KR20010001237A

KR20010001237A - 오보바톨 또는 리도보바톨 함유 항진균제

Info

Publication number: KR20010001237A
Application number: KR1019990020309A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 복성해; 김성욱; 김영국; 황의일
Original assignee: 복성해; 생명공학연구소
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 1999-06-02
Publication date: 2001-01-05
Also published as: KR100336964B1

Abstract

본 발명은 오보바톨 또는 리도보바톨 함유 항진균제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 후박나무(Magnolia obovata Thunb)의 잎으로부터 추출 및 분리 정제된 오보바톨(Obovatol)과, 이러한 오보바톨로부터 합성된 리도보바톨(Redobovatol)이 유효약물로 함유되어 있어 키틴 합성효소Ⅱ에 대한 선택적 저해활성이 우수함은 물론이고 인체 병원균에 대해서도 높은 항균력을 나타내는 항진균제에 관한 것이다.

Description

오보바톨 또는 리도보바톨 함유 항진균제{Antifungal agent containing obovatol or redobovatol}

진균류의 세포벽과 세포막 합성효소 저해제에 대한 연구는 오래전부터 진행되어 왔으나, 항세균 항생물질에 비해 그 발전속도도 완만하고 진균류에 대한 전반적인 지식이 불충분하여 진균류에 약효가 우수한 효소저해제의 숫자도 그 수가 매우 한정되어 있다. 더구나 발견된 효소저해제의 대부분도 독성이 높고 많은 부작용을 내포하고 있어서 새로운 효소저해제에 대한 필요성은 오래전부터 대두되어 왔다. 최근에는 AIDS나 장기이식시의 면역억제제 혹은 항암제 등의 장기간 사용에 따른 기회 감염에 의해 내장진균증이 더욱 더 증가하고 있는 추세이다[T. J. Walsh, et al., Science 264, 371∼373, 1994]. 따라서 이러한 감염증에 대한 대책으로서 조기진단법의 확립과 선택독성이 뛰어난 화학요법제의 조속한 개발이 시급하며 이와 더불어 칸디다(Candida)와 아스퍼질러스(Aspergillus) 등과 같은 다양한 진균류에 대한 화학요법제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

현재 임상에서 주로 이용되고 있는 항진균제로는 폴리엔(polyene)과 아졸 유도체 및 알릴아민-티오카바메이트류가 있다. 이들 화합물들은 모두 진균류 세포막 성분인 에르고스테롤(ergosterol)과 상호 작용하거나 에르고스테롤의 합성을 저해한다. 이 중에서 폴리엔이 세포막의 투과율을 증가시키고 세포 내 내용물의 유출을 일으켜 세포를 사멸시키는 등의 많은 부작용이 있음에도 불구하고 암포테리신 B(amphotericin B)는 아직도 폴리엔 항생물질중 유일하게 전신 진균감염증에 이용되고 있다. 아졸 화합물들은 대부분 합성물질이며, 에르고스테롤의 합성경로중 C-14 탈메틸아제(demethylase)를 저해하여 에르고스테롤 합성을 저해하지만, 일부 이미다졸 화합물 예를 들면, 크로트리마졸, 미코나졸 등은 세포막과 직접 상호 작용하여 세포막에 손상을 가하기 때문에 국소적으로만 이용되고 있다[D. P. Hanger, et al., Antimicrob. Agents Chemother., 32, 646, 1988]. 최근에 개발된 아졸 화합물 예를 들면 케토코나졸, 이트라코나졸 등은 심각한 독성이 적은 반면에, 씨토크롬P-450에 의존하는 효소를 저해하며 내분비계의 스테로이드 호르몬 합성을 저해한다는 부작용이 보고되고 있다. 그리고 진균제로서 나프티핀 또는 터비나핀 둥의 알릴아민 화합물 또는 톨나프테이트 등의 티오카바메이트 화합물은 스쿠알렌 에폭시다제와 옥시도스쿠알렌 싸이클라제를 저해하여 에르고스테롤 합성을 억제한다고 알려져 있으나, 이 화합물들은 생체외(in vitro)에서 항진균 활성이 광범위하고 아졸 화합물보다 독성이 적은 반면 약물동력학적인 측면이 취약하여 피부질환증에만 주로 이용되고 있다. 이외에도 에르고스테롤 합성저해제로서 많은 화합물들이 보고되고 있으나, 아직도 독성이 낮고 약효가 우수한 에르고스테롤 합성저해제는 매우 적기 때문에 새로운 에르고스테롤 합성저해제에 대한 필요성이 꾸준히 증가되어 왔다.

