CN112426522B - 一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗 - Google Patents

一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗，所述疫苗包括以下灭活抗原组合物：温和气单胞菌灭活液、恶臭假单胞菌灭活液和类志贺邻单胞菌灭活液，所述温和气单胞菌灭活液、恶臭假单胞菌灭活液和类志贺邻单胞菌灭活液的比例为1:1:1，所述温和气单胞菌灭活液浓度为2~5×108 CFU/mL，所述恶臭假单胞菌灭活液浓度为2~5×108 CFU/mL，所述类志贺邻单胞菌灭活液浓度为2~5×108 CFU/mL。本发明混合细菌灭活疫苗的抗原成分可对黄颡鱼产生较全面的体液免疫诱导；使用混合细菌灭活疫苗可减少免疫次数、节约免疫成本、降低多次接种对黄颡鱼造成的损伤，在实际生产上的应用价值较高。

Description

一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗。
背景技术
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属于鲶形目、鲿科、黄颡鱼属，广泛分布于我国江河天然水体中，其肉质鲜美、肌间刺少、抗病力强，现已成为广受消费者喜爱的名特优淡水经济鱼类。近年来，随着养殖规模的不断扩大和养殖密度的不断提高，黄颡鱼细菌性疾病常呈暴发流行，给养殖户造成巨大的经济损失，严重影响黄颡鱼产业的健康发展。目前，黄颡鱼细菌性疾病的主要防治方法是使用消毒剂和抗生素，但这2种方法存在药物残留和细菌耐药性等隐患；作为无鳞鱼的黄颡鱼对消毒剂等药物的耐受力比有鳞鱼低，因此，研发针对黄颡鱼的有效、低刺激性、无残留渔药迫在眉睫。
灭活疫苗是一种在水产病害防治上比较安全有效的方法，其原理是经过物理或化学方法将微生物灭活的同时保持该微生物的免疫原性，接种后可使动物机体产生对该微生物的特异性免疫力。已报道的黄颡鱼灭活疫苗目前仅有鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)灭活疫苗。据本实验室的前期调查发现，广西黄颡鱼常发生由多种致病菌混合感染引起的病例，但是有关黄颡鱼混合细菌灭活疫苗的研究至今未见报道。本发明将从广西南宁市区周边养殖患病黄颡鱼体内分离到的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)制成福尔马林混合灭活疫苗，将其免疫健康黄颡鱼并检测该疫苗的免疫保护率，旨在更有效地解决在实际中常遇到的黄颡鱼细菌混合感染问题，为混合灭活疫苗在黄颡鱼等养殖鱼类细菌性疾病防治上的应用提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗。为达到本发明目的所使用的技术方案为：
一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗，所述疫苗包括以下灭活抗原组合物：温和气单胞菌灭活液、恶臭假单胞菌灭活液和类志贺邻单胞菌灭活液。
优选地，所述温和气单胞菌灭活液、恶臭假单胞菌灭活液和类志贺邻单胞菌灭活液的比例为1:1:1，所述温和气单胞菌灭活液浓度为2～5×108CFU/mL，所述恶臭假单胞菌灭活液浓度为2～5×108CFU/mL，所述类志贺邻单胞菌灭活液浓度为2～5×108CFU/mL。
本发明还提供一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)将温和气单胞菌NN156、恶臭假单胞菌NN157和类志贺邻单胞菌NN159分别接种在普通琼脂培养基上，28℃恒温培养16h～24h后；
(2)分别挑取3种细菌的单菌落置于营养肉汤培养基中，在28℃条件下200rpm培养过8-12h；
(3)当细菌浓度达到0.8～1.5×109CFU/mL时，于菌液中加入福尔马林至终浓度为0.5％，25℃灭活24h后，期间每隔6h充分搅动1次菌液；
(4)将已灭活的菌液在4℃、5000rpm条件下离心10～15min收集菌体沉淀，再用0.65％无菌生理盐水洗涤并重悬3次，使用细菌浊度仪将灭活疫苗浓度调至为2～5×108CFU/mL；
(5)将3种细菌的灭活疫苗按1:1:1的比例混匀后分装并置于4℃冰箱保存备用。
优选地，所述的菌液中加入福尔马林至终浓度为0.5％，所述的浓度为体积比浓度。
本发明另外提供一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗作为预防及治疗黄颡鱼病疫苗的应用。
优选地，所述混合细菌灭活疫苗采用肌肉注射的方式进行免疫或采用口服或浸泡的方式进行免疫。
优选地，所述混合细菌灭活疫苗通过黄颡鱼腹腔注射的方式免疫黄颡鱼。
