FI93647C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 1-/4,5-dihydroksi-N2-(10,12-dimetyyli-1-oksotetradekyyli)ornitiini/-5-(3-hydroksiglutamiini)-6-(3-hydroksiproliini)ekinokandiini B:n valmistamiseksi - Google Patents

Description

93647

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen l-[4,5-dihydrok-si-N2-( 10,12-dimetyyli-l-oksotetradekyyli)ornitiini]-5-(3-hydroksiglutamiini)-6-(3-hydroksiproliini)ekinokandiini B:n valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen 1-[4,5-dihydroksi-N2- (10,12-dimetyyli-1-oksotetradekyyli)ornitiini]-5-(3-hydroksiglutamiini)-6-(3-hydroksiproliini)ekinokandiini B:n valmistamiseksi, 10 jolla on kaava

HO OH

O

NH2CCH2 \Jc=o n^/CHa HO » JIH 0=OoH

(I)

20 HO OH

Kaavan I mukaista yhdistettä tuotetaan keksinnön mukaisesti fermentoimalla tai viljelmällä Zalerion arboricola -mikro-organismia. Yhdisteen kaavan I mukainen yhdiste on 25 aiemmin tunnistamaton aine, jonka on havaittu olevan käyttökelpoinen sienten vastaisena aineena ja keuhkopöhöä vastaan suunnattuna aineena, ja jota tuotetaan viljelemällä Zalerion arboricolaa aerobisissa olosuhteissa. Keksintö koskee myös parannettua menetelmää kaavan I mukaisen yh-30 disteen aikaansaamiseksi ja myös menetelmää, jossa kaavan 1 mukainen yhdiste saadaan päätuotteena.

Kaavan I mukainen yhdiste voidaan nimetä seuraavasti: 1- [4,5-dihydroksi-N2-(10,12-dimetyyli-l-oksotetradekyyli )-3 5 orni tiini ] - 5- (3-hydroksiglutamiini )-6-( 3 -hydroksiprol ii- ni)ekinokandiini B.

O 7 £ Λ 7 ✓ J O ‘t / 2

Edullisen stereoisomeerin uskotaan olevan: l-[4, 5-dihydroksi-N2-( 10,12-dimetyyli-l-oksotetradekyyli )-L-ornitiini]-5-(3-hydroksi-L-glutamiini)-6-(3-hydroksi-L-proliini)ekinokandiini B.

5 Kuvataan myös parannetut menetelmät kaavan (I) mu kaista yhdistettä sisältävien koostumusten valmistamiseksi, yhdisteen muodostumisnopeuden kasvattamiseksi ja edelleen yhdisteen tuottamiseksi päätuotteena.

Yhdisteen rakenne on määritetty spektriominaisuuk-10 sien yksityiskohtaisten analyysien perusteella.

Massaspektritulokset

Elektronin törmäys(EI) -massaspektrin tulokset saatiin käyttämällä Finnigan-MAT 212 -massaspektrometriä 90 eV:n voimakkuudella. Kokonaishappohydrolysaattien TMS-15 (trimetyylisilyyli) johdannaisten kaasukromatogafia-massa- spektrogrammianalyysit suoritettiin samalla laitteella. Fast atom bombardment (FAB) -massaspektrit tallennettiin VG20-253 -laitteella.

Yhdisteen IA molekyylipainon määritettiin FAB-20 MS:11a olevan 1064 (havaittu (M+Li)* m/z 1071:n kohdalla). Kokonaishappohydrolysaatin GC-MS paljasti treoniiniä, 4-hydroksiproliinia, 3-hydroksiglutamiinihappoa, 3-hydroksi-proliinia ja tyydyttynyttä C16-rasvahappoa kutakin yhden ekvivalentin.

25 NMR-spektritulokset

Yhdiste I

*H NMR-spektri: CD30D 400 MHz taajuudella on kuviossa 1 nähtävän tuloksen mukainen ja CD3OD:ssa saadut 13C NMR kemialliset siirtymät 75 30 MHz:n taajuudella ilmoitettuna miljoonasosina suhteessa TMS:n 0:aan miljoonasosaan ja käyttäen sisäisenä standardina liuotinpiikkiä 49 miljoonasosan kohdalla ovat: 11,6, 19,7, 20,2, 20,7, 27,0, 28,1, 30,30, 30,34, 30,6, 30,8, 31,18, 31,24, 32,9, 34,5, 34,8, 36,7, 38,1, 38,5, 35 39,4, 45,9, 47,0, 51,4, 55,6, 56,3, 57,1, 58,3, 62,5, 68,2, 69,8, 70,55, 70,68, 71,3, 73,9, 74,3, 75,8, 76,9, 3 93647 16,2(SX), 129,6(SX), 113,0, 158,5, 169,1, 172,5, 172,7, 172,9, 173,4, 174,5, 175,8, 177,2 miljoonasosaa.

Näiden ja muiden saatujen tulosten perusteella yhdisteen I uskotaan huomattavalla varmuudella olevan esite-5 tyn rakenteen mukainen.

Yhdiste on valkoinen kiinteä aine, joka liukenee orgaanisiin liuottimiin, kuten metanoliin, etanoliin, di-metyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin, etyyliasetaat- » tiin ja vastaavanlaisiin liuottimiin.

10 Keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdisteellä on sekä rihmamaisia sieniä että hiivoja vastaan suunnattuja ominaisuuksia. Se on erityisen käyttökelpoinen patogeenisiä hiivainfektioita aiheuttavia eliöitä, kuten Candida albicansia, Candida rugosaa, Candida parapsilosista ja 15 niitä vastaavia eliöitä vastaan osoittaen ei vain huomattavaa aktiivisuutta vaan myös yhdenmukaisesti suurta akti-visuutta eliöiden laajennettua kantapaneelia vastaan.

Lisäksi päinvastoin kuin on laita monien sellaisten sieniä vastaan suunnattujen aineiden, kuten amfoterisiini 20 B:n, suhteen, joiden käyttöä rajoittaa se, että niillä on Candida albicansiin ja tiettyihin muihin taudinaiheuttaja-sieniin suunnatun vaikutuksen lisäksi myös haitallisia ja vaarallisia sivuvaikutuksia, keksinnön mukaisesti valmistetut aineet eivät ole ainoastaan hyvin tehokkaita sieniä 25 vastaan suunnattuja aineita vaan ovat myös olennaisesti ei-toksisia eikä niiden käytön yhteydessä olennaisesti esiinny haitallisia sivureaktioita.

Monien yhdisteiden käytön yhteydessä esiintyy yhdisteen pitoisuuden lähestyessä terapeuttista annosta pu-30 naisten verisolujen hajoamista, joka on vahingollinen ja mahdollisesti kohtalokas sivureaktio, joka on rajoittanut näiden yhdisteiden soveltuvuutta lääkeaineiksi. Kaavan 1 mukaisen yhdisteen suhteen on odotettavissa, että tarvitaan terapeuttista annosta paljon suurempi pitoisuus, en-35 nen kuin punaisten verisolujen hajoamista alkaa tapahtua.

4 93647

Yhdiste on myös tehokas sienten vastainen aine rih-mamaisia sieniä vastaan, mukaanlukien Aspergillus -lajit, Penicillium -lajit, Fusarium -lajit, Alternaria -lajit, Neurospora -lajit ja niitä vastaavat lajit.

5 Lisäksi yhdiste on käyttökelpoinen aine hoidettaes sa infektiota, jonka aiheuttaa Pneumocystis carinii, erityisen vakavan keuhkokuumeen aiheuttaja immuniteetin häiriöstä, kuten hankitusta immuunipuutostaudista (AIDSista), kärsivissä potilaissa.

10 Kaavan I mukainen yhdiste eroaa julkaisuista EP

331 193 sekä J. Antibiotics 42 (1989) 163 - 167, J. Antibiotics 42 (1989) 168 - 173 ja J. Antibiotics 42 (1989) 174 - 178 tunnetusta yhdisteestä siinä, että siitä puuttuu hydroksiglutamiinialayksikön viereisen peptidin hydroksi-15 proliinialayksikön metyyliryhmä. Vaikka tämä ero vaikuttaa ensikatsomalta mitättömältä erolta, tulee muistaa, ettei näiden yhdisteiden valmistus ole lainkaan yksinkertaista. Metyyliryhmää ei pystytä pelkästään lisäämään tai poistamaan kuten tavallisissa kemiallisissa menetelmissä. Mitä 20 tulee eroavaisuuksiin ominaisuuksissa, keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste eroaa tunnetusta yhdisteestä anti-mykoottiselta vaikutukseltaan tiettyjä sieniä kohtaan. Erityisesti keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste on tunnettua yhdistettä merkittävästi tehokkaampi Candida 25 tropicalis -hiivaa vastaan. Lisäksi uusi yhdiste on käyttökelpoinen Pneumocystis carinii -infektioiden ehkäisyssä tai lievittämisessä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi on tunnusomaista, että viljellään Zalerion arboricola -mikro-orga-30 nismia ravintoalustalla, joka sisältää assimiloitavia hiili- ja typpilähteitä.

Tämän keksinnön mukaisesti yhdistettä valmistetaan kätevästi viljelemällä Zalerion arboricola -viljelmää, joka on nimetty MF 5171:ksi Merckin viljelmäkokoelmassa ja 35 joka on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti Ameri- Q 7 £ A n s j O ‘t / 5 can Type Culture Collectionin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, viljelmäkokoelroaan ja joka on saatavissa talletusnumerolla ATCC 20868.

Vaikka näiden uusien yhdisteiden tuoton yhteydessä 5 käsitellään ensisijaisesti tiettyä kantaa, ATCC 20868:aa, kaikki Zalerion arboricola -suvun kannat ja mutantit kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

Kuitenkin eräs tietty talletuslaitoksessa Merck Culture Collection MF-5404:ksi nimetty ja Z. arboricola 10 ATCC 20957:nä talletuslaitoksesta American Type Culture

Collection saatavissa oleva mutantti on erityisen hyödyllinen yhdisteen I tuotossa. Tämän mutantin käyttö yhdisteen I tuotossa on myös kuvattu jäljempänä.

ATCC 20868:n ja ATCC 20957:n pesäkkeiden muodon 15 kuvaus esitetään seuraavassa.