상기와 같은 필요성 때문에 새로운 목표물로 에르고스테롤 합성효소중 스쿠알렌 합성에 관여하는 스쿠알렌 신타제 효소에 대한 연구와 이의 활성을 억제하는 물질의 탐색이 활발히 진행되고 있다. 스쿠알렌 신타제 효소는 에르고스테롤 합성과 콜레스테롤 합성시 중간 대사물 형성에 중요한 역할을 하는 효소이며, 이 효소저해제로서 이미 스쿠알레스타틴[squalestatin; M. J. Dawson, et al., J. Antibiot., 45, 639∼647, 1992]과 자라고즈산[zaragozic acid; J. D. Bergstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 80∼84 1993] 화합물들이 발표되었는데, 이 화합물들은 항진균 활성 뿐만 아니라 콜레스테롤 저하효과도 나타내어 새로운 효소저해제 탐색의 목표물이 되고 있다.

한편 진균류는 포유류 세포와는 달리 세포벽이 존재하기 때문에 진균류의 세포벽은 선택적인 목표물로서 오래전부터 많은 주목을 받아왔다. 진균류 세포벽의 주성분은 주로 폴리사카라이드 예를 들면 키틴과 글루칸으로 구성되어 있다[D. J. Frost, et al., J. Antibiot., 48, 306∼310, 1995]. 키틴은 N-아세틸-D-글루코사민이 β-1,4-결합으로 이루어진 호모폴리머로서 키틴 신타제Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 효소들에 의해 합성된다[W, J. Choi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 80∼84, 1994]. 이러한 키틴 효소들에 대한 각각의 특성과 기능이 알려지면서 선진국에서는 분자생물학 기법을 이용하여 각각의 효소만을 선택적으로 생산할 수 있는 균주를 개발하여 격막형성에 관여하는 키틴 신타제Ⅱ와 키틴 고리형성에 관여하는 키틴 신타제Ⅲ 효소 저해제 탐색을 행하고 있다. 키틴 합성저해제로는 폴리옥신[polyoxin; J. Nagatsu, et al., Agric. Biol. Chem., 29, 848∼854, 1965]과 닉코마이신[nikkomycin; H. P. Fiedler, et al., J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 271∼280, 1982]이 보고되어 있고, 글루칸 합성저해제로는 아쿠레아신[aculeacin; J. Mizoguchi, et al., J. Antibiotics, 30, 308∼313, 1977]과 에키노칸딘[echinocandin; F. Benz, et al., Helv. Chim. Acta, 57, 2459∼2477, 1974] 등이 보고되었으나, 여러가지 문제점으로 인해 널리 이용되지 못하고 있는 실정이다.

본 발명자들은 후박나무 잎으로부터 분리 정제된 오보바톨과 이를 환원시켜 얻은 리도보바톨이 진균류의 세포벽를 구성하는 성분중의 하나인 키틴(chitin)의 생합성과정 중 초기 세포벽(primary septum) 형성에 관여하는 키틴 합성효소Ⅱ에 대한 선택적 저해활성이 우수할 뿐만 아니라 인체병원균에 대해서도 높은 항균력을 나타내는 것을 처음으로 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 오보바톨 또는 리도보바톨 또는 이들의 혼합물이 유효약물로 함유되어 있어 키틴 합성효소Ⅱ 저해제로 유용한 항진균제를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 오보바톨(Obovatol), 다음 화학식 2로 표시되는 리도보바톨(Redobovatol) 또는 이들의 혼합물이 유효약물로 함유되어 있는 항진균제를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 오보바톨(Obovatol)과 상기 화학식 2로 표시되는 리도보바톨(Redobovatol)의 제조방법을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 항진균제 중에 유효약물로서 함유되는 오보바톨과 리도보바톨은 공지 화합물이다. 오보바톨은 후박나무의 잎으로부터 최초로 추출되었으며[B. M. Kwon et al., Planta Medica 63, 550∼551, 1997], 항세균작용[Ito et al, Chem. Pharm. Bull., 30(9): 3347∼3353, 1982]과 ACAT(Acyl-CoA: Cholesterolacyltransferae)저해효과[B. M. Kwon et al., Planta Medica 63, 550∼551, 1997] 등이 있다고 보고되고 있을 뿐이다. 또한 공지된 방법을 이용하여 오보바톨을 환원시켜 리도보바톨을 합성하였다.

