CN103361293A

CN103361293A - 一种大菱鲆致病菌株及其应用

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Publication number: CN103361293A
Application number: CN2013103355576A
Authority: CN
Inventors: 郑风荣; 王波; 林学政; 刘洪展; 殷树淼
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-08-04
Filing date: 2013-08-04
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-08-04
Also published as: CN103361293B

Abstract

本发明的目的是提供一种从患有大菱鲆烂边病的组织中分离得到致病菌株，为鳗弧菌（Vibrio anguillarum），并于2013年6月17日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.7733。筛选到的鳗弧菌用于制备灭活疫苗。本发明制备的大菱鲆烂边病灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达68.5%，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制大菱鲆烂边病的发生和流行，为大规模制备大菱鲆烂边病灭活疫苗提供了技术支持。

Description

一种大菱鲆致病菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物疫苗制备领域，具体涉及一种大菱鲆致病菌株及用该菌株制备的用于预防烂边病的灭活疫苗。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmas maximus) 是欧洲名贵海水鱼种，是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一，自1992年被引种到我国进行人工繁殖, 现已达到一定的规模，逐渐成为我国北方优秀的水产养殖品种和工厂化养殖的主要对象, 年创产值超过15亿元。然而伴随着养殖范围的扩大和养殖密度的增加,以及品种的退化,大菱鲆的病害问题也日渐突出，各种细菌性疾病、寄生虫病、病毒性疾病时有发生，且有愈演愈烈之势。其中细菌性疾病是大菱鲆养殖中危害最为严重的一种疾病。2009年以来山东威海养殖区大菱鲆爆发流行性疾病，症状首先表现为侧鳍、尾鳍颜色变浅，出现出血点，鳍条及鳍基部充血发红，各内脏器官有不同程度的发红和病变，患病大菱鲆未见溃烂便死亡，该病多发生于苗期和养成初期，传染性极强、流行范围广，死亡率极高，一旦发病，完全治愈非常困难，病鱼从鳍出现出血点至死亡仅需3～4天，属急性死亡，给养殖业主造成很大的经济损失。

目前大菱鲆细菌性疾病的治疗目前主要依赖于抗生素，虽然有一定效果，但是并不能从根本上控制该病，而且鱼体极易产生耐药性，造成环境中的药物残留，破坏生态平衡，威胁人体的健康和安全。此外鱼群在患病期间容易产生厌食的症状，所以投喂药饵的方法也不甚理想。因此寻找治疗该病的安全有效的途径是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种大菱鲆致病菌株及用该菌株制备的用于预防烂边病的灭活疫苗,用以解决以往使用抗生素治疗大菱鲆烂边病时所产生的药物残留和耐药性问题，以弥补现有技术的不足。

本发明提供一种从患有大菱鲆烂边病的组织中分离得到致病菌株WH-1-4，为鳗弧菌（Vibrio anguillarum），并于2013年6月17日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.7733。

本发明筛选到的鳗弧菌用于制备灭活疫苗。

所述的灭活疫苗，还包括有灭活的副溶血弧菌。

灭活疫苗中灭活菌体的浓度分别为10⁷-10¹⁰CFU/ml。

上述灭活疫苗的制备方法如下：

首先，将鳗弧菌接种于含有3%NaCl的LB液体培养基中，再将副溶血弧菌株接种于含有3%NaCl的LB液体培养基中，28?C震荡培养12-16小时，待菌液浓度达10⁹CFU/ml或分光光度计检测OD600达到0.6以上时终止培养，获得菌株的扩大培养液；

然后，对鳗弧菌和副溶血弧菌的扩大培养液进行灭菌处理，按体积比0.5%将鳗弧菌和/或副溶血弧菌的扩大培养液加入甲醛溶液，室温灭活24-48小时，期间震荡5-10次，每次10-15分钟，得到菌株的灭活菌液；

最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4?C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用灭菌磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，收集菌体，灭菌PBS重悬菌液，再将鳗弧菌和副溶血弧菌液混合，将混合菌液涂布于高盐营养琼脂平板，24-48小时候未见菌落长出，即制得灭活疫苗，存放于4?C备用。

本发明制备的大菱鲆烂边病灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达68.5%，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制大菱鲆烂边病的发生和流行，为大规模制备大菱鲆烂边病灭活疫苗提供了技术支持。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述。

一、筛选的鳗弧菌及其性状描述

1、鳗弧菌的筛选

发病大菱鲆取自山东省威海一养殖场，取侧鳍、尾鳍有出血点的大菱鲆样品，用无菌生理盐水冲洗2遍，用无菌剪刀打开腹腔，无菌操作取病鱼出血部位、肝、肾、肠等组织小块于无菌离心管中，无菌生理盐水冲洗组织块，用无菌剪刀将组织剪碎并取少量接种于3%NaCl的高盐营养琼脂培养基，28℃恒温培养24 h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行分离纯化，将纯化4次后的菌株进行常规生理生化和6S rDNA基因序列测定，确定优势菌株为鳗弧菌（Vibrio anguillarum）。

