KR102097121B1 - 테레인을 유효성분으로 포함하는 그람음성균의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 테레인을 유효성분으로 포함하는 그람음성균의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 테레인은 병독성 인자의 생성 및 생물막 형성을 효과적으로 저해하여 병원성 미생물의 항생제 감수성을 증진시키는 효과가 있으므로, 살균제 또는 병원성 미생물에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 보조제로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

테레인을 유효성분으로 포함하는 그람음성균의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도{Composition for inhibiting biofilm formation of Gram-negative bacteria comprising terrein as effective component and uses thereof}
본 발명은 테레인을 유효성분으로 포함하는 그람음성균의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 반코마이신 내성 장구균(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE), 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA) 등의 그람양성 슈퍼박테리아 치료제로서 최근 새로운 항생제가 개발되고 있으나, 그람음성균의 마지막 항생제인 카바페넴(carbapenem)에 내성을 보이는 다제내성 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 그람음성 슈퍼박테리아용 치료제는 개발되고 있지 않은 실정이다. 이에 따라 그람음성 슈퍼박테리아에 대한 신규한 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 대표적인 그람음성균 슈도모나스 애루지노사는 병독성 인자(virulent factor)를 생산하여 숙주세포를 침투하고, 생물막(biofilm)을 형성하여 항생제의 투과를 어렵게 하기 때문에, 병독성 인자 및 생물막은 그람음성균 감염에 따른 치료의 신규한 타겟으로 주목받고 있다. 슈도모나스 애루지노사가 생산하는 병독성 인자로는 엘라스타제(elastase, LasB), 피오시아닌(pyocyanin) 및 람노리피드(rhamnolipid) 등이 알려져 있는데, 이들 병독성 인자 중 특히 엘라스타제와 피오시아닌은 숙주세포 침투(invasion)시에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌기 때문에, 이들 병독성 인자를 신규의 그람음성균 치료제의 표적으로 삼고 있다.
미생물은 일정 수준의 세포농도에 도달하면 자신들의 의사소통을 위한 정보전달물질을 생산하여 세포들 간에 신호를 전달하고 이를 통해 특정 유전자의 발현을 조절한다. 이와 같이 개체 밀도 증감을 감지해 유전자 발현을 조절하는 기작을 정족수 인식(quorum sensing, QS)이라 한다. 정족수 인식 기작은 각각의 미생물 개체들이 자가유도 물질(autoinducer, AI)과 같은 저분자의 신호전달 물질들을 세포농도에 의존적으로 세포 외부 환경 중에 축적하여 활발한 증식을 유도하고 일정 정족수를 채워 유전자 발현을 유도하는 일종의 조절기구이다.
미생물들의 의사소통에 의한 대표적인 현상이 생물막(biofilm)이다. 생물막은 미생물의 대사과정에서 만들어지는 세포의 고분자 물질과 미생물이 결합하여 형성된 표면상의 부드러운 점액층을 말한다. 미생물이 다양한 무생물 및 생물체의 표면에 부착하여 생물막을 형성하고 군집을 이루는 경우 영양분의 부족, 독성물질의 노출, 산성도의 변화, 산화적 충격, 강력한 항생제의 노출과 같은 환경 스트레스에 의한 저항성이 현저히 증가 된다고 알려져 있으며 병원균 또는 잠재적인 병원균에 의해 생성되는 생물막은 고질적인 감염의 중요한 원인으로 생각되며 특히 의료 장비의 표면이나 인체 내부의 유지 장치에서도 생물막을 형성하고 견디는 능력 때문에 중요한 감염의 원인으로 생각된다.
