JP6598086B2 - バチルス属の新規細菌およびその使用 - Google Patents
バチルス属の新規細菌およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6598086B2 JP6598086B2 JP2017507440A JP2017507440A JP6598086B2 JP 6598086 B2 JP6598086 B2 JP 6598086B2 JP 2017507440 A JP2017507440 A JP 2017507440A JP 2017507440 A JP2017507440 A JP 2017507440A JP 6598086 B2 JP6598086 B2 JP 6598086B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- mtcc
- antibacterial
- cillamensis
- antifungal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
1.新規細菌株および真菌病原体を防除する方法(特許文献1)。
本発明の目的は、抗菌および/または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を示す新規細菌を提供することである。
本発明の態様は、抗菌性および/または抗真性の代謝産物または薬剤の生産に有用な単離された新規細菌を提供することである。
本発明は、枯草菌亜種シリラメンシスと呼称され、受託番号(MTCC−5674)を有するバチルス科に属す新規細菌ならびに抗菌性および/または抗真菌性ならびに植物生長促進性の組成物または薬剤を生産する方法を提供し、前記組成物または薬剤は、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)および/または枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の抽出物を含む。
本発明者らは、空中菌叢に関する試験を行いながら、ハイデラバードおよびパタンチャール(テランガーナ州、インド)の18の異なる場所から大気サンプルを採取した。培地(T3培地、Traversら, 1987)を含むディスポーザブルペトリプレートを研究室で作製し、様々な場所で大気に曝した。曝したプレートを密閉し、ラボインキュベーターにて30℃でインキュベートした。パタンチャール地方で大気に曝したプレートの1つで、菌糸に取り囲まれた細菌コロニーが見られた(図1A)。インキュベーションを続けてもクリアランスゾーンは維持され、菌糸の増殖はクリアランスゾーン周辺に限定されたままであった。このコロニー由来の微生物に対して、生物学の標準法を用いることにより精製を行った(図1B)。個々のコロニーを一般的な真菌フザリウム・オキシスポルムに対して試験した(図2)。
本細菌は、2.45×0.88μmの寸法の桿状、運動性、胞子形成、グラム不定であり;コロニーは、初期段階では平滑、粘液状、灰白色〜クリームがかっているが、長期インキュベーションではしわ型に変わる。細菌は、培地中の栄養が欠乏すると胞子となり、通常、この胞子形成の過程は、30℃および200rpmでの振盪下、25×150mm培養管にて、100μlの5×108菌体接種物を含有する10ml培地中、4日のインキュベーションを要する。
受託番号(MTCC−5674)を有する枯草菌亜種シリラメンシスの増殖のための培養培地の組成は次の通りである
1.トリプトン :0.32%(w/v)
2.トリプトース :0.24%(w/v)
3.酵母抽出物 :0.18%(w/v)
4.NaH2PO4.H2O:0.044M
5.Na2HPO4 :0.062M
6.MnCl2 :0.0005%(w/v)
pH=6.8
2.各フラスコに枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の単一の純粋コロニーを接種し、30℃、200rpmで60時間インキュベートした。
T3培養液で60時間、細菌を増殖させた後、その培養物を4℃、12000rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、0.22μmディスクフィルター(Millipore/Sartorius)を用いて濾過した。この濾液を、抗菌および/または抗真菌活性を試験するための詳細な実験のために適当な保存条件下で保存した。
細菌の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)はまた、抗菌および/または抗真菌剤とともに、高温、すなわち121℃に15分間曝した後でも活性がある強力な好熱性プロテアーゼおよびアミラーゼも生産する。
本研究で使用した方法は微生物学において周知であり、個々のパラメーターは異なり、本試験に関して最適化されている。
1.1 大気サンプルの採取および予備スクリーニング
大気サンプルの採取は、ハイデラバードおよびパタンチャール(テランガーナ州、インド)の種々の場所で行った。T3培地を含むディスポーザブルペトリプレートを研究室で作製し、種々の場所で大気に曝した。曝したプレートを密閉し、ラボインキュベーターにて30℃でインキュベートした。パタンチャール地方で大気に曝したプレートの1つで、菌糸に取り囲まれた細菌コロニーが見られた。
インキュベーションを続けてもクリアランスゾーンは維持され、菌糸の増殖はクリアランスゾーン周辺に限定されたままであった。このコロニー由来の微生物に対して、生物学の標準法を用いることにより精製を行った(図1B)。個々のコロニーを一般的な真菌フザリウム・オキシスポルムに対して試験した(図2)。コロニーの1つが真菌増殖およびクリアランスゾーンの阻害を示した(図2)。
顕微鏡下での細菌の評価により、前記コロニーは桿状運動性細菌であることが明らかになった(図5)。6日のインキュベーションの後、細菌は胞子を生産した。
2.1 新規微生物の特性評価および同定
2.1.1 受託番号(MTCC−5674)を有する新規単離株枯草菌亜種シリラメンシスの特性評価
炭水化物発酵、カタラーゼ試験、酸化−発酵試験、デンプン加水分解、硫化水素生産試験、オキシダーゼ活性試験を含む一定の範囲の生化学的試験を行った。これらの試験の結果から、前記細菌がカタラーゼ陽性、アミラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性、かつ、強い好気性であることが確認された。
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)のコロニーは、粘液状、隆起型、円形、平滑、かつ、クリーム色〜灰白色である(図4)。
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)は、30℃(15℃から55℃まで増殖可能)で最適増殖を示す。それは好気性細菌であるので、その増殖に十分な酸素を必要とし、培養液中での培養に連続的振盪を要する。
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体は、桿状、双桿菌および運動性である(図5)。
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の培養試験管
・過酸化水素
・LB培地を含む3本の試験管に「試験」、「陽性対照」および「陰性対照」と表示し、これらの試験管に白金耳1杯の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)、大腸菌(Escherichia coli)および肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia)をそれぞれ接種した。30℃で24時間のインキュベーション後に、全ての試験管に数滴の過酸化水素を加え、泡の生成を観察した。
気泡は「試験」および「陽性対照」の両試験管から生成し、このことは枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)がカタラーゼ陽性であることを示す(図6)。
材料
・草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養濾液
・デンプン寒天プレート
・ヨウ素
・インキュベーター
デンプン寒天培地は付属書類−I(VI)に示す方法に従って調製した。デンプン寒天培地を含むプレート内に等距離で2つのウェルを作り、「試験」および「陰性対照」と表示した。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養濾液および無菌蒸留水の各500μlアリコートを「試験」および「陰性対照」と表示したウェルに分注した。このプレートを50℃で4時間インキュベートした。