2、鳗弧菌的培养条件

将该菌涂布于高盐营养琼脂培养基（蛋白胨 10g/L，肉浸粉 10g/L, NaCL 30g/L ，琼脂 20g/L， PH为7.4）平板上， 28℃ 培养16-18小时即可长出单菌落。

3、形态特征

菌株在高盐营养琼脂培养基（3% NaCL）平板上28℃培养24 h后，菌落圆形，边缘整齐，菌落很小，呈透明淡蓝色；革兰氏染色阴性，短杆状。

4、生理生化特征

菌株的生理生化特性如下：无盐胨水阴性，3% NaCL胨水阳性，6%、8% NaCL胨水阴性，1% NaCL精水阳性，1% NaCL精对阳性，1% NaCL氨对阳性，1% NaCL赖氨酸阳性，1% NaCL肌醇阴性，1% NaCL阿拉伯糖阳性，1% NaCL甘露糖阳性，1%蔗糖阳性，1% NaCL蛋白胨水（靛基质）阳性，1% NaCL葡磷胨水（VP）阳性，1% NaCL果糖阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性。

5、筛选的菌株的致病性检测

从养殖场挑取日龄30-60、平均体长(2.0±1.1)cm的健康大菱鲆，饲养于10L海水的整理箱中，每组20尾，实验期间连续充气，水温14℃ ，每天换水，不投饵。将分离纯化的鳗弧菌于含有3%NaCl的高盐LB培养基，28℃ 培养24-48 h后，离心，用无菌海水重悬得菌悬液，设定细菌浓度梯度，进行浸浴感染，水体中菌液终浓度分别为1×10⁹ CFU/ml、1×10⁸ CFU/ml，每天换水补充菌液。对照组不做处理，定时观察记录各组发病和死亡情况，并取发病大菱鲆病变组织进行细菌再分离。结果表明，菌株浓度为5×10⁸ CFU/ml浸浴感染大菱鲆后第3天实验组大菱鲆开始出现死亡，第11天是死亡率为100%，菌株浓度为5×10⁷ CFU/ml浸浴感染大菱鲆后第4天实验组大菱鲆开始出现死亡，第10天时得死亡率为85%。而对照组大菱鲆无一例死亡。人工感染后发病的大菱鲆主要表现为鳍部出血，鳍条、鳍基部及脊柱部肌肉充血发红，活力大大减弱，与自然发病症状相同。取人工感染后发病濒死大菱鲆病变组织涂布于高盐营养琼脂培养基平板上，均可分别分离到大量菌落形态高度一致的细菌，其菌落形态、大小以及生理生化特征均分别鳗弧菌相同。

将筛选的鳗弧菌WH-1-4菌株于2013年6月17日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.7733。

二、制备灭活疫苗

实施例1：鳗弧菌的灭活疫苗

1、鳗弧菌灭活疫苗的制备

首先将本发明筛选到的鳗弧菌接种于500ml高盐普通LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L, 酵母浸出汁 5g/L, 氯化钠 30g/L）中，在28?C震荡培养12小时，血球计数板检测菌液浓度达10⁹CFU/ml，或OD600值达到0.6以上时终止培养，获得鳗弧菌的扩大培养液；

后按体积比0.5%加入25ml甲醛溶液，对菌株的扩大培养液于室温灭活24-48小时，期间震荡5次；得到菌株鳗弧菌的灭活菌液；

最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4?C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用无菌PBS洗涤2次，收集菌体，用无菌PBS重悬菌液，使菌液中的灭活菌体的浓度为10⁷-10¹⁰CFU/ml，取制备的灭活疫苗80μl涂布于高盐营养琼脂（43.3g营养琼脂/L，氯化钠 30g/L）平板上，36小时后，未有菌斑长出，即制得灭活疫苗。

2、鳗弧菌灭活疫苗的效果检测

随机选取30-60日龄的健康大菱鲆，转移到实施例1中制备的灭活疫苗中，10-20分钟后，取出大菱鲆，正常饲喂饵料，并以未经疫苗浸泡处理的健康大菱鲆为对照。28天后将灭活疫苗浸泡及未经过浸泡处理的大菱鲆，以1×10⁸CFU/ml浓度的鳗弧菌活菌进行攻毒试验，每天换水补充菌液，定时观察记录各组大菱鲆发病和死亡情况，结果表明对照组大菱鲆在感染后第4天出现死亡，第10天时全部死亡，免疫保护率为0％，而灭活疫苗浸泡组在感染后第8天才开始出现死亡，免疫攻毒后第10天的免疫保护力为58.5％。结果表明本发明制备的灭活疫苗能有效的对大菱鲆进行抗菌性免疫。

