JP2023546531A - 植物病害を制御するシュードモナス属菌株及びその代謝物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、様々な作物病原体及び真菌病原体に関する様々な微生物種の増殖を抑制することができる、０６１７－Ｔ３０７、０９１７－Ｔ３０５、０９１７－Ｔ３０６、０９１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７及び０４１８－Ｔ３２８の新規細菌株、細胞ブロス、並びに細菌株から産生される新規代謝産物を使用する方法に関する。方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）を有する化合物に対応する菌株から生産される新規で強力な抗菌代謝物の使用を含む。TIFF2023546531000032.tif73166

Description

本出願は、２０２０年１０月５日に出願され、「ＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＳＴＲＡＩＮＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＭＥＴＡＢＯＬＩＴＥＳ ＴＯ ＣＯＮＴＲＯＬ ＰＬＡＮＴ ＤＩＳＥＡＳＥＳ」と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／５４３０３号の一部継続出願であり、その優先権並びに２０２０年１０月５日に出願された米国仮出願第１７／０６３，５４０号、２０２０年１０月５日に出願されたアルゼンチン特許出願第Ｐ２００１０２７５７号及び２０２０年１０月５日に出願された台湾特許出願第１０９１３４４５４号の優先権を主張し、それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、生物農薬の分野である。特に、本発明は、様々な微生物種の増殖を抑制することができる、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ）、０６１７－Ｔ３０７、０９１７－Ｔ３０５、０９１７－Ｔ３０６、０９１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７及び０４１８－Ｔ３２８の７つの新規菌株、その細胞ブロス及び細菌株から生産された新規代謝物に関係する。０６１７－Ｔ３０７、０９１７－Ｔ３０５、０９１７－Ｔ３０６、０９１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７、及び０４１８－Ｔ３２８のシュードモナス属菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７９６、ＰＴＡ－１２６７９７、ＰＴＡ－１２６７９８、ＰＴＡ－１２６７９９、ＰＴＡ－１２６８００、ＰＴＡ－１２６８０１、及びＰＴＡ－１２６８０２を有する。
病原微生物によって引き起こされる植物病害は、指数関数的に増加し、費用がかかいる。植物病原生物は、真菌、細菌、マイコプラズマ、ウイルス、ウイロイド、線虫、又は寄生顕花植物を含む。現在、細菌によって引き起こされる一般的な植物病害は、斑点細菌病、細菌性胴枯病、青枯れ病など１４種類ある。火傷病（エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ））、柑橘類がん腫病［キサントモナス・アキソノポディス 病原型シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ． ｃｉｔｒｉ）（Ｘａｃ）］、細菌性斑点病（ＢＬＳ）［キサントモナス・キャンペストリス 病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）（ＸＶ－１６）］、オリーブがん腫病［シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．Ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）（Ｐｓｖ）］、軟腐病（ディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、ペクトバクテリウム・パルメンティエリ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒｉ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）は、破壊的な植物病害である。全米では、火傷病の制御費用は１億ドルを超えると推定されている（Ｎｏｒｅｌｌｉら、（２００３））。柑橘類がん腫病については、フロリダ州だけでも、１９９５年から２００５年までの根絶プログラムの実施費用、並びに商業生産者及び壊滅した住宅用柑橘類の住宅所有者への補償で、１０億ドルに迫ろうとしている。
火傷病は、グラム陰性細菌エルウィニア・アミロボーラの感染によって生じるナシ状果の壊滅的な病害で、欧州、ドイツ、オーストリア、及びスイスなど世界の多くの地域でナシやリンゴに影響を与えている（Ｃｈｅｎら、（２００９））。火傷病が果樹園全体を枯らすことはほとんどないが、この病害とその制御は、依然として大きな経済的損失をもたらす。太平洋岸北西部及びカリフォルニア州北部では、１９９１年以降、毎年小規模な発生があり、少なくとも一部の地域では３～４年ごとに大規模な発生を経験している。感染した植物部分を取り除くために剪定すると、樹形が崩れ、将来の生産性が低下するため、軽微な病害の発生であっても費用がかかることがある。例えば、樹齢４年のリンゴ園で台木の胴枯れ病が１０％発生した場合、１エーカーあたり最大３，５００ドルの損失となる（Ｎｏｒｅｌｌｉら、（２００３））。
微生物天然物は、農薬として豊富な生物学的化合物を提供してきた（Ｇｗｉｎｎ、（２０１８））。しかし、現在の細菌性植物病害の予防法は、効果が限定的である。抗生物質のストレプトマイシン硫酸塩（ＦｉｒｅＷａｌｌ， ＡｇｒｏＳｏｕｒｃｅ， Ｉｎｃ．）及びオキシテトラサイクリン塩酸塩（ＦｉｒｅＬｉｎｅ， ＡｇｒｏＳｏｕｒｃｅ， Ｉｎｃ．）は、感染リスクが高い場合にＥ．アミロボーラ対策として主に使用されてきた製品である。これらの化合物は、ヒト及び動物の健康管理にも使用されているため、これらと同じ抗生物質を作物農業に使用することは、議論の余地がある（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ、（２０１２））。ストレプトマイシン硫酸塩については、抗生物質耐性に関する懸念から、その使用は制限されている（Ｖｒａｎｃｋｅｎら、（２０１３））。また、火傷病に対して研究されている抗生物質として、カスガマイシンがある。欠点の１つは、カスガマイシンを頻繁に投与すると、植物が破壊される植物毒性につながることである（Ａｄａｓｋａｖｅｇら、（２０１０））。もう１つの欠点は、他の抗生物質と比較して、カスガマイシンの値段が高いことである。そのため、カスガマイシンは他の抗生物質と組み合わせて使用する必要がある。
ここ数十年、多数の非抗生物質製品が開発され、環境保護庁（ＥＰＡ）に登録され、全米オーガニックプログラム（ＮＯＰ）に承認され、火傷病制御のために果樹園経営者に販売されてきた（Ｔｉａｎｎａら、（２０１８））。歴史的に、欧州では、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をベースにした２つの製品が火傷病制御に登録されている：ＱＳＴ ７１３株をベースにしたＳｅｒｅｎａｄｅ（登録商標）及びＢＤ １７０菌株をベースにしたＢｉｏｐｒｏ（登録商標）（Ｂｒｏｇｇｉｎｉら、（２００５））。胞子形成バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）をベースとした生物製剤は、長期間生存できるため、生物的制御に有利である（Ｈａａｓら、（２００５））。２つのバチルス属をベースとした生物製剤のまずまずの成功は、米国とドイツの多くの野外試験で実証されている（Ａｌｄｗｉｎｃｋｌｅら、（２００２）；Ｋｕｎｚら、（２０１１）；Ｌａｕｘら、（２００３））。このことは、Ｅ．アミロボーラによる花感染症の制御において、バチルス属種が有望である見込みがあることを示唆する。しかし、バチルス属は感染圧が低い場合にのみ有効である。感染圧が中程度及び高い場合には効果がない。得られた結果は、両生物製品ともに不安定で、病害抑制率は７１％から０％の間で変動した（Ｂｒｏｇｇｉｎｉら、（２００５））。
将来の生物学的保護製品は、一方ではＥ．アミロボーラと効果的に競合し、他方では標的植物の異なる器官上の同じ微小環境にコロニー形成することができなければならない。保護細菌は、病原菌に影響を与える二次代謝産物を生産し、餌と空間を奪い合い、植物との関係性においてＥ．アミロボーラによる発病を防ぐ。この問題では、シュードモナス属の細菌は、上記の生物学的保護因子に適合する（Ｈａａｓら、（２００５））。様々な植物のコロニー形成細菌の種構成の分析は、シュードモナス属の蛍光細菌が広く存在していることを示した。
フランスでは、健康及び罹病の両方のリンゴの木、ナシ、サンザシに生息する集団の主要構成要素がシュードモナス属種であり、その多くがインビトロでＥ．アミロボーラの増殖を制限する能力を示すことがわかった（Ｐａｕｌｉｎら、（１９７８））。しかし、効能を有する代謝物に関する情報はほとんど報告されていない。
カリフォルニアでは、Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９７６）が、ナシの花の保護に有効な３種類の蛍光性シュードモナス属を選抜した（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９７６））。１９８０年代半ば、カリフォルニアのナシの木の葉から単離されたＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）菌株Ａ５０６は、Ｅ．アミロボーラの増殖を制限する特徴的な活性及び、リンゴとナシを火傷病から保護する能力を示した（Ｌｉｎｄｏｗら、（１９９６））。Ｐ．フルオレッセンスを含む製品ＢｌｉｇｈｔＢａｎ（登録商標）Ａ５０６が開発され、１９９６年から市販されている。カリフォルニア州、オレゴン州、ワシントン州で行われた多くの実験は、リンゴやナシの様々な保護プログラムにおけるこの製剤の有用性を実証した（Ｊｏｈｎｓｏｎ、（２０００））。
英国では、シュードモナス・フルオレッセンスの２つの単離株がサンザシの花及び新芽の保護に使用された（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９２））。
イタリアとニュージーランドでは、ＢＯ ３３７１及びＢＯ Ｇ１９の符号を有するシュードモナス属の２つの菌株の適性が調査された（Ｇａｌａｓｓｏら、（２００２））。温室条件では、それらはリンゴ及びナシの花及び新芽を保護するのに非常に有効である。例えば、ＢＯ３３７１菌株のナシの新芽に対する相対的な保護効果は８７％に達する（Ｇａｌａｓｓｏら、（２００２））。しかし、得られた結果は必ずしも一貫しておらず、これは開花から開花終了までの期間の長さに結び付いた花の感受性が関係している可能性がある。
ニュージーランドでは、蛍光性シュードモナス属種ＩＰＶ－ＢＯ Ｇ１９菌株が、野外条件下で７９％のリンゴの花を保護した。別の実験果樹園では、「Ｂｒａｅｂｕｒｎ」リンゴの花にＥ．アミロボーラを接種する２４時間前に散布した場合、蛍光性シュードモナス属種ＩＰＶ－ＢＯ Ｇ１９及びＩＰＶ－ＢＯ ３３７１は、火傷病の発生をそれぞれ７８％と５８％抑制した（Ｂｉｏｎｄｉら、（２００６））。
スペインでは、菌株ＥＰＳ６２ｅ Ｐ．フルオレッセンスが、野外アッセイにおいてリンゴの花、ナシの果実及びナシの花に対する試験における火傷病を有意に抑制した。Ｐ．フルオレッセンス ＥＰＳ６２ｅの、火傷病に対する適応力及び効力の向上は、栄養強化及び浸透圧適応を組み合わせた戦略によって得られた。生理学的に改良されたＰ．フルオレッセンス ＥＰＳ６２ｅをナシの花に対する野外処理は、９０％もの高い効果を生じたが、結果は試験によって異なった（Ｃａｂｒｅｆｉｇａら、（２０１１）；Ｍｉｋｉｃｉｎｓｋｉら、（２０２０））。
ポーランドでは、リンゴの葉圏と土壌から、ナシ果実への火傷病の影響を軽減することができる細菌の４７コロニーが単離された（Ｍｉｋｉｃｉｎｓｋｉら、（２００８））。
グラム陰性シュードモナス属種によって生産される代謝物は、包括的に概説されている（Ｍａｓｓｃｈｅｌｅｉｎら、（２０１７））。シュードモナス属代謝物の種類は、フェノール化合物、フェナジン、リポペプチドなどに分類される。シュードモナス属種及びその代謝物の機能としては、以下が挙げられる（Ａｌｓｏｈｉｍら、（２０１４））：１）ホルモンを生産する又は全身抵抗性を誘導する；、２）天然に存在する多くの菌株も植物の生育を著しく改善する（植物成長調節物質、ＩＡＡ、ビスコシン）、３）シデロフォアとビスコシン及びビスコシンアミドなどの界面活性物質との生産、並びにシアン化水素、フェナジン、ピロルニトリン又は２，４－ジアシルホログルシノール（ＤＡＰＧ）などの抗菌化合物により拮抗作用が付与され得る。本発明者らの研究では、菌株が同定され、発酵物及び新規代謝物が細菌から生産されており、特にＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡとＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂは、これまで報告されていない細菌及び真菌を含む複数の病原微生物に対して高い効力を示す。
セプトリア・トリティシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）によって引き起こされるセプトリア・トリティシ葉枯病（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ ｂｌｏｔｃｈ）は、主に世界の温帯地域全体にわたって見られる問題である。ＥＵでは穀物生産の収率及び価値が高いために、これは最も重要な葉病害のうちの１つになっている。高度に感受性の変種は、殺菌剤によって保護されない場合、５０％以上の収率低下を示し得る。セプトリアの化学的制御に対する大きな問題は病害抵抗性である。セプトリアのほぼすべての集団は、過去２０年以上にわたって広範囲に使用されているストロビルリン及びトリアゾール系殺菌剤に対する耐性を有している。
真菌のコレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属は、多種多様な宿主に感染する多数の植物病原性種を含む。コレトトリカム属は、リンゴ、モモ、ブドウ、他のベリー作物（イチゴ、ブルーベリー、クランベリー）を含む広範囲の果実作物において多大な損害を引き起こし得る。近年、炭疽病損害について関心を持たれている主要な作物は、イチゴ、石果及びアーモンドである。発病は、制御対策の非存在下の好ましい条件下において壊滅的となり得る。化学殺菌剤耐性は生産者の関心事である。耐性は、脱メチル化阻害薬、キノン外部阻害薬（ｑｕｉｎｏｎｅ－ｏｕｔｓｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びメチルベンゾイミダゾールカルバメートを含む複数のクラスの殺菌剤に対して立証されている。
フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）によって引き起こされるフザリウム赤かび病は、穀粒の家畜又はヒトによる消費のための販売を不可能にするマイコトキシンを生じる、コムギ及びオオムギの壊滅的な病害である。感染リスクが高い状況下では、許容されない作物中マイコトキシンレベルを防ぐために、化学殺菌剤が使用しなければならない。一部の生物学的殺菌剤が使用される場合もある。生物学的殺菌剤を使用することの主な利点は、化学殺菌剤よりも遅い時期の適用を可能にする、より短い収穫前間隔である。土壌伝染性真菌フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）によって引き起こされるフザリウム立枯病は、広範囲にわたる植物病害である。高度に感受性の一部の重要な作物としては、トマト、サツマイモ、メロン、マメ科植物及びバナナ（パナマ病）が挙げられる。病原体は、水しぶき、植え付け機及び感染した種によって拡散する。フザリウム属は、側根又は根の傷口から感染し、木部に達するまで細胞内で増殖する。歴史的に、土壌燻蒸がフザリウム属を除去するための手段として生育期の初めに実施されているが、臭化メチルの市場からの排除により、燻蒸剤の選択肢はより限定されている。
マグナポルテ・オリザエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）によって引き起こされるイネイモチ病は、イネを攻撃する最も深刻な病害である。イネイモチ病は、過酷な条件下では最大３０％以上の損害を引き起こし得る。これは、イネの栽培地域に一般的に見られる条件である温暖かつ高湿度の下で最も重度となる。
Ｎｏｒｅｌｌｉら、（２００３） Ｃｈｅｎら、（２００９） Ｇｗｉｎｎ、（２０１８） Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ、（２０１２） Ｖｒａｎｃｋｅｎら、（２０１３） Ａｄａｓｋａｖｅｇら、（２０１０） Ｔｉａｎｎａら、（２０１８） Ｂｒｏｇｇｉｎｉら、（２００５） Ｈａａｓら、（２００５） Ａｌｄｗｉｎｃｋｌｅら、（２００２） Ｋｕｎｚら、（２０１１） Ｌａｕｘら、（２００３） Ｂｒｏｇｇｉｎｉら、（２００５） Ｐａｕｌｉｎら、（１９７８） Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９７６） Ｌｉｎｄｏｗら、（１９９６） Ｊｏｈｎｓｏｎ、（２０００） Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９２） Ｇａｌａｓｓｏら、（２００２） Ｂｉｏｎｄｉら、（２００６） Ｃａｂｒｅｆｉｇａら、（２０１１） Ｍｉｋｉｃｉｎｓｋｉら、（２０２０） Ｍｉｋｉｃｉｎｓｋｉら、（２００８） Ｍａｓｓｃｈｅｌｅｉｎら、（２０１７） Ａｌｓｏｈｉｍら、（２０１４）
様々な作物病原体及び真菌病原体の増殖を抑制することができる、新規菌株、細胞ブロス、及びそのような菌株から産生される新規代謝産物に由来する新たな生物農薬に対する必要性が存在する。
（発明の簡単な要旨）
第１の態様において、細菌性作物病害を制御する方法が提供される。方法はいくつかのステップを含む。第１のステップは、式（Ｉ）：
Figure 2023546531000002
 を含む農業用組成物を生産することを含む。
第２のステップは、上記農業用組成物を作物に適用して、病原微生物の増殖を抑制することを含む。
第２の態様において、細菌性作物病害を制御する方法が提供される。方法は、約１．０×１０５～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む農業用組成物を作物に適用して、病原微生物の増殖を抑制するステップを含む。
第３の態様において、細菌作物における真菌病原体を制御する方法が提供される。方法はいくつかのステップを含む。１つのステップは、式（Ｉ）
Figure 2023546531000003
 を含む農業用組成物を生産することを含む。別のステップは、上記農業用組成物を作物に適用して、真菌病原体の増殖を抑制することを含む。
第４の態様において、細菌性作物病害を制御する方法が提供される。方法は、約１．０×１０５～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む農業用組成物を作物に適用して、真菌病原体の増殖を抑制するステップを含む。
１６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ及びｒｐｏＤの連結アライメントに基づく、代表的なシュードモナス属系統の最尤系統樹の例示的プロットを示す図である。ブートストラップ支持値は、１００％より小さい支持を得た４つの内部枝の下に表示された。表示されていないものは、１００％の支持を表す。 菌株０６１７－Ｔ３０７の酢酸エチル抽出物のアッセイに基づく単離の一例を示す図である。 振盪フラスコ発酵におけるＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの量について、細胞ブロス、上清及び細胞におけるＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの分布を示す例示的な培養プロットを示す図である。 経時的な細胞発酵からのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの産生に関する例示的なプロットを示すグラフである。 Ｖ．イナエキュアリス（Ｖ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）が、１４日目に、添加物のないＰＤＡ単独（プレートＡ）；０．２５％ ０．０１Ｍ ＰＢＳ（プレートＢ）又は０．８％ ＤＭＳＯ（プレートＣ）又は１．６％ ＤＭＳＯ（プレートＤ）でＰＤＡプレート上で増殖できることを示す例示的な寒天プレートを示す図である。 Ｖ．イナエキュアリスが、１４日目に、選択された４つの生物的制御細菌（プレートＡ：０６１７－Ｔ３０７；プレートＢ：０１１８－Ｔ３１９；プレートＣ：０３１８－Ｔ３２７；プレートＤ：０４１８－Ｔ３２８）を含むＰＤＡプレート上で増殖できないことを示す例示的な寒天プレートを示す図である。 Ｖ．イナエキュアリスが、１４日目に４０～８０μｇ／ｍＬのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを含むＰＤＡプレート上で増殖できないことを示す例示的な寒天プレートを示す図である（プレートＡ：ＰＤＡプレート中１０μｇ／ｍＬ；プレートＢ：ＰＤＡプレート中２０μｇ／ｍＬ；プレートＣ：ＰＤＡプレート中４０μｇ／ｍＬ；プレートＤ：ＰＤＡプレート中８０μｇ／ｍＬ）。 Ｖ．イナエキュアリスが、１４日目に１０～８０μｇ／ｍＬのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂを含むＰＤＡプレート上で増殖できることを示す例示的な寒天プレートを示す図である（プレートＡ：ＰＤＡプレート中１０μｇ／ｍＬ；プレートＢ：ＰＤＡプレート中２０μｇ／ｍＬ；プレートＣ：ＰＤＡプレート中４０μｇ／ｍＬ；プレートＤ：ＰＤＡプレート中８０μｇ／ｍＬ）。 Ｖ．イナエキュアリスが、１４日目に２００～１０００μｇ／ｍＬの硫酸銅を含むＰＤＡプレート上で増殖できることを示す例示的な寒天プレートを示す図である（プレートＡ：５００μｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４を含むＰＤＡプレート；プレートＢ：１０００μｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ４を含むＰＤＡプレート）。 ４０７ｎｍの波長でＨＰＬＣによって分析したＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの例示的な量－ピーク面積曲線を示す図である。 異なる細菌株からのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産に関する例示的なデータを示す図である。 ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）ＣＡ１７に対する例示的な抗真菌アッセイを示す図であり、パネルＡは、（１）５０ｍｇ／ｍＬ ニスタチン ４０μＬ、（２）４０μＬ ＤＭＳＯ、を示す；パネルＢは、（１）２４時間のＭ９培地、（２）２４時間のＭ８培地、（３）２４時間のＭ７培地、（４）２４時間のＭ６培地、を示す；パネルＣは（１）１２時間のＭ９培地、（２）１２時間のＭ８培地、（３）１２時間のＭ７培地、（４）１２時間のＭ６培地を示す。 ６００μｇ／ｍＬのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの存在下では増殖が阻害され（パネルＡ）、６０μｇ／ｍＬのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの存在下（パネルＢ）又はＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａなし（パネルＣ）ではで増殖したことを示すＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）の例示的な寒天プレートを示す図である。 ある投薬量のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ（ＲＡＡ：１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び４０ｍｇ／Ｌ）の適用後の、２８℃のＢＭ７培地中でのＬ．クレッセンス（Ｌ．ｃｒｅｓｃｅｎｓ）ＢＴ１の増殖の抑制を示すグラフである。 １ｍｇ／Ｌの投薬量のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ（ＲＡＡ）の適用後の、Ｌ．クレッセンスの増殖の部分的抑制を示すグラフである。 同じ濃度のオキシテトラサイクリン（Ｏｘｙ－Ｔｅｔ）及びストレプトマイシン（Ｓｔｒ）に匹敵する、２．５ｍｇ／Ｌの投薬量のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ（ＲＡＡ）の適用後１６日間にわたるＬ．クレッセンスの増殖の抑制を示すグラフである。
本発明は、本特許に記載されている０６１７－Ｔ３０７などのシュードモナス属７菌株が生産する、細菌及び真菌を含む病原微生物に対して抗菌活性を示す新規代謝物に関する。１６Ｓ ｒＲＮＡ及び他のハウスキーピング遺伝子の配列から、この菌株はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）群のシュードモナス・ソリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌｉ）０６１７－Ｔ３０７であると同定された。０６１７－Ｔ３０７などの７つの細菌株の細胞ブロスは、以下に示されているように、二量体のＲｅｊｕＡｇｒｏ ＢとともにＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａと名付けられた新規で強力な６員複素環天然物を含む。
Figure 2023546531000004
これらの化合物、その生産方法、及び植物微生物病原体の阻害のための用途は、本明細書でより詳細に開示される。
定義
本開示の態様又は特定の実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」は、要素の１つ以上が存在することを意味することが意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。用語「又は」は、特に指定がない限り、特定のリストのいずれか１つの要素を意味し、そのリストの要素の任意の組合せも含む。
本明細書で意図されるように、用語「実質的に」、「ほぼ」、及び「約」並びに同様の用語は、本開示の主題が関係する技術分野において一般的でかつ許容される使用と協調して広い意味を有することが意図される。これらの用語は、これらの特徴の範囲を、提供される正にその数値範囲に制限することなく、記載され、及び特許請求された特定の特徴の説明を可能にすることを意図されることが、本開示を検討する当業者によって理解されるべきである。それに応じて、これらの用語は、記載され、及び特許請求された主題の、実質的でない、又は、重要部分でない修正又は変更が、添付の特許請求の範囲に述べる本発明の範囲内にあることが考えられることを指示するものと解釈されるべきである。
「生物学的制御剤（又はＢＣＡ）」は、病原体、雑草、昆虫などの有害生物を、安全で、持続可能で、費用対効果に優れた方法で管理する方法である。これらの薬剤は、有害生物種を標的として環境に導入され、環境中の有害生物の個体数や存在量を減少させることを目的としている。
「生物学的製剤」とは、宿主にコロニーを作る生きた微生物（細菌、酵母）の製剤である。これらの微生物は、主に着生期の病原体の蓄積を遅らせるために適用される（Ｔｉａｎｎａら、（２０１８））。
「バイオラショナル（Ｂｉｏｒａｔｉｏｎａｌ）」とは、微生物に基づく生物農薬に適用される用語である。これらの生物農薬は、多くの場合、微生物株を発酵させることで作られる。これらの製品の多くは、抗菌活性と抗真菌活性の両方を備えている（Ｔｉａｎｎａら、（２０１８））。
「生物農薬」とは、米国環境保護庁（ＥＰＡ）によって天然素材由来の農薬と定義され、無害な機構によって有害生物を制御する物質を含む生物化学農薬、生物活性天然物（ＢＮＰ）を通常生産する微生物からなる微生物農薬、遺伝物質を加えたために植物が生み出す活性を持つ植物組み込み型保護剤に分類される（Ｇｗｉｎｎ Ｋ．Ｄ．（２０１８））。
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂ、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｃと呼ばれる化合物は、それぞれ以下に例示する式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）を有する化合物に相当する。
Figure 2023546531000005
第１の態様において、細菌性作物病害を制御する方法が提供される。方法はいくつかのステップを含む。第１のステップは、式（Ｉ）：
Figure 2023546531000006
 を含む農業用組成物を生産することを含む。
第２のステップは、上記農業用組成物を作物に適用して、病原微生物の増殖を抑制することを含む。
１つの点において、方法は、ブラックシガトカ、灰色かび病、火傷病、柑橘類がん腫病、軟腐病、オリーブがん腫病、トマト斑葉細菌病、細菌性がん腫病又はイモチ病（石果及びナシ状果）、ウリ科の角斑病、モモの斑点細菌病、トマト斑点細菌病、クルミ胴枯れ病、青枯れ病、トマトがん腫病、ジャガイモ葉枯れ病、リンゴ赤かび病、白葉枯病、カンキツグリーニング病、ジャガイモのゼブラチップ病、及び条斑細菌病からなる群から選択される作物の病害を含む。第２の点において、方法は、ミコスフェレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（Ｅａ）（特にストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ菌株）、キサントモナス・アキソノポディス 病原型シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）（Ｘａｃ）、ペクトバクテリウム・パルメンティエリ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒｉ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種ブラシリエンシス（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、ディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）（Ｐｓｖ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）、キサントモナス・キャンペストリス 病原型プルニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｒｕｎｉ）、キサントモナス・キャンペストリス 病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、キサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ ｐｖ．ｊｕｇｌａｎｄｉｓ）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ベンチュリア・イナエキュアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、キサントモナス・オリザエ 病原型オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）、キサントモナス・オリザエ 病原型オリジコーラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）及びキサントモナス・シトリ 病原型シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）からなる群から選択される病原微生物を含む。第３の点において、方法は、バナナ、リンゴ、ナシ、クラブアップル、柑橘類、ジャガイモ、カボチャ、タマネギ、コメ、アフリカスミレ；ニンジン、ジャガイモ、トマト、ナス、葉菜類、スカッシュ及びウリ類などのアブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）の植物種、コショウ及びグリーンペッパー、オリーブ；オリーブ、モモ、クルミを含む石果及びナシ状果植物からなる群から選択される作物を含む。
