CN113350493B - 一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联疫苗及应用，涉及微生物疫苗制备领域；本发明公开的二联疫苗的抗原为灭活的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌；所述杀鲑气单胞菌的保藏编号为CCTCC M 2021397；所述大菱鲆弧菌的保藏编号为CCTCC M 2021399。本发明制备的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌二联灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定、成本低，为可大量获得具有较高免疫效果且安全性高的灭活疫苗，弥补了目前的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌二联灭活疫苗产品的空白。本发明制备的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌二联灭活疫苗可以有效的遏制杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌病的发生和流行，为本领域大菱鲆的安全高效养殖提供了保障。

Description

一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联疫苗及应用

技术领域

本发明涉及微生物疫苗制备领域，特别是涉及一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联疫苗及应用。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus L)俗称“多宝鱼”，在大西洋沿岸、北海、黑海、地中海一带生活，15℃-18℃为其最佳生长温度范围，但在0℃-30℃时也可生存，在盐度为28-32％的水中可正常生活，pH耐受范围7.6-8.2。消费者对于大菱鲆的喜爱使得大菱鲆经济价值越来越高，我国进行了大菱鲆大规模的商业养殖，约占世界养殖总量的十分之九。但是，随着大菱鲆养殖规模的逐渐扩大，大菱鲆疾病的暴发也越来越频繁。

杀鲑气单胞菌属气单胞菌科、气单胞菌属，是一种遍布自然界的兼性厌氧的革兰氏阴性不动菌，是气单胞菌属中最早被鉴定的致病菌。在其五个亚种中，患病鱼类中最常发现的亚种是杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)，同时也被称为典型的杀鲑气单胞菌亚种。非典型杀鲑气单胞菌为其他四个亚种，分别是溶果胶亚种(Aeromonas salmonicida subsp.pectinolytica)、杀日本鲑亚种(Aeromonassalmonicida subsp.masoucida)、无色亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.achromogenes)以及史氏亚种(Aeromonas salmonicida subsp.smithia)。除了溶果胶亚种不是鱼类病原体以外，其余的三种病原体的感染都可导致非典型疥疮的症状。除虹鳟、大西洋鲑等鲑鳟科鱼类外，越来越广泛的水产养殖鱼类中发现了非典型的杀鲑气单胞菌菌株感染，例如黑岩鱼(Sebastes schlegeli)、鲫鱼(Carassius Carassius)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、团鱼(Cyclopterus lumpus)和欧洲鲈鱼(Perca fluviatilis)，同时其无色亚种、溶果胶亚种等还会使大菱鲆、半滑舌鳎等鱼感染。2005年，Bjrnsdottir等人报道了杀鲑气单胞菌引起大菱鲆肝脏出血，体表溃疡等病理性变化；2007年山东省某养殖场的体长为5厘米的大菱鲆幼苗因感染非典型杀鲑气单胞菌发生病害死亡；同时，根据张正等人文献记载，半滑舌塌养成期的常见疾病之一为杀鲑气单胞菌所引起的皮肤溃疡病，在病发初期，可观察到病鱼背部有部分白色圆斑，随着病情推进，白斑区域逐渐充血发红，至后期产生皮肤疥疮，病鱼开始死亡。无论是杀鲑气单胞菌典型性菌株还是杀鲑气单胞菌非典型菌株，它们都是水产养殖业发生经济损失的元凶。

大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)是革兰氏阴性菌和氧化酶阳性的兼性厌氧短杆菌，最早在西班牙发现并分离鉴定将其归类为弧菌属，弧菌属的一些细菌对人类和海洋动物具有致病性，且如果宿主处于应激条件下，致病性尤其严重。在大菱鲆患病后，病鱼进食减少或停止进食，腹部有积水，对病鱼进行解剖发现其肝脾肠充血发红，有白色条状物质在消化道中，大菱鲆弧菌常被认为是引起腹水病的病原菌之一。