4時間のインキュベーション後に試験ウェルを取り囲む青色が消え、このことは枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養濾液がデンプン分解活性を有することを示す。対照ウェルを取り囲む領域では青色の変化は見られなかった(図7)。
材料
・Hugsh LeifsonのOF基本培地
・試験管
・大腸菌培養物
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)
・インキュベーター
Hugsh LeifsonのOF基本培地(OFBM)(付属書類−I(VII))を含む3本の試験管を「陰性対照」、「陽性対照」および「試験」と表示し、これらの試験管に白金耳1杯のアルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)、大腸菌および枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)をそれぞれ接種した。これらの試験管を30℃で48時間インキュベートし、変色を観察した。
これらの観察から、試験生物(枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)は、培地内の深部では炭水化物を発酵しなかったので、偏性好気性であると結論付けられた。培地の表面では酸素が利用可能であるためにいくらかの変色が見られた。一方、大腸菌は培地内の深部で極めてよく増殖し、炭水化物を発酵し(気体の生成と培地の変色の両方)、このことは大腸菌が条件的嫌気性菌であることを示す(図8)。陰性対照では、気体の発生も変色も見られなかった。
材料
・SIM(Sulfide Indole Motility)培地
・培養試験管
・大腸菌培養物
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)
・インキュベーター
SIM[dole Motility、{付属書類−I(VII)}]培地を含む試験管を「陰性対照」および「試験」と表示し、これらの試験管に白金耳1杯の大腸菌および枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)をそれぞれ接種し、30℃で24時間インキュベートし、変色を観察した。
これらの観察から、培地が黒くならなかったので、試験生物はH2S生産陰性であると結論付けられた。同じ結果が陰性対照でも見られた(図9)。
3.4〜11.0(酸性〜塩基性)の範囲の種々のpH値に調整した標準培養培地(LB)を含む培養試験管を、標準条件下での枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の増殖のために使用した。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の増殖は6.4〜7.2のpH範囲で見られ、最適pHは7.0であることが判明した。
24時間経過した枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養物をT3寒天の表面に拡げた。各抗生物質の表示をしたこれらT3寒天プレートの表面に種々の抗生物質ディスクを置いた。これらのプレートを30℃で24時間インキュベートした。
これらの観察から、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)は、抗生物質−アンピシリン、カルベニシリン、カナマイシン、エンロフロキサシン、リンコマイシン、アモキシシリン、クリンダマイシン、ネオマイシン、アジスロマイシンに耐性であると結論付けられた。試験細菌は、ゲンタマイシン、トブラマイシン(tobramicin)、バンコマイシン(vancomicin)、ノボビオシン、スルフイソキサゾール、セファロチン、クロラムフェニコール、セフトリアキソンおよびバシトラシンに感受性であり、オキサシリン、アミカシン、ストレプトマイシンおよびエリスロマイシンには中間の耐性を示した。
細菌の同定のため、16S DNAシーケンシングおよびFAM分析を行った。両試験の結果は、この細菌が枯草菌亜種サブティリスと16S DNA配列に0.37%の差異および0.827のFAME類似度指数;バチルス・アトロファエウスと16S DNA配列に0.84%の差異および0.749のFAME類似度指数を示していることを示した。よって、これらの結果は、この細菌が枯草菌およびバチルス・アトロファエウスと近縁であるが、ATCCコレクションのカタログの細菌種のいずれとも同一でないことを示唆する。
3.1 抗菌および/または抗真菌剤の生産およびスクリーニング
3.1.1 抗菌および/または抗真菌剤生産
材料
・T3培養液−1L
・三角フラスコ−2L容
・カナマイシン(30μg/ml)
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)接種物
・振盪インキュベーター(温度30℃および振盪200rpmに設定)
T3培養液は付属書類−I(1)に記載の方法に従って調製した。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の培養物1mlを無菌T3培養液に接種し、振盪インキュベーターにて200rpmで振盪しながら30℃で60時間インキュベートした。T3培養液中、60時間、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を増殖させた後、培養培地を12000rpm、4℃で10分間遠心分離した。上清を回収し、0.22μmフィルターで濾過して残りの菌体から分離した。濾液を4℃で維持した。
材料
・抗菌および/または抗真菌剤を含有する枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の培養濾液
・PDAプレート
・試験真菌フザリウム・オキシスポルム
・インキュベーター
濾液中の抗菌および/または抗真菌剤の活性を試験するために、PDA寒天プレートの一方のコーナーにウェルを作り、500μlの濾液をそのウェルに入れた。同じPDA寒天プレートの他方のコーナーに白金耳1杯の真菌フザリウム・オキシスポルムを接種し、室温で5日間インキュベートした。真菌フザリウム・オキシスポルムに対する濾液の阻害活性を、ウェル周囲の阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
ウェルの周囲には14mmの透明な阻害ゾーンが見られ、これは抗菌および/または抗真菌剤の生産に用いた方法が最適であることを示唆する。
抗菌および/または抗真菌活性を生じる薬剤の性質を確認するために、枯草菌亜種シリラメンシスに関連する抗菌および/または抗真菌活性を検討した。
・T3培養液−1L
・三角フラスコ−2L容
・カナマイシン(30μg/ml)
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)接種物
・振盪インキュベーター
T3培養液は付属書類−I(1)に記載の方法に従って調製した。24時間経過した枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の1mlアリコートを無菌T3培養液に接種し、振盪インキュベーターにて200rpmで振盪しながら30℃で60時間インキュベートした。T3培養液中、60時間、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を増殖させた後、培養培地を12000rpm、4℃で10分間遠心分離した。上清を回収し、0.22μmフィルターで濾過して残りの菌体から分離した。
これらの菌体による抗菌および/または抗真菌剤の活性を試験するために、T3寒天プレートの一方のコーナーに白金耳1杯の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を接種し、同じT3寒天プレートの他方のコーナーに白金耳1杯の真菌フザリウム・オキシスポルムを接種し、室温で5日間インキュベートした。真菌フザリウム・オキシスポルムに対する菌体の阻害活性を、菌体コロニー周囲の阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
菌体コロニーの周囲には14mmの透明な阻害ゾーンが見られ(図11A)、これは抗菌および/または抗真菌剤の生産に用いた方法が最適であることを示唆する。菌体により分泌された活性化合物が培養培地に拡散するようになり、その結果、菌体コロニーから離れてクリアランスゾーンが生じることを示唆する。
濾液中の抗菌および/または抗真菌剤の性質を試験するために、500μlの濾液をそのウェルに入れた。同じPDA寒天プレートの対角の端に白金耳1杯の真菌フザリウム・オキシスポルムを接種し、室温で5日間インキュベートした。真菌フザリウム・オキシスポルムに対する濾液の阻害活性を、ウェル周囲の阻害ゾーンとしてミリメートルで記録した。