第２の態様において、細菌性作物病害を制御する方法が提供される。方法は、約１．０×１０５～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む農業用組成物を作物に適用して、病原微生物の増殖を抑制するステップを含む。
第１の点において、方法は、シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９６）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５（受託番号ＰＴＡ－１２６７９７）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６（受託番号ＰＴＡ－１２６７９８）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９９）、シュードモナス・モッセリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ） ０１１８－Ｔ３１９（受託番号ＰＴＡ－１２６８００）、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７（受託番号ＰＴＡ－１２６８０１）及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８（受託番号ＰＴＡ－１２６８０２）からなる群から選択されるシュードモナス属細菌を含む。第２の点において、方法は、約５．０×１０７～２．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌の農業用組成物を含む。第３の点において、方法は、ブラックシガトカ、灰色かび病、火傷病、柑橘類がん腫病、軟腐病、オリーブがん腫病、トマト斑葉細菌病、細菌性がん腫病又はイモチ病（石果及びナシ状果）、ウリ科の角斑病、モモの斑点細菌病、トマト斑点細菌病、クルミ胴枯れ病、青枯れ病、トマトがん腫病、ジャガイモ葉枯れ病、リンゴ赤かび病、白葉枯病、カンキツグリーニング病、ジャガイモのゼブラチップ病、及び条斑細菌病からなる群から選択される作物の病害を含む。第４の点において、方法は、ミコスフェレラ・フィジエンシス、ボトリティス・シネレア、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅａ）（特にストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ菌株）、キサントモナス・アキソノポディス 病原型シトリ（Ｘａｃ）、ペクトバクテリウム・パルメンティエリ、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種ブラシリエンシス、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種カロトボラム、ディケヤー・ダダンティイ、シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイ（Ｐｓｖ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型トマト、シュードモナス・シリンガエ 病原型シリンガエ、シュードモナス・シリンガエ 病原型ラクリマンス、キサントモナス・キャンペストリス 病原型プルニ、キサントモナス・キャンペストリス 病原型ベシカトリア、キサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディス、ラルストニア・ソラナセアラム、クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス、フィトフトラ・インフェスタンス、ベンチュリア・イナエキュアリス、キサントモナス・オリザエ 病原型オリザエ、キサントモナス・オリザエ 病原型オリジコーラ及びキサントモナス・シトリ 病原型シトリからなる群から選択される病原微生物を含む。第５の点において、方法は、バナナ、リンゴ、ナシ、クラブアップル、柑橘類、ジャガイモ、カボチャ、タマネギ、コメ、アフリカスミレ；ニンジン、ジャガイモ、トマト、ナス、葉菜類、スカッシュ及びウリ類などのアブラナ科、ナス科、ウリ科の植物種、コショウ及びグリーンペッパー、オリーブ；オリーブ、モモ、クルミを含む石果及びナシ状果植物からなる群からのものである作物を含む。
第３の態様において、細菌作物における真菌病原体を制御する方法が提供される。方法はいくつかのステップを含む。１つのステップは、式（Ｉ）
Figure 2023546531000007
 を含む農業用組成物を生産することを含む。別のステップは、上記農業用組成物を作物に適用して、真菌病原体の増殖を抑制することを含む。
第１の点において、方法は真菌病原体を含み、真菌病原体は、セプトリア・トリティシ、コレトトリカム・デマチウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｍａｔｉｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム 分化型メロニス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．Ｍｅｌｏｎｉｓ）及びマグナポルテ・オリザエからなる群から選択される。第２の点において、作物は、リンゴ、モモ、ブドウ、ベリー作物、コムギ、オオムギ、トマト、サツマイモ、メロン、マメ科植物、バナナ及びコメからなる群から選択される。
第４の態様において、細菌性作物病害を制御する方法が提供される。方法は、約１．０×１０５～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む農業用組成物を作物に適用して、真菌病原体の増殖を抑制するステップを含む。
第１の点において、方法は、シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９６）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５（受託番号ＰＴＡ－１２６７９７）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６（受託番号ＰＴＡ－１２６７９８）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９９）、シュードモナス・モッセリイ ０１１８－Ｔ３１９（受託番号ＰＴＡ－１２６８００）、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７（受託番号ＰＴＡ－１２６８０１）及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８（受託番号ＰＴＡ－１２６８０２）からなる群から選択されるシュードモナス属細菌を含む。第２の点において、方法は、約５．０×１０７～２．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む組成物を含む。第３の点において、方法は、セプトリア・トリティシ、コレトトリカム・デマチウム、フザリウム・オキシスポラム 分化型メロニス及びマグナポルテ・オリザエからなる群から選択される真菌病原体を含む。第４の点において、方法は、リンゴ、モモ、ブドウ、ベリー作物、コムギ、オオムギ、トマト、サツマイモ、メロン、マメ科植物、バナナ及びコメからなる群から選択される作物を含む。
生物寄託情報
本発明者らのうちの１人である、Ｃｈｉｎｇ－Ｈｏｎｇ Ｙａｎｇ博士は、細菌株シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７、シュードモナス・モッセリイ ０１１８－Ｔ３１９、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ（「ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ」）に２０２０年６月２５日に提出し、これらはそれぞれ、非公式のＡＴＣＣ特許番号ＰＴＡ－１２６７９６、ＰＴＡ－１２６７９７、ＰＴＡ－１２６７９８、ＰＴＡ－１２６７９９、ＰＴＡ－１２６８００、ＰＴＡ－１２６８０１及びＰＴＡ－１２６８０２を与えられた。生存率試験後、ＡＴＣＣ特許寄託機構は、これらの寄託された細菌株に、２０２０年６月２５日から有効な以下の受託番号を付与した：シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９６）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５（受託番号ＰＴＡ－１２６７９７）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６（受託番号ＰＴＡ－１２６７９８）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９９）、シュードモナス・モッセリイ ０１１８－Ｔ３１９（受託番号ＰＴＡ－１２６８００）、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７（受託番号ＰＴＡ－１２６８０１）及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８（受託番号ＰＴＡ－１２６８０２）。Ｙａｎｇ博士は、本出願人に対し、この生物寄託の開示を本出願に含めることへの許可を与えている。
［実施例１］ ０６１７－Ｔ３０７菌株の同定及び特徴付け
１６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＤの部分配列が解析された。これらの４つの遺伝子は、シュードモナス属の多座配列解析（ＭＬＳＡ）の推奨マーカーである（Ｐｅｉｘら、（２０１８））。
種の帰属のために、これらの４つの配列を使用して、ＮＣＢＩ非冗長ヌクレオチドデータベースに対してＢＬＡＳＴＮを実行した。結果に基づき、０６１７－Ｔ３０７菌株はＰ．フルオレッセンス系統のＰ．プチダ群に属するシュードモナス属種に近縁である。「ＭＬＳＡ系統樹」及び「シュードモナス属種の標準菌株由来のゲノムリスト」（Ｐｅｉｘら、（２０１８）；Ｐｅｉｘら、（２０１８）の図２及び表２参照）を分類サンプリングのガイドとして用いた（図１）。この情報をもとに、ＧｅｎＢａｎｋからゲノムを取得した。高品質なゲノムアセンブリを持つＰ．プチダ群のすべての種が含まれた。０６１７－Ｔ３０７はＰ．ソリと最も高いｒｐｏＤ（すなわち、シュードモナス属種の割り当てに最も高い解像力を持つ遺伝子）配列類似性を持つため、Ｐ．ソリの利用可能な４種類のゲノムすべてをサンプリングに含めた（Ｐ．ｓｏｌｉの標準菌株ＬＭＧ ２７９４１Ｔを含む）。Ｐ．フルオレッセンス系統の他の種については、それぞれのグループの代表として１種を選択した。Ｐ．エルジノーサ（Ｐ．エルジノーサ群、Ｐ．エルジノーサ系統）は、ツリーのルートを作成するためのアウトグループとして含まれた。
ＭＬＳＡ用の４つの遺伝子は、サンプリングされたゲノムから抽出された。それぞれの遺伝子が個別に配列された後、系統解析のために４つのヌクレオチドアライメントがすべて連鎖された。連鎖されたアライメントは、９，９１２個の配列されたヌクレオチド部位が含まれる。最尤推定はＰｈｙＭＬ（Ｇｕｉｎｄｏｎら、（２００３））を用いて行われた。ブートストラップ支持は１，０００個の複製によって評価された。
多座分子系統樹（図１）に基づき、０６１７－Ｔ３０７及びゲノム配列が利用可能な４つのＰ．ソリ菌株は、１００％のブートストラップ支持で単系統クレードを形成する。この結果は、０６１７－Ｔ３０７を、スペインのシエラネバダ国立公園の土壌試料から分離されたことが報告されている標準菌株であるＰ．ソリ（Ｐａｓｃｕａｌら、（２０１４））に割り当てる強い裏付けを提供した。
さらに、Ｇａｒｃｉａ－Ｖａｌｄｅｓ及びＬａｌｕｃａｔによって提供されたシュードモナス属種割り当てのためのガイドライン（（Ｇａｒｃｉａ－Ｖａｌｄｅｓら、（２０１６））に基づき、０６１７－Ｔ３０７をＰ．ソリに割り当てるための追加の支持は、以下を含めた。（ａ）１６Ｓ ｒＤＮＡ＞９８．７～９９％同一。Ｐ．ソリの標準菌株と比較して、０６１７－Ｔ３０７は９９．２％の配列同一性を有していた。姉妹種であるＰ．エントモフィラ（Ｐ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）と比較すると、０６１７－Ｔ３０７は９９．５％の配列同一性を有していた。１６Ｓ ｒＤＮＡはシュードモナス属における種同定に十分な解像力がないことが知られていることに注意されたい（Ｇａｒｃｉａ－Ｖａｌｄｅｓら、（２０１６）；Ｐｅｉｘら、（２０１８））；（ｂ）ｒｐｏＤ遺伝子＞９５～９６％同一。Ｐ．ソリの標準菌株と比較して、０６１７－Ｔ３０７は９６．５％の配列同一性を有していた。姉妹種であるＰ．エントモフィラと比較して、０６１７－Ｔ３０７は８９．１％の配列同一性しか有さなかった；及び（ｃ）ＭＬＳＡ＞９７％同一。Ｐ．ソリの標準菌株と比較して、０６１７－Ｔ３０７は９８．０％の配列同一性を有していた。姉妹種であるＰ．エントモフィラと比較すると、０６１７－Ｔ３０７は９５．１％の配列同一性しか有さなかった。
［実施例２］ ０６１７－Ｔ３０７菌株の細胞ブロスの酢酸エチル抽出物由来のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂの調製、単離、及び特徴付け
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＢの調製は、発酵槽発酵の細胞ブロスを酢酸エチル抽出し、その後クロマトグラフィーで単離及び精製することにより得ることができる。簡単に説明すると、ストック細菌であるシュードモナス属種０６１７－Ｔ３０７をＬＢプレート（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 寒天、水）に画線塗布し、２８℃のインキュベーター内で２４時間増殖させた。種培地の調製においては、０６１７－Ｔ３０７の単一コロニーを、５００ｍＬのオートクレーブしたＹＭＥ培地（４ｇ／Ｌ 酵母エキス、４ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ 麦芽エキス）を含む２．０Ｌフラスコに接種し、２８℃で２００ｒｐｍの振盪速度で２４時間増殖させる。次いで、１２ＬのオートクレーブしたＹＭＥ培地を含む２０ＬのＮＢＳ発酵槽に種培地を接種した。発酵は１６℃で１～７日間進行させた。撹拌速度は２００ｒｐｍ、送風量は２Ｌ／分であった。