目前，本领域对杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌引起的鱼类疾病的防治主要依赖消毒剂、抗生素等化学药物，虽然对病原菌的杀灭有一定效果，但长时间的化学药物的使用会导致微生物耐药性、药物残留以及大菱鲆应激刺激等现象出现。免疫接种是本领域防制疾病的重要手段，虽然目前已有部分杀鲑气单胞菌或大菱鲆弧菌疫苗被研制出来，但是，目前尚无高效的、商品化防控杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌引起的鱼类疾病的二联灭活疫苗产品。同时，目前研制出的杀鲑气单胞菌或大菱鲆弧菌疫苗普遍存在效力低、安全性差的问题，因此，如何提高疫苗效力和安全性也是当前重要的任务之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联疫苗及应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联灭活疫苗，所述二联疫苗的抗原为灭活的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌；所述杀鲑气单胞菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2021397；所述大菱鲆弧菌于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2021399。

进一步地，所述杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的灭活方式为甲醛灭活。

进一步地，所述二联灭活疫苗还包括佐剂。

进一步地，所述抗原为杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌灭活后以体积比1:1进行混合得到。

进一步地，所述疫苗的接种方式为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫或口服免疫。

本发明还提供一种所述的二联灭活疫苗在制备治疗和/或预防由杀鲑气单胞菌和/或大菱鲆弧菌引起的鱼类疾病的产品中的应用。

本发明还提供一种所述的二联灭活疫苗在制备提高鱼类免疫力的产品中的应用。

进一步地，所述鱼类为海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类或洄游鱼类。

本发明还提供一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联灭活疫苗的制备方法，所述方法为：

(1)灭活的杀鲑气单胞菌与灭活的大菱鲆弧菌以体积比为1:1进行混合，得到抗原；所述杀鲑气单胞菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2021397；所述大菱鲆弧菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2021399；

(2)将步骤(1)获得的所述抗原与佐剂以体积比为3:7的比例混合。

本发明公开了以下技术效果：

本发明制备的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌二联灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定、成本低，为可大量获得具有较高免疫效果且安全性高的灭活疫苗，弥补了目前的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌二联灭活疫苗产品的空白。

本发明制备的杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌二联灭活疫苗可以有效的遏制杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌病的发生和流行，为本领域大菱鲆的安全高效养殖提供了保障。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为疫苗免疫后活菌攻毒大菱鲆在15日内累积存活率；

图2为疫苗免疫后大菱鲆血清溶菌酶活性；

图3为疫苗免疫后大菱鲆血清酸性磷酸酶活性；

图4为免疫后大菱鲆血清补体C3浓度随时间变化趋势；

图5为疫苗免疫后5个时间点对照组和疫苗组的MHCⅡα在大菱鲆肝脾肾中的表达情况；

图6为疫苗免疫后5个时间点对照组和疫苗组的MHCIIβ在大菱鲆肝脾肾中的表达情况；

图7为疫苗免疫后5个时间点对照组和疫苗组的CD4在大菱鲆肝脾肾中的表达情况；

图8为疫苗免疫后5个时间点对照组和疫苗组的CD8在大菱鲆肝脾肾中的表达情况；

图9为疫苗免疫后5个时间点对照组和疫苗组的TNF-α在大菱鲆肝脾肾中的表达情况；

图10为疫苗免疫后5个时间点对照组和疫苗组的IL-1β在大菱鲆肝脾肾中的表达情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌菌株的分离及其毒性分析

2019年5月，山东烟台海阳大菱鲆养殖场大菱鲆患疥疮病，观察其外表为大菱鲆背部及腹面有较多红色疥疮，病鱼摄食减少，并在患病后有少量死亡情况。同年7月，该养殖场大菱鲆突然减少甚至停止摄食、并在池底发现白便，观察病鱼发现其腹腔鼓胀，判断其患腹水病及白便病，在发病后不到一周时间该养殖池大菱鲆全部死亡。为在以后提前进行相关疾病免疫预防，故从养殖场取患病大菱鲆进行病原菌分离鉴定。

