NO178343B - Fremgansmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv 1-[4,5-dihydroksy-N2-(10,12-dimethyl-1-oxotetradecyl)-ornithinÅ-5-(3-hydroxyglutamin)-6-[3-hydroxyprolinÅechinocandin B - Google Patents

Abstract

Det beskrives et antibiotisk middel som er fremstilt ved dyrking av Zalerion arboricola og som er et cyklisk lipopeptid med meget høy aktivitet mot patogener hos mennesker og meget lav toksisitet overfor pattedyr. Midlets fremstilling, isolasjon og anvendelse beskrives.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv 1-[4,5-dihydroxy-N2-( 10,12-dimethyl-1-oxotetradecyl)-ornithin]-5-(3-hydroxyglutamin)-6-[3-hydroxyprolin]echinocandin B, med strukturformel

som er funnet å være anvendbar som et antisoppmiddel og som et anti-pneumocystisk middel, ved dyrking av Zalerion arboricola under aerobiske betingelser.

Forbindelsen kan kalles: 1-[4,5-dihydroxy-N<2->(10,12-dimethyl-l-oxotetradecyl)-ornithin]-5-(3-hydroxyglutamin)-6-(3-hydroxyprolin)echinocandin B.

Den foretrukne stereoisomer antas å være: 1-[4,5-dihydroxy-N<2->(10,12-dimethyl-l-oxotetradecyl)-L-ornithin]-5-(3-hydroxy-L-glutamin)-6-[3-hydroxy-L-prolin]-echinocandin B.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at Zalerion arboricola-stammene ATCC 20957 og ATCC 20868 dyrkes i et vandig næringsmedium som inneholder

1) en carbonkilde omfattende minst 4 vekt% mannitol, 2) en nitrogenkilde omfattende et melkeproteinhydro-lysat, og 3) en buffer omfattende glycin eller et uorganisk fosfat, og eventuelt

4) sporelementer og melkesyre, og

5) en vegetabilsk olje valgt fra soya-, peanøtt-eller solsikkeolje,

mens pH opprettholdes ved 5,5, hvoretter produktet separeres fra mediet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også et næringsmedium som er anvendbart for fremstilling av økede utbytter av forbindelsen angitt ovenfor, og som er kjennetegnet ved at næringsmediet som benyttes og som øker utbyttet av forbindelsen inneholder i gram pr. liter av vandig medium: D-mannitol, 20-100, KH2P04, 0,5-3, glycin, 1-4, peptonisert melk, 2-20, melkesyre, 0-3, løsning av sporelementer, 0-15 ml og vegetabilsk olje, 0-20.

Forbindelsens struktur er bestemt ved detaljerte analyser av spektralegenskapene.

Massespektraldata

Elektron slage (EI) massespektraldata ble oppnådd

på et Finnigan-MAT 212 massespektrometer ved 90 eV. Gass-kromatograf-massespektrogram (GC-MS)-analyser av TMS (trimethylsilyl)-derivatene av totalsyrehydrolysater ble utført på det samme instrument. Massespektra etter raskt atombombardement (FAB) ble nedtegnet på et VG20-253-instrument.

Forbindelse IA har molekylvekten 1064 ved FAB-MS (observert (M+Li)<+> ved m/z 1071). GC-MS av det totale syrehydrolysat avslørte en ekvivalent av hver av threonin, 4-hydroxyprolin, 3-hydroxyglutaminsyre, 3-hydroxyprolin og en mettet C-^-f ettsyre.

NMR spektraldata

Forbindelse I

<1>H NMR spektrum: i CD-jOD ved 400 MHz er som det sees på

fig. 1, og

<13>C NMR kjemiske skift oppnådd i CD-jOD ved 75 MHz i ppm i forhold til TMS ved null ppm ved bruk av løsningsmiddeltopp ved 49,0 ppm som indre standard: 11,6, 19,7, 20,2, 20,7,

27,0, 28,1, 30,30, 30,34, 30,6, 30,8, 31,18, 31,24, 32,9,

34.5, 34,8, 36,7, 38,1, 38,5, 39,4, 45,9, 47,0, 51,4,

55.6, 56,3, 57,1, 58,3, 62,5, 68,2, 69,8, 70,55, 70,68,

71,3, 73,9, 74,3, 75,8, 76,9, H6,2(2X), 129,6(2X), 133,0,

158,5, 169,1, 172,5, 172,7, 172,9, 173,4, 174,5, 175,8,

177,2 ppm.

På basis av disse og andre data antas forbindelse

I med betydelig sikkerhet å ha den angitte struktur.

Forbindelsen er et hvitt fast stoff som er løselig

i organiske løsningsmidler som.f.eks. methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxyd, ethylacetat og lignende.

Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen har anti-soppegenskaper mot både trådsopper og gjær. Den er spesielt anvendbar mot organismer som forårsaker patogene mycotiske infeksjoner som f.eks. Candida albicans, Candida rugosa,

Candida parapsilosis og lignende, hvor det ikke bare oppvises høy aktivitet, men konstant høy aktivitet oppvises over et ut-strakt panel av stammene av organismene.

Til forskjell fra en rekke anti-soppmidler som for eksempel amfotericin B, som mens de er aktive mot Candida albicans og visse andre sopp-patogener, er begrenset i deres anvendbarhet på grunn av uheldige og farlige bivirkninger, er dessuten midlene ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke bare meget effektive anti-soppmidler, men er i det vesentlige ikke-toksiske i og i det vesentlige fri for uønskede bireaksjoner.

Lyse av røde blodlegemer, en skadelig og potensielt fatal bireaksjon oppvises av mange forbindelser i konsentrasjoner som nærmer seg den terapeutiske dose, og denne egenskap^har begrenset anvendbarheten av disse forbindelser som legemidler. Forbindelsen med formel (I) ventes å kreve en konsentrasjon som er langt over den for terapeutisk anvendelse før det vil inntreffe lyse av røde blodlegemer.

Forbindelsen er også effektiv som anti-soppmiddel

mot filamentsopp inkludert Aspergillus-arter, Penicillium-arter, Fusarium-arterAlternaria-arter, Neurospora-arter og lignende.

Forbindelsen er videre også anvendbar som et middel for behandling av pneumocystisk carinii, som forårsaker en spesielt alvorlig pneumonia hos immun-svekkede pasienter som f.eks. de med "ervervet immun-mangel-syndrom", (AIDS).

Forbindelsen fremstilles som angitt ved dyrking av en kultur av Zalerion arboricola, identifisert som MF 5171 i Merck kultursamling, som er deponert under Budapest-avtalen i kultursamlingen i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 og er tilgjengelig under tilvekstnummer ATCC 20868.

Produksjonen av forbindelsene er diskutert nedenfor i hovedsak med hensyn til en spesiell stamme, ATCC 20868.

En spesiell mutant som er identifisert i Merck Culture Collection som MF-5404 og er tilgjengelig fra

American Type Culture Collection som Zalerion arboricola ATCC 20957, er imidlertid spesielt anvendbar for fremstilling av Forbindelse I. Anvendelsen av denne mutant ved fremstilling av Forbindelse I beskrives også nedenfor.