본 발명에 따른 후박나무의 잎으로부터 오보바톨을 분리·정제하는 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 후박나무 잎을 메탄올 등의 알콜용매로 추출한 후 농축하고, 에틸아세테이트에 용해되는 부분만을 취한다. 에틸아세테이트에 용해되어 있는 성분을 검증한 결과 활성을 나타내었다. 활성 성분이 들어있는 에틸아세테이트 층을 분리한 후 감압하에 농축시킨다. 농축액을 다양한 칼럼크로마토 그라피법으로 분리하고 최종적으로 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 저해활성을 나타내는 화합물 즉, 상기 화학식 1로 표시되는 오보바톨(Obovatol)을 분리·정제한다. 상기한 칼럼크로마토 그라피법으로는 역상 크로마토그라피, 실리카겔 크로마토그라피 등이 포함되며, 보다 순수 정제된 오보바톨을 얻기 위해서는 칼럼크로마토 그라피법을 수행한 후에 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 최종적으로 수행하는 것이다.

이상의 방법으로 분리·정제된 오보바톨은 테트라하이드로퓨란 등의 유기용매에 용해시킨 후, Pd/C 촉매하에서 수소(H₂) 환원시켜서 상기 화학식 2로 표시되는 리도보바톨을 합성한다.

한편, 본 발명이 후박나무 잎으로부터 분리 정제된 오보바톨과 오보바톨로부터 합성된 리도보바톨은 우수한 항진균 활성을 가지며, 특히 진균류의 세포벽 합성에 필수 효소인 키틴 합성효소Ⅱ의 저해활성이 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 오보바톨과 오보바톨 각각 또는 이들이 함께 함유된 항진균제를 포함한다.

본 발명에 따른 항진균제를 제조함에 있어 활성 성분과 함께 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 포함할 수 있으며, 이의 제조는 쉽게 입수할 수 있는 성분들을 이용하여 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다. 제제의 제조시에는, 활성 성분을 담체와 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캡슐, 사셰, 종이 또는 다른 용기의 형태인 담체 내에 담을 수 있다. 담체가 희석제의 역할을 할 경우에는, 활성 성분을 위한 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서 제제는 정제, 환제, 분말제, 사셰, 엘릭서, 현탁액, 유화액, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서 또는 매질중의 것), 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사 용액, 멸균 포장된 분말제 등의 형태일 수 있다.

적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로즈, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 및 미네랄 오일 등이다. 상기한 성분들 이외에도 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항진균제는 환자에게 투여된 후 활성 성분을 급속하게, 지속적으로 또는 지연시켜 방출하도록 당분야의 공지 기술들을 이용하여 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 항진균제는 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제 또는 비경구용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화하여 항진균제로서 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여용량은 치료될 질환, 투여 경로, 환자의 나이, 성별, 체중, 건강상태, 식이, 투여시간, 배설율, 약제혼합 및 질환의 중증도를 포함하는 관련된 조건에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 일반적으로는 10 내지 15 ㎎/㎏-체중, 바람직하게는 12 내지 13 ㎎/㎏-체중의 활성성분이 되도록 1일 1회 이상 투여할 수 있으나, 상기한 투여용량의 범위는 어느 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

이와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 오보바톨의 분리 및 정제

완전히 건조된 후박나무 잎 1 kg을 20ℓ의 메탄올로 5 일간씩 2 회 추출하고 여과액을 모아 감압 농축하여 추출물을 얻었다. 에틸아세테이트에 용해되는 분획을 역상 크로마토그래피에 흡착시킨 후, 메탄올(80%)와 물(20%) 혼합액으로 용출시켜서 활성분획을 얻고, 이 활성 분획을 농축한 후 실리카 겔 크로마토그래피에 흡착시켰다. 실리카 겔에 흡착된 활성 성분을 에틸아세테이트(30%)와 헥산(70%)의 혼합액으로 용출시켜서 부분정제된 활성물질을 얻었다. 부분정제된 활성 분획을 최종적으로 HPLC를 이용하여 순수한 효소저해제들을 분리하였다. 이때 HPLC 컬럼으로는 ultracarb 10 ODS(250×21.2 mm, phenomenex 사)를 사용하였으며, 활성물질들을 메탄올(85%)와 물(15%)의 혼합 용액으로 용출시켰다. 최종적으로 순수한 오보바톨을 후박 잎 1 kg 당 120 mg의 수율로 얻었다.

