比對的代表性假單胞菌貧血之最大可能性物種發生的示範性圖。在接受＜100%支持之四個內部分支下方標記自舉支持值。未標記之彼等表示100%支持。

第2圖展示菌株0617-T307之乙酸乙酯萃取物之經檢定引導分離的實例。

第3A圖描繪展示在RejuAgro A分佈於細胞液、上清液及細胞中之搖瓶發酵中RejuAgro A之量的示範性培養圖，且第3B圖描繪隨時間自細胞發酵產生RejuAgro A。

第4圖描繪展示蘋果黑星菌( V. inaequalis)在第14天在具有單獨PDA而無添加劑(板A)、具有0.25% 0.01 M PBS (板B)或0.8% DMSO (板C)或1.6% DMSO (板D)之PDA板上能夠生長之示範性瓊脂板。

第5圖描繪展示蘋果黑星菌在第14天在含有所選四種生物控制細菌之PDA板(板A：0617-T307；板B：0118-T319；板C：0318-T327；板D：0418-T328)上不能生長之示範性瓊脂板。

第6圖描繪展示蘋果黑星菌在第14天在含有40-80 µg/mL RejuAgro A之PDA板(板A：PDA板中之10 µg/mL；板B：PDA板中之20 µg/mL；板C：PDA板中之40 µg/mL；板D：PDA板中之80 µg/mL)上不能生長之示範性瓊脂板。

第7圖描繪展示蘋果黑星菌在第14天在含有10-80 µg/mL RejuAgro B之PDA板(板A：PDA板中之10 µg/mL；板B：PDA板中之20 µg/mL；板C：PDA板中之40 µg/mL；板D：PDA板中之80 µg/mL)上能生長之示範性瓊脂板。

第8圖描繪展示蘋果黑星菌在第14天在含有200-1000 µg/mL硫酸銅之PDA板(板A：具有500 µg/mL CuSO ₄之PDA板；板B：具有1000 µg/mL CuSO ₄之PDA板)上能夠生長之示範性瓊脂板。

第9圖描繪在407 nm波長下藉由HPLC分析之RejuAgro A的示範性量-峰面積曲線。

第10圖描繪由不同細菌菌株產生RejuAgro A時之示範性資料。

第11圖描繪針對灰黴菌( Botrytis cinerea) CA17之示範性抗真菌檢定，其中圖A描繪(1) 40 µL在50 mg/mL下之制黴素、(2) 40 µL DMSO；圖B描繪(1)達24 h之M9培養基、(2)達24 h之M8培養基、(3)達24 h之M7培養基、(4)達24 h之M6培養基；圖C描繪(1)達12 h之M9培養基、(2)達12 h之M8培養基、(3)達12 h之M7培養基、及(4)達12 h之M6培養基。

第12圖描繪在600 µg/mL RejuAgro A存在下(圖A)展示抑制性生殖或在60 µg/mL RejuAgro A存在下(圖B)或在無RejuAgro A之情況下(圖C)香蕉黑條葉斑病菌( M. fijiensis)之示範性瓊脂板。

第13A圖描繪了作為平面結構之RejuAgro A分子，其中S-Me基團相對於雑環僅旋轉8.7°。該分子在C4-C5鍵(1.531 Å)處之π-共軛顯著破裂，顯然，這是因為一些軌道原因。連接至sp ²碳原子之Me基團在2個位置上可旋轉地紊亂。

第13B圖描繪晶體中之RejuAgro A分子透過N-H…O相互作用形成中心對稱H鍵合之二聚物。此外，該等二聚物藉由較弱C-H…O相互作用沿著[-3 0 1]平面形成2維層。

第14A圖描繪具有兩個對稱獨立的RejuAgro B分子之RejuAgro B晶體。每個分子具有螺旋結構，其中經連接雑環之平均平面之間的雙面角為70.3°及80.6°。每個雑環在兩個相鄰羰基基團之間的C(sp ²)-C(sp ²)鍵(鍵長度為1.534-1.539 Å範圍內)處π共軛顯著破裂，顯然，這是因為一些軌道原因。

第14B圖描繪晶體形式中心對稱H鍵合之二聚物透過N-H…O相互作用得到之RejuAgro B分子。該等二聚物在堆疊中沿著x方向藉由其他N-H…O相互作用連接。最後，該等堆疊藉由第三種N-H…O相互作用沿著[011]連接到層中。