採取後、菌体培養物は酢酸エチルにより４回抽出された。酢酸エチル層が分離され、硫酸ナトリウムを用いて脱水した後、３５℃でロータリーエバポレーションにより乾燥させた。この結果、０６１７－Ｔ３０７菌株の１２Ｌ培養物から２．９ｇの粗抽出物が得られた。
濃縮した試料は酢酸エチルに溶解され、シリカゲルと混合されてインジェクションカラム（φ３．０×２０ｃｍ）として充填され、ＵＶ検出器を備えたフラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｙａｍａｚｅｎ ＡＩ－５８０）のシリカゲルユニバーサルカラム（４．８×１８．５ｃｍ）の上に装填された。試料を装填した後、試料は、極性が増加する順に、１００％ヘキサン、７５％ヘキサン／２５％酢酸エチル、５０％ヘキサン／５０％酢酸エチル、２５％ヘキサン／７５％酢酸エチル、１００％酢酸エチル、５０％酢酸エチル／５０％アセトン、１００％アセトン、及び１００％メタノールのそれぞれの溶媒２８０ｍＬによって溶出された。試料は２０ｍＬ／分の流速で溶出された。溶出液はＵＶ２５４ｎｍでモニターされ、フラクションは２０ｍＬ／試験管の時間モードにより回収された。フラッシュクロマトグラフィーから得られたフラクション又は試験管は合計１１４本であった。
生成されたフラクションは、その後のプレートアッセイに適用された。それぞれのフラクションの１ｍＬを１．５ｍＬ試験管に採取し、エッペンドルフ真空濃縮機で真空乾燥させた。乾燥された試料は、５０μＬのＤＭＳＯに溶解され、そのうちの２μＬがプレートアッセイに使用された。簡単に説明すると、エルウィニア・アミロボーラ２７３を、ＬＢプレートに画線塗布して２８℃のインキュベーター内で増殖させ、２４時間後に得られた単一コロニーを５ｍＬのＬＢ培地に接種して２８℃、２００ｒｐｍの振盪機で一晩増殖させた。菌体を滅菌水で１：１００に希釈し、そのうちの２２５μＬを５０％ＬＢプレート（５．０ｇ／Ｌ トリプトン、２．５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 寒天）上にプレーティングした。バイオセーフティキャビネット内で１０分間乾燥させた後、それぞれのフラクションのＤＭＳＯ溶液をシャーレのあらかじめラベルを貼った部分に分配し、さらに１０分間乾燥させた。アッセイに伴い、ＤＭＳＯ及びカスガマイシンをそれぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。次いで、プレートは２８℃のインキュベーターでインキュベートされ、１日後に阻止円が確認された。
１１４フラクションのインビトロプレートアッセイでは、Ｅ．アミロボーラ２７３の増殖を抑制するフラクションが２つ示された。特筆すべきは、フラクション／試験管３８～４０（これは、Ｔ３８４０又はＦｌａｓｈ－ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａと略記された）は５０％ヘキサン／５０％酢酸エチルによって溶出され、さらなる試験で有望となり得る比較的大きなクリアランスゾーンを有していた。このアッセイにおける他の生物活性化合物は、フラクション５０～５２（これはＴ５０５２としてコード化された）にあった。これらのフラクションは、２５％ヘキサン／７５％酢酸エチルによって溶出された。
フラクション３８４０及び５０５４を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ）で精製した結果、黄色に着色した化合物ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ（Ｒｔ１７．５）１５ｍｇと暗緑色に着色した化合物ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂ１０３．３ｍｇをそれぞれ発見した。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、メタノール及びクロロホルムに溶解され得る。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂ（Ｒｔ１０．５）はメタノール及びクロロホルムには十分に溶解されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）には非常によく溶解され、濃緑色を呈する。この２つの化合物の構造を、高分解能質量分析（ＨＲ－ＭＳ）、赤外線（ＩＲ）、紫外線（ＵＶ）、１次元及び２次元核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶構造解析によって調べた。その結果、この２つの化合物は構造的に類似しており、化合物ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは７種類の炭素基（３種類のカルボニル基、２種類の３級炭素、２種類のメチル炭素）を有するが、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂは以下に示すように１種類のメチル基を欠いている：
Figure 2023546531000008
［実施例３］ ０６１７－Ｔ３０７菌株由来のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂのインビトロ抗菌活性
野生型グラム陰性植物病原性細菌、ストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ、魚病原因細菌、グラム陽性及びグラム陰性ヒト病原性細菌、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産菌（０６１７－Ｔ３０７菌株）の５種類の細菌に対して、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＲｅｊｕＡｇｒｏ ＢのＭＩＣ値は決定された。抗菌性アッセイは、ＣＬＳＩ抗菌物質感受性テスト（ＡＳＴ）標準に準拠して実施された。簡単に説明すると、試験したそれぞれの菌のストック溶液をＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ナトリウム塩、１５ｇ／Ｌ 寒天）に画線塗布した。特殊培養では、ＮＡ（栄養ブロス＋寒天）プレート（３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ポリペプトン、１０ｇ／Ｌ スクロース、１５ｇ／Ｌ 寒天）がＸａｃに対して使用された。ＳＨＩＥＨ（５ｇ／Ｌ トリプトン、０．５ｇ／Ｌ 酵母エキス、０．０１ｇ／Ｌ 酢酸ナトリウム、０．０１ｇ／Ｌ ＢａＣｌ２（Ｈ２Ｏ）２、０．１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６７ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１０ｇ／Ｌ 寒天）、及びＴＹＥＳ（４ｇ／Ｌ トリプトン、０．４ｇ／Ｌ 酵母エキス、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．２、１５ｇ／Ｌ 寒天）がそれぞれフラボバクテリウム・コルムナーレ菌株ＭＳ－ＦＣ－４及び＃２に対して使用された。その後、プレートから単一コロニーを拾い上げ、対応する液体培地に接種して一晩増殖させた。この培養物はＬＢ又は対応する培地でＯＤ５９０＝０．０１に希釈され、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで分配された。化合物ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂ及びストレプトマイシンは希釈され、それぞれの濃度の４μＬがそれぞれのウェルに添加され、最終濃度は４０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．６２５μｇ／ｍＬ、０．３１２５μｇ／ｍＬ、０．１５６２５μｇ／ｍＬ、０．０７８μｇ／ｍＬとする。対照として、ビヒクル水（ストレプトマイシンの場合）又はＤＭＳＯ（ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂの場合）を使用した。
アッセイの結果は、０６１７－Ｔ３０７菌株の最も活性な代謝物は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ ＢではなくＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａであることを示した。グラム陽性菌のＭＲＳＡ（ＭＩＣ＞４０μｇ／ｍＬ）及びグラム陰性菌のＥ．コーライＯ１５７：Ｈ７（ヒトに下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を引き起こす食品及び水媒介性重要病原菌）（ＭＩＣ＝４０μｇ／ｍＬ）に対する効果と比較すると、ＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡはＭＩＣ値が５～４０μｇ／ｍＬの試験細菌に対して特に効率的である。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌活性は、エルウィニア・アミロボーラ １１８９、キサントモナス・アキソノポディス 病原型シトリ、シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイ、ペクトバクテリウム・パルメンティエリ ＵＰＰ１６３ ９３６、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種ブラシリエンシス ９４４、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種カロトボラム ｗｐｐ１４ ９４５、ディケヤー・ダダンティイ ３９３７菌株に関してはストレプトマイシンと同等であり、Ｅ．アミロボーラに関するＭＩＣ値は５μｇ／ｍＬであり、他の弱い病原性細菌では２０～４０μｇ／ｍＬであった。キサントモナス細菌はストレプトマイシに対して非常に感受性が高く、ＭＩＣ値は０．１６μｇ／ｍＬで、これはＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａに対するＭＩＣ値５μｇ／ｍＬより低い。シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイに対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は４０μｇ／ｍＬである。キサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディス２１９に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は６．２５μｇ／ｍＬである。ラルストニア・ソラナセアラム Ｋ６０及びＰｓｓ４に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は、それぞれ３．１３及び６．２５μｇ／ｍＬである。クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス ＮＣＰＰＢ３８２、Ｃｍｍ０３１７、Ｃｍｍ０６９０に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値はそれぞれ６．２５、１．５６、１２．５μｇ／ｍＬである。ラルストニア・ソラナセアラム Ｋ６０及びＰｓｓ４に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は４０μｇ／ｍＬである。
また、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、病原性Ｅ．アミロボーラ１菌株とストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ３菌株を含む他のＥ．アミロボーラ菌株に対しても試験された。Ｅ．アミロボーラ １１０に対して、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａはストレプトマイシンと同等の効果を示した（ＭＩＣ値５μｇ／ｍＬ）。しかしながら、ＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡはＥ．アミロボーラ １１８９に対して、ストレプトマイシンよりも効果が高い。Ｅ．アミロボーラ １１８９に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びストレプトマイシンのＭＩＣ値は、それぞれ５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬである。さらに、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａに対してストレプトマイシンのＭＩＣ値（４０μｇ／ｍＬ超）よりも低いＭＩＣ値（１０μｇ／ｍＬ）が観察されたため、ストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ ＣＡ１１、ＤＭ１及び８９８に対してはより効果的である。これらの結果は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡがＥ．アミロボーラに対するテストにおいて最も強力な化合物であり、ストレプトマイシンの代替候補となり得ることを示唆する。ストレプトマイシン耐性株におけるＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａに対する交差耐性の徴候はない。
魚類のカラムナリス病の原因菌であるフラボバクテリウムに対して、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａはフラボバクテリウム・コルムナーレ ＭＳ－ＦＣ－４菌株及び＃２菌株（天然及び養殖魚のカラムナリス病を引き起こす）に対してＭＩＣ値５μｇ／ｍＬであり、この値はストレプトマイシンのＭＩＣ値より高かった（＃２菌株及びＭＳ－ＦＣ－４菌株に対してそれぞれ０．３１μｇ／ｍＬ及び１．２５μｇ／ｍＬ）。
０６１７－Ｔ３０７菌株に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの影響を検証した。シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７（ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ生産菌）に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は、試験したＬＢ培地において４０μｇ／ｍＬより大きいことが示され、このことは０６１７－Ｔ３０７菌株は少なくとも自ら生産した４０μｇ／ｍＬのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａに対して生存及び耐性を持つことを意味する。
