CN103966121B - 一株铜绿假单胞菌及其在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株铜绿假单胞菌及其在制备抗菌药物中的应用。铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号，其保藏编号为CCTCC No.M2013697。本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号具有拮抗作用，因此可以将本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号用于制备防控水产弧菌制剂中，该防控水产弧菌制剂可作为替代化学药品的有益微生物制剂，用于改善水质，清除水产品养殖系统中的水产弧菌，从而预防水产弧菌，如副溶血弧菌或溶藻弧菌对水产养殖对象的危害，促进水产养殖业的发展；避免水产品携带弧菌，保障人类健康安全。
Description
技术领域：
本发明属于水产养殖领域，具体涉及一株抗活性成分稳定性高，能作为多种菌的拮抗菌的铜绿假单胞菌及其在制备抗菌药物中的应用。
背景技术：
溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus,V.alginolyticus）隶属弧菌科（Vibrionaceae）,弧菌属（Vibrio），该菌存在于海水、河口、海洋动物体中。溶藻弧菌对鱼、虾、贝等养殖动物都有较强的致病性，可引起养殖动物急性出血性败血症。这种疾病，也称爆发性流行病、弧菌病、体表溃疡等，能感染多种海水养殖品种，如大黄鱼、鲈鱼、牙鲆、点带石斑鱼、黑鲷、平鲷、军曹鱼、中国明对虾、日本对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾、文蛤、乌贼等，是我国流行较广的一种水生动物条件致病菌。该菌为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连成“C”或“S”形，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧海生弧菌，适宜温度为17～35℃，生长最适pH值范围为6.0～9.0，近年来在我国海南、广东、福建等省养殖鱼类虾类爆发性传染病，多流行与夏季，很多报道系为该菌所致败血症，而且海水养殖病害防治比淡水困难。此外溶藻弧菌对人的致病性也有大量报道，可引起人食物中毒、耳炎等。溶藻弧菌是海水养殖品种暴发性传染病的主要病原菌之一。
该细菌的防治方法主要有：抗生素防治、中草药防治、疫苗防控、益生菌生防。
（1）抗生素防治。抗生素是用来治疗细菌性传染病的首选药物，抗生素对病原菌具有显著的抑制或杀灭作用，研究证实磺胺+TMP、环丙沙星、呋喃妥因等药物对溶藻弧菌具有较强的抑菌效果。但是随着抗生素的广泛使用，近年来不同地区由于用药种类和用法不同，产生了大量的耐药菌株、水产品药物残留等威胁养殖业和人类健康，同时水产品耐药又会加大剂量就陷入恶性循环。（2）中草药防治。中草药无抗药性，无残留，无环境污染，不会引发药源性疾病且抑菌效果明显，已经越来越引起人们的关注。研究普遍表明单方使用石榴皮、地榆、五味子、大黄、乌梅、公丁香、连翘、板蓝根等中草药具有很强的抑菌能力，在实际生产中，将具有抑菌作用的中草药组合成复方，适当利用不同中草药相互协同作用来防治溶藻弧菌引起的疾病，可以更好的发挥中草药的抑菌作用。但是，配方不合理、滥用偏方、加工工艺落后、理论研究较少等问题，使很多养殖者盲目用药。（3）疫苗防控。水产养殖上使用的疫苗主要分为两类：一类是减毒疫苗，另一类是灭活疫苗。减毒疫苗含有减毒的活病原，能诱导特异性抗体，并与自然感染相似；灭活的疫苗是由死的病原或者病原的一些成分如细菌脂多糖或灭活的毒素组成的，能刺激动物免疫系统。其免疫方式有浸泡、口服、注射和喷雾等，注射方式效果最佳但费时费力且损伤虾体，浸泡疫苗需要量大；疫苗的研制处于起步阶段，减毒疫苗还缺乏安全性保障，制备麻烦，成本高等；还缺乏简易、高效、经济的接种途径。（4）益生菌防控。随着耐药性问题的出现和环境的恶化使抗生素的使用受到越来越多的考验，而益生菌凭借无毒高效的优点，通过改善水质，在宿主体内分泌营养物质竞争或者有附着位点，增强宿主免疫力，提高抗病性，降低疾病的发病率，进而提高水产养殖产量和经济效益，正受到越来越多的关注。目前，在水产病害控制上使用较多的益生菌为乳酸菌、弧菌属、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、假单胞菌属等单一或多种有益菌组成的复合活性微生物制剂，应用于鱼、虾、蟹、贝、软体动物的养殖和饵料的培养中。
发明内容：
本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号，该菌株可以以拮抗菌的作用有效消除水产养殖系统中的水产弧菌，解决了现有技术中水产品携带水产弧菌的防疫问题。