第15A圖描繪具有平面π共軛形狀之RejuAgro C分子，其中醯胺基團自其餘原子之平面旋轉42°。

第15B圖描繪晶體中之RejuAgro C分子沿著x軸堆疊。該等堆疊沿著ab平面透過H-鍵N-H…O連接到層中。該等層透過與溶劑化物水分子(3莫耳當量)之多個氫鍵連接到3維綱路中。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 1.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0617-T307： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911020 2.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0917-T305： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911021 3.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0917-T306： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911022 4.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0917-T307： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911023 5.   摩氏假單胞菌 Pseudomonas mosselii0118-T319： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911024 6.   摩氏假單胞菌 Pseudomonas mosselii0318-T327： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911025 7.   摩氏假單胞菌 Pseudomonas mosselii0418-T328： 財團法人食品工業發展研究所、中華民國109年9月4日、BCRC 911026 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 1.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0617-T307： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126796 2.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0917-T305： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126797 3.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0917-T306： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126798 4.   土壤假單胞菌 Pseudomonas soli0917-T307： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126799 5.   摩氏假單胞菌 Pseudomonas mosselii0118-T319： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126800 6.   摩氏假單胞菌 Pseudomonas mosselii0318-T327： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126801 7.   摩氏假單胞菌 Pseudomonas mosselii0418-T328： 美國、典型培養物保藏中心(ATCC®)、2020年6月25日、PTA-126802

Claims (38)

1. 一種使細菌生長以增強保護性代謝產物之產生之方法，該方法包含以下步驟： i.使假單胞菌細菌在一容器內之液體培養基中生長以產生一細菌發酵產物，其中培養基體積與容器體積之比率為約1:2與1:10之間，且其中該容器以約100與250 RPM之間之一速率振蕩 或 ii.使假單胞菌細菌在一發酵罐之液體培養基中生長以產生一細菌發酵產物，其中該發酵罐之空氣流速為約1與3 L/min之間。
2. 如請求項1所述之方法，該方法進一步包含以下步驟：在一段時間後將該液體培養基與該細菌分離以產生包含該等保護性代謝產物之保護性上清液。
3. 如請求項1或2所述之方法，其中該細菌選自由以下項組成之群：土壤假單胞菌( Pseudomonas soli) 0617-T307 (登錄號PTA-126796，BCRC 911020)、土壤假單胞菌0917-T305 (登錄號PTA-126797，BCRC 911021)、土壤假單胞菌0917-T306 (登錄號PTA-126798，BCRC 911022)、土壤假單胞菌0917-T307 (登錄號PTA-126799，BCRC 911023)、摩氏假單胞菌( Pseudomonas mosselii) 0118-T319 (登錄號PTA-126800，BCRC 911024)、摩氏假單胞菌0318-T327 (登錄號PTA-126801，BCRC 911025)、及摩氏假單胞菌0418-T328 (登錄號PTA-126802，BCRC 911026)。
4. 如請求項1或2所述之方法，其中該生長溫度為約10℃與35℃之間。
5. 如請求項1或2所述之方法，其中該液體培養基為用於生產細胞之LB培養基。
6. 如請求項1或2所述之方法，其中該液體培養基為用於產生式(I)及式(II)之YME培養基：

   

   (I)及

   