Koloni- og morfologibeskrivelsen av ATCC 2086 8 og ATCC 20957 er angitt nedenfor: Kolonier på potet-dextrose-agar (Difco) ved 20° C langsomt-voksende, oppnår en diameter på 8 - 12 mm på 1 uke. Modne kolonier (3-4 uker) på potet-dextrose-agar utbredte, med neddykkede og lufthyfer, overflate håraktig, lanose eller funiculose, matt til moderat skinnende, danner hevede, tette kompakte kolonier, med en substromatisk tekstur på grunn av tett conidia-dannelse. Koloniens farve blek oliven-brun, oliven, oliven-brun til slutt oliven-svart, Isabella Color, Sayal Brown, Tawny-oliven, Saccardo<*>s Umber, Sepia, Brownish Olive, Raw Umber, Dark Olive, Olivaceous Black

(fra R. Ridgway, 1912, Color Standards and Nomenclature, Washington, D.C.). De samme farver i kolonien i motsatt rekkefølge, lukt, exudater og løselige pigmenter fraværende.

Hyfer (i 3 % KOH) lyse gulbrune til oliven-brune, tverrdelte, forgrenede, ofte med irregulære side- eller ende-fliker, 1 - 3 p brede, tynn- til svakt tykk-veggede, med glatte til svakt skorpebelagte eller vortede vegger. Lufthyfer kleber seg ofte sammen til bunter, børster og hyfopodier fraværende.

Conidiogene celler monoblastistø spredte til tette, integrerte, avsluttende og i avstand fra hverandre, reiser seg direkte fra udifferensierte hyfer i rette til svakt skrå vink-ler. Conidier starter som irregulære kilder, filamenter eller spiraler, utvikles senere som kompakte, irregulære masser på 6 - 25 celler. Enkelte, conidiale celler, 3 - 6 pm i diameter, kuleformede, under-kuleformede eller svakt irregulære til flikede, glatte til fint vortede, gul-brune til oliven-brune.

Forbindelse I kan fremstilles ved å dyrke

Zalerion arboricola i et passende næringsmedium under betingelser som beskrives nedenfor og deretter gjenvinne dem fra produksjonsmediet ved å ekstrahere den aktive bestanddel fra fermenteringsmediet med et passende løsningsmiddel, konsentrere løsningen inneholdende den ønskede bestanddel, og så underkaste det konsentrerte materiale en kromatografisk separering for å skille Forbindelse I fra andre metabolitter som foreligger.

Forbindelse X som er gjenstand for den samtidige søknad S.N. 362 647, innlevert 7. juni, 1989, som er en fort-settelse av S.N. 105 795, innlevert 10. oktober, 1987, nu henlagt, og der kalt 1[ (4R, 5R)-4 , 5-dihydroxy-N2-(10 ,12-dimethyl-l-oxotetradecyl) -L-ornithin]-5-(threo-3-hydroxy-L-glutamin)-echinocandin B/ fremstilles også av organismen.

For fremstilling av Forbindelse I modifiseres derfor næringsmidlet eller det anvendes en direkte syntesemetode eller mest spesielt anvendes mutanten ATCC 20957 som beskrevet nedenfor.

Mediet kan være et ellers konvensjonelt medium, slik som komplekse kilder som tilfører nitrogen som for eksempel gjærhydrolysater, gjærautolysater, caseinhydrolysater og lignende.

Carbonkildene omfatter generelt glycerol, sukkere, stivelser og andre carbohydrater eller carbohydratderivater som for eksempel dextran, cerelose, såvel som komplekse næringsmidler som for eksempel havremel, maismel, hirse, mais

■og lignende. Den nøyaktige mengde av carbonkilden som anvendes i mediet, vil delvis avhenge av de andre ingredienser i mediet, men det er vanligvis funnet at en mengde av carbohydrat mellom 0,5 og 40 vekt% av mediet er tilfredsstillende. Disse carbonkilder kan anvendes enkeltvis, eller mange slike carbonkilder ,kan kombineres i det samme medium.

Blant de uorganiske næringssaltene som kan innblandes i næringsmidlene, er de vanlige salter som er i stand til å gi natrium, kalium, magnesium, calsium, fosfat, sulfat, klorid, carbonat og lignende ioner. Det inkluderes også spormetaller som for eksempel cobolt, mangan, jern, molybden, sink, cadmium og lignende.

Typiske anvendbare medier er de følgende:

Medium I

Medium II

Forbindelse I kan fremstilles ved "den analoge inn-førings "-metode på en måte som er omtrent som følger: Et frosset medisinglass med Zalerion arboricola-kultur ATCC 20868 inokuleres i et passende dyrkningsmedium med pH i området 5 til 8,1, optimalt 6 til 7,5, og dyrkes i fra 2 til 30 dager, fortrinnsvis 2 til 5 dager, ved temperaturer i området på fra 15° C til 30° C, fortrinnsvis 25 - 26° C med eller uten omrøring, Når det anvendes omrøring, kan denne være opp til 400 omdr. pr. minutt, fortrinnsvis fra 200 til 22 0 omdr. pr. minutt. Når veksten blir rikelig, dannes kulturen for å inokulere det medium som skal modifiseres ved analog innføring og som skal dyrkes for fremstilling av den sekundære metabolitt. . Analogen tilsettes fem dager etter at veksten er blitt etablert i en mengde for å tilveiebringe en sluttkonsen-trasjon på 5 - 8 mg/ml.

Fermenteringen utføres i minimum 14 dager ved 25 -

26° C med omrøring ved 220 omdr. pr. minutt.

Ved slutten av denne periode ekstraheres hele væsken med et like stort volum av et løsningsmiddel som for eksempel methylethylketon. Andre egnede løsningsmidler omfatter ethylacetat og aceton. Løsningsmidlet fjernes så ved redusert trykk for å oppnå en rest som kan solubiliseres med et kjent volum methanol, tørkes og bestemmes ved HPLC, og det gjenværende materiale underkastes isoleringsfremgangsmåter.

Når det ikke anvendes dirigert syntese som fremgangs-måtemetode, kan det anvendes konvensjonelle materialer.

Som nitrogenkilde kan det således anvendes ammonium-salter, aminosyrer som for eksempel glycin, arginin, threonin, methionin og lignende, såvel som komplekse næringsmidler som f.eks. gjærhydrolysater, gjærautolysater, gjærceller, tomat-pasta, soyabønnemel, caseinhydrolysater, gjærekstrakter, mais-støpevæsker, mask, bomullsfrømél, kjøttekstrakt og lignende. Forskjellige nitrogenkilder kan anvendes alene eller i kombinasjon i mengder som varierer fra 0,2 til 10 vekt% av mediet.

Som carbonkilder kan det anvendes materialer som er nevnt tidligere, selv om blandinger inneholdende glycerol eller mannitol foretrekkes. Medium I, som er beskrevet foran, illustrerer et glycerol-holdig medium. De følgende medier, betegnet RG2 og RG120, illustrerer mannitol-inneholdende medium:

Det er funnet at ved bruk av visse mannitol-holdige medier kan produksjonen av det ønskede produkt økes. Den for-bedrede produksjon kan påvises ved det økede utbytte av Forbindelse I i forhold til Forbindelse X eller i den raskere dannelse av alle metabolittene.