Pesäkkeet peruna-dekstroosi -agarilla (Difco) 20 °C:een lämpötilassa ovat hitaasti kasvavia ja saavuttavat 8 - 12 mm läpimitan viikossa. Täysikasvuiset pesäkkeet (3-4 viikkoa) peruna-dekstroosi -agarilla ovat haritta-20 vat ja niiden hyyfit pinnanalaisia tai pinnalla olevia, niiden pinta on karvainen, villamainen tai juosteinen, niiden ulkonäkö vaihtelee himmeästä melko kirkkaaseen, niistä muodostuu koholla olevia ja tiheäkasvuisen kiinteitä pesäkkeitä ja niiden perusrakenteen osana on tiheän 25 konidiomuodostuksen aikaansaama kuviointi. Pesäkkeiden väri on vaalean oliivinruskea, oliivinvärinen, oliivinrus-kea, lopuksi oliivinmusta, Isabella Color, Sayal Brown, Tawny Olive, Saccardo's Umber, Sepia, Brownish Olive, Raw Umber, Dark Olive, Olivaceous Black (värien nimet teokses-30 ta R. Ridgeway, 1912, Colour Standards and Nomenclature, Washington D.C.). Pesäkkeissä tapahtuu samojen värien vaihtumista toisiinsa. Ei esiinny hajuja, eritteitä eikä liukenevia pigmenttejä.

Rihmasto (3-%:isessa K0H:ssa) on väriltään vaalean 35 kellanruskeasta oliivinruskeaan, väliseinällistä, haaroit- 6 93647 tunutta ja siinä on usein epäsäännöllisiä sivu- tai pääte-ulokkeita, se on 1 - 3 pm leveää, sen seinämäpaksuus vaih-telee ohuesta paksuhkoon, seinämien pinta vaihtelee si-leästä hieman kuorettuneeseen tai nysterömäiseen. Pinnalla 5 oleva rihmasto liittyy usein yhteen rihmastojänteiksi. Ei esiinny harjasmuodostusta eikä rihmastojalustoja.

Konidioita muodostavat solut ovat monoblastisiä, niiden esiintyminen vaihtelee hajanaisesta tiheään, ne * ovat integroituneita, terminaalisia ja interkalaarisia ja 10 ne syntyvät suoraan erilaistumattomasta rihmastosta kulmassa, joka vaihtelee suorasta hieman terävään. Konidiot saavat alkunsa epäsäännöllisinä ketjuina, rihmoina tai sykkyröinä kehittyen myöhemmin kiinteiksi, 6-25 solun epäsäännöllisiksi rykelmiksi. Yksittäiset konidiosolut 15 ovat läpimitaltaan 3-6 pm, muodoltaan ne ovat pallomaisia, mantelimaisia tai muoto vaihtelee hieman epäsäännöllisestä ulokkeita sisältävään, pinta vaihtelee sileästä hienosti nysterömäiseen ja väri kellanruskeasta oliivin-ruskeaan.

20 Yhdistettä I voidaan tuottaa viljelemällä Zalerion arborlcolaa sopivalla ravintoalustalla jäljempänä kuvatuissa olosuhteissa ja sen jälkeen ottamalla yhdiste talteen tuotantoliuoksesta uuttamalla aktiivinen ainesosa fermentaatioliuoksesta sopivalla liuottimena, väkevöimäl-25 lä halutun ainesosan sisältävä liuos ja sen jälkeen suorittamalla väkevöidylie materiaalille kromatografinen erotus yhdisteen I erottamiseksi muista samalla esiintyvistä aineenvaihduntatuotteista.

Eliö tuottaa myös yhdistettä X, joka on samanaikai-30 sesti jätetyn US-patenttihakemuksen 362 647 kohteena, jätetty 7. heinäkuuta 1989 ja continuation -hakemus 10. lokakuuta 1987 jätetystä US-hakemuksesta 105 795, joka on nyt hylätty, ja nimetty tässä l-[(4R,5R)-4,5-dihydroksi-N2-( 10,12-dimetyyli-l-oksotetradekyyli)-L-ornitiini]-5-35 (treo-3-hydroksi-L-glutamiini)ekinokandiini B:ksi.

7 93647

HO OH

«N/CHj HO H°'"NH 0=<'oh

1ϋ HO OH

Sen vuoksi yhdisteen I tuotannon edistämiseksi ravinto-alustaa muunnetaan tai käytetään suunnattua synteesimene-15 telmää tai erityisimmin käytetään mutanttia ATCC 20957 seuraavassa kuvatulla tavalla.

Tuotto

Kaavan I mukaisen yhdisteen tuotto voidaan suorittaa useita menetelmiä hyväksi käyttäen. Eräs menetelmä on 20 suunnattu biosynteesi, joka suoritetaan käyttämällä fer-mentaatioliuoksessa normaalisti tässä liuoksessa esiintymätön aminohappoanalogi typen ensisijaiseksi lähteeksi. Luonnossa tuntemattomien aminohappojen käyttämisen johon jäljempänä viitataan "analogien käyttämisenä" tai "suun-25 nattuna synteesinä", on havaittu lisäävän yhdisteen I muodostumista fermentaatioalustalla ja se on yksi tämän keksinnön puoli. Tällaisessa suunnatussa synteesissä luonnossa esiintymätön aminohappo tulee typen ensisijaiseksi lähteeksi. Eräs tehokkaimmista synteesiä suuntaavista amino-30 hapoista on 3,4-dehydroproliini. Muihin käyttökelpoisiin aminohappoihin luetaan L-proliini ja L-atsetidiini-2-kar-boksyylihappo.

Alusta voi muuten olla tavanomainen käytettäessä suunnattua synteesiä. Siten luonnossa esiintymättömien 35 aminohappojen lisäksi voidaan typen lähteinä käyttää moni- 8 93647 mutkaisia typpeä tuottavia lähteitä, kuten hiivahydroly-saatteja, hiiva-autolysaatteja, kaseiinihydrolysaatteja ja niitä vastaavia aineita.

Yleensä hiilen lähteisiin luetaan glyseroli, soke-5 rit, tärkkelykset ja muut hiilihydraatit tai hiilihydraatti johdannaiset, kuten dekstraani, sereloosi sekä kompleksiset ravinteet, kuten kaurajauhot, maissijauhot, hirssi, maissi ja niitä vastaavat aineet. Kasvualustassa käytettävän hiilen lähteen tarkka määrä riippuu osaltaan muista 10 alustassa käytettävistä aineista, mutta tavallisesti havaitaan, että 0,5 - 40 paino-% hiilihydraattia alustan painosta on tyydyttävä määrä. Näitä hiilen lähteitä voidaan käyttää yksinään tai useita tällaisia hiilen lähteitä voidaan yhdistää samaan alustaan.

15 Viljelyalustassa käytettäviin epäorgaanisiin ravin- nesuoloihin kuuluvat tavanomaiset suolat, joista saadaan natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium-, fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi- ja karbonaatti-ioneja ja näitä vastaavia ioneja. Alustaan sisältyy myös hivenaineita, kuten ko-20 boltti, mangaani, rauta, molybdeeni, sinkki, kadmium ja niitä vastaavat aineet.

Tyypilliset käyttökelpoiset alustat ovat seuraavia: Alusta I

25 Glyserolia 85,0 g

Pektiiniä 10,0 g

Maapähkinäjauhoa 4,0 g

Peptonoitua maitoa 4,0 g

Tomaattisosetta 4,0 g 30 Maissin liotusvettä 4,0 g

Ihravettä 4,0 g

Glysiiniä 2,0 g KH2P04 2,0 g

Tislattua vettä 1000,0 ml 35 pH ennen steriloimista * 7,0 9 93647

Alusta II

Sereloosia 20,0 g

Pharmamediaa* 2,5 g 85-%:ista laktaattia 2,0 g 5 KH2P04 15,0 g

Hivenaineita 10,0 ml

Tislattua vettä 1000,0 ml pH 7,0 10 Hivenaineet

Yhtä litraa 0,6 N HCl:ää kohti FeS04 · 7H20 1,0 g

MnS04 · 4H20 1,0 g

CuCl2 · 2HZ0 0,025 g 15 CaCl2 0,1 g H3BO3 0,056 g (ΝΗ4)6Μο7024 ·4Η20 0,019 g

ZnS04 7H20 0,2 g 20 * Pharmamedia on kaupallinen ravintoliuos, jonka pääasial linen komponentti on hydrolysoitumaton pellavansiemenestä johdettu globulaarinen proteiini, ja joka on saatavilla yhtiöstä Traders Protein, Buckeye Cellulose Corporation, Memphis, Tenn. 38108.

25 Yhdistettä I voidaan tuottaa "analogin käyttö" -me netelmällä suunnilleen seuraavalla tavalla: Pakastettu Zalerion arboricola -viljelmää sisältävä pullo ympätään sopivalle ymppäysalustalle, jonka pH vaihtelee välillä 5 - 8,1, optimaalisesti 6 - 7,5, ja kasvatetaan 2-30 30 päivän ajan, edullisesti 2-5 päivän ajan, lämpötilassa, joka vaihtelee välillä 15 - 30 eC, edullisesti 25 - 26 °C, joko sekoittaen tai ilman sekoitusta. Sekoittamista käytettäessä voi sekoitus tapahtua jopa nopeudella 400 kierr./min, edullisesti nopeudella noin 200 - 220 35 kierr./min. Kasvun muuttuessa runsaaksi viljelmää käytetään analogin käytöllä modifoltavan ja toissijaisen ai- 10 93647 neenvaihduntatuotteen tuottamiseksi viljeltävän liuoksen ymppäykseen.

Analogia lisätään viiden päivän kuluttua kasvun alkamisesta määrä, jolla saadaan 5-8 mg/ml:n loppupitoi-5 suus.

Fermentaatiota suoritetaan vähintään 14 päivän ajan 25-26 °C:een lämpötilassa sekoittaen 220 kierr./min.

Tämän jakson lopussa koko kasvuliemi uutetaan yhtä suurella tilavuudella liuotinta, kuten metyylietyyliketo-10 nia. Muihin sopiviin liuottimiin luetaan etyyliasetaatti ja asetoni. Tämän jälkeen liuotin poistetaan alipaineessa, jotta saadaan jäännös, joka voidaan liuottaa tunnettuun tilavuuteen metanolia, kuivata ja määrittää HPLC:llä, jonka jälkeen jäljelle jäänyt materiaali käsitellään eristys-15 menetelmillä.

Kun tuotantomenetelmänä ei käytetä suunnattua syn-tesiä, voidaan käyttää tavanomaisia materiaaleja.

Siten typen lähteinä voidaan käyttää ammoniumsuolo-ja, aminohappoja, kuten glysiiniä, arginiinia, treoniinia, 20 metioniinia ja niitä vastaavia aminohappoja sekä monimut kaisia ravintoaineita, kuten hiivahydrolysaatteja, hiiva-autohydrolysaatteja, hiivasoluja, tomaattimassaa, soijajauhoja, kaseiinihydrolysaatteja, hiivauutteita, maissin liotusvettä, distillers solubles -valmistetta, pellavan-25 siemenjauhoja, lihauutteita ja niitä vastaavia aineita.