1.1病原分离

在无菌生物安全柜中使用无菌剪刀镊子等解剖濒死患病大菱鲆，用无菌接种针分别挑取剪刀剪碎的肝脏、肾脏，并用无菌接种针抠取疥疮病灶区。在TSB平板培养基分别划线，置于28℃恒温培养箱中过夜培养，待细菌长出，观察细菌形态特征。

结果：从患疥疮病和腹水病的大菱鲆的肝、肾、疥疮和腹水均经平板划线分离到两株优势菌落，将从患疥疮病大菱鲆分离到的优势菌落命名为HHSM190529，从患腹水病大菱鲆分离到的优势菌落命名为HHDLP190721。HHSM190529菌在TSB培养基上生长正常，呈乳白色，圆形，直径约为(0.5±0.2)mm，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起。HHDLP190721菌在TSB培养基上生长较慢，略微透明，圆形，直径约为(0.2±0.1)mm，表面光滑湿润，边缘整齐，较易挑起。

1.2分子鉴定

从已进行平板划线病原分离的TSB平板培养基上挑取形态大小均一的优势菌落进行PCR扩增，并进行核酸电泳。PCR模板的制备：挑取单个菌落于20μLDEPC(diethylpyrocarbonate)水中，充分混合可作为PCR模板使用。引物采用PCR通用引物27F/1492R，序列见表1，由青岛派森诺生物有限公司合成，PCR采用25μL反应体系，具体反应体系用量及反应条件如表2、表3所示，经PCR产物电泳后，使用凝胶成像仪选择单一条带产物进行PCR反应产物测序，所得序列经NCBI Blast比对分析序列同源性。

结果：测序后HHSM190529和HHDLP190721获得的序列经Blast比对，HHSM190529与杀鲑气单胞菌相似性最高，同时与杀鲑气单胞菌的多个亚种具有相似性；HHDLP190721与大菱鲆弧菌相似性可达100％。同时，使用HHSM190529和HHDLP190721进行攻毒后取病鱼进行的病原分离及分子鉴定均显示HHSM190529与杀鲑气单胞菌相似性最高；HHDLP190721与弧菌属相似性可达100％，与大菱鲆弧菌相似性达97％，在无菌条件下，解剖濒临死亡的感染组取肝脏肾脏和腹水等进行病原分离，分离所得菌株与先前菌株形态与分子鉴定结果一致。故引起大菱鲆腹水病的病原菌HHDLP190721为大菱鲆弧菌。大菱鲆弧菌HHDLP190721(Vibrio scophthalmi HHDLP190721)的保藏号为CCTCC NO:M 2021399。

表1 PCR通用引物序列

注:F表示上游引物，R表示下游引物

表2 PCR反应体系(25μL)

表3 PCR反应条件

1.3生理生化特征

挑取于TSB固体平板上生长良好的待测菌落接种于细菌微量生化反应管，在28℃恒温培养箱内进行培养，18-24h后观察反应管变化，参照说明书、《常见细菌系统鉴定手册》对结果进行鉴定。

结果：根据微量生化反应管说明书、《常见细菌系统鉴定手册》比对HHSM190529的生化鉴定结果，与杀鲑气单胞菌无其他亚种生理生化特征进行比较(Austen and Austin，2016)。如下表4所示，HHSM190529对蔗糖、葡萄糖显阳性，可进行硝酸盐的还原反应，在0％NaCl中也可以生长，其余鉴定项目均为阴性，与杀鲑气单胞菌无色亚种结果最为相似。杀鲑气单胞菌HHSM190529(Aeromonas salmonicida HHSM190529)的保藏号为CCTCC NO:M2021397。

表4杀鲑气单胞菌HHSM190527生理生化实验结果

1.4药物敏感性实验

将待测菌株用TSB液体培养基于28℃恒温摇床进行扩大培养，24h后取少量进行菌液浓度测定，使其终浓度为2.0×10⁸CFU/ml。将菌液进行离心，并将等量PBS将菌体制成相同浓度的菌悬液，使用移液枪取100μL菌悬液注于固体平板，在无菌环境下进行涂布，将不同抗生素的贴片贴于培养基表面，一个平板贴3-4个，每个药物做三个平行。将平板倒置于28℃恒温培养箱中过夜培养，记录抑菌圈有无及相应直径，根据CLSI评判标准对药敏试验结果进行分析(Jones and R.,1984)。

