KR20190140677A - 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물 - Google Patents

황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성의 억제용 조성물에 관한 것이며, 인체에 안전한 청어기름, DHA 및 EPA을 유효성분으로 함유하고 있다.
본 발명은 저농도에서 생물막 형성을 효과적으로 억제 내지 감소시키는 효과가 있으므로 식품, 의료기기, 주방용기에 피복 또는 분사하는 것에 의해 황색포도상구균의 오염을 방지하거나 오염된 황색포도상구균의 증식을 억제 내지 사멸시키는 효과가 있다.
또 본 발명의 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성의 억제용 조성물은 단독 항생제 또는 전통적인 항생제와 함께 조합 사용하여 황색포도상구균(S. aureus) 감염에 의한 질병을 치료 내지 예방하는 효과를 나타낸다.

Description

황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물 {composition for inhibiting biofilm formation and virulence of Staphylococcus aureus}
본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 생물막(biofilm) 형성 및 병독성(virulence) 억제용 조성물에 관한 것이며, 구체적으로는 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성을 억제하는 조성물 및 황색포도상구균의 감염으로부터 질병의 치료 및 예방에 유용한 조성물에 관한 것이다.
박테리아는 점액층 또는 생물막에 싸여 있으며, 이는 전통적인 항생화학 요법, 숙주 면역계 및 외부 스트레스를 견딜 수 있는 능력 때문에 인체의 건강에 심각한 문제를 제기하고 있다(참고, “Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation” Hoffman, et al. (2005). Nature 436, 1171-1175).
황색포도상구균(S. aureus)은 중요한 병원체이며, 사람의 생명을 심각하게 위협하는 혈류감염의 다양한 원인 중에 주요한 원인이며, 전 세계적으로 병원감염의 원인이 되고 있다. 생물막은 항생제 내성(Stewart and Costerton, 2001)에서 중요한 역할을 하며 메티실린 내성 S. aureus(MRSA)와 반코마이신 내성 S. aureus는 주요 병원내의 위협이 되고 있다(참고, “Resistance to methicillin and other antibiotics in isolates of Staphylococcus aureus from blood and cerebrospinal fluid” Speller et al., (1997). England and Wales, 1989-95. Lancet 350, 323-325.).
또한 황색포도상구균은 coagulase, enterotoxins, α-hemolysin, protein A 및 TSST-1과 같은 많은 외독성 물질을 분비하여 생물학적 세포막을 손상시키고 결국 세포사멸을 일으키며, S. aureus 생물막은 의료기기 및 식품표면에서 발견되며 식중독 및 독성쇼크 증후군을 일으킨다(참고, “Staphylococcus aureus in the antibiotic era.” Chambers and Deleo, (2009). Waves of resistance: Nat. Rev. Microbiol. 7, 629-641.).
특히 α-hemolysin(Hla)은 폐렴, 패혈증 및 심한 피부감염(Menzies and Kernodle, Wilke and Bubeck Wardenburg)과 생물막 형성의 병인과 관련된 주요 세포 독성 제제이며. S. aureus 생물막은 또한 질병의 심각성과 수술 후 경과의 결정에 중요한 역할을 한다(참고, Staphylococcus aureus biofilms: Nemesis of endoscopic sinus surgery. Laryngoscope 121, Singhal et al., (2011). 1578-1583.).
따라서 생물막 형성을 억제하는 수단과 황색포도상구균(S. aureus)의 독성을 밝혀내는 것이 중요하며, 이를 위해 약물 내성의 발달을 막는 신규하고 비독성인 화합물이 시급히 요구되고 있다.
황색포도상구균(S. aureus)의 생물막 형성 억제와 관련한 선행기술을 예로 들면, 특허문헌1에는 기주 독립적인 델로비브리오 박테리오보로스의 세포 외 단백질분해 효소를 포함하는 포도상구균(Staphylococcus)의 생물막(biofilm) 억제 또는 제거용 조성물을 개시하고 있고, 특허문헌2에 옥사실린 또는 암피실린을 유효성분으로 포함하고 상기 암피실린은 모린이 61.25㎍/㎖일 때 250㎍/㎖ 이고, 상기 옥사실린은 모린이 0.97㎍/㎖일 때 250 ㎍/㎖인 메티실린 황색포도상구균(Methicillin-resistant staphylococcus aureus, ATCC 33591) 억제용 항균 조성물을 개시하고 있다.
또 비특허문헌1에 oleic acid와 cis-2-decenoic acid가 세균의 부착과 분산을 막음으로써 Staphylococcus aureus의 생물막 형성을 억제하는 것으로 밝히고 있으며, 비특허문헌2에 cis-11-eicosenoic acid와 같은 장쇄 불포화 지방산(Lee et al., 2017)이 S.aureus의 생물막 형성능을 억제한다고 제안하고 있다.
본 발명의 출원인은 청어기름에 함유된 오메가 지방산 중 DHA와 EPA가 새로운 활성인 항생물막 및 항독성을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
KR10-1707571 B KR10-1816603 B
A fatty acid messenger is responsible for inducing dispersion in microbial biofilms. Davies, D. G., and Marques, C. N. (2009). J. Bacteriol. 191, 1393-1403. Impact of oleic acid (cis-9-octadecenoic acid) on bacterial viability and biofilm production in Staphylococcus aureus. Stenz et al., (2008) FEMS Microbiol. Lett. 287, 149-155.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 생물막(biofilm) 형성 및 병독성(virulence) 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
보다 상세하게는 사람의 건강에 유익한 오메가 지방산중 DHA와 EPA에 의해 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 생물막 형성 및 병독성을 억제하는 조성물의 제공하는 것을 목적으로 하며, 또 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성 억제 조성물을 함유하는 황색포도상구균(S. aureus)의 오염을 제거 내지 방지하기 위한 피복조성물, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 감염에 의한 질병을 치료 내지 예방하는 약학조성물을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제의 해결수단은 오메가-3 불포화 지방산을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물로 이루어진다.