실시예 2 : 리도보바톨의 합성

순수정제된 오보바톨 500 mg을 200 ㎖의 THF에 녹인 후 5 mg의 Pd/C 촉매를 가하고 상온에서 수소가스를 주입하면서 환원반응을 수행하였다. 박막크로마토그래피(전개용매: 에틸아세테이트/헥산=20/80(v/v)) 상에서 오보바톨이 완전히 사라질 때를 반응 종료싯점으로 하였다. 반응이 완료된 후 여과하고 여과액을 감압하에서 농축하였다. 농축액을 실리카 겔에 흡착시킨 후 에틸아세테이트(15%)와 헥산(85%)의 혼합액으로 용출시켜서 순수한 리도보바톨을 90%의 수율로 얻었다.

상기한 실시예 1과 실시예 2에서 얻은 오보바톨과 리도보바톨 각각의 이화학적 성질은 다음 표 1에 나타내었다.

실시예 3 : 활성저해물질의 구조분석

상기한 실시예 1과 실시예 2에서 얻은 오보바톨과 리도보바톨 각각에 대해서는 UV 흡광도(Shimadzu UV-265 spectrophotometer), IR 흡광도(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophometer) 및 고성능 질량분석(VG70-SEQ mass spectrometry)을 통하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 MHz, Brucker 400 MHz NMR)를 이용하여¹H,¹³C, Cosy, HMQC, HMBC, NOESY 스펙트럼을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였다.

실시예 4 : 키틴 합성효소Ⅱ의 저해활성 검정

키틴 합성효소Ⅱ의 저해 활성은 Saccharomyces cerevisiae로부터 분리한 효소와 UDP-[¹⁴C]GlcNAc(N-아세틸-D-글루코사민)(400,000 cpm/μmol)을 기질로 하여 측정[Won-Ja Choi et. al, Anal. Biochem. 219, 368∼372, 1994]하였으며, 비교물질으로는 키틴 합성효소 저해제로서 알려져 있는 폴리옥신 D를 사용하였다.

32 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.6 mM 코발트아세테이트, 1.1 mM UDP-[¹⁴C]GlcNAc, 20 ㎕의 키틴 합성효소Ⅱ의 조효소액, 14 ㎕의 시험하고자 하는 시료, 2 ㎕의 트립신(2 mg/㎖)을 가하여 30℃에서 15분 동안 예비 반응을 시켰다. 이 반응액에 2 ㎕의 트립신 저해제(4 mg/㎖)을 첨가하여 얼음에서 10분 동안 방치한 후, 32 mM을 전체 용적이 50 ㎕ 되게 첨가한 후 30℃에서 90분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 10% 트리클로로아세트산 1 ㎖을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 GF/C 여과지를 이용하여 여과하였다. 이 여과지를 건조시킨 후 3 ㎖의 칵테일(cocktail)을 첨가하고 액체 섬광계수기를 이용하여 방사능을 측정하였다. 각 시료에 대한 키틴 합성효소Ⅱ의 저해활성 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

비교군(Control)에는 반응액에 시료를 첨가하지 않았으며, 대조군(Blank)에는 시료와 키틴 합성효소를 첨가하지 않고 반응시켜 방사능을 측정하였다.

오보바톨과 리도보바톨의 키틴 합성효소Ⅱ의 저해활성을 측정한 결과 IC₅₀가 각각 12 ㎍/㎖와 35 ㎍/㎖로 확인되었으며, 기존의 키틴 합성효소Ⅱ의 저해제로 알려진 폴리옥신 D[IC₅₀70 ㎍/㎖, E. Cabib, Antimicrob. Agents Chemother., 35 170∼173, 1991] 보다 활성이 2.0 ∼ 5.8배 더 강하다는 사실을 확인하였다.

