JP4696251B2 - 多剤耐性緑膿菌の単離方法並びに多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法 - Google Patents

Description

本発明は、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ：Multiple-Drug-Resistant Pseudomonad aeruginosa）を単離する方法並びに多剤耐性緑膿菌の単離に用いて好適な多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法に関する。

従来の細菌の検出方法は、血液寒天培地等を用いて試料を培養後、培地に発育した菌の中から緑膿菌のコロニーのみを釣菌し、緑膿菌の発育に適する培地（血液寒天培地等）を用いて緑膿菌を分離培養し、緑膿菌のみでコンタミネーションが無いことを確認した後、その独立したコロニーを釣菌して同定法及びディスク拡散法又はアナライザ等を用いて菌種の同定及び薬剤感受性を判定する。この検出方法では結果が分かるまでに約７２時間又はそれ以上を要し、さらに緑膿菌の薬剤感受性を測定する際、数十〜数千コロニーの中から１〜３コロニーのみを釣菌するため、薬剤耐性株を拾い漏れる可能性がある。

他の方法として、緑膿菌選択分離用のＮＡＣ寒天培地により緑膿菌の分離培養を行い、ディスク拡散法やアナライザ等を用いて薬剤感受性を判定する方法もある。この検出方法でも結果が分かるまでに約４８時間またはそれ以上を要し、さらに緑膿菌の薬剤感受性を測定する際、数十〜数千コロニーの中から１〜３コロニーのみを釣菌するため、薬剤耐性株を拾い漏れる可能性がある。

緑膿菌のうちＭＤＲＰのみを選択的に分離できる培地は未だ見当たらない。

上記現状を踏まえ、本発明者は、感染症患者の治療や院内感染対策等でＭＤＲＰを確実かつ迅速に検出するためにはＭＤＲＰの分離培養と薬剤感受性判定を同時に行うことができる選択培地が必要であると認識した。そこで、この発明は、ＭＤＲＰのみを選択的に培養できる培地の作成方法並びに当該培地を用いたＭＤＲＰの単離方法を提供することを課題とする。

本発明の第１の態様は、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法である。この方法は、
ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシン塩酸塩の濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物を０．０３２ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴としている。
本発明の第２の態様も、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法である。この方法は、
ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシンの濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物を０．０３２ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴としている。
本発明の第３の態様も、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法である。この方法は、
ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシン塩酸塩の濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネムを０．０１６ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴としている。
本発明の第４の態様も、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法である。この方法は、
ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシンの濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネムを０．０１６ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴としている。
本発明の第５の態様は、多剤耐性緑膿菌の単離方法である。この方法は、
第１から第４のいずれかの態様の方法で作成した多剤耐性緑膿菌選択培地に緑膿菌を塗抹することにより、前記多剤耐性緑膿菌選択培地に添加された３種類の抗菌薬の全てに耐性を持つ緑膿菌のみを単離するものである。

なお、以上の構成要素の任意の組合せもまた、本発明の態様として有効である。

本発明の多剤耐性緑膿菌の単離方法によれば、緑膿菌以外の発育が抑制される培地にカルバペネム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系の３種類の抗菌薬をあらかじめ添加し、この添加した培地に緑膿菌を塗抹するので、添加した前記３種類の抗菌薬の少なくともいずれかに耐性を持たない緑膿菌の発育が抑制され、結果的に、添加した前記３種類の抗菌薬の全てに耐性を持つ緑膿菌のみを単離することができる。

本発明の多剤耐性緑膿菌選択培地は、緑膿菌以外の発育が抑制される培地にカルバペネム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系の３種類の抗菌薬を添加することによって多剤耐性緑膿菌のみが発育可能とされているので、緑膿菌を塗抹することで前記３種類の抗菌薬の全てに耐性を持つ緑膿菌のみを単離することができる。すなわち、本発明によって初めてＭＤＲＰのみを分離選択するための培地が提供されたといえる。

本発明の多剤耐性緑膿菌選択培地を、感染症患者の細菌検査に早期から用いることで、抗生剤を適切に使用してＭＤＲＰによる菌交代症を予防することができる。

以下、本発明の好適な実施の形態を詳述するが、実施の形態は発明を限定するものではなく例示であり、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。