Näitä monia erilaisia typen lähteitä voidaan käyttää erikseen tai yhdessä määränä, joka vaihtelee 0,2 - 10 pai-no-%:iin alustan painosta.

Hiilen lähteinä voidaan käyttää aikaisemmin esitet-30 tyjä aineita, vaikkakin glyserolia ja mannitolia sisältävät koostumukset ovat edullisia. Aikaisemmin kuvattu alusta 1 on kuvaava esimerkki glyserolia sisältävästä alustasta. Seuraavat alustat, jotka on nimetty RG2:ksi ja RG120:ksi, ovat kuvaavia esimerkkejä mannitolia sisältä-35 vistä alustoista: n 11 93647 RG2 -alusta RG120 -alusta litraa litraa kohti kohti

Mannitolia 44 g Mannitolia 91 g 5 Maissin liuotusvettä 4 g Maissin liuotusvettä 4 g

Ihravettä 4 g Ihravettä 4 g

Pektiiniä 10 g Pektiiniä 10 g KH2P04 2 g KH2P04 2 g

Tomaattimassaa 4 g Tomaattimassaa 4 g 10 Peptonoitua maitoa 4 g Peptonoitua maitoa 4 g

Glysiiniä 2 g Glysiiniä 2 g

Maapähkinäjauhoa 4 g Maapähkinäjauhoa 4 g pH säädetty 7,0:ksi pH säädetty 7,0:ksi 15 Lisäksi on saatu selville, että käyttämällä tietty jä mannitolia sisältäviä alustoja voidaan halutun tuotteen tuottoa lisätä. Parantunut tuotto voi ilmetä yhdisteen I parempana tuottona yhdisteen X tuoton suhteen tai kaikkien aineenvaihduntatuotteiden nopeampana muodotumisena.

20 Tuoton nopeus voi nousta useampikertaiseksi käyttä mällä mannitolia ainakin 4 paino-% alustassa, jonka pH pidetään tarkasti 5,5:ssä ja jossa typpilähteenä toimii hydrolysoitu kaseiini ja hiivasta saatu typpilähde. pH:n tarkan säätelyn aikaansaamiseksi on tärkeää, että mukana 25 on fosforia sisältävää puskuria, edullisesti yksiemäksistä kaliumfosfaattia. Esimerkkeinä sopivista nestemäisistä liuoksista ovat TG102:ksi ja TG103:ksi nimetyt liuokset.

12 93647 TG103 liuos TG103 liuos litraa litraa kohti kohti 5 D-mannitolia 40 g D-mannitolia 40 g

Bacto-Peptonea 33 g NZ-Amine (tyyppi E)* 33 g

Bacto-Yeast Extractia 10 g Fidco-Yeast Extractia 10 g (NH4)2S04 5 g (NH4)2S04 5 g KH2P04 9 g KH2P04 9 g 10 ei pH:n säätöä ei pH:n säätöä kaseiinihydrolysaatti, Humko-Sheffield, Memphis,

Term.

Lisäksi tietyt mannitolia sisältävät alustat suosi-15 vat tämän keksinnön mukaista yhdisteen I tuottoa yhdisteen X tuoton suhteen, joka normaalisti on Zalerion arboricolan viljelyn päätuote. Käyttämällä näitä alustoja yhdisteen I saannon on havaittu kasvaneen merkittävästi. Tämä alusta on sellainen, joka on olennaisesti neutraali ja joka si-20 sältää D-mannitolia hiililähteenä, maitoproteiinihydroly-saattia (peptonoitua maitoa) kompleksisena typpilähteenä, glysiiniä aminohappona ja fosforia sisältävää puskuria ja joka myös edullisesti sisältää maitohappoa, hivenaineita ja tiettyjä kasviöljyjä. Sopivia öljyjä ovat soija-, maa-25 pähkinä ja auringonkukkaöljyt. Käyttökelpoisten määrien vaihtelualueet ovat seuraavia: grammaa/litra D-mannitolia 20 - 100 KH2P04 0 , 5 -3 30 Glysiiniä 1-4

Peptonoitua maitoa 2-20

Maitohappoa 0-3

Hivenaineita 0 - 15 ml (yksityiskohdat aiempana) 35 Kasviöljyä 0-20 (soija, maapähkinä tai auringonkukka) li 13 93647

Yhdisteen parhaan saannon aikaansamiseksi tulisi edellä mainitun koostumuksen kaikkien komponenttien olla mukana. Siten S6-liuos (alla) on edullinen liuos.

5 S2-liuos S6-liuos D-mannitolia 44 g D-mannitolia 44 g KH2P04 2 g KH2P04 2 g

Glysiiniä 2 g Glysiiniä 2 g

Peptonoitua maitoa 15 g Peptonoitua maitoa 15 g 10 Maitohappoa 2 g Maitohappoa 2 g

Hivenaineita 10 ml Hivenaineita 10 ml (yksityiskohdat aiempana) (yksityiskohdat aiempana)

Soijaöljyä 10 g esisterilointi esisterilointi 15 pH 7,0 pH 7,0

Nestemäisten alustojen lisäksi voidaan käyttää kiinteitä alustoja. Seuraavat ovat esimerkkejä kiinteistä alustoista.

20 F204 -kiinteä alusta

Perusliuos 250 ml:n pulloa kohti litraa kohti

Hirssiä 15 g Ardamine PH** 33,0 g

Perusliuosta 15 ml Natriumtartraattia 6,6 g 25 FeS04 x 7H20 0,66 g

Mononatriumglutamaattia 6,6 g Maissiöljyä 6,6 ml ei pH:n säätöä (hiiva-autolysaatti, joka on saatavilla 30 yhtiöstä Yeast Products, Inc., Clifton

New Jersey) 14 93647 F4-SF -kiinteä alusta

Perusliuos 250 ml pulloa kohti litraa kohti

Maissirouhetta 10 ml Ardamine PH 0,2 g 5 Perusliuosta 10 ml KH2P04 0,1 g

MgS04 ·7H20 0,1 g

Natriumtartraattia 0,1 g FeS04 ·7H20 0,01 g

ZnS04 ·7Η20 g 0,01 g 10 ei pH:n säätöä Näitä alustoja voidaan käyttää £ermentaatioissa, jotka suoritetaan vakiomenetelmien mukaisesti ja joissa ensin Zalerion arbiricolan pakastetut vegetatiiviset rih-15 mastot sulatetaan ja niillä ympätään ymppäysliuos, jota sitten inkuboidaan vähintään 3 päivän ajan, jotta saadaan eliöitä, jotka toimivat ymppinä yhdisteen I tuottamiseksi. Ymppäysliuos voi olla seuraavan koostumuksen mukainen: Ymppäysliuos (KF-liuos) 20 Maissin liuotusvettä 5,0 g

Tomaattimassaa 40,0 g

Kaurajauhoja 10,0 g

Glukoosia 10,0 g

Hivenaineita* 10,0 ml 25 Vettä 1000,0 ml pH = 6,8 yksityiskohdat aiempana Tässä menetelmässä osa ATCC 20868:n säilytyksessä 30 ollutta vinoviljelmää ympätään nestemäiseen ymppäysravin-toalustaan, jonka pH-alue vaihtelee välillä 5 - 8,1, optimaalisesti 6 - 7,5, ja pulloja inkuboidaan sekoittaen lämpötilassa, joka vaihtelee välillä noin 15 - 30 °C, edullisesti 20 - 28 °C. Sekoitus voi tapahtua jopa nopeu-35 della 400 kierr./min mutta on edullisesti noin 200 - 220 kierr./min. Inkubointia suoritetaan 2-30 päivän jakson 15 93647 ajan, edullisesti 2-14 päivän ajan. Kasvun ollessa runsasta voidaan kasvustoa tavallisesti 2-5 päivän kuluttua käyttää yhdisteen I tuottoon tarkoitetun liuoksen ymppäyk-seen. Edullisesti suoritetaan kuitenkin toisen vaiheen 5 fermentaatio käyttämällä osaa viljelmän kasvustoa ymppinä ja sen jälkeen käyttämällä samankaltaisia olosuhteita mutta yleensä lyhyempää 1-3 päivän jaksoa. Tämän jälkeen kasvustoa käytetään tuottoiiuoksen ymppäykseen.

%

Viljelmän kasvustolla ympättyjä fermentaation tuot-10 toalustoja inkuboidaan 3-30 päivän ajan, tavallisesti 7-14 päivän ajan joko sekoittaen tai sekoittamatta. Fermentaatio voidaan suorittaa aerobisesti noin 20 -40 eC:een lämpötiloissa. Parhaiden tulosten saavuttamiseksi on kätevintä suorittaa nämä fermentaatiot noin 24 -15 30 °C:een lämpötiloissa. Edullisimpia ovat noin 24 - 28 eC:een lämpötiloissa suoritetut fermentaatiot. Välittömästi saatavien yhdisteiden tuottamiseksi ravintoalustan pH:n tulisi olla välillä noin 5,0 - 8,5, edullisen alueen ollessa noin 6,0 - 7,5. Kuitenkin nopean tuoton aikaansaa-20 miseksi pH tulisi pitää lähellä noin 5,5:ttä. Halutun yhdisteen tai yhdisteiden tuottoon tarvittavan ajanjakson kuluttua yhdisteet otetaan talteen fermentaatioliuoksesta jäljempänä tarkemmin kuvatulla tavalla.

Näiden seikkojen lisäksi käytetään parannetussa me-25 netelmässä yhdisteen I tuottamiseksi tiettyä Zalerion ar-boricolan mutanttia fermentaatiossa. Tämä tietty mutantti saatiin ensimmäisen kerran aikaan altistamalla Z. arbori-cola 20868 mutageeniselle aineelle ja eristämällä muodostuneet pesäkkeet. Yhden noin kahdeksastakymmenestä pesäk-30 keestä havaittiin olevan käyttökelpoinen yhdisteen I tuottoon päätuotteena.

Mutantin tuottamiseen voidaan käyttää mitä tahansa yleisesti mutanttien tuottamiseen käytettyä ainetta. Siten voidaan käyttää ultraviolettisäteilyä, kemiallisia muta-35 geenejä tai interkalatoivaa ainetta. Sopiviin kemiallisiin 16 93647 mutageeneihin luetaan N-nitroso-N-metyyliuretaani ja N-metyyli-N'-nitro-N nitrosoguanidiini.

Tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoinen Z_^ arbo-ricola -mutantti saatiin aikaan käsittelemällä Z^ arbori-5 cola ATCC 20868:n itiösuspensiota, joka oli 0,3 M tris-(hydroksimetyyli)aminometaani (TRIS)-puskuriliuoksessa, pH 7, N-nitroso-N-metyyliuretaanilla, maljäämällä käsitelty suspensio peruna-dekstroosiagarille ja inkuboimalla pesäkkeiden kehittämiseksi, tämän jälkeen eristämällä pe-10 säkkeet, siirtämällä erilliset pesäkkeet peruna-dekstroosi agarvinoviljelmille ja inkuboimalla 10 - 14 päivän ajan 25 eC:een lämpötilassa, jotta saatiin Z_^ arboricolan mu-tanttiviljelmiä, joista yksi nimettiin varauksin Z7-9:ksi ja sen jälkeen sitä kasvatettiin tunnuksella MF 5404 ja 15 talletettiin talletuslaitoksen American Type Culture Collection pysyvään viljelmäkokoelmaan talletusnumerolla ATCC 20957.

Tätä mutanttia voidaan käyttää olennaisesti samalla tavoin kuin emoeliötä. Siten tätä mutanttia käyttävä sopi-20 va, enintään 30 päivän kestoinen fermentaatio voidaan suorittaa käyttäen edellä kuvattuja lämpötila- ja pH-olosuh-teita ravintoalustassa, joka on edullisesti S6, TG102 tai TG103. Kasvatuksen loputtua tuotteet kerätään talteen ja yhdiste I eristetään.

25 Talteenotto ja eristäminen

Edellä kuvattuja menetelmiä käyttäen suoritetun viljelyn jälkeen yhdiste I otetaan talteen ja eristetään liuoksesta.

Menetelmien täsmälliset vaiheet saattavat vaihdella 30 jonkin verran riippuen siitä, suoritetaanko fermentaatio nestemäisellä vai kiinteällä alustalla, mitä liuotinta käytetään ja mitä adsorboivaa ainetta tai adsorboivien aineiden yhdistelmää käytetään.

Kun fermentaatio suoritetaan kiinteällä alustalla 35 voidaan ensimmäinen vaihe suorittaa lisäämällä alkoholi- 17 93647 liuotinta fermentaatioalustalle, sekoittamalla läpikotaisin, jonka jälkeen suodatetaan ja vesipitoinen alkoholi-suodos otetaan talteen ja väkevöidään. Väkevöidylle suo-dokselle voidaan ensin suorittaa takaisinuutto tai se voi-5 daan pestä alemmalla alifaattisella hiilivetyliuottimella, kuten heksaanilla tai muulla alkaanilla alkaaneihin liukenevien epäpuhtauksien poistamiseksi. Alkaanilla pesty suo-dos voidaan uuttaa tai jaotella veteen sekoittumattomalla * hapetetulla orgaanisella liuottimena ja väkevöidä tulok-10 sena oleva liuos, jonka jälkeen se viedään kromatografia-pylvääseen ainakin yhtä, mutta tavallisesti useampia ero-tusvaiheita varten. Sopivia pylväitä ovat silikageeli, käänteisfaasi -silikageeli ja "Sephadex" LH-20 (Pharmacia )-dekstraaniabsorbentti.

15 Eräässä menetelmässä fermentaation tapahtuessa nes temäisellä alustalla rihmastosta muodostuva kiintoaines suodatetaan ja otetaan talteen fermentaatioliuoksesta. Rihmastokakulle lisätään alkoholia ja rihmastosta muodostunut kiintoaines sekoitetaan läpikotaisin alkoholin kans-20 sa, suodatetaan, suodos kerätään ja väkevöidään. Vaihtoehtoisessa menetelmässä koko kasvuliemierä voidaan uuttaa lisäämällä yksi tilavuusosa alkanolia, edullisesti metano-lia ja suodattamalla kiinteiden epäpuhtauksien poistamiseksi. Tämän jälkeen alkanoliuute adsorboidaan "Diaion" 25 HP-20 (styreeni-divinyylibentseenikopolymeeri, Mitsubishi

Chemical Industries, Ltd) hartsiin ja eluoidaan 100-%:isella alkanolilla. "Diaion" SP-207:ää (bromattua) tai muuta kaupallisesti saatavilla olevaa styreeni-divi-nyylibentseenikopolymeeriä voidaan myös käyttää. Toinen 30 laimennus/HP-20 -adsorptio/eluointivaihe suoritetaan näyt teen valmistamiseksi kromatografisia erotuksia varten. Joskus saatetaan tarvita kolmas laimennus/HP-20 -adsorptio/eluointivaihe pienemmän tilavuuden aikaansaamiseksi. Aineen erotukseen kiinteästä ravintoalustasta tai rihmas-35 totyynystä aluksi käytettävä alkoholiliuotin voi olla mikä 18 93647 tahansa alempi alkoholi, kuten metanoli, etanoli, isopro-panoli tai vastaava. Metanoli on edullinen.

Jos aktiiviselle aineelle suoritetaan jaottelu al-kanoli- tai metanoliliuoksesta, ovat sopivat liuottimet 5 estereitä, kuten etyyliasetaatti, isopropyyliasetaatti ja butyyliasetaatti, tai ketoneja, kuten metyylietyyliketoni.

Kromatografinen erotus voidaan suorittaa käyttämällä tavanomaista pylväskromatografiaa, jossa käytetään ionitonta hartsia tai korkean erotuskyvyn nestekromatogra-10 fiaa, jossa käytetään käänteisfaasihartsia. Antibioottista yhdistettä I sisältävät fraktiot voidaan havaita sieniä vastaan suunnatulla määrityksellä, jossa käytetään Candida albicansia. Yleensä suoritetaan usempi kuin yksi kromatografinen erotusvaihe. Edullisimmassa menetelmässä suorite-15 taan yksi tai useampia erotuksia käyttäen pylväskromatografiaa ja lopullinen erotus suoritetaan käyttäen korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC), jossa käytetään C18-käänteisfaasihartsia.

Kun kromatografisissa erotuksissa käytetään tavan-20 omaista pylväskromatografiaa, on silikageeli edullinen adsorboiva aine. Tavallisesti suoritetaan useampi kuin yksi kromatografinen erotus. Kaikissa erotuksissa voidaan käyttää silikageeliä vaikka käytetäänkin eri eluointiaineita. Se voidaan kuitenkin yhdistää edullisesti eri adsorboivan 25 aineen, kuten "Sephadex" LH-20 -tavaramerkillä myytävän dekstraaniadsorbentin käyttöön. Voidaan myös käyttää muita adsorboivia aineita, kuten aluminiumoksidia ja styreenidi-vinyylibentseeni-kopolymeerejä, joita on kaupallisesti saatavilla nimillä "Diaion" HP-20, HP-30, HP-40 ja SP-207 30 ja "Amber li te" XAD-2, XAD-4 ja XAD-16 (Rohm and Haas Co.).

Aktiivisen komponentin fraktioinnissa ja talteenotossa silikageelillä suoritettavassa kromatografiässä saadaan kasvavan alkoholipitoisuuden omaavilla esteri/al-koholi-seoksilla aikaan hyvä erottuminen. Etyyliasetaatin 35 ja metanolin seoksen on havaittu olevan erityisen käyttökelpoinen. Näitä voidaan käyttää isokraattisissa, askelta- 19 93647 van gradientin tai jatkuvan gradientin systeemeissä. Käytettäessä dekstraaniadsorbenttia, kuten "Sephadex" LH20:ta, voidaan käyttää kloorihiilivety/hiilivety/alkoho-li-1iuotinsysteemiä. Metyleenikloridi/heksaani/metanoli-5 seoksen on havaittu olevan erityisen käyttökelpoinen.

Tehtäessä HPLC-erotus väkevöidään tavanomaisesta kromatografiasta talteenotettua materiaalia sisältävä al-koholiliuos ja jäännös liuotetaan metanoli/vesi -seokseen samassa suhteessa kuin liikkuvassa faasissa ja viedään 10 kaupallisesti saatavilla olevaan käänteisfaasihartsilla pakattuun pylvääseen tai silikageeli/C18 -käänteisfaasi-hartsiseoksella täytettyyn pylvääseen, jotka on valmistettu kirjallisuudessa seikkaperäisesti selostetulla tavalla. Vaihtoehtoisesti alkoholiliuos voidaan laimentaa 15 52-%:iseksi vedellä ja pumpata pylvääseen. Pylvästä käytettäessä käytetään metanoli/vesi -seosta (1:1 tai valinnaisesti muissa suhteissa) 5516 - 13790 kPa:n paineella, joka saa aikaan noin 20 ml/min virtausnopeuden. Erottumista seurataan 210 nm:n aallonpituudella.

20 Fraktioiden aktiiviisuus määritetään Candida albi- cansin avulla ja analyyttisella HPLC:lla. Tuote otetaan talteen mistä tahansa kromatografisesta menetelmästä yhdistämällä Candida albicans -aktiiviset fraktiot ja väke-vöimällä ne alipaineessa. Kun fermentaatio suoritetaan mu-25 tanttia ATCC 20957 käyttäen on eristämismenettely pohjimmiltaan sama. Koska mutanttia käyttävässä menetelmässä on useat vähäisemmät tuotteet eliminoitu, ovat kromatografisia menetelmiä käyttävät eristysmenetelmät huomattavasti yksinkertaisempia ja tarvittavien kromatografisten erotus-30 kertojen määrä on huomattavasti pienentynyt.

Yhdisteen I ylivoimaisia ominaisuuksia terapeuttisena aineena sieni-infektioita vastaan voidaan valaista sieniä tuhoavan minimipitoisuusmäärityksen (MFC) tuloksilla kokeista Candida albicansia, Candida tropicallsta ja 35 Candida parapsilosista vastaan.

20 93647 Tämä aktiivisuus on nähtävissä liemimikrolaimennus-määrityksessä, jossa alustana on Yeast Nitrogen Basea (Difco), johon on lisätty 1 % dekstroosia (YNBD). Määrityksen suorittamiseksi yhdiste 1 liuotettiin 10-prosentti-5 seen dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja laimennettiin pitoisuuteen 2560 pg/ml. Yhdisteet laimennettiin edelleen pitoisuuteen 256 pg/ml YNBD:ssä. Tämän jälkeen 0,15 ml suspensiota jaettiin 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn ensim-mäiseen kuoppariviin (kukin kuoppa sisälsi 0,15 ml 10 YNBD:tä), jonka tuloksena lääkeaineen pitoisuudeksi saa tiin 128 pg/ml. Tämän jälkeen suoritettiin kaksinkertaiset laimennukset, jotta lääkeaineen loppupitoisuuksien vaihtelu osuisi välille 128 - 0,06 pg/ml.