한편, 한국등록특허 제1539977호에는 '테레인을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0586814호에는 '멜라닌 생합성 저해 활성을 갖는 테레인 화합물 및 그의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 테레인을 유효성분으로 포함하는 그람음성균의 생물막 형성 억제용 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 병독성 인자(virulence factor) 및 생물막을 타겟으로 새로운 항생제 탐색연구를 수행한 결과, 토양 곰팡이 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)에서 분리한 테레인 화합물이 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에서 엘라스타제(elastase), 피오시아닌(pyocyanin) 및 람노리피드(rhamnolipid)의 생성을 억제하였으며 슈도모나스 애루지노사의 생물막 형성도 저해함을 발견하였고, 예쁜꼬마선충 및 생쥐 감염모델에서 병원균의 감염을 억제하는 효능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 테레인 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물의 병독성 인자(virulence factor) 생성 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병원성 미생물에 대하여 정족수 인식(quorum sensing) 억제 활성을 갖는 테레인 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물의 생물막(biofilm) 형성 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 병원성 미생물과 접촉시켜 생물막 형성을 억제하는 단계를 포함하는 병원성 미생물의 생물막 형성 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 테레인 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물의 감염시 항생제 감수성을 증가시키기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 테레인은 그람 음성균인 슈도모나스 애루지노사에 대해 직접적인 항균 활성은 없으나, 상기 미생물의 병독성 인자의 생성 및 생물막 형성을 효과적으로 저해함으로써, 미생물의 항생제 감수성을 증진시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 테레인은 살균제 또는 병원성 미생물에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 보조제로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 슈도모나스 애루지노사의 병독성 인자 생성 및 생물막 형성에 대한 테레인의 저해 활성을 확인한 것으로, a는 테레인과 퓨라논 C-30(생물막 형성 저해제)의 화학식 구조를 나타내는 것이고, b는 테레인 처리 농도에 따른 병독성 인자들의 생성량을 확인한 결과이고, c는 테레인 처리 농도에 따른 생물막 형성도를 확인한 결과이고, d는 생물막의 항생제 내성에 대한 테레인의 영향을 분석한 결과이다. Cip: ciprofloxain, *p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001.
도 2는 테레인의 화학적 안정도를 확인한 결과이다.
도 3은 테레인의 in vivo 감염 억제 활성을 확인한 결과로, a와 b는 각각 꼬마선충과 생쥐에서 슈도모나스 애루지노사에 대한 테레인의 감염 억제 활성을 확인한 결과이다. PAO1: Pseudomonas aeruginosa PAO1 균주.
도 4는 테레인의 정족수 인식(QS) 신호전달물질의 생산 및 QS 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 유의성 분석은 DMSO 처리구와 비교하여 a는 *p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001을 의미하며, b는 *p<0.001, **p<0.0001을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 테레인(terrein) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물의 병독성 인자(virulence factor) 생성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 테레인은 토양 곰팡이 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus) 추출물로부터 분리된 것으로, 하기 화학식 1의 구조로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112018064798311-pat00001
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 염은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 염산염, 황산염 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 병독성 인자 생성 억제용 조성물에 있어서, 상기 병원성 미생물은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티커스(V. parahaemolyticus), 엔테로페쏘제닉 에스체리키아 콜리(enteropathogenic Escherichia coli), 엔테로헤모라직 에스체리키아 콜리(enterohaemorrhagic E. coli), 엔테로톡시제닉 에스체리키아 콜리(enterotoxigenic E. coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 또는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 등의 그람음성균일 수 있고, 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에 있어서, 상기 병독성 인자는 엘라스타제(elastase), 피오시아닌(pyocyanin) 또는 람노리피드(rhamnolipid) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "병독성 인자(virulence factor)"는 병원체가 가진 독력을 가진 모든 종류의 물질(단백질, 지질다당류, 협막, 편모, 항포식인자, 효소 등)을 의미하며, 병원성 인자, 독력 인자 또는 독성 인자와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 병원성 미생물에 대하여 정족수 인식(quorum sensing) 억제 활성을 갖는 테레인 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물의 생물막(biofilm) 형성 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 생물막 형성 억제용 조성물에 있어서, 상기 병원성 미생물은 바람직하게는 그람음성균일 수 있고, 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "정족수 인식(quorum sensing)"은 세균 사이의 의사소통으로 특정한 화학물질(autoinducer)을 이용하여 생물막 형성, 이차대사물의 생성, 생물발광(bioluminescence), 스트레스 반응 및 운동성 등을 비롯한 다양한 표현형이 나타나는 것을 의미하며, "생물막"은 미생물이 스스로 분비한 다량체 기질(polymeric matrix) 속에 형성된 미생물들의 집합체로서, 고체 표면 위에 막 형태로 형성되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 테레인은, 미생물 간의 의사소통을 방해하는 정족수 인식 억제 활성이 있어, 미생물의 번식과 생물막의 형성을 효과적으로 차단할 수 있는 것이 특징이다. 