상기 오메가 지방산 중 DHA와 EPA는 청어기름에 많이 함유된 오메가-3 불포화지방산(PUFA)으로서 인체에 유익하며, 구체적으로는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA; C22 : 6, ω-3)와 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA; C20 : 5, ω-3)이며, 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA)이 선택된다.
상기 오메가-3 불포화지방산(PUFA)인 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA)은 일반적으로 비해양동물에서는 저농도로 존재한다(참고, “Omega-3 fatty acids. Current status in cardiovascular medicine” Schmidt, E. B., and Dyerberg, J. (1994). Drugs 47, 405-424).
본 발명에 따른 과제의 해결수단으로 다른 측면은 식품, 의료기기, 주방용기에 황색포도상구균(S. aureus)의 오염을 제거 내지 방지하기 위하여 오메가 지방산 중 DHA와 EPA로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균(S. aureus)의 생물막 형성 및 억제용 조성물을 함유하는 피복조성물로 이루어진다.
상기 오메가-3 지방산인 DHA와 EPA는 본질적으로 인체에 안전하기 때문에 본 발명의 황색포도상구균(S. aureus)의 생물막 형성 및 억제용 피복조성물을 식품, 의료기기, 주방기구의 표면에 피복 또는 분사하는 것에 의해 식품, 의료기기, 주방용기에 황색포도상구균의 오염을 방지하거나 오염된 황색포도상구균(S. aureus)의 증식을 억제 내지 사멸시켜 황색포도상구균(S. aureus)의 감염에 따른 질병을 예방할 수 있으며 특히 의료기기에 상기 본 발명의 피복조성물을 적용하는 경우 황색포도상구균(S. aureus)의 증식을 억제 내지 사멸시켜 병원내 감염을 예방할 수 있는 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 과제의 해결수단으로 또 다른 측면은 청어기름, DHA 및 EPA로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균(S. aureus)의 생물막 형성 및 억제용 조성물을 함유하는 황색포도상구균(S. aureus)의 감염에 따른 질병을 치료 내지 예방하는 약학조성물로 이루어진다.
본 발명의 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성의 억제용 조성물은 인체에 안전한 청어기름, DHA 및 EPA을 유효성분으로 함유하고 있는 특징이 있고 또 저농도에서 생물막 형성을 효과적으로 억제 내지 감소시키는 효과가 있으므로 식품, 의료기기, 주방용기에 피복 또는 분사하는 것에 의해 황색포도상구균의 오염을 방지하거나 오염된 황색포도상구균(S. aureus)의 증식을 억제 내지 사멸시키는 효과가 있다.
또 본 발명의 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성의 억제용 조성물은 단독 항생제 또는 전통적인 항생제와 함께 조합 사용하여 황색포도상구균(S. aureus) 감염에 의한 질병을 치료 내지 예방하는 효과를 나타낸다.
도 1은 황색포도상구균 생물막 형성에 대한 청어기름의 효과를 나타내는 도표이다. 황색포도상구균(MSSA 6538 및 MRSA 33591) 생물막 형성(OD570)은 96-웰 폴리스티렌 플레이트에서 24시간 동안 청어기름의 존재 하에 정량화하였다(A, B). 황색포도상구균(MSSA 6538 및 MRSA 33591)의 플랑크톤 세포성장(OD600)은 250rpm에서 교반된 250㎖ 플라스크에서 청어기름의 존재 하에 측정하였다(C, D)(*,p<0.05 대. 비처리 대조군).
도 2는 황색포도상구균 생물막 형성 억제에 대한 DHA, EPA의 효과를 나타내는 도표이다. 황색포도상구균(MSSA 6538 및 MRSA 33591)에 의한 생물막 형성은 교반없이 96-웰 폴리스티렌 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 cis-11-eicosenoic acid, 청어기름, DHA, EPA의 존재 하에 20 또는 50㎍/㎖로 정량화하였다(A). 공 촛점 레이저에 의해 96-웰 플레이트에서 청어기름(50㎍/㎖), DHA(20㎍/㎖), EPA(20㎍/㎖)의 존재 하에 황색포도상구균 MSSA 6538의 생물막 형성을 24시간 후에 관찰하였다. 스캐닝현미경(B)(눈금은 100㎛를 나타낸다). 생물막 형성은 COMSTAT를 사용하여 분석하였다(C). 황색포도상구균 MSSA 6538의 세포성장은 DHA 또는 EPA의 존재 하에서 측정하였다(D, E)(*,p<0.05 대. 비처리 대조군).
도 3은 청어기름, DHA 및 EPA의 용혈활성를 나타내는 도표이다. 황색포도상구균에 의한 인간 적혈구 용혈을 20시간 동안 배양한 후에 청어기름(A), DHA(B), EPA(C)의 존재 하에서 조사하였다. 이미지는 분광광도계 큐벳에서의 용혈활동이다(*,p<0.05 대. 비처리 대조군).
도 4는 청어기름, DHA 및 EPA 존재 하에 전혈세포에 의한 황색포도상구균(MSSA 6538 및 MRSA 33591)의 사멸에 대한 효과를 나타내는 도표이다. 황색포도상구균 세포를 청어기름, DHA, EPA 존재 하에 1, 5 및 20㎍/㎖의 조건에서 20시간 동안 배양한 다음, 신선하게 채취한 인간 전혈과 혼합하고 3시간 동안 배양하였다. 시험화합물을 함유하거나 함유하지 않은 황색포도상구균의 생존율을 나타낸다(*,p<0.05 대. 비처리 대조군).