Sabouraud -dekstroosiagarilla ylläpidetyt hiivavil-15 jelmät siirrettiin YM-lihaliemelle (Difco) ja niitä inku-boitiin yön yli 35 eC:een lämpötilassa ravistellen (250 kierr./min). Inkuboinnin jälkeen kukin viljelmä laimennettiin steriiliin veteen, jotta lopulliseksi pesäkkeitä muodostavien yksikköjen (CFU) pitoisuudeksi saatiin 1 - 5 x 20 106 CFU/ml.

96-kuoppaiset mikrotiitterilevyt ympättiin käyttäen MIC-2000 (Dynotech) -laitetta, joka annostelee 1,5 μΐ kuoppaa kohti saaden aikaan 1,5 - 7,5 x 103 solun suuruisen lopullisen ympin kuoppaa kohti. Mikrotiitterilevyjä inku-25 boitiin 35 eC:n lämpötilassa 24 tunnin ajan. Pienimmät ehkäisevät pitoisuudet (MIC:t) merkittiin muistiin lääkkeen pienimpinä pitoisuuksina, joiden yhteydessä ei esiintynyt näkyvää kasvua.

MIC:n muistiin merkitsemisen jälkeen maljoja ravis-30 teltiin solujen suspendoimiseksi uudelleen. Sen jälkeen 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn kuopista otetut 1,5 μ1:η näytteet siirrettiin yksikuoppaiselle levylle, joka sisälsi Sabouraud- dekstroosiagaria. Ympättyjä levyjä inkuboi-tiin 24 tunnin ajan 28 eC:een lämpötilassa, jonka jälkeen 35 tulokset luettiin. MFC on määritelty pienimpänä lääkeai-

II

O 7 £ Λ 7 21 neen pitoisuutena, jonka yhteydessä ei esiinny kasvua tai vähemmän kuin 4 pesäkettä täplää kohti.

Sieniä tuhoava minimipitoisuus Sieni- (pg/ml) 5 kannan nro Yhdiste 1

Candida albicans MY 1585 0,5 MY 1208 0,5 10 MY 1028 1,0 MY 1750 0,25 MY 1783 0,5

Candida tropicalis MY 1012 2,0 15 Candida parapsllosis MY 1009 8,0 MY 1010 8,0

Edellä mainitut tulokset ovat hyvänä esimerkkinä 20 yhdisteen I osoittamista ylivoimaisista ja yhdenmukaisista sienten kasvua estävistä ominaisuuksista.

Tällä yhdisteellä on potentiaalia korvata tunnettu sienten vastainen aine, jonka käyttöä rajoittaa se, että vaikka se on tehokas sienten vastainen aine, sillä on ha-25 joittava vaikutus punaisiin verisoluihin alhaisilla annos-tasoilla.

Tämä yhdiste on myös laajakirjöinen monien sienilajien, sekä rihmamaisten että hiivasienten vastainen sienten vastainen aine.

30 Tämä yhdiste on käyttökelpoinen Pneumocystis cari- nli -infektioiden estämisessä tai lievittämisessä. Tällaisessa käytössä infektoituneille tai immuniteetin häiriöistä kärsiville Pneumocystis carinii -infektiolle alttiille potilaille annetaan terapeuttisesti tehokas tai ehkäisevä 35 määrä yhdistettä I. Yhdisteen 1 tehokkuus terapeuttisissa 22 93647 tai infektioita estävissä tarkoituksissa voidaan osoittaa immunosuppressoiduilla hiirillä tai rotilla tehdyillä tutkimuksilla.

Edustavassa tutkimuksessa kymmenelle koiraspuoli-5 selle C3H/Hej -hiirelle, joiden kunkin paino oli 22 - 24 g, aiheutettiin immunosuppressio lisäämällä kuuden viikon ajan juomaveteen deksametasonia (8,0 mg/1) Pneumocystis carinii -infektioiden kehittymisen aikaansaamiseksi. Infektion edistämiseksi hiiriä pidettiin myös vähäproteii-10 nisella ruokavaliolla. Seitsemännen viikon alussa hiiret jaettiin kahteen ryhmään. Kumpikin ryhmä sai edelleen deksametasonia juomavedessä ja oli vähäproteiinisella ruokavaliolla tutkimuksen loppuun saakka. Ryhmässä I olevat hiiret saivat päivittäin kaksi kertaa vatsaontelon sisäi-15 siä ruiskeita, jotka sisälsivät 0,5 ml 20-%:ista DMSO- liuosta liuotinkontrollina. Ryhmässä II olevat hiiret saivat päivittäin kaksi kertaa vatsaontelon sisäisiä ruiskeita, jotka sisälsivät 0,5 ml steriiliä vettä, jossa oli 0,0125 mg yhdistettä I (liuotettuna DMS0:hon, DMS0:n lo-20 pullinen pitoisuus on 10 %, todellinen annos 0,5 mg/kg). Käsittelyjakso kesti kaksi viikkoa.

Käsittely jakson lopuksi (yhteensä kahdeksan viikkoa immunosuppressiota) eläimet lopetettiin ja keuhkokudokset poistettiin. Tämän jälkeen kudos käsiteltiin kussakin 25 eläimessä olevien kystojen määrän määrittämiseksi. Yhdiste I pienensi kystojen määrää 81 %:lla verrattuna kontrolli-eläimiin.

Merkittäviä ominaisuuksia voidaan tehokkaimmin hyödyntää, kun yhdiste formuloidaan uusiksi farmaseuttisiksi 30 koostumuksiksi yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa tavanomaisten farmaseuttisten valmistusmenetelmien mukaisesti.

Uudet koostumukset sisältävät aktiivista yhdistettä ainakin terapeuttisen sienten vastaisen tai keuhkopöhöä 35 vastaan suunnatun painomäärän. Yleensä koostumukset sisäl- 23 93647 tävät 1 paino-% yhdistettä I. Väkevät laimennustarkoituk-siin sopivat koostumukset voivat ennen käyttöä sisältää 15 painoprosenttia tai enemmän ja jotkut koostumukset 90 painoprosenttia tai enemmän. Valmistettaessa koostumuksia 5 yhdiste 1 sekoitetaan perusteellisesti minkä tahansa tavallisen farmaseuttisen väliaineen kanssa.

Koostumukset voidaan valmistaa suun kautta tapahtuvaa, ruuansulatuskanavan ulkopuolista, paikallista tai keuhkojen kautta (inhalaatio) tapahtuvaa annostelua varten 10 tarkoitettuihin muotoihin. Lääke voidaan antaa suun kautta nestemäisenä tai kiinteänä valmisteena. Nestemäisiä valmisteita varten terapeuttinen aine formuloidaan nestemäisten kantaja-aineiden, kuten veden, glykolien, öljyjen, alkoholien ja niitä vastaavien aineiden kanssa. Kiinteitä 15 valmisteita, kuten kapseleita ja tabletteja varten, terapeuttinen aine formuloidaan kiinteiden kantaja-aineiden, kuten tärkkelysten, sokereiden, kaoliinin, etyyliselluloo-san, kalsium- ja natriumkarbonaatin, kalsiumfosfaatin, kaoliinin, talkin, laktoosin kanssa sekä yleensä liukas-20 timen, kuten kalsiumstearaatin kanssa yhdessä sitoja-ai-neiden, hajoamista edistävien aineiden ja niitä vastaavien aineiden kanssa. Tabletit ja kapselit ovat kaikkein edullisin suun kautta tapahtuva annostusmuoto, koska näiden antaminen on helppoa.

25 Yhdiste I voidaan formuloida terapeuttiseen koostu mukseen injektiota varten. Lisäksi se voidaan tuoda tarjolle annosyksikkömuodossa, ampulleina tai moniannoksisina säiliöinä ja tarvittaessa myös lisätyn säilöntäaineen kanssa. Injektoitavat koostumukset voivat olla suspensio!-30 den, liuosten tai emulsioiden muodossa öljyisissä tai vesipitoisissa liuottimissa, kuten 0,85-%:isessa natriumklo-ridissa tai 5-%:isessa dekstroosin vesiliuoksessa, tai ne voidaan liuottaa alkoholi/propyleeniglykoliseokseen tai polyetyleeniglykoliin ja ne voivat sisältää formuloivia 35 aineita, kuten suspendoivia, stabiloivia ja/tai dispergoi- 24 93647 via aineita. Niin puskurointiaineita kuin muitakin lisäaineita voidaan lisätä. Vaihtoehtoisesti aktiiviset ainesosat voivat olla jauheen muodossa sopivalla väliaineella tehtävää, annostelua edeltävää rekonstituutiota varten.

5 Koostumukset voidaan formuloida annosyksikkömuo- toon. Termillä "annosyksikkömuoto", sellaisena kuin sitä käytetään selitysosassa ja vaatimuksissa, tarkoitetaan fysikaalisesti erillisiä yksikköjä ja kukin yksikkö sisältää halutun terapeuttisen tehon tuottamiseksi lasketun, 10 ennalta määrätyn määrän aktiivista ainesosaa yhdessä farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa. Esimerkkejä tällaisista annosyksikkömuodoista ovat tabletit, kapselit, pillerit, jauhepaketit, kiekot, mitatun yksikön sisältävät ampullit tai moniannoksiset säiliöt ja niitä vastaavat muo-15 dot. Annosyksikkö voi käyttötarkoituksesta riippuen sisäl tää 35 - 200 mg tai enemmän komponenttina olevaa lääkeainetta .

Jos käyttötarkoitus tule olemaan paikallinen, voidaan lääkeaine formuloida tavanomaisiin voiteisiin, kuten 20 valkovaseliiniin, lanoliinianhydridiin, setyylialkoholiin, ihovoiteeseen, glyseryylimonostearattiin, ruusuveteen ja niitä vastaaviin aineisiin. Yleensä valmistetaan 1 - 2-%:inen voideliuos, joka levitetään hoidettavalle alueelle.