따라서, 본 발명의 테레인 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 세균의 감염을 차단하거나 생물막의 형성을 방지할 필요가 있는 가정, 환경, 의료 및 산업 분야에 걸쳐 폭넓게 사용될 수 있다. 예를 들면, 각종 의학기구, 의학장비, 의학시설/설비와 같은 물건은 물론 상피세포, 뼈, 치아, 및 혈관내벽 등을 포함하는 각종 생체 조직/기관과 같은 생체조직 및 생체에 적용되는 각종 인공 삽입 보형물에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 생물막 형성 억제용 조성물은 생물막 형성의 방지 또는 저해에 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 효과적인 양은 생물막을 형성하는 미생물의 종류, 처리하는 표면의 종류 및 그 면적, 및 목적하는 생물막 형성의 감소정도, 처리 시점 등을 포함하는 조건에 맞추어 결정될 수 있으며, 당업자라면 본 발명의 기재 및 표적 미생물의 생물막 형성에 관한 지식을 근거로 적절한 농도를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 실시예에 기재된 생물막 형성 측정 방법으로 측정 시 처리 전과 비교하여 목적에 따라, 생물막 형성이 약 100%, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 50% 이상, 약 45% 이상, 약 40% 이상, 약35% 이상, 약 30% 이상, 약 25% 이상, 약 20% 이상의 감소에 필요한 양을 일컫는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 생물막 형성 억제용 조성물은 가정, 산업, 의학, 및 환경분야에서의 구체적인 목적에 맞추어 다양한 형태로 제조될 수 있고, 바람직하게는 소독제의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 생물막 형성 억제용 조성물을 병원성 미생물과 접촉시켜 생물막 형성을 억제하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물의 생물막 형성 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 생물막 형성 억제용 조성물은 미생물과 직접적으로 접촉시키거나 또는 미생물이 증식할 수 있는 또는 증식하고 있는 표면에 처리하여, 생물막의 형성을 미리 예방하거나, 또는 억제할 수 있고, 이에 따라 미생물의 병원성을 떨어뜨릴 수 있다. 상기 미생물과의 접촉은 물건의 표면을 본 발명의 조성물로 처리하는 것을 포함한다. 본 발명의 생물막 형성 억제용 조성물은 상기에서 언급한 바와 같이 목적하는 생물막 형성의 저해에 유효한 양으로 처리될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 사료첨가제는 병독성 인자의 생성 억제 및/또는 생물막 형성 억제 효과가 있는 테레인을 유효성분으로 포함하고 있어, 기초사료에 일정 비율로 첨가하여 사용하면, 종래의 항생제 사용량을 절감할 수 있고, 유해한 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레늄 등으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 테레인 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물의 감염시 항생제 감수성을 증가시키기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 병원성 미생물은 그람음성균일 수 있고, 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "항생제 감수성"이란, 하나의 미생물이 특정 항생제에 대하여 효과적으로 반응함으로써, 결과적으로는 사멸되는 특성을 의미한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 병원성 미생물에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 보조제로 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 병원성 미생물의 감염이 의심되는 인간을 제외한 개체에 상기 약학 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물에서 항생제에 대한 감수성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 미생물의 병독성 인자의 생성 및 생물막 형성을 효과적으로 저해함으로써, 미생물의 항생제 감수성을 증진시키는 효과가 있는 테레인을 유효성분으로 포함하고 있으므로, 상기 약학 조성물을 미생물의 감염이 의심되는 개체에 처리할 경우, 감염된 미생물의 병원성 인자 생성을 저해하고 생물막 형성을 억제함으로써 상기 미생물의 병원성을 감소시켜, 항생제에 대한 감수성을 증진시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 테레인 또는 식품학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 감염성 질병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐제(capsule), 산제 중에서 선택된 어느 하나의 식품으로 제조하거나, 다른 식품 또는 식품의 성분에 첨가하여 제조될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 테레인의 분리
토양에서 분리한 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus) FN423 균주를 감자 덱스트로스 액체배지(Potato Dextrose Broth; BD, USA)에서 배양한 후, 배양액의 상층액을 동량의 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였다. 에틸아세테이트의 조추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합물(클로로포름:메탄올 = 30:1~5:1)을 사용하여 이산화규소(실리카) 컬럼 크로마토그래피를 통해 용출시키고, 클로로포름과 메탄올의 혼합물(20:1)의 분획물에서 활성물질을 확인하였으며, HPLC(high-performance liquid chromatography)로 분석한 결과 테레인으로 확인되었다.
2. 엘라스타제 분석
슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1 균주로부터 생성되는 엘라스타제(elastase)의 분석은 Elastin-Congo red 검정법을 이용하였다. PAO1 균주는 LB 배지에서 220rpm의 교반속도로 37℃ 조건으로 밤샘 배양하였다. 상기 배양액을 동일 배지를 사용하여 100배 희석하고, 96-웰 마이크로플레이트에 웰당 0.1㎖씩 분주하였다. DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹인 테레인 화합물, DMSO(음성 대조구)를 PAO1 균주 배양액이 들어있는 웰에 첨가하였다. 37℃에서 12시간 반응시킨 후, 세포 생존율을 흡광도(OD600)를 측정하거나 살아있는 세포의 수를 계산하여 측정한 후, 4,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포배양 상층액의 엘라스타제 활성은 기질인 Elastin-Congo red를 사용하여 측정하였다.