结果：药敏实验结果如表5-6所示(其中，S为高度敏感；I为中度敏感；R为耐药)，大菱鲆弧菌对卡那霉素、强力霉素、头孢呋辛等5种药物高度敏感，对恩诺沙星和庆大霉素等3种药物中度敏感，对头孢吡肟和氨苄西林等3种药物不敏感，耐药菌比例达27.3％；而杀鲑气单胞菌则仅对头孢吡肟1种药物高度敏感，对强力霉素、头孢呋辛和恩诺沙星等5种药物中度敏感，对氨苄西林和磺胺异恶唑等3种药物不敏感，耐药菌所占比例达30％。

表5杀鲑气单胞菌菌株药敏实验鉴定结果

表6大菱鲆弧菌菌株药敏实验鉴定结果

实施例2疫苗制备及效果检测

2.1疫苗制备

先将菌株复苏扩大培养，使用0福尔马林法对菌株进行灭活。

分别将灭活后的杀鲑气单胞菌HHSM190529和大菱鲆弧菌HHDLP190721菌液按1:1等量混合，振荡均匀，用微量移液器吸取100μL涂布于TSB固体培养基平板上检验灭活效果，同时重复三个平行。若所有平板均未长菌，则混合后的抗原未被污染，可以使用。将已制备好的抗原与MontanideTMISA 763A VG佐剂以3:7比例混合乳化，使用滴管吸取液体滴入水中，如果在水中成白色球状不散开，则为成功乳化，获得二联灭活疫苗。将二联灭活疫苗装入离心管放进4℃冰箱备用，并进行3-5d观察，如不分层则疫苗稳定。

结果：在普通肉汤培养基中加入1％胰蛋白胨，置于28℃摇床过夜24h培养杀鲑气单胞菌无色亚种和大菱鲆弧菌。将两种细菌扩大培养，分别加入5‰甲醛(v/v)，灭活温度为4℃，灭活24h验证无活菌后，按体积比1:1混合后涂布于TSB琼脂平板，重复三个平行，28℃培养48h，未有菌落生长，故二联灭活疫苗制备完成。

2.2疫苗安全性检测

取20只健康无病大菱鲆饲养于蓝色塑料桶中1周，保持供氧并每天换水，投喂饲料，一周后接种100μL已制备成功的二联灭活疫苗，接种后使用加热棒将水温加热至20℃，饲养一周观察是否有死亡情况。

结果：观察3-5d后，疫苗并未分层，证实疫苗稳定；经过一周饲养，观察接种后大菱鲆的情况，大菱鲆并未出现死亡或腹水、下颌充血体表溃烂疥疮等症状，解剖注射二联灭活疫苗组，也未见腹水等症状，因此注射灭活疫苗组与PBS对照组对于大菱鲆无差异，证明二联灭活疫苗对于大菱鲆无危险，质量上已经合格，可以应用于大菱鲆免疫保护试验。

2.3免疫保护率测定

按公式计算相对免疫保护率(RPS)：RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。

结果：免疫后攻毒结果汇总见附图1，与对照组相比，接种疫苗组获得了显著的免疫保护水平。攻毒一周后对照组死亡率不断升高，攻毒后13d其死亡率达到77.27％。疫苗接种组的死亡从攻毒后10d开始，死亡率在攻毒14d达到36.36％。试验结束时相对保护率(RPS)为68.92％。

2.4溶菌酶活性测定

采用空白对照法测定溶菌酶活性，参考溶菌酶活性试剂盒(南京建成生物公司)说明书进行实验操作，所使用血清样品取自-80℃冰箱。操作表如表7所示：

表7溶菌酶检测操作表

充分混匀后37℃准确水浴15min，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3min，使用1cm光径比色皿于530nm处以蒸馏水调透光度(T)为100％，检测各管透光度T₁₅(T₁₅即37℃水浴15min后的透光度)。记录数值并代入计算公式计算，公式如下：