Produksjonshastigheten kan økes flere ganger ved bruk av mannitol i en mengde på minst 4 vekt% i et medium med om-sorgsfull pH-kontroll på ca. 5,5 i hvilket nitrogenkilden er hydrolysert casein og gjærnitrogenbase. For å overholde kri-tisk pH-kontroll er det viktig med nærvær av en fosforholdig

.buffer, fortrinnsvis et basisk kaliumfosfat. Representative

for egnede væskemedier er de som er betegnet TG102 og TG103.

Visse mannitol-holdige medier fremmer produksjonen av Forbindelse I ifølge den foreliggende oppfinnelse i forhold til Forbindelse X, som normalt er hovedproduktet ved dyrking av Zalerion arboricola. Ved bruk 'av disse medier er det funnet at utbyttet av Forbindelse I økes signifikant. Således inneholder et medium som er i det vesentlige nøytralt og som inneholder D-mannitol som carbonkilde, et melkeprotein-hydrolysat (peptonisert melk) som en kompleks nitrogenkilde, glycin som aminosyre og buffer, en fosfor-holdig buffer og fortrinnsvis også melkesyre, sporelementer og utvalgte vegetabilske oljer. Egnede oljer er soya-, jordnøtt- og solsikkeoljer. De anvendbare områder er som følger:

For å oppnå best utbytte av forbindelsen kan alle bestanddelene i den foraruitående blanding være tilstede. Således er S6-medium (nedenfor) et foretrukket medium.

I tillegg til de flytende mediene kan det anvendes faste medier. Det følgende er representativt:

De foranstående medier kan anvendes i fermenteringer som utføres ved bruk av en standard fremgangsmåte hvori et frosset vegetativt mycelium av Zalerion arboricola først tines og anvendes for å inokulere et kim-medium som så innkuberes i minimum 3 dager for å produsere organismer som tjener som kim ved fremstilling av Forbindelse I. Kim-mediet kan ha følgende sammensetning.

I denne fremgangsmåte inokuleres en skrå-seksjon av en konservert kultur av ATCC 20 868 i et flytende næringskim-medium med pH i området 5 til 8,1, optimalt 6 til 7,5, og kolbene inkuberes med omrøring ved temperaturer i området på fra ca. 15 til ca. 30° C, fortrinnsvis 20 til 28° C. Omrøring kan foregå opp til 400 omdr. pr.minutt, fortrinnsvis fra 200 til 22 0 omdr. pr. minutt. Inkuberingen utføres i løpet av en periode på fra 2 til 30 dager, fortrinnsvis i 14 dager. Når veksten er rikelig, vanligvis mellom 2 og 5 dager, kan veksten anvendes for å inokulere produksjonsmediet for fremstillingen av Forbindelse I. Fortrinnsvis utføres en andre trinns fermentering, ved inokulering med en del av kulturveksten og så anvende lignende betingelser, men generelt med en forkortet inkuberingsperiode fra ca. 1 til 3 dager. Veksten anvendes så for å inokulere produksjonsmediet.

Fermenteringsproduksjonsmediet som er inokulert med kulturveksten, inkuberes i 3 til 30 dager, vanligvis 7 til 14 dager, med eller uten omrøring. Fermenteringen kan gjennom-føres aerobisk ved temperaturer som varierer fra ca. 20 til ca. 40° C. For å oppnå optimale resultater er det mest hensikts-messig å utføre disse fermenteringer ved temperaturer i området på ca. 24 til ca. 30° C. Temperaturer på ca. 24 til 28° C er mest foretrukket. pH-verdien i næringsmediet som er egnet for fremstilling av de foreliggende forbindelser, kan variere fra ca. 5,0 til 8,5 med et foretrukket område fra ca. 6,0 til 7,5. For rask produksjon skal imidlertid pH holdes nær ved ca. 5,5. Etter den passende periode for fremstilling av den ønskede forbindelse eller de ønskede forbindelser gjenvinnes de sist-nevnte fra fermenterinsmediet slik det skal beskrives mere fullstendig nedenfor.

I tillegg til det foranstående anvender en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av Forbindelse I en spesiell mutant av Zalerion arboricola ved fermenteringen. Denne spe-sielle mutant ble først oppnådd ved å utsette Zalerion arboricola 20868 for et mutagent middel og isolering av de fremstilte kolonier. En enkelt koloni fra ca. åtti kolonier ble funnet å være anvendbar ved fremstilling av Forbindelse I som hoved-bestanddel.

For fremstilling av mutanten kan et hvilket som helst av de midler som vanligvis anvendes for å produsere mutanter, anvendes. Således kan det anvendes ultrafiolett stråling, kjemiske mutagener eller innskuddsmidler. Egnede kjemiske mutagener omfatter N-nitroso-N-methylurethan og N-methyl-N<1->nitro-N-nitrosoguanidin.

Den Z. arboricola-mutant som er anvendbar i foreliggende oppfinnelse, ble oppnådd ved å behandle en sporesuspensjon av S. arboricola ATCC 20868 i 0,3 M tris(hydroxymethyl)amino-methan (TRIS)-buffer pH = 7 med N-nitroso-N-methylurethan,

plassering av den behandlede suspensjon på potetdextroseagar og inkubering for å utvikle kolonier, deretter isolering av koloniene, overføring av de separerte kolonier til potetdextroseagar-skrå og inkubering i 10 til 14 dager ved 25° C for å oppnå kulturer av mutanter av Z. arboricola, av hvilke én forsøksvis ble identifisert som Z7-9 og deretter bibeholdt som MF 5404 og deponert i den permanente kultursamling til American Type Culture Collection og betegnet med tilvekstnummeret ATCC 20957.

Mutanten kan anvendes på i det vesentlige samme måte som foreldre-mikroorganismen. Således kan fermentering under anvendelse av denne mutant utføres ved å anvende de ovenstående temperatur- og pH-betingelser i næringsmediene som er beskrevet ovenfor, fortrinnsvis i ett av de medier som er identifisert som S6, TG102 eller TG103 i en passende periode på opp til ca. 30 dager. Etter fullføring av dyrkingen innhøstes produktene og Forbindelse I isoleres.

Etter produksjon ved dyrking under anvendelse av én av de ovenfor beskrevne metoder, innhøstes Forbindelse I og isoleres fra mediet.

De nøyaktige trinn kan variere avhengig av om fermenteringen utføres i fast eller flytende medium, hvilket løsnings-middel som anvendes og hvilken adsorbent eller kombinasjon av adsorbenter som anvendes.

Når fermenteringen utføres på et fast medium, kan det første trinn utføres ved å tilsette et alkoholisk løsningsmiddel til fermenteringsmediet, blande grundig, så filtrere, gjenvinne og konsentrere det vandige alkoholfiltrat. Det konsentrerte filtrat kan først tilbakeekstraheres eller vaskes med et lavere alifatisk hydrocarbonløsningsmiddel som for eksempel hexan eller et annet alkan for å fjerne alkanløselige forurensninger. Det alkan-vaskede filtrat kan ekstraheres eller fordeles med

et vann-blandbart, oxygenert, organisk løsningsmiddel og den resulterende løsning konsentreres, så plasseres på en kromato-grafikolonne for minst ett, generelt flere separeringstrinn. Egnede kolonner er silicagel, omvendt fase-silicagel og "Sephadex" LH-20 (Pharmacia) dextran-absorbent.