도 5는 C. elegans 생존에 대한 청어기름 DHA 및 EPA의 효과를 나타내는 도표이다. 청어기름, DHA, EPA(2, 5 또는 20㎍/㎖)의 존재 하에 S. aureus MSSA 6538로 감염시키고, 25℃에서 1일 노출 후 C. elegans fer-15;fem-1균주 생존율(A). 청어기름, DHA, EPA 독성은 생존율을 비감염 선충(B)과 비교하여 평가하였다. 생존은 운동을 기반으로 죽거나 살아있는 것으로 평가하였다(*,p<0.05 대. 비처리 대조군).
도 6은 청어기름 DHA 및 EPA 처리후 황색포도상구균의 전사 프로필변화에 대한 도표이다. S. aureus MSSA 6538은 청어기름(100㎍/㎖), DHA, EPA(20㎍/㎖)를 함유한 LB 배지에서 5시간 동안 250rpm으로 교반하면서 배양하였다. 상대적 전사 프로파일을 16s rRNA 발현과 관련하여 qRT-PCR에 의해 결정하였다. qRT-PCR을 이중으로 수행하고 접힘 -변화는 처리 대 비처리 황색포도상구균을 사용하여 계산하였다(*,p<0.05 대. 비처리 대조군).
이하에서는 실시를 위하여 구체적인 내용, <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 하며 아래 기재된 사항에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
상기에서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 황색포도상구균(S. aureus)의 생물막(biofilm) 형성 및 병독성(virulence ) 억제용 조성물은 청어기름, DHA 및 EPA로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하고 있다.
본 발명에 따른 상기 황색포도상구균은 메티실린에 민감한 S. aureus 균주(MSSA; ATCC 6538)와 메티실린 내성 S. aureus 균주(MRSA; ATCC 33591)를 포함하며, 유효성분인 청어기름, DHA 및 EPA는 황색포도상구균의 생물막 형성과 독성을 억제하는 효과가 있으며, 또 황색포도상구균의 표면관련 생물막 형성 및 그 병원성을 억제하기 위한 치료 및/또는 예방에 유용하다.
본 발명에 따른 상기 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물을 포함하는 피복조성물은 그 유효성분인 청어기름, DHA 및 EPA가 인체에 안전하므로 황색포도상구균이 생물막을 형성할 수 있는 생물체 또는 비생물체의 표면에 분사 등의 수단으로 피복하여 황색포도상구균의 오염을 방지하거나 오염된 황색포도상구균(S. aureus)의 증식을 억제 내지 사멸시켜 황색포도상구균(S. aureus)의 감염에 따른 질병을 예방할 수 있다.
상기 생물체 또는 비생물체의 표면은 생체 유래의 표면은 물론, 가정, 산업, 환경, 의료 분야에서 사용되는 물건의 표면을 포함하여 예를 들면, 피부, 치아 등 생체표면, 도마, 식칼, 주걱 및 국자 등의 주방기구 및 각종 의료용 설비, 장비, 기구, 임시 또는 영구용 인공삽입 보형물인 렌즈, 인공판막, 페이스메이커, 수술용 핀, 삽입 도관, 카테터 등의 의료기기가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 도마, 식칼, 주걱 및 국자 등의 주방기구는 여름철 음식조리과정에 황색포도상구균(S. aureus)의 오염에 의한 식중독 발생의 주요 원인이므로 상기 주방기구의 표면에 본 발명에 따른 피복조성물을 피복하여 줌으로써 황색포도상구균(S. aureus)의 오염을 방지하거나 오염된 황색포도상구균(S. aureus)의 증식을 억제, 감소 및 사멸시켜 황색포도상구균(S. aureus)의 오염에 의한 식중독을 예방할 수 있다.
그리고 상기 본 발명에 따른 황색포도상구균의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물을 포함하는 황색포도상구균(S. aureus)의 감염에 따른 질병을 치료 내지 예방하는 약학조성물은 그램 양성(Gram positive) 세균으로서 화농, 농양형성, 다양한 화농성 감염, 패혈증을 유발하는 병원성 미생물인 황색포도상구균에 의해 유발되는 모든 염증질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있으며, 바람직하게는 독소성 쇼크 신드롬(toxic-shock syndrome toxin, TSST), 패혈증, 폐렴, 염증성 장질환 또는 중증 피부감염에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 약학조성물의 유효성분인 DHA와 EPA 사용량은 DHA와 EPA 100㎍/㎖ 가 생물막 형성과 용혈인자(Hla) 생성을 억제하므로 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 제형으로 제조되어 경구투여 또는 비경구투여할 수 있으며, 예를 들면, 경구용 제형으로 정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등, 비경구형 제형으로 멸균 주사용 수성, 유성 현탁액, 국소형 제형으로 용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치 등으로 제형화하여 투여할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
또 본 발명은 청어기름, DHA 및 EPA로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 유효성분으로 포함하는 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등의 형태로 제공될 수 있으며 예를 들면, 구강내 바이오필름 형성을 억제하여, 치아의 부식예방, 치석형성 예방, 잇몸질환 예방 내지 개선 및 입 냄새 개선 등을 위한 껌 또는 음료, 차로 제공된다.
<실시예 1> 박테리아 균주, 시험물질
본 발명의 황색포도상구균(S. aureus)의 생물막 형성 및 병독성 억제용 조성물에 대한 시험을 위하여 시험물질로 DHA, EPA, cis-11-eicosenoic acid 및 erucic acid는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였으며, 청어(Clupea pallasii)기름은 내장이 제거된 반 건어물인 과메기로부터 아래와 같이 조제하였다.
국내 포항의 겨울철에 20일 동안 옥외에서 건조시킨 반건조 청어(764g)를 동결 건조기에서 3일간 더 건조시켜 건조된 청어 586g을 잘게 썰어 soxhlet 추출장치로 70℃에서 하루동안 n- 헥산으로 환류시켜 오일을 추출하였다.