   (II)。
7. 如請求項1或2所述之方法，該方法可使用一振動器或一發酵罐進行。
8. 如請求項7所述之方法，當使用一振動器時，其中培養基體積與容器體積之比率為約1:5與1:10之間。
9. 如請求項8所述之方法，當使用一振動器時，其中培養基體積與容器體積之比率為約1:7與1:9之間。
10. 如請求項9所述之方法，當使用一振動器時，其中培養基體積與容器體積之比率為約1:8。
11. 如請求項1或2所述之方法，其中該容器以約200與250 RPM之間之一速率振動。
12. 如請求項11所述之方法，其中該容器以約210與230 RPM之間之一速率振動。
13. 如請求項1或2所述之方法，當使用一發酵罐時，其中該發酵罐之空氣流速為約1.5與2.5 L/min之間或一氧氣濃度為5 mg/L至12 mg/L之間。
14. 如請求項1或2所述之方法，其中該生長溫度為約10℃與20℃之間。
15. 如請求項14所述之方法，其中該生長溫度為約15℃與17℃之間。
16. 如請求項1或2所述之方法，其中該細菌生長達18 h至7天之一段時間。
17. 如請求項1或2所述之方法，其中該細菌生長達至少七天之一段時間。
18. 如請求項16所述之方法，其中該細菌生長達一天與兩天之間之一段時間。
19. 一種農業組成物，該農業組成物包含藉由如請求項1-18中任一項所述之方法產生之細菌發酵產物或保護性上清液。
20. 如請求項19所述之農業組成物，其中該保護性上清液或其代謝產物之調配物選自一溶液(SL)、一可溶性粉末(SP)、一可溶性顆粒(SG)及一封裝調配物。
21. 如請求項19所述之農業組成物，其中該細菌發酵產物及細胞之調配物選自一懸浮液濃縮物(SC)、一可潤濕粉末(WP)及一水分散性顆粒(WG)。
22. 如請求項19之農業組成物，該組成物進一步包含佐劑。
23. 如請求項22之農業組成物，其中該佐劑為界面活性劑。
24. 如請求項22之農業組成物，其中該佐劑為一所選活性成分、水及一極性溶劑。
25. 如請求項23之農業組成物，其中該界面活性劑選自一潤溼劑及一擴散劑。
26. 如請求項25之農業組成物，其中該界面活性劑為一潤溼劑，該潤溼劑包括烷基聚氧化乙烯或聚氧化丙烯。
27. 一種純化來自假單胞菌細菌之保護性代謝產物之方法，該方法包含以下步驟： i. 產生藉由如請求項1-18中任一項所述之方法產生之一細菌發酵產物或保護性上清液或其調配物； ii. 藉由乙酸乙酯萃取來萃取該細菌發酵產物或保護性上清液；及 iii. 藉由使用50%己烷及50%乙酸乙酯溶離該細菌發酵產物或保護性上清液或藉由使用25%己烷及75%乙酸乙酯溶離該細菌發酵產物或保護性上清液來產生含有保護性代謝產物之一溶離物。
28. 如請求項27所述之方法，其中該假單胞菌細菌選自由以下項組成之群： 土壤假單胞菌0617-T307 (登錄號PTA-126796，BCRC 911020)、土壤假單胞菌0917-T305 (登錄號PTA-126797，BCRC 911021)、土壤假單胞菌0917-T306 (登錄號PTA-126798，BCRC 911022)、土壤假單胞菌0917-T307 (登錄號PTA-126799，BCRC 911023)、摩氏假單胞菌0118-T319 (登錄號PTA-126800，BCRC 911024)、摩氏假單胞菌0318-T327 (登錄號PTA-126801，BCRC 911025)、及摩氏假單胞菌0418-T328 (登錄號PTA-126802，BCRC 911026)。
29. 一種控制細菌作物病害之方法，該方法包含以下步驟： i. 產生包含藉由如請求項1-18中任一項所述之方法產生之細菌發酵產物或保護性上清液的農業組成物或如請求項19-26中任一項所述之農業組成物或藉由如請求項33或34所述之方法純化之來自假單胞菌細菌之保護性代謝產物，及 ii. 向作物施加該農業組成物以抑制一病原微生物之生長。
30. 如請求項29所述之方法，其中該作物病害選自由以下項組成之群：黑葉斑病、灰黴病、火燒病、柑橘潰瘍病、軟腐病、橄欖節疤病、番茄細菌性斑點病、細菌性潰瘍病或稻瘟病(核果及梨果)、瓜類角斑病、桃細菌性斑點病、番茄細菌性斑點病、核桃黑腐病、細菌凋萎病、番茄潰瘍病、馬鈴薯晚疫病、蘋果黑星病、細菌性葉疫病、及細菌性葉條斑病。
31. 如請求項29所述之方法，其中該病原微生物選自由以下項組成之群：香蕉黑條葉斑病菌 、灰黴菌、解澱粉歐文氏菌( Ea)(尤其是鏈黴素抗性之解澱粉歐文氏菌菌株) 、地毯草黃單胞菌柑橘變種( Xac) 、土豆果膠桿菌、黒腐果膠桿菌、胡蘿蔔果膠桿菌巴西子種、胡蘿蔔果膠桿菌胡蘿蔔子種、菊歐文氏菌、薩氏假單胞菌薩氏變種( Psv)、丁香假單胞菌番茄變種、丁香假單胞菌丁香變種、丁香假單胞菌黃瓜變種、野油菜黃單胞菌李變種、野油菜黃單胞菌皰病變種、樹生黃單胞菌核桃變種、青枯雷爾氏菌、密西根棒形桿菌密西根子種、馬鈴薯腐疫菌、蘋果黑星病菌、稻黃單胞菌稻變種、稻黃單胞菌稻生變種 、及柑桔黃單孢菌柑桔變種。
32. 如請求項29所述之方法，其中該病原微生物為病原性解澱粉歐文氏菌，該病原性解澱粉歐文氏菌為鏈黴素抗性解澱粉歐文氏菌。
33. 如請求項29所述之方法，其中該作物選自由以下項組成之群：香蕉、蘋果、梨、海棠、柑橘、馬鈴薯、番茄、茄子、綠葉蔬菜、南瓜及瓜類、辣椒及青椒、橄欖、核果及梨果植物，包括橄欖、桃、胡桃。
34. 如請求項29所述之方法，其中該病原微生物選自柱狀黃桿菌#2及柱狀黃桿菌MS-FC-4。
35. 如請求項29所述之方法，其中該病原微生物為大腸桿菌O157:H7。
36. 如請求項29所述之方法，該方法包含以下步驟： 向作物施加包含每mL假單胞菌細菌約1.0 x 10 ⁵與1.0 x 10 ⁹cfu之間之該農業組成物以抑制病原微生物之生長。
37. 如請求項36所述之方法，其中該農業組成物包含每mL假單胞菌細菌約5.0 x 10 ⁷與2.0 x 10 ⁸cfu之間。
38. 一種結晶化合物，該化合物選自以下結構之一：

    

    式(I)、

    

    式(II)、及

    

    式(III)。

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