Når fermenteringen utføres i et væskemedium, filtreres myceliefaststoffene i én metode og gjenvinnes fra fermenteringsmediet. Alkohol tilsettes til mycelkaken og mycel-faststoffet blandes grundig med alkoholen, filtreres og fil-tratet oppsamles og konsentreres. I en alternativ metode kan hele væsken ekstraheres ved tilsetning av ett volum alkanol, fortrinnsvis ethanol, og filtreres for å fjerne faste forurensninger. Alkanolekstrakten adsorberes på "Diaion" HP-20-(styren-divinylbenzen-kopolymer, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd) harpiks og elueres med 100 % alkanol. "Diaion" SP-207 (bromert) eller en annen, kommersielt tilgjengelig styren-divinylbenzen-kopolymer kan også anvendes. Et andre fortynnings-HP-2 0-adsorpsjons/elueringstrinn anvendes for å konsentrere prøven som forberedelse for kromatografiske separeringer. Noen ganger kan et tredje fortynnings/HP-20-adsorpsjons/eluerings-trinn være ønskelig for volumreduksjon.

Det alkoholiske løsningsmiddel som skal anvendes i den første ekstraksjon av det aktive middel fra det faste næringsmediet eller fra mycelputen, kan være hvilke som helst av de lavere alkoholer som for eksempel methanol, ethanol, isopropanol og lignende. Methanol foretrekkes.

Dersom det aktive middel fordeles fra alkanol- eller methanol-løsningen, er de egnede løsningsmidler estere, som f.eks. ethylacetat, isopropylacetat, butylacetat, eller ketoner, som f.eks. methylethylketon.

Den kromatografiske separering kan utføres ved å anvende konvensjonell kolonnekromatografi med ikke-ionisk harpiks eller ved høyytelsesvæskekromatografi under anvendelse av omvendt fase-harpiks. De fraksjoner som inneholder den antibiotiske Forbindelse L, kan påvises ved antisoppforsøk ved bruk av Candida albicans. Generelt anvendes fler enn én kromatografisk separering. I den mest foretrukne fremgangsmåte utføres én eller flere separeringer ved å anvende kolonne-kromatograf i, og en slutt-separering utføres ved anvendelse av høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) med C^g-harpiks med motsatt fase.

Når det anvendes konvensjonell kolonnekromatografi for kromatografiske separeringer, er silicagel den foretrukne adsorbent. Vanligvis anvendes mer enn én kromatografisk separering. Silicagel kan anvendes i alle separeringer, mens det anvendes forskjellige elueringsmidler. Den kan imidlertid med fordel kombineres ved bruk av en annen absorbent som for eksempel en dextranadsorbent som selges under varemerket "Sephadex" LH-20. Andre adsorbenter som for eksempel aluminiumoxyd,

styren-divinylbenzen-kopolymerer som er kommersielt tilgjenge-lige som "Diaion" HP-20, HP-30, HP-40, Sp-207 og "Amberlite" XAD-2, XAD-4, XAD-16 (Rohm and Haas Co.), kan også anvendes.

Ved fraksjoneringen og gjenvinningen av den aktive bestanddel ved kromatografi på silicagel gir ester/alkohol-blandingen med økende konsentrasjon av alkohol god separering. En blanding av ethylacetat og methanol er funnet å være spesielt anvendbar. Disse kan anvendes i isocratiske trinngradient-eller kontinuerlige gradient-systemer. Når det anvendes en dextran-adsorbent som f.eks. "Sephadex" LH-20, anvendes et klorhydrocarbon/hydrocarbon/alkohol-løsningsmiddelsystem. En blanding av methylenklorid/hexan/methanol er funnet å være spesielt anvendbar.

Ved innføring av HPLC-separeringen konsentreres det alkohol-løsnings-inneholdende materiale som gjenvinnes fra den konvensjonelle kromatografi, og resten oppløses i methanol/vann i det samme forhold som finnes i den mobile fase og plasseres på en kolonne pakket med kommersiell omvendt faseharpiks eller på en kolonne fylt med silicagel/C^g motsatt faseharpiks fremstilt som rikelig rapportert i litteraturen. Alternativt kan alkoholløsningen fortynnes til 52 % vann og pumpes på kolonnen. Kolonnen opereres ved bruk av methanol/vann (1:1 eller eventuelt andre innhold) ved 56 - 140 kg/cm 2 som gir en strømningshastig-het på ca. 20 ml/min. Separasjon styres ved 210 nm.

Fraksjonene undersøkes på aktivitet med Candida albicans og analyttisk HPLC. Produktet gjenvinnes fra hvilke som helst av de kromatografiske fremgangsmåter ved å kombinere de Candida albicans-aktive fraksjoner og konsentrere under redusert trykk.

Når fermenteringen utføres ved bruk av mutanten,

ATCC 20957, er isolasjonsfremgangsmåten i hovedsak den samme. Med elimineringen av en rekke mindre produkter i den fremgangsmåte som anvender mutanten, forenkles imidlertid den isolasjons-fremgangsmåte som anvender kromatografiske fremgangsmåter meget, og antallet kromatografiske separasjoner som er nødvendig redu-seres meget.

De overlegne egenskaper til Forbindelse I som et terapeutisk middel ved behandling av mycotiske infeksjoner kan illustreres med minimum fungicid konsentrasjon (MFC)-resultater i tester mot Candida albicans, Candida tropicalis og Candida parapsilosis.

Aktiviteten kan påvises i et mikrokraft-fortynnings-forsøk hvor det som medium anvendes en gjærnitrogenbase (Difco) med 1 % dextrose (YNBD). Ved utførelse av forsøket ble Forbindelse I solubilisert i 10 % dimethylsulfoxyd (DMSO) og fortynnet til 2560 ug/ml. Forbindelsene ble videre fortynnet til 256 ug/ml i YNBD. Så ble 0,15 ml av suspensjonen overført til den første rekke i en 96 brønns plate (hver brønn inneholder 0,15 ml av YNDB) som resulterer i en medisinkonsentrasjon på 128 ug/ml. To gangers fortynninger ble så gjort for å oppnå sluttkonsentrasjoner av legemidler varierende fra 128 til 0,06 ug/ml.

Gjærkulturene, holdt på Sabouraud dextroseagar, ble overført til YM-kraft (Difco) og inkubert over natten ved 35° C med rysting (250 omdr. pr. min.). Etter inkubering ble hver kultur fortynnet i sterilt vann for å gi en sluttkonsen-trasjon på 1 - 5 x 10 koloni-dannende enheter (CFU)/ml.

96-brønns mikroplater ble inokulert ved bruk av en MIC-2000 (Dynotech) som avgir 1,5 \ il pr. brønn for å gi et slutt-inoculum pr. brønn på 1,5 - 7,5 x 10 3 celler. Mikro-platene ble inkubert ved 35° C i 24 timer. De minimale inhiberende konsentrasjoner (MIC) ble nedtegnet som de laveste konsentrasjoner av legemiddel som ikke oppviste synlig vekst.

Etter nedtegning av MIC ble platene rystet for å resuspendere cellene. Deretter ble 1,5 ul prøver fra brønnene i 96 brønns-mikroplaten overført til et enkelt brønnbrett inneholdende Sabouraud dextroseagar. De inokulerte brett ble inkubert i 24 timer ved 28° C og så avlest. MFC defineres som den laveste konsentrasjon av legemiddel som ikke viser vekst eller mindre enn 4 kolonier pr. flekk.