환류시킨 후, 잔류용액을 수집하고 1% AcOH 용액 및 염수로 세척하여 과량의 단백질을 제거하고, 세척한 추출액을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시켜 맑은 황색의 점성의 기름을 얻었다(267g, 수율 45.6 %).
본 발명의 아래 <시험예>에서는 황색포도상구균으로 메티실린에 민감한 S. aureus 균주(MSSA; ATCC 6538)와 메티실린 내성 S. aureus 균주(MRSA; ATCC 33591)를 사용하였으며, 또 MSSA 균주(ATCC 6538)용 Luria-Bertani(LB) 배지 및 MRSA 균주(ATCC 33591)용 0.2 % 글루코스 함유 LB배지 내에서 37℃에서 각각 수행하였다.
<시험예 1> 청어기름의 주요성분 식별
공기 건조된 청어기름의 화학적 조성은 Agilent 6890N GC 및 SP-2560(Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)용융 실리카 모세관 컬럼 (100m x 0.25mm i.d., 필름 두께 0.25㎛)을 사용하여 GC로 측정하였으며, 모세관 컬럼의 세부사항, 온도조건 및 지방산의 유도체화(메틸화)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 요컨대, 헬륨은 0.75㎖/min의 캐리어로 사용되었으며, GC 인젝터는 225℃로 유지하였다. GC 오븐온도는 다음과 같이 프로그램되었다; 100℃에서 4분간, 240℃에서 3℃/분으로 증가시킨 후, 250℃에서 15분간 지속하였다. 스플릿 비율은 200 : 1로 제어되었으며, Triundecanoin(C11:00)을 내부표준으로 사용하고, 정량화는 전체면적과 지방산 메틸화의 보정에 의해 수행되었다. Supelco 37 구성요소 FAME Mix(Supelco)를 참조표준으로 사용하였다.
상기 가스크로마토그래프/질량분석(GC-MS 분석)으로 청어기름에서 28가지의 지방산을 동정하였으며, 청어기름에서 5% 이상을 구성하는 성분으로는 erucic acid(17.49%), DHA(11.31%), cis-11-eicosenoic acid(9.75%), palmitic acid(8.18%), myristic acid(5.78%) 및 EPA(5.78 %)이며(아래 표 1참조), GC-MS 분석으로 확인된 청어기름 성분은 이전의 선행문헌 보고와 일치하였다(참조, Lambertsen & Braekkan, 1965).
그리고 이전 연구논문인“Supercritical fluid extracts of Moringa oleifera and their unsaturated fatty acid components inhibit biofilm formation by Staphylococcus aureus” Lee, J.-H., Kim, Y.-G., Park, J. G., and Lee, J. (2017), Food Control 80” 74-82.에 의하면 cis-11-eicosenoic acid 및 oleic acid와 같은 불포화 지방산은 강력한 항생물막 작용효과를 나타내지만, 포화 지방산(myristic acid 및 palmitic acid)은 S. aureus에 대한 항생물막 작용을 나타내지 않는 것으로 보고되고 있으므로 본 발명에서는 불포화도가 우의적인 3종류의 오메가 지방산(DHA, EPA, 및 erucic acid)의 항생물막 작용에 초점을 두었다.
Lipid number Fatty acid name Composition (%)
C12:0 Lauric acid 0.13
C13:0 Tridecanoic acid 0.03
C14:0 Myristic acid 5.78
C14:1 Tetradecenenoic 0.05
C15:0 Pentadecanoic acid 0.45
C16:0 Palmitic acid 8.18
C16:1 Palmitoleic acid 2.15
C17:0 Heptadecanoic acid 0.36
C17:1 cis-10-Heptadecenoic aid 0.05
C18:0 Stearic acid 1.35
C18:1n-9,trans Elaidic acid 0.09
C18:1n-9,cis Oleic acid 2.72
C18:2n-6,cis Linoleic acid 1.11
C18:3n-6 γ-Linolenic acid 0.20
C20:1 cis -11- Eicosenoic acid 9.75
C18:3n-3 α-Linolenic acid 1.23
C21:0 Heneicosanoic acid 0.22
C20:2n-6 Eicosadienoic acid 3.80
C22:0 Behenic acid 0.05
C20:3n-6 Dihomo-γ-Linolenic acid 0.07
C22:1n -9 Erucic acid 17.49
C20:3n-3 cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid 0.1
C23:0 Tricosanoic acid 0.24
C22:2 Docosadienoic acid 0.91
C24:0 Lignoceric acid 0.02
C20:5n -3 cis -5,8,11,14,17- Eicosapentaenoic acid (EPA) 5.78
C24:1 Nervonic acid 0.93
C22:6n -3 cis -4,7,10,13,16,19- Docosahexaenoicacid ( DHA ) 11.31
<시험예 2> 크리스탈 - 바이올렛 생물막 분석
2종류의 박테리아 균주(MSSA 6538, MRSA 33591)를 96-웰 폴리스티렌 플레이트(SPL Life Sciences, Korea)에서 정적 생물막 형성 분석에 적용하였으며, 아래와 같이 시험하였다.
세포를 600nm에서 0.05의 초기 혼탁도에서 LB 배지(300㎕)에 접종하고 청어기름, cis-11-eicosenoic acid, DHA, EPA 또는 erucic acid를 다른 농도로 첨가하고 24시간 동안 배양하고, 37℃에서 진탕하였다. 생물막 형성을 정량화하기 위해 세포 배양물을 물로 3회 세척한 다음, 생물막을 0.1% 수정 바이올렛으로 20분 동안 염색하고, 이어서 생물막을 95% 에탄올 300㎕에 용해시키고 570nm에서 흡광도를 측정하였다(OD570).