실시예 5 : 병원성 균주를 이용한 활성 검색

병원성 균주들 중 효모류는 사브로오드 발효액(Sabouraud's broth)을 이용하여 하룻밤 액체 배양한 후 균액을 10⁷CFU/㎖되게 조절하여 접종 균액으로 사용하였으며, 진균류는 25℃에서 포테이토 덱스트로스 아가 또는 사브로오드 아가 배지에서 7 ∼ 14일 동안 충분히 배양하여 접종원으로 사용하였다. 접종 균액을 멸균된 증류수를 이용하여 2배 희석 계열을 만든 후 멸균하여 50℃로 유지시킨 포테이토 덱스트로스 아가 또는 사브로오드 아가 배지를 접종 균액과 9:1의 비율로 혼합하여 최종 농도가 1000 ∼ 1.95 ㎍/㎖이 되도록 5 cm 크기의 평판에 분주하였다. 배지가 고형화되면 상기에서 제조한 접종 균액을 각 평판마다 일정량씩 접종하여 25 ∼ 30℃에서 1 ∼ 5일 동안 배양한 후 육안으로 관찰하여 균의 생육이 억제된 농도를 최소생육저지농도(MIC)로 정하였다.

본 발명에 따른 오보바톨 및 리도보바톨에 대해서는 다음 표 3의 대표적인 인체 병원균를 대상으로 활성을 검증하였으며, 그 결과 다음 표 3과 같은 항균력을 나타내었다.

오보바톨과 리도보바톨의 항균 활성을 측정한 결과 인체 기회 감염균인 Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Candida krusei에 대한 MIC는 7.8 ∼ 31.2 ㎍/㎖으로 비교적 강한 저해 활성을 나타내었다.

또한, 무좀균인 Trichophyton mentagrophytes와 Aspergillus fumigatus에 대한 MIC에 있어서, 오보바톨은 각각 62.5 ㎍/㎖과 125 ㎍/㎖이었으며, 리도보바톨은 각각 125 ㎍/㎖과 500 ㎍/㎖를 나타내었다.

실시예 6 : 독성 시험

오보바톨과 리도보바톨에 대해서는 무게 200 g의 정상쥐를 대상으로 급성독성 시험을 수행하였으며, 그 결과 이들 화합물 각각을 100 ㎍씩 지속적으로 투여하여하여도 커다란 독성이 없음을 확인하였다.

다음의 제제예는 본 발명에 따른 오보바톨 또는 리도보바톨이 유효성분으로 함유된 항진균제의 제제화를 위한 일례이다. 본 발명에 따른 항진균제가 다음의 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제제예 1 : 경구투여용 정제의 제조

오보바톨 또는 리도보바톨을 유효약물로하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 제조하였다.

유효약물 100 mg

경질무수규산 10 mg

미세결정셀룰로오스 190 mg

스테아린산마그네슘 5 mg

전분글리콘산나트륨 60 mg

무수일산일수소칼슘 135 mg

제제예 2 : 주사제의 제조

오보바톨 또는 리도보바톨을 유효약물로하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

유효약물 100 mg

만니톨 180 mg

Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg

증류수 2974 mg

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명이 후박나무 잎으로부터 분리해낸 오보바톨과, 이러한 오보바톨을 환원시켜 합성한 리도보바톨은 키틴 합성효소Ⅱ에 대한 선택적 저해활성이 우수하고, 인체 병원균에 대한 항균활성이 우수하므로, 이들 화합물은 항진균제의 유효약물로 유용하다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 오보바톨(Obovatol), 다음 화학식 2로 표시되는 리도보바톨(Redobovatol) 또는 이들의 혼합물이 유효약물로 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 항진균제.

화학식 1

화학식 2
후박나무(Magnolia obovata Thunb)의 잎을 알콜용매로 추출하고, 추출물을 칼럼크로마토그라피한 후에 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 수행하여 분리 및 정제하는 것을 특징으로 하는 다음 화학식 1로 표시되는 오보바톨(Obovatol)의 분리·정제방법.

화학식 1
후박나무(Magnolia obovata Thunb)의 잎을 알콜용매로 추출하고, 추출물을 칼럼크로마토그라피한 후에 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 수행하여 오보바톨(Obovatol)을 분리·정제하고, 오보바톨(Obovatol)을 Pd/C 촉매하에서 환원하여 수득하는 것을 특징으로 하는 다음 화학식 2로 표시되는 리도보바톨(Redobovatol)의 제조방법.

화학식 2