De foregående resultater er eksempler på de overlegne og konstante, antimycotiske egenskaper som Forbindelse I viser.

Forbindelsen har potensiale som en erstatning for et kjent antisoppmiddel, som mens det er effektivt som et anti-soppmiddel, har begrenset anvendbarhet da det har lytisk effekt på røde blodlegemer ved lave dosenivåer.

Forbindelsen er også et bredspektret antisoppmiddel som er effektivt mot mange sopparter, både trådsopper og gjær.

Forbindelsen er anvendbar for inhibering eller dem-ping av Pneumocystis carinii-infeksjoner. I en slik anvendelse administreres Forbindelse I i en terapeutisk effektiv eller inhiberende mengde til personer som er infisert med eller til personer med nedsatt immunitet som er utsatt for å infiseres med Pneumocystis carinii. Effektiviteten til Forbindelse I for terapeutisk eller anti-infiserende formål kan påvises i undersøkelser på immun-nedsatte mus eller rotter.

I et representativt undersøk ble ti C3H/Hej-hannmus som veide 22 - 24 g hver, immunoundertrykket ved tilsetning av dexamethason til drikkevannet (8,0 mg/l) i seks uker for å indusere utviklingen av P. carinii-infeksjoner. For å øke infeksjonen ble musene også holdt på en lav proteindiett.

Ved begynnelsen av den 7. uke ble musene delt i to grupper. Begge grupper fortsatte å motta dexamethason i drikkevannet og lav proteindiett for resten av undersøkelsen. Mus i Gruppe I ble daglig injisert intraperitonealt med 0,5 ml av en 20 % DMSO-løsning som en bærerkontroll. Mus i Gruppe II fikk injisert intraperitonealt to ganger daglig 0,5 ml sterilt vann inneholdende 0,0125 mg av Forbindelse I (oppløst i DMSO, sluttkonsen-trasjon av DMSO er 10 %, aktuell dose, 0,5 mg/kg). Behandlingsperioden varte i to uker.

Ved slutten av behandlingsperioden (en total på 8-ukers immunoundertrykkelse) ble dyrene drept og lungevevet fjernet. Vevet ble så behandlet for å bestemme antall cyster i hvert dyr. Forbindelse I reduserte antallet av cyster med 81 % sammenlignet med kontrolldyrene.

De nedenstående egenskaper anvendes mer- effektivt når forbindelsen sammensettes med de farmasøytiske preparater med en farmasøytisk akseptabel bærer ifølge konvensjonelle farma-søytiske sammenblandingsteknikker.

De nye preparater inneholder minst en terapeutisk antisopp- eller antipneumocystisk vektmengde av den aktive forbindelse. Generelt inneholder preparatene minst 1 vekt% av Forbindelse I. Konsentratpreparater som er egnet for fortynninger før bruk, kan inneholde 15 % eller mer og i noen preparater 90 % eller mer. Ved fremstilling av preparatene blandes Forbindelse I godt med hvilke som helst av de vanlige, farma-søytiske medier.

Preparatene kan fremstilles i former for oral, paren-teral, topisk eller pulmonal (inhalerings)-administrasjon.

Oral administrasjon kan foretas med flytende eller faste preparater. For flytende preparater sammenblandes det terapeutiske middel med flytende bærer som for eksempel vann, glykoler, oljer, alkoholer og lignende. For faste preparater som for eksempel kapsler og tabletter, sammenblandes det terapeutiske middel med faste bærere som f.eks. stivelser, sukkere, kaolin, ethylcellulose, calsium- og natriumcarbonat, calsiumfosfat, kaolin, talkum, lactose, generelt med smøremidler som f.eks. calsiumstearat, sammen med bindemidler, desintegreringsmidler og lignende. På grunn av deres lette administrasjon represen-terer tabletter og kapsler de mest fordelaktige orale doserings-former .

Forbindelse I kan sammensettes til terapeutiske preparater for injeksjon. Videre kan den foreligge i enhetsdoseringsform, i ampuller eller i heldosebeholdere, og om nødvendig med et tilsatt konserveringsmiddel. De injiserbare preparater kan ha slike former som suspenjoner, løsninger eller emulsjoner i olje eller vandige bærere som f.eks. 0,85 % natriumklorid eller 5 % dextrose i vann, eller kan solubiliseres i alkohol/ propylenglykol eller polyethylenglykol og kan inneholde sammen-blandingsmidler som f.eks. suspenderings-, stabiliserings-og/eller dispergeringsmidler. Bufringsmidler såvel som andre additiver kan tilsettes. Alternativt kan de aktive ingredienser foreligge i pulverform for rekonstituering med en passende bærer før administrasjon.

Preparatene kan sammensettes til enhetsdoseringsform. Uttrykket "enhetsdoseringsform" slik det anvendes i beskrivelsen og kravene, refererer til fysisk adskilte enheter, idet hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde aktiv bestanddel beregnet på å gi den ønskede terapeutiske effekt i forbindelse med den farmasøytiske bærer. Eksempler på slike enhetsdose-ringsformer er tabletter, kapsler, piller, pulverpakker, kjeks, målte enheter i ampuller eller i flerdosebeholdere og lignende. En enhetsdosering kan avhengig av bruken inneholde fra 35 til 200 mg eller mer av legemiddelbestanddelen.

Dersom anvendelsen skal være lokal, kan legemidlet iblandes i konvensjonelle kremer og salver som for eksempel hvit vaselin, vannfri lanolin, cetylalkohol, koldkrem, glyceryl-monostearat, rosenvann og lignende. Vanligvis fremstilles en 1 til 2 % kremløsning og påføres på det område som skal behand-les .

For anti-pneumocystisk bruk kan administrasjon ved inhalering være spesielt anvendbar. For administrrasjon ved inhalering kan Forbindelse I avgis i form av en aerosol-

spray fra trykksatte innpakninger eller forstøvere. Forbindelsene kan også leveres som pulvere som kan være sammensatte,

og pulverblandingen kan inhaleres ved hjelp av en pulver-innblåsningsinhaleringsanordning. Det foretrukne avgivnings-system for inhalering er en målt doseinhalerings (MDI)-aerosol, som kan sammensettes som en suspensjon eller løsning av Forbindelse I i passende drivmidler, som f.eks. fluorcarboner eller hydrocarboner.

På grunn av den dårlige løselighet av forbindelsen i farmasøytisk akseptable flytende bærere og på grunn av ønskelig-heten av direkte å behandle lunge og bronkier, er aerosol-administrasjon en foretrukket administrasjonsmetode. Innblås-ning er også en ønskelig metode, spesielt når infeksjonen kan ha spredt seg til ørene og andre kroppshulrom.

For ikke-medisinsk anvendelse kan produktet anvendes

i preparater i en inert bærer som omfatter findelte, tørre eller flytende fortynningsmidler, strekkmidler, fyllstoffer, kondisjoneringsmidler og hjelpemidler, inkludert forskjellige leirer, diatoméjord, talkum og lignende, eller vann og forskjellige organiske væsker som for eksempel lavere alkanoler, for eksempel ethanol og isopropanol, eller kerosen, benzen, toluen og andre petroleumdestillatfraksjoner eller blandinger derav.