생물막 분산분석을 위해, S. aureus(MSSA 6538, MRSA 33591)는 37℃에서 흔들림 없이 24시간 동안 96-웰 플레이트에서 배양되었다. 그런 다음 청어기름, DHA 또는 EPA를 배양액에 첨가하고 생물막 분석 전에 10시간 더 배양하였다. 정적 생물막 형성결과는 12 replicate wells의 독립적인 4개 배양액의 평균이다.
<시험예 3> 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 및 COMSTAT 분석
청어기름, DHA 또는 EPA의 존재 또는 부재 하에 96-웰 플레이트(흔들림없이)에서 S. aureus(MSSA 6538)에 의한 정적 생물막 형성을 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경(Nikon Eclipse Ti, Tokyo, Japan)으로 평가하였다.
이전의 선행문헌에서 보고된 것처럼 세포는 생물막에서 생존 가능한 세포를 얼룩지게 하는 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(Invitrogen, Molecular Probes Inc., Eugene, USA)로 염색하였다. 염색된 S. aureus(MSSA 6538) 생물막은 Ar 레이저(여기파장 488nm 및 방출 파장 500 내지 550 nm) 및 20 x objective을 사용하는 공 초점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 가시화되었다.
컬러 공 촛점 이미지는 동일한 조건에서 NIS-Elements C 버전 3.2 (Nikon eclipse)를 사용하여 제작되었으며, 각각의 실험에서 2개의 독립적인 배양에서 적어도 10개의 임의의 위치가 관찰되었고, 20개의 평면 이미지가 위치 당 분석되었다.
생물막 형성을 정량화하기 위해, biovolumes(㎛3/㎛2), 평균두께(㎛) 및 기저 적용범주(%)를 측정하기 위해 COMSTAT 생물막 소프트웨어(Heydorn 등, 2000)가 사용되었으며, 모든 이미지 스택에 대한 임계값이 고정되었고 위치 당 최소 4개의 위치와 20개의 평면 이미지를 분석하였다.
<시험예 4> 용혈 분석
인간 적혈구 용혈 효능은 이전의 선행문헌에서와 같이 S. aureus(MSSA 6538)의 전체 배양액을 사용하여 아래와 같이 시험하였다.
S. aureus 세포(MSSA 6538)를 밤새 배양하여 LB배지(9 x 109 CUF/㎖)로 1 : 100로 희석하고, 250rpm으로 진탕하면서 20시간 동안 청어기름, DHA 또는 EPA와 함께 또는 그렇지 않는 상태에서 배양하였다.
별도로, 인간 전혈 샘플을 900g에서 2분간 원심 분리한 다음 PBS로 3회 세척하고 PBS(PBS 완충액 10㎖ 당 적혈구 330㎕)로 희석시켰다. 이어서, 희석된 인간 적혈구(PBS 중 3.3%) 1㎖에 박테리아 배양액(200㎕)을 첨가하고, 용혈활성을 측정하기 위해 혈액과 황색포도상구균의 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 250rpm으로 배양하고, 상등액을 16,600g에서 10분 동안 원심분리하여 수집하였으며, 광학밀도를 543nm에서 측정하였다.
<시험예 5> 전혈 세균 살상 분석
S. aureus(MSSA 6538) 세포를 밤새 배양된 LB배지에 접종하고(1 : 100 희석, 0.05의 OD600) 청어기름, DHA 또는 EPA(1, 5, or 20 ㎍/㎖) 또는 DMSO(음성대조군)과 함께 250rpm으로 흔들어 주면서 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 그 후 신선하게 채취한 인간의 혈액(0.3㎖)을 S. aureus 배양액(0.1㎖)과 혼합하고, 혼합물을 250rpm으로 진탕하면서 37℃에서 3시간 동안 배양했다. S.aureus(MSSA 6538)의 생존은 LB 한천 플레이트에서 CFU로 계수하여 측정하였다.
<시험예 6> Caenorhabditis elegans 생존분석
S. aureus MSSA 6538의 병독성에 대한 청어기름과 불포화 지방산의 영향을 조사하기 위해 이전 선행문헌을 약간 수정하여 아래와 같이 선충(Caenorhabditis elegans)의 생존 분석에 적용하였다.
S. aureus MSSA 6538 세포를 청어기름, DHA 또는 EPA(2, 5 또는 20㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 24시간 동안 항온 배양하고, Caenorhabditis elegans fer-15; fem-1 L1- 단계 선충(Caenorhabditis elegans)을 배양된 S.aureus MSSA 6538 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 단일 웰에 첨가하였다. 약 30마리의 선충을 배양된 S. aureus MSSA 6538에 25℃에서 1일 동안 사료로 먹였다.
세포 독성 분석을 위해 110±10마리의 선충(Caenorhabditis elegans)을 M9 완충액이 들어있는 96-웰 플레이트의 단일 웰에 넣고 25℃에서 1일 동안 20 또는 100㎍/㎍의 최종 농도로 첨가했다.
그런 다음 iRiSTM Digital Cell Imaging System(로고스 바이오 시스템, 한국)을 사용하여 선충(Caenorhabditis elegans)을 생존 또는 사멸로 기록했다. 네 번 반복된 well을 사용하여 적어도 세 번의 독립적인 실험을 수행하였다.
<시험예 7> RNA 분리 및 qRT - PCR
S.aureus MSSA 6538 세포를 250㎖ 플라스크에서 37℃의 LB 배지 25㎖에 0.05의 OD600로 접종을 시작으로 하여, 청어기름(100㎍/㎖), DHA 또는 EPA(20㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에 250rpm으로 흔들어 주면서 5시간 동안 배양하였다.