図１は、本発明の実施の形態に係るＭＤＲＰ選択培地２をシャーレ１に分注した円形の平板培地の模式図である。ＭＤＲＰ選択培地２は、緑膿菌以外の発育が抑制される培地としてのＮＡＣ寒天培地にカルバペネム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系の３種類の抗菌薬を添加することによってＭＤＲＰのみを発育可能としたものである。ＭＤＲＰ選択培地２に占めるＮＡＣ寒天培地の濃度は、３５．５〜３６．０ｇ／Ｌが好ましい。

前記カルバペネム系の抗菌薬としては、イミペネム、又はイミペネム・シラスタチンナトリウム混合物が好適である。イミペネムの場合は０．０１６ｇ／Ｌ、イミペネム・シラスタチンナトリウムの場合は等量混合物として０．０３２ｇ／Ｌの濃度でＭＤＲＰ選択培地２に含有されているとよい。ここで、イミペネムは熱に不安定なので、ＮＡＣ寒天培地にイミペネム添加した後に沸騰させると分解してしまう。イミペネムの熱分解を極力抑制しながら寒天が固まらずに均一に混和できる温度は約６０℃である。したがって、ＮＡＣ寒天培地の溶液を沸騰させて寒天を溶かした後、６０℃に冷ましてからイミペネムを添加することが好ましい。

また、前記アミノグリコシド系の抗菌薬としては、アミカシンが好適である。アミカシンは、０．０３２ｇ／Ｌの濃度でＭＤＲＰ選択培地２に含有されているとよい。

また、前記ニューキノロン系の抗菌薬としては、シプロフロキサシン又はシプロフロキサシン塩酸塩が好適である。シプロフロキサシン又はシプロフロキサシン塩酸塩は、０．０１６ｇ／Ｌの濃度でＭＤＲＰ選択培地２に含有されているとよい。感染症法のＭＤＲＰ判定基準に基づけばシプロフロキサシンは４ｍｇ／Ｌになるが、ＮＡＣ寒天培地に含まれる硫酸マグネシウムとキレートを形成することによりシプロフロキサシンの力価が２５％に低下するため、本来必要な力価を保持するために４倍量（１６ｍｇ／Ｌ）添加することが好ましい。なお、水に溶けやすいシプロフロキサシン塩酸塩を用いれば、培地の作成が容易になる。

作成したＭＤＲＰ選択培地２に患者検体等の試料を塗抹することで、試料中にＭＤＲＰが存在するか否かを検出することができる。

本実施の形態によれば、下記のとおりの効果を奏することができる。

(1) 緑膿菌以外の発育が抑制されるＮＡＣ寒天培地にカルバペネム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系の３種類の抗菌薬を添加することによって多剤耐性緑膿菌のみが発育可能とされているので、緑膿菌を塗抹することで前記３種類の抗菌薬の全てに耐性を持つ緑膿菌のみを単離することができる。

(2) 添加薬剤の全てに耐性を持っている緑膿菌であるＭＤＲＰしか発育しないので、分離培養と薬剤感受性の判定とを別々に行っていた従来の方法と比較して、ＭＤＲＰ検出に要する時間を約２４時間短縮できる。

(3) 従来のように分離培養をした後に菌種を同定するために釣菌するコロニーを選択する場合と比較して満遍なく検査でき、薬剤耐性株の拾い漏れが起こる可能性が極めて低くなる。

（ＭＤＲＰ選択培地の作成）
下記表１に示す組成を有するＭＤＲＰ選択培地を作成した。

ＭＤＲＰ選択培地の作成手順は以下のとおりである。

ＮＡＣ寒天培地（乾燥粉末）３５．８ｇ、シプロフロキサシン塩酸塩１６ｍｇ、アミカシン３２ｍｇを水１０００ｍＬに溶かす。これを沸騰させた後に、６０℃に冷ましてからイミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物０．０３２ｇを添加した培地溶液をシャーレ１枚につき約２０ｍＬずつ注ぎ、室温で放置して冷却し寒天を固めて寒天平板培地を作成する。なお出来上がったＭＤＲＰ選択培地（寒天平板培地）は、半透明で淡黄色の培地であった。このＭＤＲＰ選択培地に患者検体等の試料を塗抹し、３６±１℃の恒温下で２４時間培養した後、培地上の黄色〜黄緑色のコロニーの有無（すなわちＭＤＲＰの存否）を確認する。