25 Keuhkopöhöä vastaan suunnattua käyttöä varten voi inhalaation kautta tapahtuva antaminen olla erityisen käyt-tökelpoinen tapa. Inhalaatiota varten yhdistettä I voidaan antaa painepakkauksista tai suihkepulloista tulevan aerosolisuihkeen muodossa. Yhdisteet voidaan antaa 30 myös formuloitavina jauheina ja jauhekoostumus hengittää sisään jauhehengityspuhallinlaitteen avulla. Edullinen antosysteemi inhalaatioannostelussa on mitta-annosin-halaatio (MDI)-aerosoli, joka voidaan formuloida yhdistettä I sisältäväksi suspensioksi tai liuokseksi yhdessä 35 sopivien ponnekaasujen, kuten fluorihiilivetyjen tai hiilivetyjen kanssa.

li 25 93647

Aerosolin avulla tapahtuva annostelu on edullinen antamismenetelmä johtuen yhdisteen vaikealiukoisuudesta nestemäisiin farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin ja siitä, että halutaan suoraan hoitaa keuhkoja ja 5 keuhkoputkia. Puhallus on myös haluttu menetelmä, varsinkin tapauksissa, joissa infektio on levinnyt korviin tai muihin ruumiinonteloihin.

Ei-lääketieteellisiä käyttötarkoituksia varten tuotetta voidaan käyttää koostumuksissa inertissä kantaja-10 aineessa, joihin luetaan hienojakoiset kuivat tai nestemäiset laimentimet, täyteaineet ja koostumuksen säätöaineet, joihin luetaan erilaiset savet, piimää, talkki ja niitä vastaavat aineet, tai vesi ja erilaiset orgaaniset nesteet, kuten alemmat alkanolit, esimerkiksi etanoli ja 15 isopropanoli, tai kerosiini, bentseeni, tolueeni ja muut maaöljyn tislausfraktiot ja niiden seokset.

Keksintöä sovellettaessa voidaan koostumuksia levittää sienien vastainen määrä suoraan alueille, joilla sienten hillitseminen on toivottua.

20 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä, mutta niitä ei tulisi pitää rajoittavina.

Esimerkki I

Fermentaatiossa käytettiin MF-5171 Zalerion arbori-cola ATCC n:o 20868:n Merck-viljelmäkokoelmassa pidettyä 25 pakastettua viljelmää.

Koko 2,5 ml:n pakastettu vinoviljelmä sulatettiin ja siirrettiin aseptisesti 250 millilitran vetoiseen 3-laippaiseen pulloon, joka sisälsi 40 ml alustaa I (koostumus kuvattu edellä).

30 Viljelmällä ympättyä alustaa I inkuboitiin 26 eC:een lämpötilassa viiden päivän ajan sekoittaen nopeudella 220 kierr./min valmiin ymppiliemen aikaansaamiseksi.

Aikaisemmin kuvatun koostumuksen mukaisesta alus-35 tästä II valmistettiin myös ymppiliemet. Tämän jälkeen 26 93647 alustoista I ja II saadut ympit ympättiin 7,5 millilit-raan alustoja I ja II, tässä järjestyksessä, 5 prosentin ymppitasolla ja niitä inkuboitiin 26 °C:een lämpötilassa kasvun aikaansaamiseksi. Tämän jakson lopussa seuraavia 5 aminohappoja lisättiin kutakin alustaa sisältäviin erillisiin putkiin: L-proliinia, D-proliinia, L-atsetidiini-2-karboksyylihappoa ja 3,4-dihydro-L-proliinia ja kontrollina yhdistettä X. Putkia inkuboitiin 26 °C:een lämpötilassa ravistellen nopeudella 220 kierr./min 14 päivän 10 ajan.

Tämän jakson lopussa kussakin putkessa ollut liemi laimennettiin yhtä suurella tilavuudella metanolia, seos homogenoitiin ja kirkastettiin suodattamalla. Metanoliseos vietiin alipaineeseen, jotta metanoli saataisiin poiste-15 tuksi ja saataisiin talteen jäännös, joka sitten uutettiin kahdesti 10 millilitralla etyyliasetaattia. Etyyliasetaat-tiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla.

Liuokset väkevöitiin kuiviksi ja rekonstituoitiin 0,5 ml:lla metanolia erillisinä toimenpiteinä. Kukin tu-20 loksena ollut liuos laimennettiin 1:5 ja 10 μ1:η erä laimennettua liuosta käytettiin analyyttiseen HPLC-määrityk-seen "Zorbax” ODS (DuPont) -pylväässä käyttäen 1:1 asetoni triili/vesi -seosta ja kontrollina käytettiin yhdistettä X, jonka retentioajat olivat 8,38 minuuttia (alusta I) ja * 25 8,29 minuuttia (alusta II). Putkesta, joka sisälsi alustaa I ja johon oli lisätty L-proliinia ja 3,4-dehydro-L-pro-liinia, ja putkesta, joka sisälsi alustaa II ja johon oli lisätty L-proliinia, L-atsetidiinikarboksyylihappoa ja 3,4-dehydro-L-proliinia, saatiin retentiohuiput alueella 30 7,39-7,48 minuuttia, sen lisäksi, että niissä näkyi yh disteestä X johtuva 8,28 - 8,38 minuutin retentioaika.

HPLC-bioautografiset määritykset suoritettiin samoilla 10 μΐ näytteillä, joita käytettiin analyyttisessä HPLC:ssä. Injektiota kohti käytettiin 10 mikrolitraa näy-35 tettä ja eluoitiin asetonitriili/vesi -seoksella (1:1) 27 93647 virtausnopeudella 1 ml/min ja 200 mikrolitraa/otto sisäisen tilavuuden ollessa 1,5 ml. Fraktiot kerättiin 96-kuop-paiselle mikrotiitterilevylle. HPLC-liuotin haihdutettiin ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 0,2 millilitraa Candida 5 albicans MY-1028:lla ympättyä ja 24 tunnin ajan kasvatettua peruna-dekstroosi -lientä. Yhdisteestä X johtuvan aktiivisuuden lisäksi saatiin aktiivisuutta 7,57 minuutin huippua vastaavasta fraktiosta, joka oli peräisin alustasta, johon oli lisätty 3,4-dehydro-L-proliinia. Tämä huippu 10 vastaa analyyttisessä HPLC:ssä havaittua 7,39 - 7,48 minuutin huippua.

HPLC-bioautografiamäärityksestä saatiin eristetyksi pieni määrä yhdistettä. Tämän suunnatulla biosynteesillä 3,4-dehydro-L-proliinia käyttäen saadun vähäisen ainesosan 15 FAB-massaspektri osoitti 14 massayksikköä yhdistettä X ke-veämmän molekyylirakenteisen ionin.

Esimerkki II

Fermentaatio

Pakastetun MF 5171- (Zalerion arboricola) -viljel-20 män sisältävän pullon (noin 2 millilitraa) sisältö ympättiin 54 millilitraan KF-ymppäysalustaa laipattomassa Er-lenmeyer-pullossa. Viljelmää inkuboitiin 25 °C:een lämpötilassa 3 päivän ajan nopeudella 220 kierr./min toimivalla edestakaisella ravistelijalla. Viljelmästä otettu näyte 25 ( 5 ml) ympättiin 2-litraiseen laipattomaan Erlenmeyer-pul- loon, joka sisälsi 500 millilitraa KF-ymppialustaa ja sitä viljeltiin 25 *C:een lämpötilassa kolmen päivän ajan sekoittaen nopeudella 220 kierr./min.

Kolmen päivän jakson kuluttua 5 millilitraa viljel-30 mää ympättiin kuhunkin viiteen 2-litraiseen 500 millilitraa ymppäysalustaa sisältävään laipattomaan Erlenmeyer-pulloon ja viljeltiin 25 °C:een lämpötilassa 3 päivän ajan nopeudella 220 kierr./min. Nämä pullot yhdistettiin ja ympättiin 75-litraiseen sekoittimella varustettuun 35 astiaan, joka sisälsi 50 litraa seuraavan koostumuksen omaavaa tuotantoalustaa: 28 93647

Tuotantoalusta

Materiaali Pitoisuus (g/1)

Maissin liotusvettä 5,0 ml (NH4)2S04 2,0 5 Ihravettä 5,0

CoCl2 ' 6H20 10,0 mg

Turskanmaksaöljyä 2,0 ml

Tomaattimassaa 5,0

Na-sitraattia 2,0 10 Glyserolia 75,0

Polyetyleeniglykoli 2000:tta 2,0 ml pH = 7,0 ennen steriloimista 121 °C:een lämpötilassa 35 minuutin ajan.

15

Viljelyä jatkettiin 8 päivän ajan 25 °C:een lämpötilassa sekoittaen nopeudella 300 kierr./min ja ilmastuksen ollessa 5 litraa/min. Tämän jälkeen fermentaatioliemi kerättiin talteen eristystä varten.

20 Eristys

Edellä mainitun 70 litran fermentaatioerän koko-naisliemi suodatettiin ja rihmastokakku uutettiin 10 litralla metanolia. Metanoliuute suodatettiin ja laimennettiin 10 litralla vettä ja adsorboitiin 1,2 litraan HP-20 25 -hartsia ja eluoitiin 100-%:isella metanolilla. Talteenotettu metanolia runsaasti sisältävä erä, tilavuudeltaan 1500 millilitraa, väkevöitiin 150 millilitraksi.

Väkevöity liuos laimennettiin seoksella, jonka koostumus oli 40 % metanolia/60 % vettä, ja adsorboitiin 30 200 ml:aan HP-20:tä. Pylväs pestiin peräkkäin metanoli/ve- si (50:50) -seoksella, vedellä ja asetonitriili/vesi (25:50) -seoksella, jonka jälkeen aineenvaihduntatuotteet eluoitiin pylväästä asetonitriili/vesi (50:50) -seoksella.

Seitsemänkymmentä millilitraa runsaasti biologista 35 aktiivisuutta osoittavasta 400 millilitran HP-20 -adsorp- ,ο 93647 29 tiosta talteenotetusta erästä laimennettiin 300 millilit-raksi vedellä, suodatettiin ja imeytettiin virtausnopeudella 10 ml/min 88 millilitran "Zorbax" ODS-pylvääseen, joka oli tasapainotettu asetonitriili/vesi (12,5/87,5) 5 -seoksella. Pylvästä eluoitiin virtausnopudella 20 milli-litraa/minuutti ensin asetonitriili/vesi (40/60) -seoksella ja sitten asetonitriili/vesi (50/50) -seoksella. Yhdisteet eluoitiin 50/50 asetonitriili/vesi -seoksella. Pylvästä monitoroitiin UV:11a 210 nm:n aallonpituudella ja 10 näille fraktioille suoritettiin sieniä vastaan suunnatun aktiivisuuden määritykset Candida albicans MY-1028:lla sekä analyyttiset HPLC-arvioinnit. Näiden analyysien perusteella tietyt fraktiot yhdistettiin.

Kuivaksi väkevöimisen ja analyyttisellä HPLC:llä 15 suoritetun arvioinnin jälkeen yhdistetyistä fraktioista otetun näytteen havaittiin olevan 1:1 seos yhdisteistä X ja I.