Ved utførelse av oppfinnelsen kan en antisoppmengde av preparatene påføres direkte på områder der soppkontroll er ønsket.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel I

En frosset kultur av MF-5171 Zalerion arboricola, ATCC nr. 20868, som er vedlikeholdt i Merck kultursamling, ble anvendt i fermenteringen.

Hele skråen av en 2,5 ml frosset kultur ble tint og aseptisk overført til en 250 milliliters 3-halskolbe inneholdende 40 milliliter av Medium I (sammensetning angitt i detalj tidligere).

Medium I, inokulert med kulturen, ble inkubert ved 26° C i fem dager med omrøring med 220 omdr. pr. min. for å oppnå en moden kimkraft.

Kimkraft ble fremstilt på lignende måte fra Medium II med den sammensetning som allerede tidligere er angitt i detalj. Kim fra Medium I og Medium II ble så inokulert i 7,5 ml av hen-holdsvis Medium I og Medium II, i en mengde av 5 % og inkubert ved 26° C for å etablere vekst. Ved slutten av denne periode ble følgende aminosyrer tilsatt til de separate rør av hvert medium: L-prolin, D-prolin, L-azetidin-2-carboxylsyre og 3,4-dihydro-L-prolin, og Forbindelse X som kontroll. Rørene ble inkubert ved 2 6° C ved 22 0 omdr. pr. min. i 14 dager.

Ved slutten av denne periode ble kraften i hvert av rørene fortynnet med et likt volum methanol, blandingen ble homogenisert og klarnet ved filtrering. Methanolblandingen ble underkastet redusert trykk for å fjerne methanolen og gjenvinne en rest som så ble ekstrahert to ganger med 10 milliliter ethylacetat. Ethylacetatløsningen ble tørket over magnesiumsulfat.

I separate operasjoner ble de tørkede løsninger konsentrert til tørrhet og rekonstituert med 0,5 ml methanol.

Hver resulterende løsning ble fortynnet 1:5, og 10 ul av den fortynnede løsning ble anvendt i et analyttisk HPLC-forsøk på "Zorbax" ODS (duPont)-kolonne ved bruk av 1:1 acetonitril/vann med Forbindelse X som hadde retensjonstider på 8,38 minutter (Medium I) og 8,29 minutter (Medium II) som kontroller. Røret med Medium I til hvilket L-prolin og 3,4-dehydro-L-prolin var tilsatt og røret med Medium II til hvilket L-prolin, L-azetidin-carboxylsyre og 3,4-dehydro-L-prolin var tilsatt, viste reten-sjonstopper i området 7,39 - 7,48 minutter i tillegg til en retensjonstid på 8,28 - 8,38 minutter som kunne tilbakeføres til Forbindelse X.

Bioautografiske HPLC-forsØk ble også utført på de samme 10 \ il fermenteringsprøver som var anvendt for analyttisk HPLC. 10 mikroliter prøve ble brukt pr. injeksjon og eluert med acetonitril/vann (1:1) ved en strømningshastighet på 1 ml/ min og 200 mikroliter/kutt med et tomromvolum på 1,5 milliliter. Fraksjonene ble oppsamlet i en mikrotiterplate med 9 6 brønner. HPLC-lØsningsmidlet ble fordampet, og til hver brønn ble det tilsatt 0,2 milliliter potetdextrosekraft som var inokulert med Candida albicans MY-1028 og dyrket i 24 timer. Aktivitet ved siden av den som kunne tilbakeføres til Forbindelse X ble funnet i den prøve som ble oppnådd fra det medium til hvilket 3,4-dehydro-L-prolin var tilsatt i fraksjonen, hvilket tilsvarer en topp som ble funnet ved 7,57 minutter. Denne topp tilsvarer de 7,39 til 7,48 minutter som ble funnet i den analyttiske HPLC-vurdering.

En liten mengde av forbindelsen ble isolert fra den bioautografiske HPLC-bestemmelsen. FAB-massespekteret for den mindre bestanddel fra den dirigerte biosyntese ved bruk av 3,4-dehydro-L-prolin viste et molekylært ion ved 14 masseenheter lavere enn Forbindelse X.

Eksempel II

Fermentering

Innholdet i et frosset medisinglass (ca. 2 milliliter) av kulturen MF 5171 (Zalerion arboricola) ble " inokulert i 54 milliliter KF kimmedium i en 250 milliliters Erlenmeyer-kolbe. Kulturen ble inkubert ved 25° C i 3 dager ved 220 omdr. pr. minutt på en rystemaskin. En prøve av kulturen (5 ml) ble inokulert i en 2-liters Erlenmeyer-kolbe inneholdende 500 milliliter av KF-kimmediet og dyrket ved 25° C i 3 dager under rysting ved 220 omdr. pr. minutt.

Ved slutten av 3-dagersperioden ble 5 milliliter av kulturen inokulert i hver av fem 2-liters Erlenmeyer-kolber inneholdende 500 milliliter av kimmediet og dyrket ved 25° C i 3 dager ved 220 omdr.pr.min. Disse kolber ble samlet og inokulert i et 75 liters omrørt kar inneholdende 50 liter produksjonsmedium med følgende sammensetning:

Dyrking ble fortsatt i 8 dager ved 25° C ved en omrøringshastighet på 300 omdr.pr.min. og en luftstrøm på 5 liter/minutt. Deretter ble fermenteringskraften høstet for isolasjon.

Isolasjon

Hele kraften fra den foranstående 70 liters fermen-teringssats ble filtrert og myceliekaken ble ekstrahert med 10 liter methanol. Methanolekstrakten ble filtrert og fortynnet med 10 liter vann og adsorbert på 1,2 liter HP-20-harpiks og eluert med 100 % methanol. Det methanol-rike kutt, som oppgikk til 1500 milliliter, ble konsentrert til 150 milliliter.

Konsentratet ble fortynnet til en 40 % methanol/60 % vann-blanding og adsorbert på 200 milliliter HP-20. Kolonnen ble vasket i rekkefølge med methanol/vann (50:50), vann og acetonitril/vann (25:50), og så ble metabolittene eluert fra kolonnenmed acetonitril/vann (50:50).

Sytti milliliter av de 400 miniliterne av kuttet fra HP-20-adsorpsjonen, som var rike på biologisk aktivitet, ble fortynnet til 300 milliliter med vann, filtrert og tilsatt ved en strømningshastighet på 10 ml/min på en 80 milliliters "Zorbax" ODS-kolonne som var bragt i likevekt med acetonitril/ vann (12,5/87,5). Kolonnen ble eluert med en strømningshastig-het på 20 milliliter/minutt med acetonitril/vann (40/60), fulgt av acetonitril/vann (50:50). Forbindelsene ble eluert med blandingen av 50/50 acetonitril/vann. Kolonnen ble styrt via UV ved 210 nm og antisoppforsøk med Candida albicans MY-1028, og analyttiske HPLC-vurderinger ble utført på fraksjonene.

På basis av disse analyser ble visse fraksjoner kombinert.

En prøve av dé-}«xmbinerte fraksjoner etter konsentre-ring til tørrhet og vurdering ved analyttisk HPLC ble funnet å være en l:l-blanding av Forbindelse X og Forbindelse I.