3. 피오시아닌, 람노리피드 및 생물막 생성 분석
슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1 균주로부터 생성되는 피오시아닌(pyocyanin) 및 람노리피드(rhamnolipid)의 분석은 각각 Essar 등(J. Bacteriol. 1990, 172:884-900)의 방법과 Boles 등(Mol. Microbiol. 2005, 57:1210-1223)의 방법으로 수행하였다. 또한, 슈도모나스 애루지노사의 생물막 형성은 96-웰 마이크로플레이트의 웰 표면에 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 분석하였다. 생물막 분석을 위해, 96-웰 플레이트에서 6시간 동안 배양하여 생물막을 형성하도록 한 후, 각 웰에서 플랑크톤 형태의 세포를 제거하고, 부착된 생물막에 0.01 mg/L의 시프로플록사신(ciprofloxacin; Sigma, USA)을 DMSO 또는 테레인과 혼합하여 처리하고 3시간 동안 반응시켰다. 생물막 내의 세균은 2분간 초음파분쇄(40KHz) 처리하여 분리시켰고, 살아있는 세포를 계열희석하고 플레이팅하여 나타내었다.
3. 예쁜꼬마선충 생존 분석
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 대장균 OP50 균주가 깔려있는 NGM 플레이트에서 20℃ 조건으로 48시간 동안 배양하여 L4 단계가 되도록하였다. 꼬마선충의 사멸을 확인하기 위한 플레이트는 4㎖의 PGS 한천 위에 밤샘 배양된 PAO1 배양액 5㎕가 스프레딩된 35mm 페트리 디쉬로 준비하였고, 대조구로는 PAO1 대신 대장균 OP50이 스프레딩된 것으로 준비하였다. 상기 플레이트는 37℃에서 24시간 동안 배양시킨 후, 23℃에서 24시간 배양시켰다. 그 후, L4 단계의 꼬마선충 30마리를 각각의 플레이트에 놓고 상온에서 30시간 동안 반응시키며, 매 5시간마다 살아있는 개체수를 계산하였다.
4. 생쥐 기도 감염
테레인의 in vivo 감염 억제 활성을 확인하기 위해서, 50㎕의 PBS 또는 50㎕의 테레인을 포함하는 PBS에 1×107 cfu의 PAO1을 희석시켜 5주령의 암컷 BALB/C 생쥐(오리엔트, 한국)에 감염시켰다. PAO1의 감염 전, 생쥐는 졸레텔과 롬푼(각각 최종농도 0.006㎖/10g, 0.004㎖/10g)을 복강투여하여 마취시킨 후, PAO1을 포함하는 PBS를 비강으로 주입하여 감염시켰다. 각 그룹 당 n수는 7마리로 하였으며, 24시간 동안 생존율을 확인하였다. 각 그룹에서 3마리의 생쥐를 무작위로 선택하여 감염 후 9시간째에 안락사시키고, 폐를 적출하여 살아있는 PAO1의 수를 계산하였다.
5. 정족수 인식 신호전달 분자의 측정 및 관련 유전자의 발현 수준 분석
테레인이 정족수 인식(quorum sensing, 이하 QS) 신호전달 물질에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 세가지 QS 신호전달 물질, OdDHL(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone), BHL(N-butanoyl-l-homoserine lactone) 및 PQS(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone)의 생성량을 PAO1 배양 상층액을 이용하여 측정하였다.
또한, 테레인이 QS-관련 유전자의 전사체 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 총 RNA를 추출하여 각 표적 유전자 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 CFX-96 real time system(Bio-Rad, USA)을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. mRNA 발현 수준은 rpoD 유전자를 사용하여 표준화하였다.
Figure 112018064798311-pat00002
실시예 1. 테레인의 병독성 인자 생성 및 생물막 형성 저해 활성
다양한 농도(3, 10, 30 및 100μM)의 테레인을 슈도모나스 애루지노사 PAO1 균주에 처리하고, PAO1 균주의 병독성 인자 생성에 대한 영향을 분석하였다. 먼저, 테레인의 항균 활성을 확인한 결과 100μM의 테레인이 처리되어도 PAO1 균주의 생존율에는 전혀 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 그러나, 병독성 인자인 엘라스타제, 피오시아닌 및 람노리피드의 생성량은 테레인의 처리 농도에 의존하여 감소되는 것을 알 수 있었고(도 1b), 100μM의 테레인 처리구에서 엘라스타제, 피오시아닌 및 람노리피드의 생성량은 무처리 대조구 대비 각각 81.1%, 86.6%, 73.1% 감소되어 있었다. 특히 피오시아닌의 경우 저농도(10μM)의 테레인 처리구부터 무처리 대조구에 비해 그 생성량이 유의성 있는 수준에서 감소됨을 확인할 수 있었다.