Edellämainittu näyte, jonka koostumus oli 7,5 mg yhdistettä X ja 7,5 mg yhdistettä I 3,2 ml:ssa metanolia, 20 laimennettiin vedellä 10 millilitraksi ja ruiskutettiin "Dynamax"-60 Α8μΜ C18 -pylvääseen, jonka koko oli 21,4 mm (sisähalkaisija) x 25 cm ja joka oli varustettu 5 cm:n suojapylväällä (Rainin Instrument Co., Inc. Woburn, MA) ja joka oli aikaisemmin tasapainotettu asetonitriili/vesi 25 (60/40) -seoksella. Tämän jälkeen seosta eluoitiin samalla asetonitriili/vesi -eluointiaineella 10 millilitraa/mi-nuutti huoneen lämpötilassa ja tästä kerättiin 15 milli-litran fraktiot. Kolmekymmentä minuuttia ruiskutuksen jälkeen aloitettiin lineaarinen 60 minuutin ajan kestävä gra-30 dientin nousu, jonka seurauksena asetonitriilin pitoisuus nousi 40 prosentista 60 prosenttiin. 210 nm kohdalta saadut lukemat ja niitä seuranneet näyte-erien HPLC-analyysit osoittivat, että esiintyi kolme yhdistettä I sisältävää fraktiota. Keskimmäinen, yhdistettä eniten ja sen puhtain-35 ta osuutta sisältävä fraktio väkevöitiin kuivaksi ja sille suoritettiin preparatiivinen massaspektrometrimääritys.

30 93647

Litiumia käyttäen saatu fast atom bombardment -mas-saspektri (FAB-MS) osoitti molekyylipainon olevan 1064. Kokonaishappohydrolysaattien trimetyylisilyyli(TMS) -johdannaisten kaasukromatografiamassaspektri (GC-MS) paljasti 5 päätuotteiden olevan treoniini, 4-hydroksiproliini, orni-tiinin kaltaisen yhdisteen hapettumistuote, 3-hydroksiglu-tamiinihappo, C16-rasvahappo ja 3-hydroksiproliini. Tämän analyysin perusteella arvioihin yhdisteen I rakenne.

Tämän fraktion komponentti puhdistettiin edelleen 10 liuottamalla fraktio liuokseen, joka sisälsi 33 μΐ metano-lia, 100 μΐ vettä ja 10 μΐ trifluorietikkahappoa (TFA), ja suorittamalla tuloksena olleelle liuokselle kromatografinen analyysi Dynamax-60 A C18 -pylväässä, jonka sisähal-kaisija oli 10 mm ja pituus 25 cm ja joka oli tasapainoi-15 tettu liuoksella, jonka koostumus oli 55 % 0,l~%:sta TFA:n vesiliuosta/45 % vettä. Eluointi samalla liuotinsysteemil-lä 4 ml/min huoneenlämpötilassa tuotti kolme fraktiota, joilla oli 210 nm adsorptiohuiput. Kaksi näistä fraktioista haihdutettiin kuivaksi ja analysoitiin 1H NMR:llä. Tu-20 lokset preparatiivisestä *H NMR-analyysista tukivat yhdisteen I kaavaa.

Puhdistetulla yhdistettä I sisältävällä näyttellä on kuvan 1 mukainen XH NMR-spektri ja aikaisemmin esitetyt 13C NMR- ja massaspektritulokset.

25 Esimerkki III

50 millilitraa KF-ymppäysalustaa 250 ml:n vetoisessa laipattomassa Erlenmeyer -pullossa ympättiin pakastetulla Zalerion arboricola -pullolla ja ravisteltiin 25 °C:een lämpötilassa 72 tunnin ajan nopeudella 220 30 kierr./min. Kaksi millilitraa tätä ymppikasvustoa käytettiin ymppäämään 50 millilitraa KF-alustaa ja sitä kasvatettiin 72 tunnin ajan. Seuraava vaihe suoritettiin tuo-tantoalustan ymppäämiseksi.

Neljäkymmentä millilitraa S-6 -alustaa 250 milli-35 litran vetoisessa laipattomassa Erlenmeyer-pulloissa ympättiin 2 millilitralla ymppiä ja pulloja ravisteltiin 31 93647 nopeudella 220 kierr./min ja 25 °C:een lämpötilassa 14 päivän ajan. Yhteensä 125 pulloa yhdistettiin, jotta saatiin 5 litraa lopullista lientä.

Kokonaisliemi tyhjiösuodatettiin 2,54 cm:n "Super-5 Cel" (Manville) -kerroksen läpi. Suodatetussa liemessä ei havaittu aktiivisuutta. Rihmastokakku uutettiin 1 litralla metanolia yön yli samalla sekoittaen. Metanoliuutteesta suoritettiin määritys bioaktiivisten komponenttien esiintymisen selvittämiseksi käyttäen C. albicans MY1028:aa 10 käyttävää kiekkodiffuusiomääritystä ja HPLC-määritystä (50/50 asetonitriili/O,01 M kaliumfosfaatti, pH 7,0) ja vertaamalla tuloksia standardina käytettävään aikaisemmin saatuun näytteeseen yhdisteestä X. Metanoliuute laimennettiin lopulliseen pitoisuuteensa 50-prosenttiseen vesipi-15 toiseen metanoliin ja adsorboitiin 200 millilitran HP-20 -pylvääseen virtausnopeudella 20 ml/min. Pylväs pestiin kolmella pylvään tilavuudella 50-prosenttista vesipitoista metanolia. Aktiivisuus eluoitiin kuudella pylvään tilavuudella 75-prosenttista vesipitoista metanolia. Halutut kom-20 ponentit olivat asianmukaiset yhdistettä I ja yhdistettä X sisältävät fraktiot, jotka yhdistettiin 1,7 litraksi.

Biologisesti aktiivisia komponentteja sisältävä näyte laimennettiin 1,7 litralla vettä, jotta koostumukseksi saatiin 50:50 metanoli/vesi, ja koostumus suodatet-25 tiin liukenemattomien hiukkasten poistamiseksi. Tämän jälkeen tämä tuote adsorboitiin 88 millilitran "Zorbax" 0,05 -pylvääseen (esitasapainotettu 50:50 metanoli/vesi-seoksella) nopeudella 20 ml/min. Pylvästä eluoitiin 45:55 asetonitriili/vesi -seoksella nopeudella 20 ml/min, kah-30 denkymmenen millilitran fraktiot otettiin talteen 30 millilitran sisäisen tilavuuden jälkeen. Kromatografiaa seurattiin UV:ssa 210 nm:n aallonpituudella, analyyttisella HPLC:llä ja sieniä vastaan suunnatulla biologisella määrityksellä (C. albicans MY1028). Tietyt fraktiot yhdistet-35 tiin pääasiassa analyyttiseen HPLC:hen perustuen ja 80 32 93647 milligramman painoisen yhdisteen I ja yhdisteen X seoksen osoitettiin sisältävän 19,8 milligrammaa yhdistettä I.

Esimerkki IV

Pakastettua vegetetiivista Zalerion arboricola ATCC 5 20868 -rihmastoa sisältävän pullon sisältö sulatettiin ja sitä käytettiin ymppäämään 54 millilitraa KF-ymppäysalus-taa, jota sitten inkuboitiin ymppiviljelmän valmistamiseksi 3 päivän ajan 25 °C:een lämpötilassa nopeudella 220 kierr./min pyörivällä ravistelijalla, jonka kiertoympyrän 10 halkaisija oli 5 senttimetriä.

Kahden millilitran eriä ymppiviljelmästä ympättiin 250 millilitran Erlenmeyer -pulloon, joka sisälsi 50 millilitraa TG103 -alustaa ja inkuboitiin 5 päivän ajan 25 °C:een lämpötilassa sekoittaen.

15 Tämän jakson lopussa fermentaatioliemi kerättiin.

Kerättäessä nestemäinen viljelmä sentrifugoitiin solujen erottamiseksi viljelmän supernatantista. Solut sekoitettiin 20 ml:n erään metanolia ja uuton annettiin jatkua yön yli huoneen lämpötilassa. Kiinteät aineet poistettiin sen-20 trifugoimalla, jonka jälkeen metanolia sisältävä uute ruiskutettiin 5 pm:n "Ultrasphere" (Beckman Engineering) -pylvääseen (4,6 mm x 25 cm), jota eluoitiin isokraatti-sesti asetonitriili/vesi 48/52 -seoksella virtausnopeuden ollessa 0,75 ml/min. Ulosvirtaavaa ainetta moni-oroitiin 25 210 nm:n aallonpituudella ja 0,25 ml:n fraktiot kerättiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille. Liuotin poistettiin levyistä tyhjiössä ja levyjen biologinen aktiivisuus määritettiin viemällä kuhunkin kuoppaan hiivauute, peptoni, dekstroosi (YEPD) liemi, jolla oli koostumus: 30 g/litra

Bacto-hiivauutetta 10

Bacto-peptonia 20

Dekstroosia 20 ei pH:n säätöä, 35 ja johon oli ympätty Candida albicans MY1028:a, ja tätä inkuboitiin yön yli 37 'C:een lämpötilassa. Tulokset 33 93647 osoittivat yhdisteen I tuottoa. Myös yhdistettä X tuotettiin.

Esimerkki V

Valmistettiin 54 millilitraa KF -ymppäysalustaa 5 (koostumus annettu edellä) sisältävät 250 millilitran pullot, jotka ympättiin MF5404 arboricola ATCC 20957:n agarvinoviljelmästä ja inkuboitiin 25 °C:een lämpötilassa neljän päivän ajan nopeudella 220 kierr./min. 20 millilitran näytettä käytettiin kunkin neljän 500 ml KF-alustaa 10 sisältävän 2 litran vetoisen pullon ymppäykseen. Pulloja inkuboitiin 25 °C:een lämpötilassa kolmen päivän ajan nopeudella 220 kierr./min. Tämän jälkeen pullojen sisällöt yhdistettiin, jotta siitä saatiin ymppi 300 litran ymppi-fermenttoria varten, joka sisältää 180 litraa KF-alustaa 15 ja 2 ml/litra polypropyleeniglykolia P-2000 (Dow Chemical Co.), jota on lisätty vaahtoamisen vähentämiseksi. Ymppi-fermenttoria käytettiin kolmen päivän ajan 25 eC:een lämpötilassa, ilmastuksen ollessa 90 litraa/min, paineen ollessa 70 kPa ja sekoittimen nopeuden ollessa 200 20 kierr./min. 25 litran näytettä käytettiin ymppäämään 800 litran vetoinen tuotantofermenttori, joka sisälsi 475 litraa aikaisemmin kuvatun koostumuksen mukaista TG103 -alustaa, joka sisälsi 2 ml/litra polypropyleeniglykoli P-2000:a ja joka oli steriloitu 25 minuutin ajan 25 120 °C:een lämpötilassa. Fermentaatio suoritettiin viiden päivän ajan 25 °C:n lämpötilassa ilmastuksen ollessa 250 litraa/minuutti, paineen ollessa 68,65 kPa ja sekoittimen nopeuden ollessa 150 kierr./min. pH:n annettiin laskea alkuperäisestä arvosta 6,0:sta 5,5:een, jonka jälkeen se 30 pidettiin pH:ssa 5,5 ± 0,4 käyttäen Na0H:ta ja H2S04:ää.