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、トマトの病原菌（Ｐ．シリンガエ 病原型トマト ＰＴ３０、Ｐ．シリンガエ 病原型シリンガエ ７０４６、Ｐ．シリンガエ 病原型ラクリマンス １１８８－１）及びその他の柑橘類がん腫病病原菌（キサントモナス・キャンペストリス 病原型プルニ、キサントモナス・キャンペストリス 病原型ベシカトリア ＸＶ－１６）についてストレプトマイシンとともに試験された。Ｐ．シリンガエに対するＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は４０μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシンのＭＩＣ値は２．５～５μｇ／ｍＬであった。Ｘ．キャンペストリス種に対しては、ＲｅｊｕＡｇｒｏ ＡのＭＩＣ値は２．５μｇ／ｍＬ又は４０μｇ／ｍＬであり、これは、ストレプトマイシンのＭＩＣ値２０μｇ／ｍＬ又は４０μｇ／ｍＬ超と比較して小さい。これらのことから、シュードモナス属を原因とするトマトの病原菌と比較した場合、キサントモナス・キャンペストリスの病原菌はストレプトマイシンよりもＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａに対して感受性が高いことが示された。
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、試験したすべての病原性真菌に対して有効であった（表１）。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、フィトフトラ・インフェスタンス、ベンチュリア・イナエキュアリス、ミコスフェレラ・フィジエンシスに対して試験された。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、４０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬでＰ．インフェスタンス及びＶ．イナエキュアリスに対して１００％の阻害を示した（表１）。
Figure 2023546531000009
Figure 2023546531000010
［実施例４］ 振盪フラスコ発酵における０６１７－Ｔ３０７菌株由来のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産及び安定性
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産及び調製に用いる０６１７－Ｔ３０７の発酵は、振盪フラスコ発酵と発酵槽発酵の２つのアプローチで得ることができる。発酵槽発酵は、実施例２に記載した。本実施例では、フラスコ発酵は以下のように得ることができる。ストック細菌であるシュードモナス属種０６１７－Ｔ３０７を、ＹＭＥ寒天培地（４ｇ／Ｌ 酵母エキス、４ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ 麦芽エキス、１５ｇ／Ｌ 寒天）に画線塗布し、２８℃のインキュベーターで２４時間増殖させた。５０ｍＬの滅菌ＹＭＥ液体培地を含む２５０ｍＬフラスコにおいて０６１７－Ｔ３０７の単一コロニーを１６℃、２２０ｒｐｍで２４時間増殖させることによって、種培地を作成した。次いで種培地を、４％の比率（ｖ／ｖ）で０．５Ｌ滅菌ＹＭＥ培地を含む４Ｌフラスコに接種した。２ＬのＹＭＥ培地を含む８つの４Ｌフラスコへの接種（２％、ｖ／ｖ）に続いて、細菌は１６℃で２００～２２０ｒｐｍの振盪機で１～７日間増殖させた。
開発した標準曲線に従って、ＬＣ－ＭＳ分析によりＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの濃度が得られた。ＬＣ－ＭＳ分析用の試料の調製には、２つの方法が用いられた。１つのアプローチは、細胞ブロスを酢酸エチル（１ｍＬ：１ｍＬ、ボルテックス１分）で抽出し、遠心分離と酢酸エチル層の真空乾燥により酢酸エチル抽出物を得ることである。乾燥した酢酸エチル抽出物は４０μＬのメタノールに溶解され、２μＬのメタノール溶液がＬＣ－ＭＳ分析に使用された。もう１つの方法は、細胞ブロスを遠心分離して上清を得、次いでその上清と等量のメタノールを混合して５０％メタノール溶液とし、そのうちの１０μＬ溶液をＬＣ－ＭＳに注入する方法である。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産は細胞外分泌であり、細胞内ではなく上清にＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａが多く含まれていることが確認されたため、第２の方法を採用した（図３Ａ）。
７日間の発酵中、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの総生産量は初日にピーク濃度に達し、その後、時間の増加とともに減少し始めた（図３Ｂ）。さらに、振盪フラスコ発酵において、６時間ごとにＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産量と細胞濃度について詳細な検討が行われた。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの濃度（ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの総量）は１８時間で最大値１３．８ｍｇ／Ｌに達し、細菌細胞濃度は１２時間で最大値２×１０１１ＣＦＵ／ｍＬに達し、このことはＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産が細胞の増殖に伴う生産プロセスであることが示された。
４Ｌの振盪フラスコ内の培地の体積は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産に影響を与える。ＹＭＥ培地を使用した４Ｌフラスコでは、５００ｍＬの体積サイズでのみＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産が確認され、１．０Ｌと１．５Ｌの体積サイズでは確認されなかった。この観察結果は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産が、高い通気状態に存在するのを好むことを示す。
培地の種類と培養温度はＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産に影響を与える。ＬＢ培地はＹＭＥ培地と並行して１６℃又は２８℃で試験された。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産は、１６℃においてＹＭＥ培地では確認されたが、ＬＢ培地では確認されなかった。コロニー形成単位について、０６１７－Ｔ３０７菌株は１６℃と２８℃の両方のＬＢ培地、及び２８℃のＹＭＥ培地で良好に増殖した。これらの結果は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産は培地特異的かつ温度依存的であることを示唆する。０６１７－Ｔ３０７由来の生産物に対する活性は、Ｅ．アミロボーラに対するプレートアッセイによってモニターされ、これはＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産と一致するものである。
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産条件の適用性を確認するため、シュードモナス属 ０６１７－Ｔ３０７菌株と並行して、他の１０菌株のシュードモナス属も同条件で試験した。ハウスキーピング遺伝子の解析に従って、０９１７－Ｔ３０５、０９１７－Ｔ３０６、及び０９１７－Ｔ３０７はシュードモナス・ソリであると同定され、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７、０４１８－Ｔ３２８はシュードモナス・モッセリイであると同定された。シュードモナス・ソリ及びシュードモナス・モッセリイの両方のタイプ菌株が報告されている（Ｄａｂｏｕｓｓｉら、（２００２）；Ｐａｓｃｕａｌら、（２０１４））。
０６１７－Ｔ３０７株とその系統的に近縁な種は、２８℃、２２０ｒｐｍのＹＭＥにおいてＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを生産できることが示された。この結果は、本方法が０６１７－Ｔ３０７株及びその近縁種の一部に対してＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを生産する特異性を有することを示唆する（表２）。０６１７－Ｔ３０７をＹＭＥ培地で１６℃、２２０ｒｐｍの振盪機で培養することによって得られた４０時間の培養物についてＬＣＭＳで試験したところ、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは室温で少なくとも４週間存在し、安定である。
Figure 2023546531000011
［実施例５］ 菌株０６１７－Ｔ３０７の細胞ブロスの、０６１７－Ｔ３０７及びＥ．アミロボーラに対する抗菌活性。
０６１７－Ｔ３０７の細胞ブロス及び代謝物の抗菌試験には、２つのアッセイが使用された。１つはプレート拡散アッセイ、もう１つはマイクロプレートアッセイである。Ｅ．アミロボーラに対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ含有フラクション及び細胞ブロスの抗菌活性のプレート拡散アッセイには、ＬＢプレートを使用した（表３）。０６１７－Ｔ３０７の生細胞を含む細胞ブロス及び２ｍｇ／ｍＬのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ含有懸濁液は、いずれもＥ．アミロボーラに対して抗菌活性を示した。しかし、Ｓｅｒｅｎａｄｅ（登録商標）を適用した場合には、阻止円は観察されなかった。
Figure 2023546531000012
０６１７－Ｔ３０７細胞と活性成分ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの両方からなる生物学的制御方法を見つけるために、以下のような実験が行われた。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産菌である０６１７－Ｔ３０７に対する抗菌アッセイのために、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを含む０６１７－Ｔ３０７の４０時間培養した細胞ブロスの上清（「上清」と略記）を使用した。０６１７－Ｔ３０７菌株はＹＭＥ培地ではなく、ＬＢ培地で上清の２倍希釈で増殖できることが示された。上清の抑制効果は、ｐＨ値が低いことに起因することをさらなる研究が示した。次いでｐＨを６．５～６．８に制御することで、質問１及び２に「はい」と答えることができる。
生物活性フラクション（粗抽出物、１００μｇ／ｍＬ；ｆｌａｓｈ－ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ、２０μｇ／ｍＬ；ＨＰＬＣ－ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ、１０μｇ／ｍＬ）を菌株０６１７－Ｔ３０７、Ｅａ及びＸａｃに対して試験した。生物活性フラクションは菌株０６１７－Ｔ３０７の増殖を抑制することができなかったことが示され、このことは生物的防除剤を調製するために、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは０６１７－Ｔ３０７細胞と混合できることを示す。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを含む生物活性フラクションは、Ｅａ及びＸａｃに対して阻害効果を示し、特にｆｌａｓｈ－ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＨＰＬＣ－ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、試験条件下でＥａ及びＸａｃの増殖をほぼ停止させた。このことは、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ溶液は、１０～２０μｇ／ｍＬで火傷病及び柑橘類がん腫病の生物的制御に使用され得ることを実証する。
［実施例６］ ０６１７－Ｔ３０７菌株の酸性化上清（ｐＨ２．０）の酢酸エチル抽出物由来の生物活性代謝物の同定及び特徴付け。
ストック細菌であるシュードモナス属種０６１７－Ｔ３０７を、ＬＢ寒天（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 寒天、水）プレートに接種し、２８℃インキュベーターで２４時間増殖させた。種培地の調製については、０６１７－Ｔ３０７の単一コロニーを、５００ｍＬのオートクレーブしたＹＭＥ培地（４ｇ／Ｌ 酵母エキス、４ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ 麦芽エキス）に接種し、２８℃で１５０ｒｐｍの振盪速度で２４時間増殖させる。次いで、２ＬのオートクレーブしたＹＭＥ培地をそれぞれ含む８つの４Ｌフラスコに種培地を接種した。１６℃、振盪速度１５０ｒｐｍの振盪機で７日間発酵を進行させた。
７日間の増殖後、上清は、細菌培養物を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって得られた。次いで、上清のｐＨは、６Ｎ ＨＣｌを加えることによって２．０に調整された。次いで、酸性化した上清は、酢酸エチル抽出に供せられた。この結果、０６１７－Ｔ３０７菌株の１４Ｌ培養物から３．０ｇの粗抽出物が得られた。
濃縮した試料はアセトンに溶解され、シリカゲルと混合されてＵＶ検出器を備えたフラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｙａｍａｚｅｎ ＡＩ－５８０）のシリカゲルカラム（φ３．０×２０ｃｍ）の上に装填された。試料を装填した後、試料は、極性が増加する順に、１００％ヘキサン、７５％ヘキサン／２５％酢酸エチル、５０％ヘキサン／５０％酢酸エチル、２５％ヘキサン／７５％酢酸エチル、１００％酢酸エチル、５０％酢酸エチル／５０％アセトン、１００％アセトン、及び１００％メタノールのそれぞれの溶媒２８０ｍＬによって溶出された。試料は２０ｍＬ／分の流速で溶出された。溶出液はＵＶ２５４ｎｍでモニターされ、フラクションは２０ｍＬ／試験管の時間モードにより回収された。フラッシュクロマトグラフィーから得られたフラクション又は試験管は合計１１４本であった。
生成されたフラクションは、その後のプレートアッセイに適用された。それぞれのフラクションの１ｍＬを１．５ｍＬ試験管に採取し、エッペンドルフ真空濃縮機で真空乾燥させた。乾燥された試料は、５０μＬのＤＭＳＯに溶解され、そのうちの２μＬがプレートアッセイに使用された。簡単に説明すると、エルウィニア・アミロボーラ ２７３を、５０％ＬＢ（５．０ｇ／Ｌ トリプトン、２．５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）プレートに接種し、単一コロニーを５ｍＬ ＬＢ培地に接種することになる。細菌は滅菌水で１：１００に希釈されることになり、そのうちの２２５μＬが５０％ＬＢプレートにプレーティングされた。バイオセーフティキャビネット内で１０分間乾燥させた後、それぞれのフラクションのＤＭＳＯ溶液をシャーレのあらかじめラベルを貼った部分に分配し、さらに１０分間乾燥させた。アッセイに伴い、ＤＭＳＯ及びカスガマイシンをそれぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。次いで、プレートは２８℃のインキュベーターでインキュベートされ、１日後に阻止円が確認される。