实施例2：鳗弧菌和/或副溶血弧菌混合菌株的灭活疫苗

1、灭活疫苗的制备

再将副溶血弧菌（其中副溶血弧菌来自中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）菌株保藏编号1H00057。）接种于含有500ml高盐普通LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L, 酵母浸出汁 5g/L, 氯化钠 30 g/L）中，在28?C震荡培养16小时，血球计数板检测菌液浓度达10⁹CFU/ml，或OD600值达到0.6以上时终止培养，然后按体积比0.5%加入25ml甲醛溶液，对副溶血弧菌的扩大培养液于室温灭活48小时，期间震荡5次，得到菌株的灭活菌液；

最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4?C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用无菌PBS洗涤3次，收集菌体，用无菌PBS重悬菌液，得到不同菌株的灭活菌液；再将灭活的两种菌的灭活菌液按约1：1的比例混合即制得灭活疫苗，其中灭活菌体的浓度分别为10⁸-10¹⁰CFU/ml。

本发明实施例制备的鳗弧菌和副溶血弧菌的灭活疫苗二联灭活疫苗菌体浓度为10⁹cfu/mL。

对该灭活疫苗进行无菌检测：取上述二联灭活疫苗80μl 涂布于含有3%的NaCl的高盐度的普通LB 固体培养基，涂布均匀后，28?C培养48小时后未见菌落长出，合格者即为鳗弧菌和副溶血弧菌的二联灭活疫苗；

对该灭活疫苗的安全性进行检测：取灭活疫苗以0.2 ml/尾腹腔注射大菱鲆，对照组注射同等剂量的无菌PBS。然后正常饲养观察l4天，观察注射疫苗的大菱鲆全部存活，且进食及活动正常，内脏剖检未见任何异常，可认为制备的灭活疫苗安全可靠。

对灭活疫苗进行无菌检测和安全性检测后，合格者即鳗弧菌和副溶血弧菌的二联灭活疫苗，4?C条件下保存备用。

三、灭活疫苗的效果检测

1：二联灭活疫苗的免疫保护试验

采用浸泡免疫的方法对制备的灭活疫苗的免疫效果进行检测：选取30-60日龄的健康大菱鲆600尾，随机分为3组，使用具体实施例2中制备的灭活疫苗进行浸泡免疫试验，方法如下：试验分为3组，第1组为对照组，第2组为加强免疫组，第3组为不加强免疫组，将第2组和第3组大菱鲆浸泡于经1O倍稀释的灭活菌液(2×10⁸CFU／m1)中浸泡15min。第2组大菱鲆10天后再按同样的方法加强免疫一次，其他饲养条件均与未免疫大菱鲆一致。在免疫后第30天，对3组大菱鲆进行攻毒试验，第1组大菱鲆全部死亡，第2组的免疫保护率达78%，第3组的免疫保护率为66%。

2 疫苗的免疫保护试验

采用腹腔注射的方法对制备的灭活疫苗的免疫效果进行检测：随机抽取30-60日龄的健康大菱鲆300尾，随机分3个试验组，处理1为对照组，腹腔注射灭菌PBS 100μl，处理2 为加强免疫组，腹腔注射100μl实施例2制备的灭活疫苗，10d后再注射100100μl实施例2制备的灭活疫苗，处理3 为不加强免疫组，腹腔注射100μl实施例2制备的灭活疫苗。免疫30天后，对3组大菱鲆进行攻毒试验，第1组大菱鲆全部死亡，第2组的免疫保护率达82%，第3组的免疫保护率为70%。

上述的实验结果表明，本发明制备的二联灭活疫苗具有高效的免疫效果，能够有效的提高大菱鲆的抗病力，具有良好的市场推广前景。

Claims

1.一种大菱鲆致病菌株，为鳗弧菌（Vibrio anguillarum），其保藏编号为 CGMCC NO.7733。

2.权利要求1所述的鳗弧菌用于制备灭活疫苗。

3.一种灭活疫苗，所述的灭活疫苗是由权利要求1所述的鳗弧菌制备的。

4.如权利要求2所述的灭活疫苗，其特征在于，除灭活的鳗弧菌外，还包括有灭活的副溶血弧菌。

5.如权利要求4所述的灭活疫苗，其特征在于灭活疫苗中灭活的鳗弧菌和灭活的副溶血弧菌的浓度分别为10⁷-10¹⁰CFU/ml。

6.权利要求4或5所述的疫苗用于预防大菱鲆烂边病。

7.权利要求4所述的灭活疫苗的制备方法，其步骤如下：

最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4?C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用灭菌磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，收集菌体，灭菌PBS重悬菌液，再鳗弧菌和副溶血弧菌液混合，将混合菌液涂布于高盐营养琼脂平板，24-48小时候未见菌落长出，即制得灭活疫苗，存放于4?C备用。