RNase 저해제(RNAlater, Ambion, TX, USA)를 첨가하고 95% 에탄올을 함유한 드라이 아이스 배스에서 30초 동안 즉시 세포를 냉각시켜 RNA분해를 막았다. 세포를 16,600g에서 1분간 원심 분리하여 수확하고, Qiagen RNeasy mini Kit(Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다.
qRT-PCR은 10개의 생물막 관련 유전자, 즉 agrA, arlR, arlS, aur, hla, icaA, nuc1, rbf, RNAⅢ, saeR, sarA, sarZ, seb, sigB 및 spa의 전사 수준을 조사하기 위해 사용되었다. S.aureus MSSA 6538 세포에서 유전자 특이적 프라이머를 사용하였고, 관심있는 유전자의 발현을 정상화하기 위해 16s rRNA를 하우스 키핑 대조군 (supplementary table 1)으로 사용하였다.
사용된 qRT-PCR 기술은 이전의 선행문헌에 기술된 방법에 따라 수행하였다. qRT-PCR은 SYBR Green master mix(Applied Biosystems, Foster City, USA)와 ABI StepOne Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였으며, 발현수준은 유전자 당 2개의 독립적인 배양액 및 6개의 qRT-PCR 반응을 사용하여 결정하였다.
A. 통계 분석
값은 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 데이터는 차이의 중요성을 결정하기 위하여 SPSS 버전 23(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하는 Dunnett 's test에 이어서 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석하였다. 0.05 미만의 p값에 대해서는 통계적 유의성을 인정하였다.
B. 결과 및 고찰
1. 황색포도상구균 생물막 형성에 대한 청어기름의 효과
청어기름의 항생물막 활성은 96-well polystyrene plates에서 2개의 S. aureus 균주(MSSA 6538 및 MRSA 33591)에 대해 조사하였다. 박테리아 배양 초기에 청어기름을 첨가하면 용량 의존적으로 S. aureus 생물막 형성이 억제되었다(도 1; A, B 참조).
특히, 청어기름 100㎍/㎖는 S. aureus MSSA 6538에 의한 생물막 형성을 75% 이상 감소시키는 반면, 청어기름 20㎍/㎖는 S. aureus MRSA 33591에 의한 생물막 형성을 65% 이상 억제하는데 필요하였다.
청어기름은 최대 1000㎍/㎖의 농도에서 S. aureus 균주(MSSA 6538 및 MRSA 33591)의 성장을 감소시키지 않았으며(도 1; C, D 참조), 1000㎍/㎖ 보다 증가한 농도에서도 S. aureus 균주(MSSA 6538 및 MRSA 33591)의 플랑크톤 세포수에는 영향을 미치지 않았다.(데이터 미도시). 이러한 결과로부터 청어기름의 항생물막 활성이 살균효과로 인한 것이 아님을 보여주는 것을 알 수 있다.
2. 황색포도상구균에 의한 생물막 형성에 대한 DHA와 EPA의 효과
4개의 주요 PUFA(cis-11-eicosenoic acid, DHA, EPA 및 erucic acid)의 항생물막 작용효능을 96-웰 플레이트에서 두 S. aureus 균주(MSSA 6538 및 MRSA 33591)에 대해 시험하였다. 20㎍/㎖ 농도의 cis-11-Eicosenoic acid, DHA 및 EPA는 두 가지 S. aureus 균주에 의한 생물막 형성을 유의하게 억제했다(도 2; A 참조).
DHA 및 EPA가 모두 20㎍/㎖에서 90%이상 생물막 형성을 억제하였으며, 이는 cis-11-eicosenoic acid에 대해 이전의 선행문헌에 보고된 것보다 현저한 억제 효과이다.
이전의 선행기술에서는 유리 지방산과 박테리아 생물막 형성 사이의 관계를 연구하였다. 특히 oleic acid와 cis-2-decenoic acid는 세균의 부착과 분산을 막음으로써 Staphylococcus aureus의 생물막 형성을 억제하는 것으로 밝혔다(Davies and Marques, 2009; Stenz et al., 2008). 또한 cis-11-eicosenoic acid와 같은 장쇄 불포화 지방산(Lee et al., 2017)이 S.aureus의 생물막 형성능을 억제한다고 제안하였다.
그러나 본 발명은 황색포도상 구균에 대한 DHA와 EPA의 항생물막 활성을 처음 시도한 것이며, 청어기름에 고농도로 존재하는 불포화 지방산인 erucic acid(표 1참조)은 20㎍/㎖에서 S. aureus MRSA 33591에 의한 생물막 형성을 85%이상 억제하였으나, S. aureus MSSA 6538에 의한 생물막 형성을 억제하지는 않았다(도 2; A 참조).
그리고 500 및 1000㎍/㎖에서 erucic acid의 농도가 높을수록 플랑크톤 성장에 영향을 주지 않으면서 S. aureus MSSA 6538의 생물막 형성이 현저히 감소되었다(데이터는 표시하지 않음). 이러한 결과는 erucic acid의 영향은 용량 의존적이고, strain 의존적인 것으로 보인다.
공 촛점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 청어기름, DHA 또는 EPA의 존재하에 S.aureus에 의한 생물막 형성을 정량화하는데 사용되었다. 형광 스태킹 3D 이미지는 청어 기름(50㎍/㎖), DHA(20㎍/㎖) 또는 EPA(20㎍/㎖)가 S. aureus 생물막 형성을 현저하게 억제했으며(도 2; B 참조) 그리고 이것은 COMSTAT에 의해 확인되었다.
보다 구체적으로는 DHA, EPA 및 청어기름은 3항목의 S. aureus MSSA 6538 매개변수(혈청 체적, 평균 두께 및 기저 적용범주) 모두를 감소시켰으며(도 2; C 참조), 실제로 DHA와 EPA는 바이오 매스와 평균두께를 각각 90%이상 감소시켰다. 이러한 결과는 청어기름, DHA 및 EPA 모두가 96-웰 플레이트의 바닥에서 생물막 형성을 효과적으로 감소시키는 것을 보여주는 것을 알 수 있다.