１１４のフラッシュフラクションのインビトロプレートアッセイでは、Ｅ．アミロボーラ２７３の増殖を抑制する３つの生物活性フラクション（Ｔ３２３４、Ｔ５０５８、Ｔ７８８２）が示された。フラクション３２３４及び５２５８は、比較的小さなクリアランスゾーンを示した。フラクション３２３４は、５０％ヘキサン／５０％酢酸エチルによって溶出される。フラクション５０５８は、２５％ヘキサン／７５％酢酸エチルにより溶出された。陰性対照では、ＤＭＳＯは阻止円を示さず、陽性対照のカスガマイシンは阻止円を示した。別のフラッシュフラクションＴ７８８２は、アセトン／酢酸エチル（５０％／５０％）によって溶出された。これは、Ｅ．アミロボーラ活性の増殖を同様に阻害した。
さらに抗Ｅ．アミロボーラ活性に基づくＨＰＬＣによる単離及び精製は、Ｔ５０５８から２つの抗菌性化合物（Ｒｔ２２．９及びＲｔ２５．０）（化合物の式、０６１７＿Ｔ３０７＿５０５８＿Ｒｔ２２．９及び０６１７＿Ｔ３０７＿５０５８＿Ｒｔ２５．０を参照）、Ｔ７８８２から１つの抗菌性化合物（Ｒｔ１８．９）（化合物の式０６１７＿Ｔ３０７＿７８８２＿Ｒｔ１８．９を参照）を同定した。Ｔ３０７＿５０５８＿Ｒｔ２２．９及びＴ３０７＿５０５８＿Ｒｔ２５．０はトリプトファン由来の天然物であり、その構造はＳｃｉｆｉｎｄｅｒデータベースで報告されているが生物活性は報告されていない（Ｌｏｏｔｓら、（２０１５））。０６１７＿Ｔ３０７＿７８８２＿Ｒｔ１８は、以前に報告されているジフリルの誘導体であると予測された（Ｏｓｉｐｏｖら、（１９７８））。これらの天然物を以下に示す：
Figure 2023546531000013
［実施例７］ ＬＣＭＳＭＳ及びスペクトルライブラリ検索を使用した０６１７－Ｔ３０７菌株由来のその他の代謝物の同定。
非ｐＨ調整細胞ブロス及びｐＨ調整細胞ブロス（６Ｎ ＨＣｌにより細胞ブロスのｐＨは２．０に調整された）の粗抽出物は濃縮され、内部標準（ｍ／ｚ３１１．０８）を含む２５０μＬ １００％ ＭｅＯＨに再懸濁され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に使用された。ＬＣ注入量：５μＬ；ＬＣカラム：１．７μＭ Ｃ１８、１００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘからの５０×２．１ｍｍ Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８カラム、１２分のグラジエント。Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ Ｉｍｐａｃｔ ＩＩで５～９５％ ＡＣＮ。データは、Ｂｒｕｋｅｒ ＭａＸｉｓ Ｉｍｐａｃｔ ＩＩ、ＵＨＲ－ＱｑＴＯＦ（超高分解能Ｑｑ－Ｔｉｍｅ－Ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析装置によって取得した。各フルＭＳスキャンに続いて、スペクトル中の最も豊富な８つのイオンの衝突活性化解離法（ＣＩＤ）フラグメンテーションを用いたタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）を実施した。スキャン速度は３Ｈｚであった。
次いで、バイオインフォマティクス解析及び分子ネットワーク解析に基づき、新規化合物及び既知化合物の同定を目的として、正確なスペクトルライブラリ検索が実施された。試料のＭＳ／ＭＳスペクトルは、以下のスペクトルライブラリに対して検索された、１）ＧＮＰＳ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｌｉｂｒａｒｙ、２）ＦＤＡ Ｌｉｂｒａｒｙ、ＰｈｙｔｏＣｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ、３）ＮＩＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、４）ＮＩＨ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｉｂｒａｒｙ、５）Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ ＮＩＨ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、６）Ｆａｕｌｋｎｅｒ Ｌｅｇａｃｙ Ｌｉｂｒａｒｙ、７）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ、８）Ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ＭＳ／ＭＳ Ｐｅｐｔｉｄｉｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、９）ＰＮＮＬ Ｌｉｐｉｄｓ、１０）Ｍａｓｓｂａｎｋ、１１）Ｍａｓｓｂａｎｋ ＥＵ、１２）ＭｏＮＡ、１３）ＲｅＳｐｅｃｔ－Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１４）ＨＭＤＢ。
試料のＭＳ／ＭＳスペクトルは上記のライブラリで検索され、参照スペクトルにオフセットして整列させた。マッチングパラメーターは同じであった。これらの結果は、既知化合物の構造類似体を同定するために探索され得る。ＭＳ／ＭＳ分子ネットワークは、最小クラスタサイズ＝２、最小エッジ０．７コサイン、最小マッチングピーク数６で生成された。例として、ｍ／ｚ３０３．１６の新しい分子種は、活性フラクション０６１７－Ｔ３０７＿５０５８＿Ｒｔ２５．０からの新しい化合物に対応するものであることが同定された。粗抽出物から既知化合物の一部が確認され、粗抽出物は植物成長促進因子であるインドール－３－カルボン酸及びキサントリジン（ｘａｎｔｈｏｌｙｓｉｎ）Ａを含む。１）Ｐ．プチダ ＢＷ１１Ｍ１の幅広い抗真菌活性は主にキサントリジン生産に依存する、２）キサントリシンはスウォーミングに必要でバイオフィルム形成に寄与している、と報告されている（Ｌｉら、（２０１３））。実際に、０６１７－Ｔ３０７、０４１８－Ｔ３２８、及び０３１８－Ｔ３２７を２８℃で培養することにより、より高い濃度のキサントリジンＡが観察された。つまり、生物活性化合物であるＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを除けば、キサントリジンＡは生物的制御細菌０６１７－Ｔ３０７とその近縁種０３１８－Ｔ３０２７及び０４１８－Ｔ３２８の抗菌活性に寄与する代謝物である。
［実施例８］ ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを生産する菌株０６１７－Ｔ３０７及びそのいくつかの近縁種の温室及び野外感染アッセイ。
エルウィニア・アミロボーラに対する０６１７－Ｔ３０７の生物制御活性を評価するため、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍｉｌｗａｕｋｅｅの温室でクラブアップルの木を用いた感染アッセイを行った。１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬを含む生物制御剤（０６１７－Ｔ３０７、０７１７－Ｔ３２７、０６１７－Ｔ３１８）は、複数本の小区画にある花（８０％～満開）に散布された。簡単に説明すると、菌株０６１７－Ｔ３０７を５ｍＬのＬＢ培地を含む２６ｍＬガラス管で一晩増殖させ、次いでその細胞をＬＢ培地に接種（１：１００）して２８℃、２００ｒｐｍの振盪機で１４～１８時間増殖させた。細胞が採取され、１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるまで１０倍の水に再懸濁させた。この再懸濁液は、温室及び野外での火傷病制御のための野外アッセイに使用され得る。対照花には蒸留水が散布された。次いで、すべての花に、１．０×１０６ｃｆｕ／ｍＬのＥ．アミロボーラ菌株エルウィニア・アミロボーラ ２７３を散布することによって接種した。０６１７－Ｔ３０７による処理は、２０１８年９月７日、１０月９日、及び１０月１９日に３回実施した。表４を参照すると、０６１７－Ｔ３０７（シュードモナス・ソリ）のすべての散布処理は、クラブアップルの花に蒸留水の０％制御に対して花枯病症状の１００％制御をもたらし、０６１７－Ｔ３０７がＥ．アミロボーラによる火傷病に対する有望な生物制御剤となることが示唆された。他の２つのシュードモナス属種、０７１７－Ｔ３２７（シュードモナス・コーリエンシス）及び０６１７－Ｔ３１８（シュードモナス・プロテゲンス）の制御率はそれぞれ１６．７％と２５％と低かった。結論として、今回試験した３種のシュードモナス属種のうち、０６１７－Ｔ３０７のみがクラブアップルの火傷病に対して良好な制御効果を示す。植物毒性は認められなかった。
Figure 2023546531000014
野外アッセイでは、２０１９年５月５日及び５月６日（リンゴの花の４０％及び７０％開花）に、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを生産する生物的制御細菌（０６１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７、０４１８－Ｔ３２８；表２参照）は５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度で果樹園内のリンゴ木の花に適用された。細菌性病原菌Ｅ．アミロボーラ Ｅａ１１０は、５月７日（９０％開花）に、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの濃度で接種された。水対照、ストレプトマイシン、０６１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７、及び０４１８－Ｔ３２８の罹病花房率はそれぞれ３２．９％、１３．３％、１６．８％、１８．５％、１６．７％、１１．８％である。ストレプトマイシンと比較して、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを生産する生物的制御細菌は、リンゴ園の火傷病の制御に対して同等かそれ以上の効果を有する。
［実施例９］ ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＢとその生産菌のベンチュリア・イナエキュアリスに対する抗真菌活性。
リンゴ赤かび病を引き起こす真菌ベンチュリア・イナエキュアリスをＰＤＡ寒天培地で暗所、室温（約２４℃）で維持した。ＰＤＡ（ポテトデキストロースアガー）から、分生子及び菌糸の混合懸濁液（０．０１Ｍ ＰＢＳ中）が採取された。１０μＬの分生子及び菌糸の懸濁液を、生物的制御細菌、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ、又はＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ改良プレートに滴下した。対照は、生物的制御細菌、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ又はＢを添加しないＰＤＡプレートであった。シャーレは、暗所の室温でインキュベートされ、７日後にＶ．イナエキュアリスのそれぞれのコロニーの直径が確認された。
対照（図４）と比較した場合、選択された４つの生物的制御細菌株０６１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７、及び０４１８－Ｔ３２８は、ＰＤＡプレート上のＶ．イナエキュアリスの増殖を抑制することができる（図５）。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、４０～８０μｇ／ｍＬでＰＤＡプレート上のＶ．イナエキュアリスの増殖を抑制できる（図６）。しかし、１０～８０μｇ／ｍＬでＰＤＡプレート上において、Ｖ．イナエキュアリスの増殖に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂの抑制作用は観察されなかった（図７）。最後に、２００～１０００μｇ／ｍＬの硫酸銅を含むＰＤＡプレート上において、Ｖ．イナエキュアリスの抑制は観察されなかった（図８）。
［実施例１０］ シュードモナス属種によるＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの量は、５００ｍＬのＹＭＥ培地を含む４Ｌフラスコを１６℃、２２０ｒｐｍの振盪条件で２４時間発酵させた後のブロスについて、ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析された。ＨＰＬＣピーク面積とＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの量との関係を調べるために、量－ピーク面積曲線が作成された（図９）。分析方法：１）２５ｍＬの細胞ブロスは２５ｍＬの酢酸エチルで抽出された。２）５ｍＬの酢酸エチル抽出物は乾燥され、０．１ｍＬのメタノールに溶解された。３）４μＬがＨＰＬＣ－ＭＳに注入された。
７種類の細菌（０６１７－Ｔ３０７、０９１７－Ｔ３０５、０９１７－Ｔ３０６、０９１７－Ｔ３０７、０１１８－Ｔ３１９、０３１８－Ｔ３２７、０４１８－Ｔ３２８）がＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生産について評価され、種培地は、細菌をＹＭＥ培地で１６℃、２２０ｒｐｍで２４時間増殖させることによって調製された。ＨＰＬＣ分析は、７種類の細菌すべてがＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａを生産することを示した（図１０）。
［実施例１１］ ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの製剤化及び温室アッセイ。
ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの製剤化（溶液、ＳＬ；表５参照）。花に適用する前に、１０μｇ／ｍＬが毒性緩和剤として１％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００とタンク混合された。その後の試験で、毒性緩和剤として０．０３％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用すると、より優れた花の保護効果が得られることが示された。また、界面活性物質であるＡｌｌｉｇａｒｅ９０は、より高い効果を得るために添加することができる（表５）。
Figure 2023546531000015
エルウィニア・アミロボーラに対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの生物制御活性を評価するため、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍｉｌｗａｕｋｅｅにおいて、クラブアップルの木を用いた温室感染アッセイが実施された。１０μｇ／ｍＬに１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００を添加したもの又は１％ＰＥＧ４０００（陰性対照）を、接種３時間前と接種２４時間後に満開の木花に適用した。接種には、水に懸濁したＥ．アミロボーラ１１０菌株を約１０８ＣＦＵ／ｍＬが使用された。感染率は接種後６日目前後に算出された。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、花枯病を効果的に抑制することができる（表６）。
Figure 2023546531000016
［実施例１２］ ボトリティス・シネレア ＣＡ１７に対する０６１７－Ｔ３０７細胞ブロスの抗真菌活性