또한, 테레인이 PAO1 균주의 생물막 형성에 미치는 영향을 조사한 결과, 처리된 테레인의 농도가 증가할수록 생물막 생성이 억제되는 것이 관찰되었다(도 1c). 또한, 생물막에 의한 미생물의 항생제 내성에 대한 테레인의 저해 활성을 확인하기 위해, 항생제인 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 테레인과 혼합처리한 결과, 항생제 단독 처리구에 비해 항생제와 테레인을 혼합하여 처리한 조건에서 PAO1의 생존율이 감소되어 있음을 확인할 수 있었다(도 1d). 이의 결과를 통해 테레인이 슈도모나스 애루지노사에 대해 병원성 인자 생성 억제 활성과 함께 생물막 형성 저해 활성을 보여, 항생제에 대한 상기 미생물의 감수성을 증가시켰음을 알 수 있었다.
또한, 알려진 생물막 형성 저해제인 퓨라논 C-30과 테레인의 화학적 안정성을 비교한 결과, 퓨라논 C-30은 배양 11시간 후부터 그 활성이 저해되어 생물막 형성 억제 효과가 떨어진 반면, 테레인은 배양 24시간 후까지 높은 생물막 형성 억제 효과를 유지하여 안정성이 퓨라논 C-30에 비해 우수함을 알 수 있었다(도 2).
실시예 2. 테레인의 in vivo 감염억제 활성
예쁜꼬마선충과 생쥐를 대상으로, 테레인이 슈도모나스 애루지노사의 in vivo 감염을 억제할 수 있는지 분석하였다. 그 결과, 슈도모나스 애루지노사만 감염시킨 꼬마선충 실험구는 30시간째에 약 33%의 개체만 생존한 반면, 30 또는 100μM의 테레인과 함께 PAO1을 감염시킨 꼬마선충 실험구는 30시간째에 약 72~73%의 개체가 생존하고 있어, 테레인 무처리구에 비해 약 2.2배 이상의 높은 생존율을 보이고 있음을 알 수 있었다(도 3a). 생쥐를 이용한 실험 결과 또한, 테레인 전처리에 의해 생존율이 현저히 증가하였음을 알 수 있었다(도 3b).
실시예 3. 테레인의 작용 기전 분석
테레인이 PAO1의 QS 신호 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해서, AHL(acyl homoserine lactones) 및 PQS(2-heptyl-3-hydroxy-4(1H) quinolone) 분자의 생성을 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 테레인을 처리하지 않은 PAO1은 OdDHL, BHL 및 PQS를 각각 6.67±0.57 ng/㎖, 5.06±0.10 ng/㎖ 및 24.1±2.5 ng/㎖ 생성하였으나, 테레인을 처리한 PAO1에서는 처리 농도가 증가할수록 상기 QS 물질의 생성량이 감소됨을 알 수 있었다(도 4a). 또한, QS 조절과 관련된 유전자들(lasI, IasR, rhlI, rhlR, pqsA, phnB, pqsH, pqsR, lasA, lasB, aprE, rhlA 및 phzA2)의 발현 수준을 확인한 결과에서도 테레인의 처리 농도가 증가할수록 QS 관련 유전자들의 발현이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다(도 4b). 이의 결과를 통해, 테레인이 미생물의 QS을 저해하여 생물막 형성의 저해 및 병원성 인자의 생성 억제 효과를 나타냄을 유추할 수 있었다.
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Claims (10)

  1. 테레인 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 병독성 인자(virulence factor) 생성 억제용 조성물로서,
    상기 병독성 인자는 엘라스타제(elastase), 피오시아닌(pyocyanin) 및 람노리피드(rhamnolipid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 병독성 인자의 생성 억제용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 정족수 인식(quorum sensing) 억제 활성을 갖는 테레인 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 슈도모나스 애루지노사의 생물막(biofilm) 형성 억제용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 소독제인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루지노사의 생물막 형성 억제용 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항의 조성물을 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)와 접촉시켜 생물막 형성을 억제하는 단계를 포함하는 슈도모나스 애루지노사의 생물막 형성 억제 방법.
  7. 삭제
  8. 테레인 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 감염시 항생제 감수성을 증가시키기 위한 약학 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 유발된 감염성 질환의 치료 보조제로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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