溶菌酶含量＝(样本透光度UT₁₅-对照透光度OT₁₅)/(标准透光度ST₁₅-对照透光度OT₁₅)×标准品浓度×样本测试前稀释倍数

注：标准品浓度：2.5μg/mL即200U/mL

结果：如图2所示，在疫苗免疫当天，疫苗组溶菌酶活性水平与对照组溶菌酶活性水平未出现差异，在疫苗免疫后7-28d，疫苗组活性较对照组活性大幅提高，在7d时观察到溶菌酶最大活性，达到42.44μg/ml。7d-28d期间溶菌酶活性范围整体波动不明显，疫苗组和对照组之间始终存在显著差异。在所有时间段中，对照组的溶菌酶活性范围为20-23.5μg/ml。

2.5酸性磷酸酶活性测定

酸性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。参考溶菌酶活性试剂盒(南京建成生物公司)说明书进行实验操作，所使用血清样品取自-80℃冰箱中。操作表如表8所示：

表8酸性磷酸酶活力测定操作表

每完成一个样品管就立即混匀，室温静置10min，使用1cm光径比色皿于520nm检测，使用对照管调零，测量并记录吸光度。将测得数据代入公式中计算，公式如下：

酸性磷酸酶＝(样本OD值/标准OD值)×标准管含酚的量(0.005mg)×100ml/0.05

结果：免疫后对照组及疫苗组大菱鲆血清酸性磷酸酶活力变化趋势如图3所示。从图3中可以看出，在免疫接种后14d内，对照组ACP活力稍有下降，疫苗组ACP活力在第14d小幅上升，在第21d时，对照组ACP活力仍变化不大，但疫苗组ACP大幅上升，达到6.20(U/100ml)，在第28d时，疫苗组ACP下降但仍比0天时有一定提高。显著性分析可知，仅在第21d时疫苗组ACP活力显著高于对照组，其他时段差异不显著。

2.6补体C3含量测定

在适宜温度下孵育，血清中补体C3与试剂中补体C3抗体可互相结合形成大分子免疫复合物，根据浑浊程度在340nm处进行补体C3含量测定。参考的补体C3检测试剂盒(伊利康生物公司)说明书进行实验操作，所使用血清样品先前保存于-80℃冰箱中，操作表如表9所示：

表9补体C3含量测定操作表

使用校准品进行校准后，测量并记录空白管和样品管吸光度，并按照以下格式进行计算：

C₃(g/L)＝C_S×ΔA_T/ΔA_S(g/L)

ΔA_T：以对照管吸光度作为对照的样品管吸光度值

ΔA_S：以对照管吸光度作对照的校准管吸光度值

C_S：校准液中C₃的浓度

结果：免疫后对照组和疫苗组补体C3变化及差异情况见图4。免疫后0d时，疫苗组及对照组补体C3浓度基本保持一致，在免疫后7d时，疫苗组补体C3浓度大幅上升，比对照组高大约4倍左右，是28d内补体C3浓度最高的时间，在随后的14、21和28d有较小幅度的下降，维持在1.2g/L-1.4g/L左右；而对照组在28d内一直处于0.3g/L-0.42g/L。从显著性分析来看，对照组与疫苗组仅在7-28d内均具有较大的差异显著性。

2.7 qRT-PCR检测不同基因表达

使用NCBI Primer针对不同8对基因的qRT-PCR引物进行设计，引物名称、碱基序列和在GeneBank序列号均见表10，将设计好的引物送至青岛派森诺生物有限公司合成。qRT-PCR反应体系为10μL，具体各组分用量及反应条件见表11、表12。每个样品设置3个平行。实验后，用软件导出相关数据，对反应数据进行处理，计算各免疫基因表达量，以β-actin为内参基因，在五个时间点(0d、7d、14d、21d和28d)疫苗免疫组的免疫相关基因与对照组相比较。