항균제, 효소 및 지방산에 의한 성숙한 생물막 박리는 항생제에 대한 내성 때문에 관심이 있으나(Gwisai et al., 2017; Flemming and Wingender, 2010; Lee et al., 2018), 청어기름(1000㎍/㎖), DHA(100㎍/㎖) 및 EPA(100㎍/㎖)는 성숙한 S. aureus ATCC 6538 생물막을 분산시킬 수 없었다.
3. 황색포도상구균에 대한 DHA와 EPA의 항균효과
DHA와 EPA의 항균활성은 S. aureus MSSA 6538과 MRSA 33591에 대한 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MICs)를 측정하여 평가하였다. MICs(200㎍/㎖)에서 DHA와 EPA에 의해 플랑크톤의 성장이 완전히 저해되었다. ciprofloxacin과 vancomycin의 MICs는 각각 이전에 보고된 값과 일치하는 0.5 ~ 1㎍/㎖와 4㎍/㎖이다(Desbois and Lawlor, 2013; Gwisai et al., 2017). 특히 DHA와 EPA의 MICs는 항생물막 작용에 필요한 농도(20㎍/㎖)보다 10배 높았다(도 2; A). 5㎍/㎖ DHA 또는 20㎍/㎖ EPA의 존재 하에 S.aureus MSSA 6538 및 MRSA 33591의 플랑크톤 세포 성장은 약간 억제되었다(도 2; D, E).
그러나 두 균주의 세포 성장은 50㎍/㎖의 DHA 또는 EPA에 의해 68% 이상 억제되었으며, 이는 DHA와 EPA가 비교적 높은 농도에서 항균(항박테리아) 효과를 가지는 것을 나타낸다(도 2; D, E). 이러한 관찰은 DHA와 EPA가 저농도에서는 항생물막 작용효과를 나타낼 뿐 아니라, 높은 수준에서는 플랑크톤 세포의 성장을 억제 할 수도 있음을 제시한다.
4. 황색포도상구균에 대한 DHA와 EPA의 항균효과
DHA와 EPA의 항균활성은 S. aureus MSSA 6538과 MRSA 33591에 대한 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MICs)를 측정하여 평가하였다.
MICs(200㎍/㎖)에서 DHA와 EPA에 의해 플랑크톤의 성장이 완전히 저해되었으며, ciprofloxacin과 vancomycin의 MICs는 각각 이전의 선행기술에서 보고된 값과 일치하는 0.5 ~ 1㎍/㎖와 4㎍/㎖이었다.
특히, DHA와 EPA의 MICs는 항생물막 작용에 필요한 농도(20㎍/㎖)보다 10배 높았다(도 2; A 참조). 5㎍/㎖ DHA 또는 20㎍/㎖ EPA의 존재 하에 S.aureus MSSA 6538 및 MRSA 33591의 플랑크톤 세포 성장은 약간 억제되었다(도 2; D, E 참조).
그러나 두 균주의 세포 성장은 50㎍/㎖의 DHA 또는 EPA에 의해 68% 이상 억제되었으며, 이러한 결과는 DHA와 EPA가 비교적 높은 농도에서 항균(항박테리아) 효과를 가지는 것을 나타내는 것을 알 수 있다(도 2; D, E 참조). 이러한 관찰은 DHA와 EPA가 저농도에서는 항생물막 작용효과를 나타낼 뿐 아니라, 높은 수준에서는 플랑크톤 세포의 성장을 억제할 수 있음을 제시하는 것이다.
5. 황색포도상구균에 의한 용혈에 대하여 청어기름, DHA , EPA의 효과
황색포도상구균(S. aureus)는 가장 많이 연구된 S. aureus 세포독소 중 하나 인 α-Toxin(독소)를 생산한다. α-Toxin은 용혈을 유발하는 적혈구막에 통합되며, 이것은 생물막 형성에 기여한다.
따라서 청어기름, DHA 및 EPA가 황색포도상구균에 의한 인간 적혈구 용혈에 미치는 영향을 조사하였다.
대조군으로 황색포도상구균(S.aureus) 세포가 없는 청어기름, DHA 및 EPA는 용혈 활성을 나타내지 않았다(데이터 미기재). 청어기름, DHA 및 EPA 모두가 S. aureus의 용혈 활성을 용량 의존적으로 억제하였으며(도 3 참조), 20㎍/㎖의 DHA와 EPA는 용혈 활성을 완전히 없애고, 20㎍/㎖의 청어기름은 용혈활성을 75% 감소시켰으며, 또한 청어기름, DHA 및 EPA는 모두 1㎍/㎖에서도 황색포도상구균의 용혈활성을 현저히 감소시켰는데, 이는 항생물막 활성 및 항균활성에 필요한 농도보다 훨씬 낮은 것이다.
이러한 결과는 청어기름, DHA 및 EPA에 의한 S.aureus 생물막 형성의 억제가 용혈 억제와 관련되어 있으며, 생물막 형성 및 용혈과 관련된 유전자가 이러한 사건의 원인이 될 수 있음을 시사한다.
본 발명은 청어기름, DHA 및 EPA가 황색포도상구균에 의한 인간 적혈구의 용혈을 억제하는 것에 대하여 처음으로 제시한 것이며, 황색포도상구균의 독성 제어에 중요한 의미가 있다.
6. 인간 전혈이 있을 때 S. aureus의 생존에 대한 청어기름, DHA 및 EPA의 효과
황색포도상구균(S.aureus)은 인간 및 다른 동물에서 식세포에 대하여 저항성을 특징으로 보이므로 청어기름, DHA 및 EPA가 인간 전혈의 존재하에 S. aureus 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해 생존 테스트를 사용하였다.