已有研究表明，注射细菌灭活疫苗可对鲶形目鱼类具有一定的免疫保护作用。如鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)灭活疫苗对黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)和斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)的免疫保护率分别为70.2％和64.0％；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)灭活疫苗对斑点叉尾鮰的免疫保护率为75％等。但以往的研究并未注意到在实际生产中养殖鱼类可能存在由多种致病菌引起的混合感染现象，因此，本发明混合细菌灭活疫苗的抗原成分包含引起黄颡鱼发病的温和气单胞菌、恶臭假单胞菌和类志贺邻单胞菌，可对黄颡鱼产生较全面的体液免疫诱导；从发病黄颡鱼中分离细菌并制作疫苗，解决不同地区不同血清型细菌的抗原交叉保护能力弱的问题。本发明所用的3种细菌均为我国水产养殖的常见致病菌，其中，温和气单胞菌和类志贺邻单胞菌可引起黄颡鱼的体表溃疡和肠炎等病症，恶臭假单胞菌可造成长薄鳅(Leptobotia elongate)等鱼类体表溃烂、出血等症状。本发明以这3种细菌的混合细菌灭活疫苗对健康黄颡鱼接种免疫7d～28d后，免疫保护率达64.2％～92.4％，免疫保护效果显著，证明接种混合细菌灭活疫苗使黄颡鱼对这3种细菌的共同感染形成了较强的防御作用，能有效保护养殖鱼类，提高养殖存活率；此外，使用混合细菌灭活疫苗还具有可减少免疫次数、节约免疫成本、降低多次接种对黄颡鱼造成的损伤等优点。本发明表明，3种细菌混合灭活疫苗在黄颡鱼疫苗的研究和实践上具有较好的发展前景。
本发明中，3种细菌混合灭活疫苗在免疫7d后对黄颡鱼保护率就达到64.2％、在免疫14d和28d后其保护率升至92.4％和89.0％，这可能与混合细菌灭活疫苗同时诱导了黄颡鱼的特异性和非特异性免疫从而增强黄颡鱼抵抗混合细菌侵袭的能力有关。根据本发明结果，建议养殖户使用混合细菌灭活疫苗对黄颡鱼进行疾病防治时，可在疾病流行季节前7d～28d左右接种疫苗，达到有效预防和控制疾病的目的。
佐剂是一种可以非特异性地增强抗原的免疫原性或可以提高机体免疫力的物质。常见的渔用佐剂包括铝盐类、白油类、维生素、壳聚糖、中药多糖等，尽管这些成分均具有一定的佐剂性，但铝盐类和白油类佐剂容易引起鱼类的不良反应；维生素、壳聚糖、中药多糖等佐剂价格较高、使疫苗成本增加。本发明制作的混合细菌灭活疫苗未添加任何佐剂，但在免疫14d和28d后其保护率均超过85％，说明无佐剂混合灭活疫苗对黄颡鱼可产生较好的免疫保护效果。
综上，本发明混合细菌灭活疫苗的抗原成分可对黄颡鱼产生较全面的体液免疫诱导；使用混合细菌灭活疫苗可减少免疫次数、节约免疫成本、降低多次接种对黄颡鱼造成的损伤，在实际生产上的应用价值较高。
附图说明
图1为具体实施方式人工感染试验的黄颡鱼累计死亡率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1材料与方法
1.1实验材料
健康黄颡鱼购于广西南宁市某养殖场，体重约(14.1±1.2)g，放养前经过2.5％的盐水消毒处理，挑选出行动活泼、外表无受伤、规格一致的个体置于广西大学水产教学科研基地实验池里，经30d的检疫饲养观察及随机抽样检测，确定黄颡鱼无异常后用于人工感染试验。整个试验期间水温在(28±2)℃。
混合疫苗制备和人工感染试验使用菌株为温和气单胞菌NN156、恶臭假单胞菌NN157和类志贺邻单胞菌NN159，均分离自广西南宁市区周边养殖患病黄颡鱼，经鉴定后置于-80℃冰箱中保存。试验前再次对该3株菌株进行了API生化鉴定和16S rRNA分子生物学鉴定以验证。普通琼脂培养基和营养肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，福尔马林购自成都科隆化学品有限公司。
1.2疫苗制备
将冷藏于冰箱中的温和气单胞菌NN156、恶臭假单胞菌NN157和类志贺邻单胞菌NN159用接种针挑出后分别接种在普通琼脂培养基上，28℃恒温培养16h～24h后，分别挑取3种细菌的单菌落置于营养肉汤培养基中，在28℃条件下200rpm培养过夜。当细菌浓度达到约1.0×109CFU/mL时，于菌液中加入福尔马林至终浓度为0.5％(V/V)，25℃灭活24h，期间每隔6h充分搅动1次菌液。然后，将已灭活的菌液在4℃、5000rpm条件下离心10min收集菌体沉淀，用0.65％无菌生理盐水洗涤并重悬3次，使用细菌浊度仪将灭活疫苗浓度调至4×108CFU/mL左右。最后，将3种细菌的灭活疫苗按1:1:1的比例混匀后分装并置于4℃冰箱保存备用。
1.3安全性试验
将混合灭活疫苗涂布在营养琼脂培养基上，28℃培养48h，观察是否有菌落生长。将60尾健康黄颡鱼分为试验组、对照组和空白组3组，每组20尾。试验组注射混合灭活疫苗0.2mL/尾，对照组注射等量的0.65％无菌生理盐水，空白组则不作任何处理。注射后连续观察14d，期间进行常规饲养，每天观察黄颡鱼的摄食和活动等情况。