ウェルの周囲には14mmの透明な阻害ゾーン(図11B)が見られ、これは濾液が抗菌および/または抗真菌活性を保持し、従って、活性化合物が菌体外の培養培地中に分泌されることを示すということを示唆する。
3.3.1 抗菌および/または抗真菌剤の凍結乾燥
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の培養濾液
・硫酸アンモニウム
・凍結乾燥機
抗菌および/または抗真菌剤を3.1.1で説明した方法により生産および精製した。培養濾液の800mlアリコートを382.18gの硫酸アンモニウムと70%(w/v)飽和で混合し(Jingら,2009の改変プロトコール)、溶液を4℃で一晩撹拌することにより穏やかに混合した。この懸濁液を4℃にて10,000rpmで10分間遠心分離した。このようにしてえられたペレットを凍結乾燥機で24時間凍結乾燥させ、乾燥したペレットを室温で保存した。
方法
3.3.2.1 試験管希釈法
3.3.2.2 寒天拡散法
凍結乾燥抗菌および/または抗真菌剤の保存溶液の調製
保存溶液は、抗菌および/または抗真菌剤の1gの凍結乾燥粉末を50mlリン酸バッファー(pH7.0)に溶かすことにより調製した。保存溶液の終濃度は20μg/μlに調整した。この保存溶液を、PDB培地を用い、表−1に示されるような種々の比率で希釈液を作製するために使用した。
材料
・1.5ml試験管
・PDB培地
・抗菌および/または抗真菌剤保存液
・フザリウム・オキシスポルム胞子懸濁液
抗菌および/または抗真菌剤のMICアッセイは、1.5ml試験管で行った。10μg/μl(1:1)〜198ng/μl(1:100)の範囲の抗菌および/または抗真菌剤の種々の希釈液をPDB培地(表−2)中で調製した。MICアッセイは、フザリウム・オキシスポルムに対して、30μl(5×106cfu/ml)の胞子懸濁液を全ての試験管に加えることにより行い、180rpmで振盪しながら28℃で2日間インキュベートした。
材料
・PDA(バレイショデキストロース寒天)プレート
・PDB(バレイショデキストロース培養液)培地
・抗菌および/または抗真菌剤保存液
・フザリウム・オキシスポルム
凍結乾燥枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)抗菌および/または抗真菌剤のMICアッセイはまた寒天拡散法によっても行った。PDAプレートに等距離で各9mm径の4つのウェルを作った。10μg(1:1)〜198ng(1:100)の範囲の抗菌および/または抗真菌剤の種々の希釈液をPDB(表−3)中で調製した。各希釈溶液の200μlアリコートを、各希釈率を表示したウェルに入れた。試験真菌フザリウム・オキシスポルムをこのPDA培地の中心に接種し、これらのプレートを28℃で4日間インキュベートした。
試験管希釈法(図12)
これらのサンプルを48時間のインキュベーション後に光学顕微鏡下で胞子発芽に関して観察した。胞子は、抗菌および/または抗真菌剤を1:1、1:2、1:3および1:4の比率で含有する試験管では発芽しなかった。抗菌および/または抗真菌剤を1:5、1:6、1:7、1:8および1:9希釈の比率で含有する試験管では、中等度の胞子発芽が見られ、抗菌および/または抗真菌剤を1:10〜1:100の比率で含有する残りの試験管では正常な胞子発芽および菌糸の形成が見られた(表−2)。
抗菌および/または抗真菌剤を1:1、1:2、1:3および1:4の比率で含有するウェルの周囲では菌糸増殖の阻害が見られた(表−3)。抗菌および/または抗真菌剤を1:5、1:6および1:7希釈の比率で含有するウェルの周囲では、中等度の阻害が見られ、残りの希釈率(1:8〜1:100)では、阻害は見られなかった(表−3)。
上記実験から、粗抽出物の粉末中の抗菌および/または抗真菌剤は胞子発芽ならびに菌糸増殖を1:4(v/v)の希釈率まで濃度依存的に阻害していることが結論付けられる。
材料
・PDA寒天プレート
・LB培養液
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体
・リゾチーム
・インキュベーター
3.4.1 枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体溶解
LB培養液は、付属書類−I(3)に記載の方法に従って調製した。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の単一コロニーを無菌LB培養液に接種し、30℃で24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション後、栄養菌体を4℃、6500rpmでの遠心分離により回収し、これらの菌体を無菌蒸留水で3回洗浄し、リゾチーム中、37℃で2時間のインキュベーションにより菌体溶解を行った。溶解後、この懸濁液を4℃、10,000rpmで10分間遠心分離して菌体残渣を除去した。上清を回収し、0.22μmフィルターに通し、4℃で保存した。
ペトリプレートのPDA寒天の対角の2端に2つのウェルを作り、一方を「試験」、他方を「対照」と表示した。溶解液の500μlアリコートを試験ウェルに加え、500μlのリゾチームのみを対照ウェルに加えた。試験真菌フザリウム・オキシスポルムをPDA寒天の中心に接種し、室温で5日間インキュベートした。
菌体溶解液は真菌フザリウム・オキシスポルムに対して抗菌および/または抗真菌活性を示さず(図15)、このことは抗菌および/または抗真菌剤が主として培地中に分泌されることを示唆する。
4.1 他の病原性真菌に対する抗菌および/または抗真菌活性の試験
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)
・植物病原性真菌
1.リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)(ナス科のメンバーの紋枯病を引き起こす)
2.サロクラジウム・オリゼ(Sarocladium oryzae)(イネに葉鞘腐敗病を引き起こす)
3.コレトトリクム・カプシシ(Colletotrichum capsicii)(トウガラシに炭疽病を引き起こす)
4.エクセロフィルム・ツルシクム(Exerohilum turcicum)(ツルシクム紋枯病を引き起こす)
5.マクロフォミア・ファセオリナ(Macrophomina phaseolina)(炭腐病を引き起こす)
・T3培養液
・T3寒天プレート
・PDA寒天プレート
・インキュベーター
4.1.1 様々な植物病原性真菌に対する枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を用いた抗菌および/または抗真菌活性の試験
白金耳1杯の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体および白金耳1杯の試験真菌を、各真菌の表示をしたT3プレートの対角上の反対側に接種し、菌体コロニーの近傍に菌糸の増殖が見られるまで28℃でインキュベートした。
抗菌および/または抗真菌剤を含有する培養濾液の500μlアリコートを、PDA寒天に作ったウェルに加え、各真菌の表示をした各プレートの他方のコーナーに白金耳1杯の試験真菌を接種し、培養濾液を含有するウェルの近傍に菌糸の増殖が見られるまで28℃でインキュベートした。
植物に病害を引き起こす一定範囲の真菌種を抗菌および/または抗真菌アッセイで試験したところ、それらは全て、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体およびまたその培養濾液の存在下で完全な増殖阻害を示した。
イネ種子をフザリウム・オキシスポルム胞子および枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養濾液で処理し、無添加寒天を含むペトリプレートに置き、発芽中の種子に対する真菌攻撃の阻害における枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)抗菌および/または抗真菌剤の有効性を確認した。
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)抗菌および/または抗真菌剤の存在下では、真菌は種子に感染できず、イネ種子は正常に発芽した。しかしながら、真菌のみで処理した種子は重度の感染を示し、発芽できなかった(図17)。
材料
・噴霧可能なフォームの1%CMC中の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)
・イネ、ワタ、タバコ、トウモロコシおよびトマト植物
・噴霧器
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養物を、一定範囲の植物種に対して、存在する場合に病原性挙動に関して包括的に試験した。