菌株０６１７－Ｔ３０７の種菌は、ＹＭＥ培地で２８℃、１８０ｒｐｍで２４時間増殖させることにより調製された。次いで、４％（２ｍＬ～５０ｍＬ）を５０ｍＬのＭ８（ＩＡＡ培地）又はＭ９（ＣＮ培地）又はＭ７（ＰＲＮ培地）又はＭ６（ＤＡＰＧ培地）を含む２５０ｍＬフラスコに接種し、２８℃、１８０ｒｐｍで４８時間増殖させた。０．５ｍＬの細胞ブロスが１２時間及び２４時間に採取され、－２０℃のフリーザーで保管された。抗真菌アッセイのために、細胞ブロスが解凍され、ＰＤＡ（ポテトデキストロースアガー）プレートの試料ウェル上に、ボトリティス・シネレアを接種した中心から半径方向に等しい距離で５μＬ塗布された（図１１）。細胞ブロスは、ＰＤＡ（ポテトデキストロースアガー）プレート上のボトリティス・シネレア ＣＡ１７に対して抗真菌活性を有することが示された。
［実施例１３］ 粗抽出物、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及びＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂの植物病原性細菌に対する抗菌活性。
細菌０９１７－Ｔ３０５、０３１８－Ｔ３２７及び０４１８－Ｔ３２８の代謝物は、Ｒ．ソラナセアラム、Ｃ．ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス及びＸ．アルボリコーラ 病原型ジュグランディスに対して優れた効果を示した（表７）。細菌０９１７－Ｔ３０５、０３１８－Ｔ３２７及び０４１８－Ｔ３２８は、ＹＭＥ培地でそれぞれ１６℃及び２８℃で増殖させた。０９１７－Ｔ３０５、０３１８－Ｔ３２７及び０４１８－Ｔ３２８の天然物抽出物は５ｍｇ／ｍＬで調製され、それらを３種類の植物病原菌、ラルストニア・ソラナセアラム、クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス、及びキサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディスに対してプレート拡散アッセイにより試験された。寒天プレート拡散アッセイでは、１６℃と２８℃のＹＭＥで増殖させた細菌０９１７－Ｔ３０５、０３１８－Ｔ３２７、０４１８－Ｔ３２８の代謝物が、試験したＲ．ソラナセアラム、Ｃ．ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス、Ｘ．アルボリコーラ 病原型ジュグランディスに対して比較的良い効果を示した（表７）。このことは、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａとともに、他の代謝物もラルストニア・ソラナセアラム、クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス、キサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディスに対して優れた効果を有することを示す。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ｂは、ラルストニア・ソラナセアラムに対して良好な効果を示す（表７）。
Figure 2023546531000017
［実施例１４］ Ｒｔ１８．９、Ｒｔ２２．９、及びＲｔ２５．０の抗菌効果。
ストック細菌であるシュードモナス属種０６１７－Ｔ３０７は、ＬＢ寒天（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 寒天、水）プレートに接種され、２８℃インキュベーターで２４時間増殖させた。発酵及び粗抽出物の調製は実施例６に記載されたものと同様に実施された。
シュードモナス属種０６１７－Ｔ３０７の酸性化細胞ブロスの酢酸エチル抽出物のＨＰＬＣによる分離及び精製は、フラッシュフラクションＴ５０５８から２種類の抗菌性化合物（Ｒｔ２２．９及びＲｔ２５．０）、フラッシュフラクションＴ７８８２から１種類の抗菌性化合物（Ｒｔ１８．９）を同定した。これらは、表８に示された細菌株に対して抗菌活性について試験された。ＤＭＳＯ、Ｒｔ１８．９、Ｒｔ２２．９又はＲｔ２５．０の２μＬが、異なる細菌株が増殖した寒天プレートにそれぞれスポットされ、阻止円がさらに試験された（表８）。
Figure 2023546531000018
Figure 2023546531000019
［実施例１５］ ミコスフェレラ・フィジエンシスに対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌効果
ミコスフェレラ・フィジエンシスに対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌効果は、ＨＰＬＣで精製したＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの最終濃度６０μｇ／ｍＬと６００μｇ／ｍＬをそれぞれＰＤＡ寒天培地に添加することによって検討された。０．５ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬ ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの４８０μＬは、６ウェルプレートのウェル内の３．５２ｍＬのＰＤＡに添加され、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの最終濃度がそれぞれ６０μｇ／ｍＬ（図１２、中央のウェル（パネルＡ））及び６００μｇ／ｍＬ（図１２、左のウェル（パネルＢ））になるようにした。プレートは穏やかに振盪され、化合物を溶解させた。３．５２ｍＬのＰＤＡを含む４８０μＬの水が対照処理として使用された（図１２、右のウェル（パネルＣ））。寒天の固化後、Ｍ．フィジエンシスを増殖させた寒天片が寒天表面の中央に配置された。Ｍ．フィジエンシスの増殖の完全な抑制は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの６００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合、接種後２週間に確認された（図１２）。
［実施例１６］ キサントモナス・オリザエ 病原型オリザエ（Ｘｏｎ５０７）に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌効果
キサントモナス・オリザエ 病原型オリザエ（Ｘｏｎ５０７）に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌効果が検討された。Ｘ．オリザエ 病原型オリザエ（Ｘｏｎ５０７）の細菌懸濁液（ＯＤ６００＝０．３）がＰＳＧ寒天プレートに噴霧された。ＨＰＬＣにより精製された水性ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａをそれぞれ５．５μｇ／ｍＬ、１１．１μｇ／ｍＬ、２２．１μｇ／ｍＬ、３３．２μｇ／ｍＬ、５５．４μｇ／ｍＬ、１１０．７μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬの装填体積で装填したペーパーディスクは寒天プレートに配置され、ペーパーディスクを置いて４４時間後に阻止円が計測された。阻害は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ懸濁液を染み込ませたペーパーディスクのすべての濃度で観察された（表９）。
Figure 2023546531000020
［実施例１７］ キサントモナス・シトリ 病原型シトリ シトランジェ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｐｖ． ｃｉｔｒｉ ｃｉｔｒａｎｇｅ）（ＸＷ１９）に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌効果
キサントモナス・シトリ 病原型シトリ シトランジェ（ＸＷ１９）に対するＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの抗菌効果が検討された。Ｘ．シトリ 病原型シトリ シトランジェ（ＸＷ１９）の細菌懸濁液（ＯＤ６００＝０．３）がＰＳＧ寒天プレートに噴霧された。ＨＰＬＣにより精製された水性ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａをそれぞれ５．５μｇ／ｍＬ、１１．１μｇ／ｍＬ、２２．１μｇ／ｍＬ、３３．２μｇ／ｍＬ、５５．４μｇ／ｍＬ、１１０．７μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬの装填体積で装填したペーパーディスクは寒天プレートに配置され、ペーパーディスクを寒天プレートに置いて４４時間後に阻止円が計測された。阻害は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの濃度が５５．３７μｇ／ｍＬ及び１１０．７４μｇ／ｍＬで観察された（表１０）。
Figure 2023546531000021
［実施例１８］ カンキツグリーニング病、ジャガイモのゼブラチップ病を抑制するためのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ及び他のナス科宿主の使用。
カンキツグリーニングとしても公知である黄龍病（Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ：ＨＬＢ）は、柑橘類の最も壊滅的な病害である。ＨＬＢは、アジアが起源であると考えられており、米国では２００５年にフロリダ州における発生が最初に検出された。２００５年以来、ＨＬＢは、フロリダ州の柑橘類生産地域に拡散し、柑橘類の生産量を７５％減少させると同時に生産コストを２倍超にしている。２００８年に、ＨＬＢはルイジアナ州において検出され、２００９年に、この病害はジョージア州及びサウスカロライナ州において検出された。２０１２年に、ＨＬＢは、テキサス州、及びカリフォルニア州の住居地域において検出された（Ｈｕ＆Ｗｒｉｇｈｔ．（２０１９））。この病害は、純粋培地において培養できない細菌病原体であるカンディダトゥス・リベリバクター・アジアティカス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）によって引き起こされる。リベリバクター・クレッセンスは、無菌培地において増殖させることができるこの属の唯一の種であり、カンキツグリーニングを引き起こすＣａ．リベリバクター・アメリカヌス（Ｃａ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）及び「Ｃａ．リベリバクター・アフリカヌス（Ｃａ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）」；並びにジャガイモのゼブラチップ（ＺＣ）病を引き起こし、トマト及びナス科の他の植物とセリ科（Ａｐｉａｃｅａｅ）又は散形科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）の植物とを攻撃する「Ｃａ．リベリバクター・ソラナセアラム（Ｃａ．Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）」などの他の培養できないリベリバクター属病原体を研究するためのモデルとして使用されている（Ｓｅｎａ－Ｖｅｌｅｚら（２０１９））。
ＨＬＢ病原体は植物の師管に生息し、病害の蔓延には、病原媒介昆虫であるミカンキジラミを必要とする。この病害を制御する取組みは行われているが、効果は限定的であり、持続可能ではない。感染を予防する現在の方法及びＨＬＢに感染した木の生産性を維持する現在の方法は、病原媒介生物の殺虫制御、抗菌処理及び栄養補助剤を含む。抗生物質であるオキシテトラサイクリン及びストレプトマイシンはこの病害の制御において有効性を示す唯一の選択であるが、これらの抗生物質は、ヒト病原体の抗生物質耐性及び柑橘類の木の生態系の破壊を引き起こすおそれがある。殺虫剤を噴霧することによる昆虫制御もまた、ヒトの健康及び花粉媒介昆虫などの非標的昆虫に対する潜在的な脅威である。ＨＬＢを処置するために抗微生物ペプチドを使用することに関する近年の進歩は有望であるが（Ｈｕａｎｇら（２０２１））、それは依然として実験段階であり、柑橘類の木の維管束組織への大規模な適用に関するコストは高い可能性がある。
本発明者らはこれまでに、細菌種シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７をウィスコンシン州の土壌試料から単離した。この細菌株は、火傷病原因物質のエルウィニア・アミロボーラ及び柑橘類がん腫病原因物質のキサントモナス・アキソノポディスを含む、多様な植物細菌病原体に対する抑制を示す活性化合物、すなわちＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ（ＲＡＡ）を産生する。本発明者らは、１８５．２ｇの分子量を有するこの化合物を成功裏に精製し、この分子量は、オキシテトラサイクリン（ＭＷ：４６０．４ｇ）及びストレプトマイシン（ＭＷ：５８１．６ｇ）よりも著しく小さい。予備試験結果は、ＲＡＡがリベリバクター・クレッセンスＢＴ－１の増殖を成功裏に抑制できることを示す。効力及び最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、オキシテトラサイクリン及びストレプトマイシンと同等であり、１６日間の抑制にわたって２．５ｍｇ／Ｌと低い（図１３）。ＲＡＡの標的は、作物及び果実における経済的損害を引き起こす植物細菌病害である。ＲＡＡは、ヒト及び動物において適用されたことがない新規の天然化合物であるため、抗生物質耐性を増強するリスクは、他の従来の抗生物質よりもはるかに低いと考えられる。加えて、より小さい分子サイズは、ＨＬＢが生息する柑橘類の木の維管束組織に達することをより容易にする。ＲＡＡは、ＨＬＢ、ＺＣ、及びカンディダトゥスによって引き起こされる多くの他のナス科宿主に対する病害を、有意に低い環境への影響を伴って制御するために使用することができる。
［実施例１９］ 植物真菌病原体を抑制するためのＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａの使用
ＨＰＬＣ精製ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａのｉｎ ｖｉｖｏ抗菌活性を実施した。寒天を有する６ウェルプレートに様々な濃度のＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａ（５、１０、１５、２５、５０及び１００μｇ／ｍＬ）を添加した。ＤＭＳＯを陰性対照として使用し、特定の抗菌化合物を陰性対照として使用した。ペトリプレートにおいて増殖させた真菌培養を小片に切断し、アッセイプレートの各ウェルの中央に移した。６日後に真菌の増殖が観察された。セプトリア・トリティシ及びコレトトリカム・デマチウムについて、増殖培地はポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）であり、陽性対照はナイスタチン（５０μｇ／ｍＬ）であった。フザリウム・オキシスポラム 分化型メロニス及びマグナポルテ・オリザエについて、使用した増殖培地はＰＤＡであり、陽性対照はシクロヘキシミド（５０μｇ／ｍＬ）であった。真菌病原体セプトリア・トリティシ、コレトトリカム・デマチウム、フザリウム・オキシスポラム 分化型メロニス及びマグナポルテ・オリザエの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）による抗微生物効果は、それぞれ１００、５０ １００、７５μｇ／ｍＬであった（表１１）。この研究は、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａが、コムギ及び他の穀類における、セプトリア・トリティシによって引き起こされるセプトリア葉枯病に対する抑制活性を有することを示す。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、リンゴ、モモ、ブドウ、ベリー作物（例えばイチゴ、ブルーベリー、クランベリー）及びコレトトリカム属が感染する他の植物作物を含む植物宿主に感染する真菌のコレトトリカム属に対する抑制活性を示す。加えて、ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、コムギ及びオオムギにおけるフザリウム赤かび病、並びにトマト、サツマイモ、メロン、マメ科植物、バナナ（パナマ病）及びフザリウム属が感染する他の作物におけるフザリウム立枯病を引き起こす真菌のフザリウム属に対する抑制活性を示す。ＲｅｊｕＡｇｒｏ Ａは、イネイモチ病を引き起こすマグナポルテ・オリザエに対する抑制活性を示す。