Viiden päivän kuluttua liemi kahdesta tuotantoerästä kerättiin talteen tuotteen eristämiseksi.

750 litraa metanolia lisättiin 750 litraan koko-naisfermentaatiolientä ja seosta sekoitettiin 8 tunnin 35 ajan. Kokonaisliemiuute sentrifugoitiin liukenemattomien fermentaatiossa muodostuneiden kiinteiden aineiden poista- 34 93647 miseksi, jolloin saatiin 1436 litraa kirkastettua superna-tanttia, jonka pH säädettiin 7:ksi.

77 litran "Diaion" SP-207 (Mitsubishi Chemical Industries) -käsittelykerros valmistettiin pesemällä metano-5 lilla ja esitasapainottamalla 50:50 metanoli/vesi (Me0H/H20) -seoksella. Tämän jälkeen kirkastetusta super-natantista SP-207:ään sitoutuvien aineiden annettiin sitoutua ylöspäin suunnatun virtauksen avulla pitäen leiju-kerrosta yllä 5,7 litran minuuttinopeudella. Sitoutumisen 10 jälkeen pylväs pestiin 567 litralla 65:35 metanoli/vesi-seosta ja eluoitiin 454 litralla 100-%:ista metanolia.

SP-207-pylväästä talteenotetut Me0H/H20 65:35- ja 100-%:iset MeOH -erät yhdistettiin ja koostumus säädettiin 50:50 Me0H/H20:ksi lisäämällä H20:ta, jotta saatiin 945 15 litran yhdistettä runsaasti sisältävä erä. Yhdistettä runsaasti sisältävän erän annettiin sitoutua 108 litran "Diaion" HP-20 -pylvääseen (pesty metanolilla ja esitasa-painotettu Me0H/H20 50:50 -seoksella) virtausnopeuden ollessa 2-4 litraa minuutissa. Tämän jälkeen hartsi pes-20 tiin 567 litralla Me0H/H20 65:35 -seoksella ja eluoitiin 454 litralla l00-%:ista MeOH:ta.

Yhdistettä I runsaasti sisältävä HP-20 -erä väke-vöitiin 6 litran tilavuuteen laimentamalla ensin H20:lla ja sitten adsorboimalla ja eluoimalla pienemmästä HP-20 -pyl-25 väästä (10 litraa) samalla tavoin, kuin mitä tapahtui suurempaa HP-20 -pylväästä käytettäessä.

Kaksi litraa (yhteensä 6 litrasta saatua) väkevöityä, runsaasti yhdistettä sisältävää HP-20 -erää laimennettiin 2 litralla vettä ja vietiin MeOH:11a preparatiivi-30 seen 800A HPLC-systeemiin (Separations Technology), joka on varustettu MeOH:11a esipestyllä ja Me0H/H20 50:50 -seoksella esitasapainotetulla 3,9 litran C18 -pylväällä (Amicon). Kun erä oli imeytetty pylvääseen, lisättiin 500 millilitraa Me0H/H20 50:50-seosta ja eluoitiin virtausno-35 peuden ollessa 212 ml/min lineaarisen nousun tapahtuessa Me0H/H20 50:50 -liuoksesta 100-prosenttiseen MeOH-liuokseen 35 93647 60 minuutin jakson aikana. Fraktiot analysoitiin HPLC:llä, yhdistettiin ja väkevöitiin kuiviksi, jotta saatiin noin 20 grammaa 88-prosenttisen puhdasta yhdistettä.

Esimerkki VI

5 6 litran erästä väkevöityä, esimerkin V mukaisella tavalla saatua yhdistettä I runsaasti sisältävästä HP-20 -osasta otettiin 900 ml:n erä puhdistusta varten.

900 millilitran erään lisättiin yhtä suuri tilavuus metanolia ja tuloksena olleeseen liuokseen lisättiin 900 10 millilitraa vettä, 900 millilitraa heksaania ja 900 milli-litraa isopropyyliasetaattia ja ravisteltiin voimakkaasti. Tuloksena oli erottumaton emulsio, johon lisättiin 450 millilitraa metanolia kahden kerroksen aikaansaamiseksi. Alempi kerros, jonka tilavuus oli 2,5 litraa, lisättiin 15 900 millilitraan heksaania, 900 millilitraan isopropyyli asetaattia ja 450 millilitraan metanolia, jonka jälkeen jälleen ravisteltiin voimakkaasti ja alemmat, yhteensä 3 litran kerrokset otettiin talteen. Jaotteluvaihe suoritettiin kolmannen kerran alemmalle kerrokselle vielä yhden 20 alemman 3 litran kerroksen muodostamiseksi.

Lopullinen jaottelukokeista saatu alempi kerros väkevöitiin kuivaksi. Jäännös (4 g) lisättiin 50 millilitraan seosta, jonka koostumus oli CH2Cl2/CH3OH/5 % CH3COOH (72,5/27,5/10), jolloin se liukeni alempaan kerrokseen.

25 Tälle liuokselle suoritettiin kromatografia 2 litralla si-likageeli 60:tä (seulamitta 230 - 400) virtausnopeudella 50 ml/min käyttäen samaa CH2Cl2/CH30H/5 % CH3C00H (72,5/27,5/10) -seosta liikkuvana faasina, jotta saatiin hyvin puhdasta, muista vähäisemmistä komponenteista ero-30 tettua yhdistettä I.

Esimerkki VII

Seuraavasta formulaatiosta valmistetaan 1000 puristettua tablettia, jotka kukin sisältävät milligrammaa yhdistettä I: 36 93647 grammaa

Yhdistettä I 500 Tärkkelystä 750

Kaksiemäksistä kidevedellistä kalsiumfosfaattia 5000 5 Kalsiumstearaattia 2,5

Hienoksi jauhetut ainesosat sekoitetaan hyvin ja rakeistetaan 10-prosenttisella tärkkelysmassalla. Rakeet kuivataan ja puristetaan tableteiksi.

10 Esimerkki VIII

Seuraavasta formulaatiosta valmistetaan 1000 kovaa gelatiinikapselia, jotka kukin sisältävät 210 milligrammaa yhdistettä IA: grammaa 15 Yhdistettä I 500 Tärkkelystä 750

Laktoosia 750

Talkkia 250

Kalsiumstearaattia 10 20

Yhtenäinen ainesosien seos valmistetaan sekoittamalla ja sitä käytetään täyttämään kovia kaksiosaisia ge-latiinikapseleita.

Esimerkki IX

25 Paikalliseen käyttöön sopiva voide voidaan valmis taa dispergoimalla perusteellisesti 13 milligrammaa yhdistettä I 1 grammaan kaupallisesti saatavilla olevaan poly-etyleeni/hi i1ivetygeeliin.

Esimerkki X

30 Injektoitava suspensio (IM) voidaan valmistaa seu- raavalla tavalla: 37 93647 mg/ml

Yhdistettä I 10,0

Metyyliselluloosaa 5,0

Tween 80:tä 0,5 5 Bentsyylialkoholia 9,0

Bentsalkoniumkloridia 1,0

Vettä täytetään 1 ml:ksi

Esimerkki XI » '

Voidaan valmistaa seuraavan formulaation omaava 10 aerosolikoostumus: säiliötä kohti

Yhdistettä I 24 mg NF-lesitiinin nestemäistä tiivistettä 1,2 mg 15 Trikloorifluorimetaania 4,052 g

Diklooridifluorimetaania 12,15 g

Claims (7)

38 93647

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen 1-[4,5-dihydroksi-N2-( 10,12-dimetyyli-l-oksotetradekyyli )or-5 nitiini]-5-(3-hydroksiglutamiini)-6-(3-hydroksiproliini)-ekinokandiini B:n valmistamiseksi, jolla on kaava HO OH 8 -ΓΡ NH2CCH2j^=0 HN/CHa HO NH 0=(^OH (I> HO OH tunnettu siitä, että viljellään Zalerion arborico-la -mikro-organismia ravintoalustalla, joka sisältää assimiloitavia hiili- ja typpilähteitä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että viljellään Zalerion arboricola -mikro-organismia ravintoalustalla, jossa ensisijaisena typpilähteenä esiintyy luonnossa esiintymätön aminohappo.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- 25. e t t u siitä, että viljellään Zalerion arboricola -mikro-organismia ATCC 20868 ravintoalustalla, joka sisältää ensisijaisena hiililähteenä mannitolia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä on parantunut saanto ja että 30 viljellään Zalerion arboricola -mikro-organismia vesipitoisella ravintoalustalla, joka sisältää: (1) hiililähteen, joka on mannitoli, (2) typpilähteen, joka on maitoproteiinihydroly-saatti, ja 35 (3) puskurin, joka on glysiini tai epäorgaaninen fosfaatti. 39 93647

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty ravintoalusta koostuu seu-raavista aineista grammoina litraa vesipitoista alustaa kohti: D-mannitolia 20 - 100, KH2P04:ää 0,5 - 3, glysiiniä 5 1-4, peptonoitua maitoa 2-20, maitohappoa 0-3, hi- venaineliuosta 0 - 15 ml ja kasviöljyä 0-20.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään Zalerion arboricola -mikro-organismia ravintoalustalla, joka sisältää mannito- 10 lia vähintään 4 paino-% ja jonka pH pidetään noin 5, 5:ssä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi ensisijaisena tuotteena, tunnettu siitä, että viljellään MF5404 Zalerion arboricola -mikro-organismia, ATCC 20957, hiilen, 15 typen ja epäorgaanisten suolojen assimiloituvassa muodossa olevia lähteitä sisältävässä ravintoalustalla aerobisissa olosuhteissa, kunnes riittävä määrä kaavan I mukaista yhdistettä on saatu aikaan, minkä jälkeen yhdiste eristetään alustalta. 40 93647