1.4保护率试验
1.4.1免疫注射试验
试验设计见表1。将270尾健康黄颡鱼随机分成试验组A、对照组A和空白组A，试验组B、对照组B和空白组B，试验组C、对照组C和空白组C，每组均为30尾。A组、B组、C组的免疫天数(免疫注射至人工感染试验的天数)分别为7d、14d和28d。取黄颡鱼进行腹腔注射，各试验组和对照组分别注射混合灭活疫苗和0.65％无菌生理盐水(0.2mL/尾)，空白组不作处理。免疫注射后对各组受试鱼进行常规饲养。
1.4.2人工感染试验
将试验菌株温和气单胞菌NN156、恶臭假单胞菌NN157和类志贺邻单胞菌NN159分别接种在普通琼脂培养基上，经28℃培养16h～24h后在无菌条件下用0.65％无菌生理盐水洗下细菌培养物制成菌悬液，并采用细菌浊度仪将3种细菌浓度均调至约5×108CFU/mL左右，并将3种细菌悬液按1:1:1的比例混合均匀以制成人工感染用的混合细菌悬液。分别对经免疫注射7d、14d、28d后的试验组和对照组黄颡鱼进行混合细菌悬液的人工感染试验(腹腔注射0.2mL/尾)，空白组不做处理。人工感染注射后对各组黄颡鱼进行连续14d的常规饲养观察，记录每天受试鱼的发病和死亡等情况。疫苗保护率按以下公式计算。
疫苗保护率＝(对照组死亡率－免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。
表1混合灭活疫苗的保护率试验设计
1.4数据处理
以SPSS 18.0中的Duncan's新复极差法对试验组和对照组死亡率的差异进行统计分析。
2结果与分析
2.1疫苗的安全性
涂布在营养琼脂培养基上的混合灭活疫苗，经28℃培养48h后未观察到有细菌生长。将混合灭活疫苗和无菌生理盐水分别注射至黄颡鱼体内后，在14d的观察期内各组黄颡鱼的摄食、活动均正常，均无肉眼可见病症和死亡现象(表2)。表明本发明制备的混合灭活疫苗已达到完全灭活要求，且对黄颡鱼安全。
表2混合灭活疫苗的安全性试验结果
2.2疫苗的保护率
如图1所示，除空白组外，在人工感染后的第1d～3d为各试验组和对照组黄颡鱼的死亡高峰期。至第5d后，所有试验组和对照组均未再发生黄颡鱼有死亡现象。至第14d，各对照组累计死亡率均显著高于对应的试验组(P<0.05)(图1，表3)。各空白组黄颡鱼在人工感染14d内的累计死亡率均为0％(图1)。解剖濒死个体发现眼部、下颌、胸鳍基部、肛门发红以及有腹水等症状。该病症由人工感染试验引起，与广西南宁市区周边养殖自然患病黄颡鱼的感染症状基本吻合。
根据表3，在免疫天数为7d的A组中，未接种混合灭活疫苗的对照组的死亡率(46.7％)显著高于经过免疫的试验组(16.7％)(P<0.05)，保护率为64.2％。在免疫天数为14d的B组中，对照组B的死亡率(43.3％)显著高于试验组B的死亡率(3.3％)(P<0.05)，保护率为92.4％。在免疫天数为28d的C组中，对照组C的死亡率(30.0％)也显著大于试验组C的死亡率(3.3％)(P<0.05)，保护率为89.0％。
表3混合灭活疫苗对黄颡鱼的免疫保护率试验结果
注：不同的小写字母表示显著差异(P<0.05)
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种黄颡鱼混合细菌灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗包括以下灭活抗原组合物：温和气单胞菌灭活液、恶臭假单胞菌灭活液和类志贺邻单胞菌灭活液，所述温和气单胞菌灭活液、恶臭假单胞菌灭活液和类志贺邻单胞菌灭活液的比例为1:1:1，所述温和气单胞菌灭活液浓度为5×108 CFU/mL，所述恶臭假单胞菌灭活液浓度为5×108 CFU/mL，所述类志贺邻单胞菌灭活液浓度为5×108 CFU/mL。
2.根据权利要求1所述黄颡鱼混合细菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
（1）将温和气单胞菌NN156、恶臭假单胞菌NN157和类志贺邻单胞菌NN159分别接种在普通琼脂培养基上，28 ℃恒温培养16 h~24 h后；
（2）分别挑取3种细菌的单菌落置于营养肉汤培养基中，在28 ℃条件下200 rpm培养过8-12 h；
（3）当细菌浓度达到0.8~1.5×109 CFU/mL时，于菌液中加入福尔马林至终浓度为0.5%，所述的浓度为体积比浓度，25 ℃灭活24 h后，期间每隔6 h充分搅动1次菌液；
（4）将已灭活的菌液在4℃、5000 rpm条件下离心10~15 min收集菌体沉淀，再用0.65%无菌生理盐水洗涤并重悬3次，使用细菌浊度仪将灭活疫苗浓度调至为5×108 CFU/mL；
（5）将3种细菌的灭活疫苗按1:1:1的比例混匀后分装并置于4 ℃冰箱保存备用。
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