これらの観察から、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を噴霧した全ての植物種(イネ、タバコ、トウモロコシ、トマトおよびワタ)がいずれの種類の病害症状も示さなかったことが結論付けられ、それらの生育は対照植物と等しく、このことは枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)が植物種に対して非病原性であることを示す(図18)。
生物防除剤としての枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を含有する抗菌および/または抗真菌組成物の配合剤
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)
・LB培養液
・PDB(バレイショデキストロース培養液)
・リン酸バッファー(pH7.0)
・CMC(カルボキシメチルセルロース)
5.1.1 枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体懸濁液の調製
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を2L三角フラスコ中の1L無菌LB培養液に接種し、200rpmで振盪しながら30℃で24時間インキュベートした。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の増殖後、培養物を4℃、6,500rpmで10分間遠心分離した。ペレットをリン酸バッファー(pH7.0)で2回洗浄し、リン酸バッファー(pH7.0)中1%CMC(カルボキシメチルセルロース)と混合して6×107cfu/mlを含むスラリーを調製した。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を含むスラリーを、植物に噴霧し、浸漬により植物の実生の根を処理するために使用した。
材料
・枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を含むスラリー
・リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)真菌(ナス科のメンバーの紋枯病を引き起こす)
・ソイルライト
・トマト実生
リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)は、バレイショデキストロース培養液(付属書類−I(V)培地に示される方法に従って調製)中で6日間増殖させた。リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)の増殖後、それをソイルライトと十分に混合し、室温で15日間インキュベートした。真菌を含むソイルライトを土壌と1:1比で混合した。
本試験には草丈10cmのトマト実生を使用した。
本試験は下記のように行った。
A.トマト実生をリゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)を含むが枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)で処理していな土壌に植え付けた。
B.トマト実生の根を、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)を含むスラリーで処理し、リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)を含む土壌に植え付けた。
C.無処理のトマト実生。
トマト実生の根を枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体配合剤に30分間浸漬した。処理した実生を、真菌リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)と混合した土壌を含むポットに植え付けた。
実生に病害を引き起こすために、トマト実生(無処理)を、真菌リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)と混合した土壌を含むポットに植え付けた。
これらの観察から、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)と真菌リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)の組合せで処理した実生は対照植物と同等に極めて良好に生長したが、真菌リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)を含むポットに植え付けた実生(無処理)は、対照に比べて生長の遅れ、不十分な開花および果実形成を示したことが結論付けられた。ゆえに、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)は、トマト実生の根圏で真菌リゾクトニア・ソラニ(NFCCI−3194)の増殖を阻害し、病害を引き起こす真菌から実生を保護したと結論付けることができる(図19)。
6.1 土壌および種実伝染性の真菌病原体ペニシリウム・オクサリクム)(NFCCI−1997)による発芽中のトウモロコシ種実の感染を防除することができる枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体の最小数のin vitro評価
6.1.1 細菌および真菌懸濁培養物の調製
材料
a.枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)
b.ペニシリウム・オクサリクム(NFCCI−1997)−植物病原性真菌
c.カルベンダジムWP50(市販の殺真菌剤)
d.Luria Bertani培養液(LB)
6.1.1.1 枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の懸濁培養物の調製
枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)の純粋コロニー(図20−1)を10mlのLB培養液に接種し、30℃で24時間、180rpmでインキュベートした。生物防除配合剤の調製については、1mlの新鮮培養物を100mlのLB培養液に接種し、30℃で24時間、180rpmでインキュベートした。培養物の増殖は625nmでの培養物の吸光度を周期的に測定することにより経過観察した。菌体を遠心分離により回収し、4℃、5500rpmで10分の遠心分離により無菌リン酸バッファーで洗浄した。最終的に菌体を5mlの無菌リン酸バッファーに懸濁させた。この濃縮懸濁液を生物防除配合剤の調製に使用した。
ペニシリウム・オクサリクム(NFCCI−1997)の純粋コロニー(図20−2)をPDAプレートに接種し、胞子形成まで28℃でインキュベートした。白金耳1杯の真菌胞子を100mlのPDBに接種し、28℃で7日間、180rpmでインキュベートした。真菌胞子を含む培養物の水性部分を50mlポリプロピレン試験管に採取した。これらの胞子を4℃、8000rpmで10分の遠心分離により無菌リン酸バッファーで洗浄した。胞子を必要な容量の無菌リン酸バッファーに、cfuが6×104ml−1となるように懸濁させた。
土壌媒体に十分な真菌胞子量を維持するために、50ml真菌胞子懸濁液(6×104cfu/ml)をオートクレーブにかけた1kgのソイルライトと混合し、28℃で10日間インキュベートした。真菌が定着したソイルライトを土壌と1:1比で均一に混合し、96カップトレイに充填した。
材料
a.CMC(カルボキシメチルセルロース)
b.スクロース
c.レッドポリマー(殺真菌剤不含)
d.枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体懸濁液(生物防除剤)
e.カルベンダジム(市販の殺真菌剤)