1, 5 또는 20㎍/㎖의 청어기름, DHA 또는 EPA는 신선한 인간의 전혈에 노출된 황색포도상구균(S.aureus)의 생존을 현저히 감소시켰으며 (도 4 참조), 이러한 결과는 황색포도상구균(S.aureus)이 인간의 선천성 면역계에 저항하는 능력을 약화시킨다는 것을 보여주는 것이다.
7. 선충류 모델 내의 S. aureus 독성에 대한 청어기름, DHA 및 EPA의 효과
황색포도상구균(S. aureus)은 선충류 모델(Caenorhabditis elegans)의 소화관에서 번식하고 복제하며, 포유류에서 관찰되는 감염과 유사한 과정을 통해 선충류 모델(C. elegans)를 죽일 수 있는 능력을 가지고 있다.
따라서 황색포도상구균의 독성에 대한 청어기름, DHA 및 EPA의 영향을 황색포도상구균(S. aureus)의 존재 하에 C. elegans 생존을 분석하여 조사하였다. 청어기름, DHA 및 EPA는 S. aureus의 존재 하에서 C. elegans의 생존을 현저하게 연장시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 5; A 참조).
선충류 생존율은 처리되지 않은 S.aureus 존재 하에서는 10%이하 이지만, 20㎍/㎖의 청어기름, DHA 또는 EPA 존재 하에서는 각각 55%, 60%, 70%의 선충류가 생존하였다.
다시 말하면 C. elegans의 생존율은 웜이 20㎍/㎖의 DHA 나 EPA의 존재 하에 황색포도상구균(S. aureus)에 노출되었을 때 7배 및 9배 이상 증가하였다(도 5; A 참조).
또한, 감염되지 않은 웜이 최대 100㎍/㎖ 농도의 청어기름, DHA 또는 EPA에 노출되었을 때 독성 영향이 관찰되지 않았다(도 5; B 참조).
8. 황색포도상구균에서 청어기름, DHA 및 EPA에 의해 유도된 전사 변화
황색포도상구균(S. aureus)에 대한 청어기름, DHA 및 EPA의 저해효과에 대한 분자적 메커니즘을 조사하기 위하여 qRT-PCR에 의해 S.aureus 세포에서 선택된 생물막, 독성 관련 유전자의 발현 및 중요한 조절 유전자를 조사하였다.
청어기름, DHA 및 EPA는 α- 용혈 인자(hla)의 발현을 각각 27배, 24배 및 20배 감소시켰다(도 6 참조). 또한 청어기름, DHA 및 EPA는 agr operon의 upstream에 존재하는 조절 RNA분자(RNAⅢ)를 하향 조절하는 반면, 다른 유전자의 발현은 영향을 받지 않았다(도 6 참조).
RNAⅢ가 hla 번역을 자극한다는 보고가 있음로 hla 억제는 부분적으로 DHA와 EPA에 의한 RNAⅢ의 하향 조절에 기인하는 것이다.
α-Hemolysin은 생물막 형성동안 세포간 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 α-hemolysin 발현의 감소는 S. aureus에 의한 생물막 형성과 용혈을 억제한다는 최근 발표된 논문에 의해 알려져 있다.
본 시험의 결과는 α-hemolysin이 S. aureus에서의 생물막 형성과 양의 상관관계가 있음을 보여주며, 또한, hla가 선충류 모델에서 S.aureus의 병원성에 필수적임을 보여 주주는 것이다. 특히, 청어기름, DHA 또는 EPA는 생물막 관련 유전자, 즉 agrA, arlR, arlS, aur, icaA, nuc1, rbf, saeR, sarA, sarZ, seb, sigB 또는 spa의 발현에 유의한 영향을 미치지 않았다.
상기한 시험예의 결과에 의해 본 발명은 청어기름, DHA 및 EPA가 항생물막활성(도 1, 2 참조) 및 항용혈활성(도 3 참조) 그리고 부분적으로 hla 유전자의 발현을 하향 조정하는 함으로써(도 6 참조) 감소에 의해 입증된 것처럼 황색포도상구균(S. aureus) 독성을 약화시키는 것을 제시하였다.
또한 본 발명은 상기 시험 결과에 의해 청어기름, DHA 및 EPA가 단독 항생제 또는 전통적인 항생제와 함께 S. aureus 감염을 치료하는데 사용될 수 있음을 시사하며(도 5 참조), 더욱이 오메가-3 지방산 중 DHA와 EPA는 본질적으로 안전하기 때문에 의학적 목적 내지 생물체 또는 비생물체의 표면처리에 사용되어 황색포도상구균(S. aureus) 감염의 예방 내지 치료제로 적용하는 것이 가능한 것을 쉽게 예측할 수 있다.

Claims (7)

  1. 오메가 지방산 중 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코가펜타엔산(EPA)으로부터 선택되는 하나 또는 두성분을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균의 병독성 억제용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    황색포도상구균은 메티실린에 민감한 S. aureus 균주(MSSA; ATCC 6538) 또는 메티실린 내성 S. aureus 균주(MRSA; ATCC 33591)인 것을 특징으로 하는 황색포도상구균의 병독성 억제용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기의 조성물은 주방기구용 또는 의료기구용 황색포도상구균의 오염방지에 특징을 갖는 병독성 억제용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    주방기구는 도마, 식칼, 주걱, 국자, 주방용 가위 중 어느 하나인 것을 특징으로 갖는 병독성 억제용 조성물.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 조성물을 포함하는 황색포도상구균 감염으로부터 유발되는 질병의 치료 또는 예방용 약학조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    황색포도상구균 감염으로부터 유발되는 질병이 독소성 쇼크 신드롬(toxic-shock syndrome toxin, TSST), 패혈증, 폐렴, 염증성 장질환 및 중증 피부질환 중 어느 하나인 것을 특징하는 약학조성물.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장용 로션 또는 화장용 크림.
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