本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNo.M2013697。
本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号对多种菌具有拮抗作用，因此可以将本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号用于制备抗菌药物中，如防控枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、紫色色杆菌制剂，特别是防控水产弧菌制剂中，如防控水产溶藻弧菌或副溶血弧菌制剂。适用于鱼、虾等水产动物，可用于防治水产弧菌引起的疾病。
本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号具有拮抗作用，因此可以将本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号用于制备防控水产弧菌制剂中，该防控水产弧菌制剂可作为替代化学药品的有益微生物制剂，用于改善水质，清除水产品养殖系统中的水产弧菌，从而预防水产弧菌，如副溶血弧菌或溶藻弧菌对水产养殖对象的危害，促进水产养殖业的发展；避免水产品携带弧菌，保障人类健康安全。
本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNo.M2013697。
附图说明：
图1是拮抗菌的筛选；
图2是卤虫保护实验图，其中实验组ZJO表示只添加溶藻弧菌、实验组31#表示只加溶藻弧菌拮抗菌发酵剂，实验组ZJO+31#表示加溶藻弧菌和溶藻弧菌拮抗菌发酵剂。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号的筛选和鉴定
（1）溶藻弧菌拮抗菌寻找、筛选
（A）原料
溶藻弧菌
待筛的拮抗菌株：从西沙海域、龙虾肠道、海参肠道等分离得到311株菌。
所用培养基试剂：LB培养基，从试剂公司采购。
LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
（B）溶藻弧菌液的制备：通过无菌操作，接种环将溶藻弧菌接种到LB培养基中，30℃200rpm过夜培养。
（C）溶藻弧菌拮抗菌分离筛选
（1）细菌分离
通过无菌操作，将在西沙采样的龙虾肠道等用PBS研磨并稀释成10倍梯度，各取100ul涂布于LA，置于30℃培养箱培养24h-48h,反复划线2-3次，直至得到单菌落，并且记录培养皿中菌落的大小、形状、颜色、光泽等培养特征，共分离得到311株细菌，作为待筛拮抗菌，30℃200rpm培养24-48h,作为待测的细菌纯培养液。
（2）拮抗菌的筛选
通过无菌操作，将过夜培养的溶藻弧菌稀释10倍，取100ul涂布于LA平板，之后用打孔器在培养基上均匀打直径为9mm的孔，然后分别吸取待测的拮抗菌发酵液各100ul，加入孔中，培养皿于30℃培养24-48h,观察培养基打孔周围抑菌圈的大小，初步筛选得到对溶藻弧菌有抑制效果的菌株。
通过在LA培养基上打孔抑菌实验，从311株细菌中找到一株对溶藻弧菌有抑制作用的拮抗菌株。代号为菌株31号，其培养特征与对溶藻弧菌的抑制效果见表1。其抑菌圈见图1，最左边一个为阴性对照，中间和右边（箭头所指）均为铜绿假单胞菌31号的抑菌效果图，中间添加的量较少，抑制作用小，圈较小。
表1：菌株31号的培养特征及其对溶藻弧菌的抑制
（2）拮抗菌鉴定
筛选出来的一株溶藻弧菌拮抗菌株31号，其生物学特征：革兰氏阴性菌，菌体大小约(1.5x5.0)umx宽（0.5-1）um,细长且长短不一，有时呈球杆状或者线状，成对或短链状排列。菌体一端有单鞭毛，无芽孢。该菌氧化酶阳性，能分解葡萄糖和木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，吲哚阴性，精氨酸双水解酶阳性。
经过微生物自动分析系统Biolog鉴定，再结合16SrDNA（如SEQ ID NO.1所示）测序结果比对可知，其与 Pseudomonas aeruginosa fwzb9 (KF 208491.1) 相似性100%，Pseudomonas aeruginosa ALK319（KC 456534.1）相似性100%，Pseudomonas aeruginosaF23（JQ 579643.1）相似性100%，属于铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）中的成员，依据鉴定结果并结合菌株号，将其命名为：铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号。