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、およびレッドポリマーから構成される。この配合剤は生物防除剤、病害誘導因子および殺真菌剤を含まない。この配合剤で処理した種実を対照種実として用いた。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、およびレッドポリマーから構成される。この配合剤は生物防除剤/市販の殺真菌剤を含まないが、この配合剤で処理した種実をP.オキサリクム(NFCCI−1997)真菌を接種した土壌に播種した。種実周囲には生物学的保護も化学的保護もないので、真菌は旺盛に増殖し、種実に感染し、実生に病害が発生する。この配合剤で処理した種実を病害対照として用いた。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、レッドポリマーおよび市販の殺真菌剤カルベンダジムWP50(商標バビスチン)から構成され、500μg/mlの濃度で使用した(Mohiddinら,2013)。この配合剤は、発芽中の種実の近傍の真菌増殖の抑制における生物防除剤および市販の殺真菌剤の両方の効果を比較するために用いた。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、レッドポリマーおよび5×104cfu/ml濃度の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体から構成される。この配合剤は最小数の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を含む。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、レッドポリマーおよび5×105cfu/ml濃度の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体から構成される。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、レッドポリマーおよび5×106cfu/ml濃度の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体から構成される。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、レッドポリマーおよび5×107cfu/ml(5000万菌体/ml担体)濃度の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体から構成される。この配合剤は最大数の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を含む。
この配合剤は、1%CMC、2%スクロース、レッドポリマーおよび5×107cfu/ml濃度の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体から構成される。この配合剤は、最大数の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を含み、種子発芽および植物生長に対する生物防除剤の効果を検討するために用いた。
上記に示す組成に従う生物防除配合剤をトウモロコシ種実にコーティングした(図21)。各処理に対して3反復で20粒のトウモロコシ種実(合計60粒)を0.1%HgCl2で10分間表面殺菌し、各10分間、95%エタノールですすぎ、無菌水で洗浄した。乾燥した種実を171μl/60粒の種々の配合剤でコーティングし、2時間風乾した。
処理した全ての種実を96カップトレイに、各処理3反復で播種した。全てのトレイを温室で保持し、管理された条件下で維持した。種実発芽以降から5週間まで、これらのトレイを経過観察した。
発芽パーセンテージ
全ての種実処理の発芽パーセンテージを播種1週間後に記録した。
病害発生率は、播種4週間のパーセンテージとして記録した。病害発生率の記録のために使用した式(Hoffmanら,2002)は次の通りである:
種実発芽および実生生存率
配合剤−3(対照−3)、4c、1(対照−1)、4b、4dおよび5で処理した種実でそれぞれ、最適な種実発芽、すなわち、93.33%、96.66%、100.00%、100.00%、100.00%および100.00%、次いで、配合剤−4aおよび2(対照−2)で処理した種実で83.33%、33.33%が記録された。播種4週間後の実生生存率は、配合剤−3(市販の殺真菌剤を含む)で処理した種実以外の上記全ての配合剤で処理した種実で100.00%と記録され、これは明らかに、市販の殺真菌剤「カルベンダジムWP50」は、真菌増殖の抑制に有効であったとしても100.00%の効果は無いことを示す。種々の濃度(最小数の菌体を含む配合剤4a以外)の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を含む配合剤は、土壌中に存在するP.オキサリクム(NFCCI−1997)からの種実の保護に100.00%有効であることが分かった。
本試験の結果は、処理間に有意差があったことを示した。配合剤1、4b、4c、4dおよび5で処理した種実はいずれの病害症状も示さず、対照実生と同様の健康な生長を示し、このことは、これらの配合剤中に存在する生物防除剤枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)が真菌P.オキサリクム(NFCCI−1997)の増殖および病原性を大幅に抑制し、従って、種実を真菌感染から保護したことを示す。配合剤−3(市販の殺真菌剤カルベンダジム50WPを含む)で処理した種子は3.57%の病害発生率を示し、このことは、市販の殺真菌剤は真菌増殖の抑制に有効であったが、本試験で用いた生物防除剤ほど良好でなかったことを示す。
上記の結果は、5×105cfu/ml濃度の枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)(配合剤−4b)は真菌病原体の増殖の抑制に有効であり、トウモロコシの発芽実生に100%の保護を与えることを明らかに示す。ゆえに、この生物防除剤は、土壌伝染性の病原性真菌P.オキサリクム(NFCCI−1997)の有効な防除のための種実のコーティングに首尾良く使用できる。
材料および方法
材料
1.6.1.3(4b)に記載の配合剤で処理したトウモロコシ、トマトおよびナスの種子。
2.トウモロコシ、トマトおよびナスの対照種子。
種子のコーティング
トウモロコシ、トマトおよびナスの種子を6.1.3(4b)に記載の配合剤で処理し、風乾した。
トウモロコシ、トマトおよびナスの処理および無処理(対照)の種子(各3反復、各反復は23種子を含む)を面積4平方メートルの圃場に播種した。植物間20cmおよび畝間60cmの距離の標準的な空間寸法を維持した。適当な農学慣行に従ってこれらの作物を登熟まで生育させた。
圃場条件下で植物生長パラメーターおよび収量に有意な増加が見られた。枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)菌体を含む配合剤でコーティングした種子は、トウモロコシ、ナスおよびトマトの収量をそれぞれ17.60、37.15および1.58%増大させた(表−7)。トウモロコシ、ナスおよびトマト植物は、より高い生育率およびバイオマス蓄積率を示した(処理および無処理トウモロコシの差異の代表的な写真を図25に示す)。植物生長促進剤に関する初期の報告には、枯草菌を含む配合剤は植物の生長を増大させ、かつ、60種の異なるタイプの二次代謝産物を生産することにより、病害保護のための全身耐性を誘導したことも報告されている(Compantら,2005およびMohan Kumarら,2015)。
7.1 ヒト病原性真菌の増殖を阻害する抗真菌/抗菌剤の有効性のスクリーニング
ヒトに疾患を引き起こす一定範囲の真菌種を様々な皮膚および肺感染を患う人から単離した。抗真菌および/または抗菌活性を単離されたヒト病原性真菌の全てに対して試験した。
材料
1.ペニシリウム亜種
2.アスペルギルス・フラブス
3.アスペルギルス・ニガー
4.アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)
5.PDAプレート
6.枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)から単離された抗真菌/抗菌剤
抗菌および/または抗真菌剤を含む培養濾液の500μlアリコートを、PDA寒天に作ったウェル中に加え、各真菌の表示をした各プレートの他方のコーナーに白金耳1杯の試験真菌を接種し、培養濾液を含有するウェルの近傍に菌糸の増殖が見られるまで28℃でインキュベートした。
ヒトに疾患を引き起こす一定範囲の真菌種を様々な皮膚者および肺感染を患う人から単離し、抗菌および/または抗真菌アッセイで試験したところ、それらは全て、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)培養濾液の存在下で完全な増殖阻害を示した(図24)。
これらの所見から、枯草菌亜種シリラメンシス(MTCC−5674)から単離された抗真菌/抗菌剤は医薬適用にも使用可能であると結論付けられた。
1. Compant , S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C. and Barka, E.A. (2005). Use of plants growth promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, Mechanisms of action, and future prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71:4951-4959. Sci. World J., Vol 2012, pp. 001-012.