Figure 2023546531000022
［実施例２０］ 実施例に使用された培地培養組成
表１２は、実施例に使用された例示的な培地組成を含む。
Figure 2023546531000023
［実施例２１］ 細菌株、天然物、及びこれらに引用された文献。
本願に記載され、添付の特許請求の範囲に示された細菌株及び天然物は、微生物学の文献でよく知られたものである。これらの文献は、本明細書に開示された引用された細菌株及び天然物のそれぞれについて、以下の表１３に示されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2023546531000024
引用文献
Figure 2023546531000025
Figure 2023546531000026
Figure 2023546531000027
Figure 2023546531000028
Figure 2023546531000029
参照による組み込み
ここで引用されているすべての文献、出版物、特許、特許出願及び関連資料は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。
生物寄託情報
本発明者らのうちの１人である、Ｃｈｉｎｇ－Ｈｏｎｇ Ｙａｎｇ博士（アメリカ合衆国、ウィスコンシン・５３９０２、メクォン、ノース・シェリダン・ドライブ・１０１２０在住）は、ＰＣＴ第１３規則の２に基づく「寄託された微生物に関する表示」（ＰＣＴ／ＲＯ／１３４）（本願において提出）によって証明される、細菌株シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７、シュードモナス・モッセリイ ０１１８－Ｔ３１９、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ（「ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ」）に２０２０年６月２５日に提出した。生存率試験後、ＡＴＣＣ特許寄託機構は、これらの寄託された細菌株に、２０２０年６月２５日から有効な以下の受託番号を付与した：シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９６）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５（受託番号ＰＴＡ－１２６７９７）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６（受託番号ＰＴＡ－１２６７９８）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９９）、シュードモナス・モッセリイ ０１１８－Ｔ３１９（受託番号ＰＴＡ－１２６８００）、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７（受託番号ＰＴＡ－１２６８０１）及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８（受託番号ＰＴＡ－１２６８０２）。Ｙａｎｇ博士は、本出願人に対し、この生物寄託の開示を本出願に含めることへの許可を与え、かつ、出願日の時点で公衆に利用可能にされることについて、無条件かつ取消不能な同意を与えている。

Claims (18)

  1. 細菌性作物病害を制御する方法であって、
    ｉ．式（Ｉ）
    Figure 2023546531000030
     を含む農業用組成物を生産するステップ；及び
    ｉｉ．前記農業用組成物を作物に適用して、病原微生物の増殖を抑制するステップ
    を含む方法。
  2. 作物病害が、ブラックシガトカ、灰色かび病、火傷病、柑橘類がん腫病、軟腐病、オリーブがん腫病、トマト斑葉細菌病、細菌性がん腫病又はイモチ病（石果及びナシ状果）、ウリ科の角斑病、モモの斑点細菌病、トマト斑点細菌病、クルミ胴枯れ病、青枯れ病、トマトがん腫病、ジャガイモ葉枯れ病、リンゴ赤かび病、白葉枯病、カンキツグリーニング病、ジャガイモのゼブラチップ病、及び条斑細菌病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 病原微生物が、ミコスフェレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（Ｅａ）（特にストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ菌株）、キサントモナス・アキソノポディス 病原型シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）（Ｘａｃ）、ペクトバクテリウム・パルメンティエリ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒｉ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種ブラシリエンシス（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、ディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）（Ｐｓｖ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）、キサントモナス・キャンペストリス 病原型プルニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｒｕｎｉ）、キサントモナス・キャンペストリス 病原型ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、キサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ ｐｖ．ｊｕｇｌａｎｄｉｓ）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ベンチュリア・イナエキュアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、キサントモナス・オリザエ 病原型オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）、キサントモナス・オリザエ 病原型オリジコーラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）及びキサントモナス・シトリ 病原型シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 作物が、バナナ；リンゴ；ナシ；クラブアップル；柑橘類；ジャガイモ；カボチャ；タマネギ；コメ；アフリカスミレ；ニンジン、ジャガイモ、トマト、ナス、葉菜類、スカッシュ及びウリ類などのアブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）の植物種；コショウ及びグリーンペッパー；オリーブ；オリーブ、モモ、クルミを含む石果及びナシ状果植物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 細菌性作物病害を制御する方法であって、
    約１．０×１０５～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む農業用組成物を作物に適用して、病原微生物の増殖を抑制すること
    を含む方法。
  6. シュードモナス属細菌が、シュードモナス・ソリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌｉ） ０６１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９６）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５（受託番号ＰＴＡ－１２６７９７）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６（受託番号ＰＴＡ－１２６７９８）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９９）、シュードモナス・モッセリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ） ０１１８－Ｔ３１９（受託番号ＰＴＡ－１２６８００）、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７（受託番号ＰＴＡ－１２６８０１）及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８（受託番号ＰＴＡ－１２６８０２）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 組成物が、約５．０×１０７～２．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む、請求項５に記載の方法。
  8. 作物病害が、ブラックシガトカ、灰色かび病、火傷病、柑橘類がん腫病、軟腐病、オリーブがん腫病、トマト斑葉細菌病、細菌性がん腫病又はイモチ病（石果及びナシ状果）、ウリ科の角斑病、モモの斑点細菌病、トマト斑点細菌病、クルミ胴枯れ病、青枯れ病、トマトがん腫病、ジャガイモ葉枯れ病、リンゴ赤かび病、白葉枯病、カンキツグリーニング病、ジャガイモのゼブラチップ病、及び条斑細菌病からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  9. 病原微生物が、ミコスフェレラ・フィジエンシス、ボトリティス・シネレア、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅａ）（特にストレプトマイシン耐性Ｅ．アミロボーラ菌株）、キサントモナス・アキソノポディス 病原型シトリ（Ｘａｃ）、ペクトバクテリウム・パルメンティエリ、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種ブラシリエンシス、ペクトバクテリウム・カロトボラム 亜種カロトボラム、ディケヤー・ダダンティイ、シュードモナス・サバスタノイ 病原型サバスタノイ（Ｐｓｖ）、シュードモナス・シリンガエ 病原型トマト、シュードモナス・シリンガエ 病原型シリンガエ、シュードモナス・シリンガエ 病原型ラクリマンス、キサントモナス・キャンペストリス 病原型プルニ、キサントモナス・キャンペストリス 病原型ベシカトリア、キサントモナス・アルボリコーラ 病原型ジュグランディス、ラルストニア・ソラナセアラム、クラビバクター・ミシガンエンシス 亜種ミシガンエンシス、フィトフトラ・インフェスタンス、ベンチュリア・イナエキュアリス、キサントモナス・オリザエ 病原型オリザエ、キサントモナス・オリザエ 病原型オリジコーラ及びキサントモナス・シトリ 病原型シトリからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  10. 作物が、バナナ；リンゴ；ナシ；クラブアップル；柑橘類；ジャガイモ；カボチャ；タマネギ；コメ；アフリカスミレ；ニンジン、ジャガイモ、トマト、ナス、葉菜類、スカッシュ及びウリ類などのアブラナ科、ナス科、ウリ科の植物種；コショウ及びグリーンペッパー；オリーブ；オリーブ、モモ、クルミを含む石果及びナシ状果植物からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  11. 細菌性作物における真菌病原体を制御する方法であって、
    ｉ．式（Ｉ）
    Figure 2023546531000031
     を含む農業用組成物を生産するステップ；及び
    ｉｉ．前記農業用組成物を作物に適用して、真菌病原体の増殖を抑制するステップ
    を含む方法。
  12. 真菌病原体が、セプトリア・トリティシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、コレトトリカム・デマチウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｍａｔｉｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム 分化型メロニス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．Ｍｅｌｏｎｉｓ）及びマグナポルテ・オリザエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 作物が、リンゴ、モモ、ブドウ、ベリー作物、コムギ、オオムギ、トマト、サツマイモ、メロン、マメ科植物、バナナ及びコメからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 細菌性作物病害を制御する方法であって、
    約１．０×１０５～１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む農業用組成物を作物に適用して、真菌病原体の増殖を抑制すること
    を含む方法。
  15. シュードモナス属細菌が、シュードモナス・ソリ ０６１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９６）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０５（受託番号ＰＴＡ－１２６７９７）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０６（受託番号ＰＴＡ－１２６７９８）、シュードモナス・ソリ ０９１７－Ｔ３０７（受託番号ＰＴＡ－１２６７９９）、シュードモナス・モッセリイ ０１１８－Ｔ３１９（受託番号ＰＴＡ－１２６８００）、シュードモナス・モッセリイ ０３１８－Ｔ３２７（受託番号ＰＴＡ－１２６８０１）及びシュードモナス・モッセリイ ０４１８－Ｔ３２８（受託番号ＰＴＡ－１２６８０２）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 組成物が、約５．０×１０７～２．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬのシュードモナス属細菌を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 真菌病原体が、セプトリア・トリティシ、コレトトリカム・デマチウム、フザリウム・オキシスポラム 分化型メロニス及びマグナポルテ・オリザエからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  18. 作物が、リンゴ、モモ、ブドウ、ベリー作物、コムギ、オオムギ、トマト、サツマイモ、メロン、マメ科植物、バナナ及びコメからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
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