本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号，与已知的铜绿假单胞菌相比，在形态、生理生化和营养特征方面均不相同。其主要特征为：专性需氧，菌体球杆状，菌落扁平，边缘不整齐，在普通固体培养基上产生水溶性的蓝绿色色素。能在0-4%NaCl中生长，在8%NaCl不生长。不液化明胶、果胶，不利用甘油，不发酵果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、麦芽糖、鼠李糖、乳糖、半乳糖，仅发酵葡萄糖。精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸阳性，丙氨酸、丝氨酸、肌醇、甘露醇、山梨醇阴性。能在pH5-9中生长，最适pH为7-8，最适温度为30-37℃，最适盐度为2%NaCl。
该铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2013697。
实施例2：拮抗菌制剂（发酵剂）的制备
根据筛选获得的最佳溶藻弧菌拮抗菌铜绿假单胞菌31号的生物学特征，筛选出合适的培养基，并采用适当的发酵条件，将该拮抗菌制成发酵菌液。
具体采用的发酵条件如下：
发酵菌株：溶藻弧菌拮抗菌铜绿假单胞菌31号。
发酵培养基配方：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,蒸馏水1L。
发酵温度：30℃
发酵周期：48-72h
发酵摇床转速：150-200rpm
根据上述发酵条件，发酵获得溶藻弧菌拮抗菌发酵剂，其pH为8.0-8.5。铜绿假单胞菌31号浓度达到1x108-6x1010cfu/ml。
实施例3：卤虫应用模拟实验
称取0.2g卤虫（丰年虾）卵放入500ml的无菌海水，在30℃恒温泵气的条件下，过夜孵化。用12孔板做实验，事先准备实施例2发酵好的溶藻弧菌拮抗菌发酵剂，每孔放入2ml无菌海水和30只卤虫，实验组为只添加溶藻弧菌（108cfu/ml）、只加溶藻弧菌拮抗菌发酵剂（108cfu/ml），以及加溶藻弧菌（108cfu/ml）和溶藻弧菌拮抗菌发酵剂（108cfu/ml），对照组为不加任何菌，只有卤虫。每组设置3个平行，实验期间条件不改变，观察4d，统计各组死亡率。具体结果如表2和图2所示。
表2：各组存活率
由图2和表2可以看出，本发明的铜绿假单胞菌31号能够清除水中的溶藻弧菌，从而预防溶藻弧菌对水产养殖对象的危害。
实施例4：铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号的抑菌效果试验
参考实施例1的拮抗菌的筛选试验，进行铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号的抑菌效果试验，具体结果如表3所示：
表3
| 指示菌 | 抑菌圈（直径d mm） |
| Bacillus subtilis | 24±0.1 |
| Staphylococcus aureus | 13±0.1 |
| C.violaceum CV026 | 20±0.1 |
| Vibrio alginolyticus(E167) | 12±0.2 |
| Vibrio alginolyticus(A187) | 8±0.2 |
| Aeromonas salmonicida199 | 25±0.1 |
| Vibrio parahaemolyticus13150 | 21±0.2 |
| Vibrio harveyi ATCC044 | 19±0.1 |
| Vibrio harveyi BB170 | 12±0.1 |
| Vibrio anguillarum NB10 | 21±0.2 |
| Vbirio alginolyticus1903 | 22±0.1 |
| Vibrio cholerae006 | 12±0.1 |
由上表可以看出，本发明的铜绿假单胞菌（peudomonas aeruginosa）31号对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、紫色色杆菌以及弧菌属的多种弧菌都具有较好的拮抗作用。
Claims (2)
1.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)31号，其保藏编号为CCTCC No.M2013697。
2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)31号在制备抗菌药物中的应用，所述的抗菌药物为防控枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、紫色色杆菌、溶藻弧菌或副溶血弧菌制剂。
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