2. Hoffmann, W.A. and Poorter, H. 2002. Avoiding Bias in Calculations of Relative Growth Rate. Ann. Bot., Vol.90 (1), pp. 37-42.
3. Li, J. Yang, Q. Zhao, L-H, Zhang, S.M., Wang, Y.X. Xiao-yu and Zhao, X.Y. 2009. Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29. J. Zhejiang Univ. Sci. B.,Vol.10 (4) pp. 264-272.
4. Malusa, E. Sas-Paszt, L. and Ciesielska, J. 2012. Technologies for Beneficial Microorganisms Inocula Used as Biofertilizers.
Mena-Violante, H.G. and Olalde-Portugal, V. 2007. Alteration of tomato fruit quality by root inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Bacillus subtilis BEB-13bs. Sci. Hort.,Vol.1 (113), pp. 103-106.
6. Mohan Kumar, S.P., Chowdappa, P. and Krishna, V. (2015). Development of seed coating formulation using consortium of Bacillus subtilis OTPB1 and Trichoderma harzianum OTPB3 for plant growth promotion and induction of systemic resistance in field and horticultural crops. Indian Phytopath. 68 (1):25-31.
7. Mohiddin, F. A. and Khan, M. R. 2013. Tolerance of fungal and bacterial bio-control agents to six pesticides commonly used in the control of soil borne plant pathogens. Global J. Pests, Dis. Crop Prot., Vol. 1 (1), pp. 001-004.
関連特許
1. A novel strain of Bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm. (EP981540A1).
2. Strain of Bacillus subtilis for agricultural use. (WO2009031874A1).
3. Antifungal Bacillus subtilis and a microorganism wettable powder containing the same (KR2011075132A).
使用した培養培地の組成
注: 培地調製の一般法を以下に示す。下記に示す培地組成は全て100ml容量に関するものである。組成は必要量に応じて変わる。
T3培地の組成
全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含む容器を121℃で15分間オートクレーブにかけた。
T3培地の組成
全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を121℃で15分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌ペトリプレートに注いだ。
LB培地の組成
全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含む容器を121℃で15分間オートクレーブにかけた。
LB培地の組成
全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を121℃で15分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌ペトリプレートに注いだ。
PDB培地の組成
50mlの蒸留水を含む250mlガラス瓶にバレイショ粉末(2.0g)を秤り取り、5分間煮沸した。煮沸したバレイショ水を、モスリン布を用いて濾過した。濾液を新しい250mlガラス瓶に回収し、それに2.0gのデキストロースを加えた。総容量を100mlとした後に、培地を含む瓶を121℃で15分間オートクレーブにかけた。
PDA培地の組成
50mlの蒸留水を含む250mlガラス瓶にバレイショ粉末(2.0g)を秤り取り、5分間煮沸した。煮沸したバレイショ水を、モスリン布を用いて濾過した。濾液を新しい250mlガラス瓶に回収し、それに2.0gのデキストロースおよび2.0gの寒天を加えた。総容量を100mlとした後に、培地を含む瓶を121℃で15分間オートクレーブにかけた。融解したPDAを無菌ペトリプレートに注いだ。
OFBM培地の組成
全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を121℃で15分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌培養試験管に注いだ。
SIM培地の組成
全ての培地成分をガラス瓶に秤り取り、蒸留水に溶かした。培地を含むガラス瓶を121℃で15分間オートクレーブにかけた。オートクレーブ後、培地を無菌培養試験管に注いだ。
リン酸バッファーの調製
両リン酸塩をガラスビーカーに取り、塩に50mlの蒸留水を加え、マグネチックバーを用いてマグネチックスターラーで撹拌した。リン酸塩が完全に溶けたことを確認した後、その溶液を蒸留水で100mlとした。
試験に使用した担体および他の薬剤
Claims (13)
- 抗菌および/または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を示す新規細菌である、受託番号(MTCC−5674)を有する枯草菌亜種シリラメンシス。
- 抗菌および/または抗真菌活性を示す、請求項1に記載の枯草菌亜種シリラメンシスの培養濾液由来の抽出物。
- 請求項1に記載の枯草菌亜種シリラメンシスの純粋培養物。
- 生産のプロセスが
a.受託番号(MTCC−5674)を有する枯草菌亜種シリラメンシスを、振盪インキュベーター内、30℃で60時間、pH6.8のT3培地中で増殖させること、
b.抗菌および/または抗真菌活性を有する抽出物を回収すること
を含む、請求項2に記載の培養濾液由来の抽出物。 - 前記枯草菌亜種シリラメンシスが好気条件下で増殖される、請求項2に記載の培養濾液由来の抽出物。
- 任意選択により前記培養濾液由来の抽出物を従来の方法を用いて濃縮することを含む、請求項2に記載の培養濾液由来の抽出物。
- 組成物が5×105cfu/ml〜5×107cfu/mlの細菌濃度で抗菌および/または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を有する、請求項1に記載の枯草菌亜種シリラメンシスを含む組成物。
- 組成物が4μg/μl〜20μg/μlの抽出物濃度で抗菌および/または抗真菌活性を有する、請求項2に記載の培養濾液由来の抽出物を含む組成物。
- 組成物が抗菌および/または抗真菌活性ならびに植物生長促進活性を有する、請求項1に記載の枯草菌亜種シリラメンシスおよび請求項2に記載の培養濾液由来の抽出物を含む組成物。
- 任意選択により1種類以上の抗菌および/または抗真菌ならびに植物生長促進剤を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 任意選択により農業上許容される担体を含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 病原性真菌および/または細菌の増殖を阻害するための方法であって、病原性真菌および/または細菌を5×105cfu/ml〜5×107cfu/mlの有効量の、請求項1に記載の枯草菌亜種シリラメンシスまたは請求項7〜11のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 病原性真菌および/または細菌の増殖を阻害するための抗菌および/または抗真菌ならびに植物生長促進組成物の調製にいずれの場合にも使用される、請求項1もしくは2に記載の枯草菌亜種シリラメンシスもしくは培養濾液由来の抽出物または請求項7〜11のいずれか一項に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN2331DE2014 | 2014-08-16 | ||
IN2331/DEL/2014 | 2014-08-16 | ||
PCT/IN2015/000294 WO2016027279A1 (en) | 2014-08-16 | 2015-07-21 | Novel bacterium of bacillus genus and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017525356A JP2017525356A (ja) | 2017-09-07 |
JP6598086B2 true JP6598086B2 (ja) | 2019-10-30 |
Family
ID=55610090
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017507440A Active JP6598086B2 (ja) | 2014-08-16 | 2015-07-21 | バチルス属の新規細菌およびその使用 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10327448B2 (ja) |
EP (1) | EP3180420B1 (ja) |
JP (1) | JP6598086B2 (ja) |
CN (1) | CN107075459B (ja) |
AP (1) | AP2017009761A0 (ja) |
AR (1) | AR104079A1 (ja) |
AU (1) | AU2015304820B2 (ja) |
BR (1) | BR112017003182B1 (ja) |
CA (1) | CA2957697C (ja) |
IL (1) | IL250450B (ja) |
MX (1) | MX2017002067A (ja) |
MY (1) | MY194066A (ja) |
PH (1) | PH12017500257A1 (ja) |
RU (1) | RU2689530C2 (ja) |