Den foranstående prøve som oppgikk til ca. 7,5 mg av Forbindelse X og 7,5 mg av Forbindelse I i 3,2 milliliter methanol, ble fortynnet til 10 milliliter med vann og injisert på en "Dynamax"-60 A8uM C18 21,4 mm ID x 25 cm-kolonne (utstyrt med en 5 cm beskyttelseskolonne (Rainin Instrument Co., Inc. Woburn, MA)) som på forhånd var bragt i likevekt med acetonitril/vann (60:40). Blandingen ble så eluert med det samme acetonitril/vann-elueringsmiddel ved 10 milliliter/minutt ved omgivelsestemperatur, og fraksjoner av 15 milliliter hver ble oppsamlet. 30 minutter etter injeksjonen ble en lineær gradient over 60 minutter injisert som øket acetonitrilkonsentra-sjonen fra 40 til 60 %. Avlesninger ved 210 nm og etter-følgende HPLC-analyse av kuttene indikerte at det var tre fraksjoner som inneholdt Forbindelse I. Midtfraksjonen som inneholdt det meste av og den reneste Forbindelse I, ble konsentrert til tørrhet og en foreløpig massespektralbestemmelse utført.

Lithierte massespektra med raskt atombombardement (FAB-MS) indikerte at molekylvekten var 1064. Gasskromatogram-massespektra (GC-MS) av trimethylsilyl (TMS)-derivatet av det totale syrehydrolysat avslørte som hovedbestanddeler threonin, 4-hydroxyprolin, et oxydasjonsprodukt av ornithin-liknende forbindelse, 3-hydroxyglutaminsyre, en C^g-fettsyre og 3-hydroxyprolin. På basis av denne analyse ble strukturen til Forbindelse I foreslått.

Bestanddelen i denne fraksjon ble ytterligere renset ved oppløsning av fraksjonen i 33 ul methanol, 100 ul vann og 10 ul trifluoreddiksyre (TFA) og kromatografering av den resulterende løsning på en Dynamax-60 A C18 10 mm ID 25 cm-kolonne som var bragt i likevekt med 55 % 0,1 % TFA i vann/ 45 % acetonitril. Eluering med det samme løsningsmiddelsystem ved 4 ml/min ved omgivelsetemperatur ga tre fraksjoner som hadde adsorpsjonstopp ved 210 nm. To av fraksjonene ble inn-dampet til tørrhet og analysert på <1>H NMR. Foreløpig ^"H NMR understøttet formelen for Forbindelse I.

En renset prøve av Forbindelse I har " H NMR på fig. 1 og <13>C NMR og massespektraldata som er angitt i detalj tidligere.

Eksempel III

50 milliliter KF-kimmedium i en 250 milliliters Erlenmeyer-kolbe ble inokulert med et frosset medisinglass av Z. arboricola og rystet ved 220 omdr.pr.min. og 25 Ci 72 timer. 2 milliliter av dette kim ble anvendt for å inokulere 50 milliliter KF-medium og ble dyrket i 72 timer. Det andre trinn ble anvendt for å inokulere produksjonsmediet. 40 milliliter av medium som tidligere er angitt i detalj som Medium S-6 i 250 milliliters Erlenmeyer-kolber, ble inokulert med 2 milliliter kim og kolbene rystet ved 22 0 omdr.pr.min. og 25° C i 14 dager. Totalt 125 kolber ble samlet for å få 5 liter ferdig kraft. Hele kraften ble vakuumfiltrert gjennom et 2,5 cm's lag av "Super-Cel" (Manville). Ingen aktivitet ble påvist i den filtrerte kraft. Myceliekaken ble ekstrahert med 1 liter methanol over natten med omrøring. Methanolekstrakten ble undersøkt på nærvær av bioaktive forbindelser ved bruk av et skivediffusjonsforsøk med C. albicans MY1028 og HPLC-forsøk (50/50 acetonitril/0,01 M kaliumfosfat pH 7,0) og sammenligning av resultatene med den tidligere oppnådde prøve av Forbindelse X som standard. Methanolekstrakten ble fortynnet til en slutt-konsentrasjon på 50 % vandig methanol og adsorbert på en 200 milliliters HP-20-kolonne med en strømningshastighet på 20 ml/ min. Kolonnen ble vasket med tre kolonnevolumer av 50 % vandig methanol. Aktiviteten ble eluert med seks kolonnevolumer av 75 % vandig methanol. De ønskede bestanddeler var de passende fraksjoner med Forbindelse I og Forbindelse X som ble kombinert til 1,7 liter.

Den prøve som inneholdt bioaktive bestanddeler, ble fortynnet med 1,7 liter vann for å få sammensetningen 50:50 methanol/vann og blandingen filtrert for å fjerne uløselige partikler. Dette preparat ble så adsorbert på en 88 milliliters "Zorbax" 0,05-kolonne (på forhånd bragt i likevekt med 50:50 methanol/vann) ved 20 ml/min. Kolonnen ble eluert med 45:55 acetonitril/vann ved 20 ml/min, 20 milliliters fraksjoner ble tatt ut etter et 30 milliliters tomvolum. Kromatografien ble styrt via UV ved 210 nm, via analyttisk HPLC og via antisopp-bioforsøk (C. albicans MY1028). Visse fraksjoner ble kombinert, basert i hovedsak på analyttisk HPLC. En blanding av Forbindelse I og Forbindelse X som oppgikk til 80 milligram, ble vist å inneholde 19,8 milligram av Forbindelse: i.

Eksempel IV

Innholdet i et medisinglass ble frosset, vegetativt mycel av Zalerion arboricola, ATCC 20868, ble tint og anvendt for å inokulere 54 milliliter KF i kimmedium som så ble inkubert i 3 dager ved 25° C med 220 omdr.pr.min. på en roterende rystemaskin med et kast på 5 cm for å fremstille en kimkultur.

2 milliliters porsjoner av kimkulturen ble inokulert

i en 250 milliliters Erlenmeyer-kolbe inneholdende 50 milliliter TG103-medium og inkubert i 5 dager ved 25° C med rysting.

Ved slutten av perioden ble fermenteringskraften høstet. Ved innhøsting ble væskekulturen sentrifugert for å separere cellene fra kultursupernatanten. Cellene ble blandet med en 20 ml<1>s porsjon methanol og ekstraksjonen fikk foregå over natten ved romtemperatur. Faststoffene ble fjernet ved sentrifugering og methanolekstrakten ble så injisert på en 5 u "Ultrasphere" (Beckman Engineering)-kolonne (4,6 mm x 25 cm) som ble eluert isokratisk med acetonitril/vann 48/52 med en strømningshastighet på 0,75 ml/min. Den utløpende væske ble styrt ved 210 nm, og 0,25 ml fraksjoner ble oppsamlet i mikrotiterplater i 9 6 brønner. Løsningsmidlet ble fjernet fra platene i vakuum, og platene ble undersøkt på bioaktivitet ved i hver brønn å plassere en gjærekstrakt-, pepton-, dextrose-(YEPD) kraft og med følgende sammensetning:

som var kimsatt med Candida albicans MY102 8 og inkubering over natten ved 37° C. Resultatene viste produksjonen av Forbindelse I. Forbindelse X produseres også.