なお、上記実施例ではイミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物０．０３２ｇとシプロフロキサシン塩酸塩１６ｍｇを添加したが、他の実施例ではイミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物０．０３２ｇの代わりにイミペネム１６ｍｇを添加してもよく、またシプロフロキサシン塩酸塩１６ｍｇの代わりにシプロフロキサシン１６ｍｇを添加してもよい。

（試験例１：検出精度試験）
薬剤感受性の不明な緑膿菌試料１３個（♯１〜♯１３）を表１に示す組成を有するＭＤＲＰ選択培地（寒天平板培地）１枚につき１個ずつ塗抹して３６±１℃の恒温下で２４時間培養した後、ＭＤＲＰ選択培地上のコロニー形成の有無を確認したところ、表２下段に示されるように、試料♯３及び♯１２以外の１１個にコロニー形成が確認された。この結果、試料♯３及び♯１２以外の１１個はＭＤＲＰである（同時に試料♯３及び♯１２はＭＤＲＰでない）と判定できる。なお、上記緑膿菌試料１３個（♯１〜♯１３）をＮＡＣ寒天培地に同様に塗抹し確認した結果を表２上段に示している。ここで、１つのシャーレにＭＤＲＰ選択培地及びＮＡＣ寒天培地を分注した円形の２文画培地（図２参照）を用いれば、確認の効率がよい。

上記表２における判定の正否を確かめるために、上記緑膿菌試料１３個（♯１〜♯１３）について従来から知られているディスク拡散法によって薬剤感受性を測定した結果を示す（下記表３）。表３に示されるように、ディスク拡散法によって、試料♯３及び♯１２以外の１１個がＭＤＲＰである（同時に試料♯３及び♯１２はＭＤＲＰでない）ことが明らかとなった。すなわち、本実施例のＭＤＲＰ選択培地でコロニー形成が確認された緑膿菌試料はＭＤＲＰであり、コロニー形成が確認されなかった緑膿菌試料はＭＤＲＰでないとする判定の正当性が確かめられたといえる。

（試験例２：選択性試験）
表１に示す組成を有するＭＤＲＰ選択培地に、緑膿菌以外の細菌とＭＤＲＰの双方、又は緑膿菌以外の細菌のみを塗抹し、３６±１℃の恒温下で２４時間培養した後、ＭＤＲＰ選択培地上のコロニー形成の有無を確認し菌種を同定した結果を示す（下記表４）。表４に示されるように、緑膿菌以外の細菌とＭＤＲＰの双方を塗抹したＭＤＲＰ選択培地からはＭＤＲＰのみが検出され、緑膿菌以外の細菌のみを塗抹したＭＤＲＰ選択培地からは菌が検出されなかった。この結果、本実施例のＭＤＲＰ選択培地では緑膿菌以外の細菌の発育が抑制されることが明らかとなった。

以上、実施の形態を例に本発明を説明したが、実施の形態の各構成要素や各処理プロセスには請求項に記載の範囲で種々の変形が可能であることは当業者に理解されるところである。

本発明の実施の形態に係るＭＤＲＰ選択培地を分注した円形の平板培地の模式図 ＭＤＲＰ選択培地及びＮＡＣ寒天培地を分注した円形の２文画培地の模式図

符号の説明

１ シャーレ
２ ＭＤＲＰ選択培地
３ ＮＡＣ寒天培地

Claims (5)

1. ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシン塩酸塩の濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物を０．０３２ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴とする、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法。
2. ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシンの濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネム・シラスタチンナトリウム等量混合物を０．０３２ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴とする、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法。
3. ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシン塩酸塩の濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネムを０．０１６ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴とする、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法。
4. ＮＡＣ寒天培地の濃度が３５．５〜３６．０ｇ／Ｌ、シプロフロキサシンの濃度が０．０１６ｇ／Ｌ、アミカシンの濃度が０．０３２ｇ／Ｌであって沸騰した水溶液を、６０℃に冷ましてから、イミペネムを０．０１６ｇ／Ｌの濃度で添加し、その後、室温で冷却して寒天を固めることを特徴とする、多剤耐性緑膿菌選択培地の作成方法。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の方法で作成した多剤耐性緑膿菌選択培地に緑膿菌を塗抹することにより、前記多剤耐性緑膿菌選択培地に添加された３種類の抗菌薬の全てに耐性を持つ緑膿菌のみを単離する、多剤耐性緑膿菌の単離方法。

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