SG (2) | SG10202108611PA (ja) |
WO (1) | WO2016027279A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107683090A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-02-09 | 有机科技农业株式会社 | 利用抗菌剂、农药、微生物的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌 |
WO2020018694A1 (en) * | 2018-07-18 | 2020-01-23 | The Regents Of The University Of California | Bacteria from medicago root nodules as plant probiotic bacteria for agriculture |
CN109022318B (zh) * | 2018-08-15 | 2021-08-20 | 龙海市农丰源肥料有限公司 | 枯草芽孢杆菌l1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用 |
CN111560324B (zh) * | 2019-01-28 | 2022-09-20 | 福建省农业科学院农业生物资源研究所 | 一种促生解磷固氮的芽孢杆菌及其应用 |
RU2764695C1 (ru) * | 2020-12-08 | 2022-01-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма" | Штамм бактерий Bacillus subtilis subsp. subtilis - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней |
WO2024075782A1 (ja) * | 2022-10-05 | 2024-04-11 | 住友化学株式会社 | 安定化有害生物防除剤、及び、安定化有害生物防除剤の製造方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62135494A (ja) * | 1985-12-09 | 1987-06-18 | Kibun Kk | P19物質及びその製造法 |
RU2094990C1 (ru) * | 1993-07-08 | 1997-11-10 | Амбросов Валерий Антонович | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент вещества, обладающего противогрибковой активностью |
US5589381A (en) * | 1994-06-30 | 1996-12-31 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Bacillus licheniformis producing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi |
WO1997002749A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-30 | Rutgers University | Bacillus licheniformis producing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi |
US6103228A (en) * | 1997-05-09 | 2000-08-15 | Agraquest, Inc. | Compositions and methods for controlling plant pests |
SK283036B6 (sk) * | 1997-05-09 | 2003-02-04 | Agraquest, Inc. | Biologicky čistá kultúra kmeňa Bacillus subtilis, metabolit, supernatant, prostriedok a spôsob ochrany alebo ošetrenia rastlín a plodov |
US6896883B2 (en) * | 1997-07-22 | 2005-05-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Biocontrol for plants with Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, and Sporobolomyces roseus |
US6015553A (en) * | 1997-08-22 | 2000-01-18 | Agraquest, Inc. | Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests |
AUPP589798A0 (en) | 1998-09-14 | 1998-10-08 | Charles Sturt University | Novel bacterial strains and methods of controlling fungal pathogens |
JP3140430B2 (ja) * | 1999-03-09 | 2001-03-05 | 株式会社 バイテク | バチルス属微生物とその用途 |
KR100587447B1 (ko) * | 2004-03-24 | 2006-06-12 | 한국화학연구원 | 바실러스 서브틸리스 eb120 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는방법 |
US7211428B1 (en) * | 2004-05-18 | 2007-05-01 | Council Of Scientific And Industrial Research | Strain of Bacillus as a bioinoculant |
CN101084318A (zh) * | 2005-11-04 | 2007-12-05 | 株式会社Ahc | 抗菌活性物质dm0507及其应用 |
ES2306600B1 (es) * | 2007-03-19 | 2009-06-17 | Probelte, S.A. | Un cultivo puro de la cepa ah2 de la especie bacillus velezensis y producto para el control biologico de hongos fitopatogenos y estimulador del crecimiento vegetal. |
WO2009031874A1 (es) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Jorge Olmos Soto | Cepa de bacillus subtilis para uso agrícola |
US20100143316A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Taiwan Agricultural Chemicals And Toxic Substances Research Institute, | Novel strain of bacillus amyloliquefaciens and its use |
KR101181756B1 (ko) | 2009-12-28 | 2012-09-11 | 효성오앤비 주식회사 | 항진균성 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 포함하는 미생물 수화제 |
CN102786581A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-11-21 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 侧孢短芽孢杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用 |
WO2013165607A1 (en) * | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Novel bacillus amyloliquefaciens strain bac03 and methods of using same |
US9125419B2 (en) * | 2012-08-14 | 2015-09-08 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Bacillus sp. strain with antifungal, antibacterial and growth promotion activity |
KR101390457B1 (ko) * | 2013-08-29 | 2014-04-29 | 강원대학교산학협력단 | 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ebn-tk3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균제 |
-
2015
- 2015-07-21 EP EP15834463.0A patent/EP3180420B1/en active Active
- 2015-07-21 MX MX2017002067A patent/MX2017002067A/es unknown
- 2015-07-21 RU RU2017108599A patent/RU2689530C2/ru active
- 2015-07-21 AU AU2015304820A patent/AU2015304820B2/en active Active
- 2015-07-21 CA CA2957697A patent/CA2957697C/en active Active
- 2015-07-21 CN CN201580056277.9A patent/CN107075459B/zh active Active
- 2015-07-21 AP AP2017009761A patent/AP2017009761A0/en unknown
- 2015-07-21 SG SG10202108611PA patent/SG10202108611PA/en unknown
- 2015-07-21 US US15/503,941 patent/US10327448B2/en active Active
- 2015-07-21 MY MYPI2017700491A patent/MY194066A/en unknown