表10荧光定量PCR反应所用引物

表11 qRT-PCR反应体系

表12 qRT-PCR反应条件

结果：本实验对免疫相关基因在肝脏、脾脏和肾脏中的转录表达变化进行了研究。在经过取样、RNA提取、cDNA反转录和qRT-PCR的方法分析后，试验结果如图5-10。在肝脏中，对照组中免疫相关基因变化较小，而疫苗组大菱鲆主要组织相容复合物Ⅱα和IIβ(MHCⅡα、MHCIIβ)在7d显著上升，MHCⅡα在7-21d均保持较高表达量，28d时稍有下降，而MHCIIβ在21d时开始下降，28d时有所回升；免疫组CD4和CD8基因表达均呈先上升后下降的状态，其中CD4在0-21d时逐渐升高，21d相对表达量达到峰值，随后下降，CD8则于14d达到峰值，随着时间变长表达量也逐渐下降；肿瘤坏死因子α(TNF-α)在14d时表达量迅速升高，并于14d达最大值，随后在21d下降，但表达量整体高于0d；白细胞介素1β(IL-1β)与CD4表达趋势类似，在21d时达到最大值；Toll样受体3(TLR3)则与MHCIIβ趋势相似，在7d大幅上升，21d小部分下降后再次上升。在脾脏中，对照组相关免疫基因表达变化较小，而免疫组中各种免疫相关基因在脾脏中均整体呈现上调的趋势，MHCⅡα和MHCIIβ均在14d达到最大值，14d到28d表达量有所降低；CD4与CD8同样于14d达到峰值，但CD4随着免疫后时间推移逐渐上调，CD8则为14d左右明显上调，CD4和CD8在14d达到最大值后均下降；TNF-α相对表达量在14d大幅上升，随后均保持较高表达量波动，28d时表达量达到最大值；IL-1β同样与CD4表达趋势相似，从免疫开始随时间变长表达量也逐渐上升，于14d达到峰值后下降；TLR3则与其他5种免疫基因不同，TLR3在0-14d左右表达量波动较小，在21d时表达量迅速升高达到峰值，后迅速下降。在肾脏中，对照组中相关免疫基因表达量没有较大波动，而在免疫组中MHCⅡα、MHCIIβ整体呈上调趋势，但MHCⅡα在14d表达量才有大程度提升，随后有小幅度下降，MHCIIβ在7d时已达到峰值，随着免疫时间加长表达量逐渐下降；CD4、CD8、TNF-α、IL-1β和TLR3趋势相同，在0-7d表达量较低，与对照组表达量近乎相似，在14d时，表达量明显上升并达到峰值，21-28d持续下降，但都比第一周表达量高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联疫苗及应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

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<212> DNA

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<212> DNA

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catcaaccaa tcagctgcac tc 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccggcttcac agcacagtag t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aatgagctga gagttgcccc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcttggatg gcaacgtaca 20

Claims (8)

1.一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗的抗原为灭活的杀鲑气单胞菌和灭活的大菱鲆弧菌；所述杀鲑气单胞菌的保藏编号为CCTCC M 2021397；所述大菱鲆弧菌的保藏编号为CCTCC M 2021399；所述杀鲑气单胞菌为杀鲑气单胞菌无色亚种。

2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的灭活方式为甲醛灭活。

3.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述抗原为杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌灭活后以体积比1:1进行混合得到。

4.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联疫苗还包括佐剂。

5.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的接种方式为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫或口服免疫。

6.一种权利要求1-5任一项所述的二联灭活疫苗在制备预防由杀鲑气单胞菌和/或大菱鲆弧菌引起的鱼类疾病的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述鱼类为海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类或洄游鱼类。

8.一种杀鲑气单胞菌和大菱鲆弧菌的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法为：

(1)灭活的杀鲑气单胞菌与灭活的大菱鲆弧菌以体积比为1:1进行混合，得到抗原；所述杀鲑气单胞菌的保藏编号为CCTCC M 2021397；所述大菱鲆弧菌的保藏编号为CCTCC M2021399；

(2)将步骤(1)获得的所述抗原与佐剂以体积比为3:7的比例混合。

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