Eksempel V

250 milliliters kolber ble preparert inneholdende 54 milliliter KF kimmedium (tidligere angitt) og inokulert fra en agarskrå av MF5404 Z. arboricola ATCC 20957 og inkubert ved 25° C i 4 dager ved 220 omdr.pr.min. En 20 milliliters prøve ble brukt for å inokulere hver av fire 2-liters kolber inneholdende 500 ml KF-medium. Kolbene ble inkubert ved 25° C i tre dager ved 220 omdr.pr.min. Flaskeinnholdene ble så samlet for bruk som inokulum for et 300 liters kimfermenteringskar inneholdende 180 liter KF-medium og 2 ml/liter polypropylenglykol P-2000 (Dow Chemical Co.) tilsatt for å redusere skumming. Fermen-.teringskaret ble operert i 3 dager ved en temperatur på 25° C, en luftstrøm på 90 liter/min, et trykk på 0,7 kg/cm 2 gauge og en omrøringshastighet på 200 omdr.pr.min. En 25 liters prøve ble brukt for å inokulere et 800 liters produksjons-fermenteringskar inneholdende 475 liter TG10 3-medium med den sammensetning som er angitt tidligere, men til hvilket 2 ml/ liter polypropylenglykol P-2000 var tilsatt og sterilisert ved 120° C i 25 minutter. Fermenteringen ble utført i 5 dager ved en temperatur på 25° C, en luftstrøm på 250 liter/minutt, et trykk på 0,7 kg/cm 2 gauge og en omrøringshastighet på 150 omdr.pr.min. pH fikk minske fra en startverdi på 6,0 til 5,5 og så holdt ved 5,5 + 0,4 ved bruk av NaOH og H2S04. Etter 5 dager ble kraften fra to satser innhøstet for produktisolasjon.

750 liter methanol ble tilsatt til 750 liter hel fermenteringskraft og blandingen omrørt i 8 timer. Hele kraft-ekstrakten ble sentrifugert for å fjerne de uløselige fermen-teringsfaststoffer og for å gi 1436 liter klarnet supernatant, som ble justert til pH 7.

Et 77 liters "Diaion" SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries)-sjikt ble fremstilt ved å vaske methanol og på forhånd å bringe i likevekt med 50:50 methanol/vann (MeOH/H20). Den klarnede supernatant ble så tilsatt til SP-207 i en opp-strømsretning med en fluidisert sjikthastighet på 5,7 liter pr. minutt. Etter tilsetningen ble kolonnen vasket med 567 liter 65:35 methanol/vann og eluert med 454 liter 100 % methanol.

MeOH/H20 65:35- og 100 % MeOH SP-207-kuttene fra SP-207-kolonnen ble kombinert og justert til en sammensetning. 50:50 for MeOH/H20 ved tilsetning av H20 for å gi et 945 liters rikt kutt. Dette rike kutt ble tilsatt til en 108 liters "Diaion" HP-20-kolonne (vasket med methanol og på forhånd bragt i likevekt med MeOH/H20 50:50) med en strømningshastighet på 2-4 liter pr. minutt. Harpiksen ble så vasket med 567 liter MeOH/H20 65:35 og eluert med 454 liter 100 % MeOH.

HP-2 0-kuttet som var rikt på Forbindelse I, ble konsentrert til et volum på 6 liter, via først å fortynne med H20 og så adsorbere og eluere fra en mindre HP-20-kolonne

(10 liter) på en måte som er lik den som ble anvendt i den større HP-20-kolonne. 2 liter (av en total på 6 liter) av det konsentrerte HP-20-rike kutt ble fortynnet med 2 liter vann og tilsatt til-et 800A preparativt HPLC-system (Separations Technology) utstyrt med en 3,9 liters C18-kolonne (Amicon), som på forhånd var vasket med MeOH og på forhånd bragt i likevekt med MeOH/H20 50:50 . Satsen ble fulgt av 500 milliliters MeOH/H20 50:50 og eluert med en strømningshastighet på. 212 ml/min med en lineær gradient fra MeOH/H20 50:50 til 100 % MeOH i en 60 minutters tidsperiode. Fraksjoner ble analysert via HPLC, kombinert og konsentrert til tørrhet for å gi ca.

20 g av Forbindelse I med .88 % renhet.

Eksempel VI

Fra 6-liters konsentratet av HP-20-kutt som var rikt på Forbindelse I som er oppnådd som beskrevet i eksempel V, ble det tatt ut 900 milliliter for rensing.

Til 900 milliliter ble det tilsatt et like stort volum methanol, og til den resulterende løsning ble det tilsatt 900 milliliter vann, 900 milliliter hexan og 900 milliliter isopropylacetat og rystet kraftig. Det oppsto en useparerbar emulsjon, og til denne ble det tilsatt 450 milliliter methanol for å oppnå to sjikt. Det nedre sjikt som oppgikk til 2,5 liter, ble tilsatt til 900 milliliter hexan, 900 milliliter isopropylacetat og 450 mililiter methanol og igjen rystet kraftig, og det ble gjenvunnet et nedre sjikt på 3 liter. Fordelingstrin-net ble utført en tredje gang på det nedre sjikt for å generere et nytt nedre sjikt som oppgikk til 3 liter.

Det endelige nedre sjikt fra fordelingsforsøkene ble konsentrert til tørrhet. Resten (4 gram) ble tilsatt til 50 milliliter av en blanding av CH2Cl2/CH3OH/5%CH3CæH (72,5/27,5/10) hvorpå den ble oppløst i det nedre sjikt. Denne løsning ble kromatografert på 2 liter silicagel 60 (230 - 400 mesh) i en . mengde på 50 ml/min ved bruk av samme CH2Cl2/CH3OH/5%CH3COOH (72,5/27,5/10) (72,5/27,5,5/10) som den mobile fase for å oppnå Forbindelse I med høy renhet separert fra mindre bestanddeler.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv 1- [4, 5-dihydroxy-N2-(10,12-dimethyl-l-oxotetradecyl)-ornithin] - 5-( 3-hydroxyglutamin)-6-[3-hydroxyprolin]echinocandin B, med strukturformel

karakterisert ved at Zalerion arboricola-stammene ATCC 20957 og ATCC 20868 dyrkes i et vandig næringsmedium som inneholder 1) en carbonkilde omfattende minst 4 vekt% mannitol, 2) en nitrogenkilde omfattende et melkeproteinhydro-lysat, og 3) en buffer omfattende glycin eller et uorganisk fosfat, og eventuelt 4) sporelementer og melkesyre, og 5) en vegetabilsk olje valgt fra soya-, peanøtt-eller solsikkeolje, mens pH opprettholdes ved 5,5, hvoretter produktet separeres fra mediet.

2. Næringsmedium som er anvendbart for fremstilling av økede utbytter av forbindelsen ifølge krav 1,karakterisert ved at næringsmediet som benyttes og som øker utbyttet av forbindelsen inneholder i gram pr. liter av vandig medium: D-mannitol, 20-100, KH2P04, 0,5-3, glycin, 1-4, peptonisert melk, 2-20, melkesyre, 0-3, løsning av sporelementer, 0-15 ml og vegetabilsk olje, 0-20.

3. Næringsmedium som er anvendbart for økning av produksjonshastigheten av forbindelsen med formel (I) i krav 1, karakterisert ved at næringsmediet som benyttes og som øker utbyttet av forbindelsen omfatter et næringsmedium med assimilerbart carbon, assimilerbart nitrogen og uorganisk salt som inneholder minst 4 vekt% mannitol og en buffer for å vedlikeholde pH ved ca. 5,5.