- 2015-07-21 JP JP2017507440A patent/JP6598086B2/ja active Active
- 2015-07-21 BR BR112017003182-5A patent/BR112017003182B1/pt active IP Right Grant
- 2015-07-21 WO PCT/IN2015/000294 patent/WO2016027279A1/en active Application Filing
- 2015-07-21 SG SG11201700821TA patent/SG11201700821TA/en unknown
- 2015-08-12 AR ARP150102600A patent/AR104079A1/es unknown
-
2017
- 2017-02-05 IL IL25045017A patent/IL250450B/en active IP Right Grant
- 2017-02-10 PH PH12017500257A patent/PH12017500257A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2015304820B2 (en) | 2018-07-19 |
RU2017108599A3 (ja) | 2018-09-17 |
CN107075459B (zh) | 2021-03-02 |
EP3180420A1 (en) | 2017-06-21 |
CA2957697C (en) | 2021-04-13 |
IL250450A0 (en) | 2017-03-30 |
AR104079A1 (es) | 2017-06-28 |
EP3180420A4 (en) | 2017-12-27 |
WO2016027279A1 (en) | 2016-02-25 |
EP3180420B1 (en) | 2020-10-21 |
US20170231230A1 (en) | 2017-08-17 |
MY194066A (en) | 2022-11-10 |
JP2017525356A (ja) | 2017-09-07 |
BR112017003182B1 (pt) | 2023-05-09 |
SG10202108611PA (en) | 2021-09-29 |
MX2017002067A (es) | 2017-05-04 |
US10327448B2 (en) | 2019-06-25 |
CA2957697A1 (en) | 2016-02-25 |
CN107075459A (zh) | 2017-08-18 |
RU2017108599A (ru) | 2018-09-17 |
IL250450B (en) | 2019-10-31 |
RU2689530C2 (ru) | 2019-05-28 |
PH12017500257A1 (en) | 2017-07-10 |
AP2017009761A0 (en) | 2017-02-28 |
AU2015304820A1 (en) | 2017-03-09 |
BR112017003182A2 (pt) | 2017-11-28 |
SG11201700821TA (en) | 2017-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Myo et al. | Evaluation of Bacillus velezensis NKG-2 for bio-control activities against fungal diseases and potential plant growth promotion | |
JP6598086B2 (ja) | バチルス属の新規細菌およびその使用 | |
Abdullah et al. | Biological control of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary with Trichoderma harzianum and Bacillus amyloliquefaciens | |
KR101569737B1 (ko) | 벼 근권에서 분리된 신규 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 및 이를 이용한 천연식물 보호 및 식물 강화제 개발 | |
Bacon et al. | Abiotic and biotic plant stress-tolerant and beneficial secondary metabolites produced by endophytic Bacillus species | |
JP5567634B2 (ja) | バチルスバリスモルティスbs07m菌株、微生物製剤、及び作物育成方法 | |
KR101905045B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 ygb70 균주 및 이를 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제 | |
TW201428097A (zh) | 具有抗真菌及抗細菌功效與促生活性之芽孢桿菌品種 | |
KR101379708B1 (ko) | 바실러스 아밀로리쿼페이션스 eml-cap3, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 식물병 방제방법 | |
KR101346698B1 (ko) | 식물병원성 세균 및 진균을 방제하는 기능과 약제 다제내성 세균에 대한 억제활성이 있는 바실러스 메틸로트로피쿠스 eml-cap7 | |
KR20140127670A (ko) | 식물 내생세균 바실러스 메칠로트로피쿠스 yc7007 균주 및 이를 이용한 다기능 생물농약 및 미생물비료 개발 | |
Benaissa et al. | Antagonistic effect of plant growth promoting rhizobacteria associated with Rhus tripartitus on gram positive and negative bacteria. | |
US10980242B2 (en) | Xylaria grammica EL 000614 strain having nematicidal activity against root knot nematode and uses thereof | |
JP2019142847A (ja) | 植物病害防除剤 | |
KR20110120748A (ko) | 신규한 미생물 바실러스 아밀로리큐파션스 씨피 1 및 이를 이용한 딸기 탄저병균의 방제방법 | |
KR20180091598A (ko) | 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ak―0 균주 및 이를 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제 | |
Hernández-Hernández et al. | In vitro characterization of rhizobacteria and their antagonism with fungi that cause damping off in chili | |
RU2422511C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Brevibacillus laterosporus, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ШИРОКИЙ СПЕКТР БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ | |
KR101406823B1 (ko) | 바실러스 속 cs-52 균주 및 이를 이용한 고추 탄저병의 방제 | |
KR20190052847A (ko) | 식물병 방제효과 및 식물 생장 촉진 활성을 가지는 세라시아 sp. KUDC3025 균주, 및 이의 이용 | |
CN112226387B (zh) | 一株白色杆菌及其在防治玉米茎基腐病中的应用 | |
KR20180117322A (ko) | 신규한 셀라티아 에스피 im2 균주, 및 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 | |
KR20180105460A (ko) | 산양삼 뿌리로부터 분리한 인삼 식물병 원인균에 대해 항균 활성을 가지는 버크홀데리아 스타빌리스 pg159 균주 및 이의 용도 | |
JP6824519B2 (ja) | ダイズ黒根腐病防除剤、ダイズ黒根腐病を抑制する微生物資材、及びダイズ黒根腐病防除方法 | |
KR101887987B1 (ko) | 신규 박테리오파지 acp17 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170410 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170619 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170926 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180522 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180814 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180814 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181218 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190318 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190416 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190624 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190820 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190919 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6598086 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |