KR20180136908A - 병원체 검출 방법 - Google Patents

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KR20180136908A
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코르넬리우스 요한네스 프란코이스 타우테
두 토이트 루츠
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노스-웨스트 유니버시티
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Abstract

본 발명은 시험관내 생물학적 샘플 중 마이코티올 형태의 마이코박테리움 특이적 대사산물을 검출하는 방법으로서, 생물학적 샘플을, 반응 버퍼, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 함유하는 효소 용액과 배합함으로써 반응 혼합물을 제조하는 단계; 생물학적 샘플 중에 존재하는 경우, 마이코티올 형태의 소정의 마이코박테리움 특이적 대사산물과 FD-MDH의 상호작용에 의해 반응 혼합물 중에서 NAD를 환원시키는 단계; 및 생물학적 샘플 중 마이코티올의 존재 및 이에 따라 생물학적 샘플의 공급원 중 마이코박테리움 감염을 가리키는, 샘플 내 환원된 NAD를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

Description

병원체 검출 방법{PATHOGEN DETECTION METHOD}
본 발명은 생물학적 샘플에서 마이코박테리움 특이적 대사산물의 검출을 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
마이코박테리움 질병, 구체적으로는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 관련된 결핵("TB")은 1년에 백만명이 넘는 사망자를 초래하며; 특히 사망률은 HIV 감염 사례와 관련이 있다. 마이코박테리움 감염의 초기 검출 및 양성 확인은, 에어로졸 액적에 의해 전염될 수 있고 이에 따라 활동성 감염의 경우 높은 전염 속도를 갖기 때문에 질병 치료의 중요한 구성요소이다. 추가적으로, 다제내성(MDR) 균주를 포함한 엠. 투베르쿨로시스의 다제내성 균주는 현재 공지되어 있으며, 정확한 치료 과정이 이어지는 것을 보장하기 위해 신속한 확인이 요구된다.
마이코박테리움 감염을 진단하는 통상의 방법은 직접적인 현미경 검사 및 배양에 의한 객담 내 항산성균의 검출에 의한 것이다. TB의 검출을 위해 지일-닐센(ZN) 염색을 사용한 현미경 검사가, 적절하게 이루어지는 경우, 빠르고 저렴하지만, 객담 배양과 비교하였을 때, 폐 TB 보유 전체 성인의 60-70%만이 검출된다. 하지만, 실제로, 이 수치는 훨씬 더 낮다. 배양은 현재 TB 진단에 대해 "금본위제"로서 분류되며, 현재 모든 개발도상국에서 그 목적으로 권장된다. 하지만, 이것 역시 비제한적이 아니며; 주요한 것은 진단에 걸리는 시간, 즉 2-8주이다. 객담에서 박테리아 내용물을 유전자형화시키는 분자 생물학 기법은, 복잡한 객담 마이크로구조 및 마이코박테리움 세포벽을 분해시켜 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 마이코박테리움 유전 물질을 수득하는 지루한 샘플 조제를 수반한다. 최근에, PCR 기술은 TB 진단 응용예에 사용된 바 있다. 하지만, 이것 또한 높은 비용과 첨단 기술 인프라 및 숙련된 인력의 필요성을 고려할 때 비제한적인 것도 아니다. 실험실 교차 오염으로 인한 위양성 결과의 높은 발생률은 또한 업계의 조건 하에서 그 성능을 제한하고, 도말 음성-배양 확인된 샘플에서의 감도는 47-68% 사이의 임의값인 것으로 보고되었다. PCR은 고가의 고감도의 정확한 분자 생물학적 도구로서, 샘플 취급의 오류가 있기 쉽고, 빈약하고 무지한 영역에서 사용이 배제되는 부적절한 샘플 조제의 억제제로서 숙련된 인력만이 요구된다. 이러한 불충분성은 자신의 지역 사회에 대한 치료되지 않은 감염성 개인의 연장된 노출을 초래하고, 증가된 TB 및 MDR-TB 감염, 질병의 출현율 및 사망률에 기여하는 주요 요인이 되는 것으로 여겨진다.
결핵의 초기 검출은, 1. MDR-TB의 새로운 균주의 발생 및 이의 확산 방지, 2. 감소된 사망률 및 3. 더욱 효과적인 치료 결과를 유도할 수 있다. 신속한 진단적 현장현시(POC: point-of-care) 장치의 개발은 나노기술 및 나노입자에 대한 관심이 증가함에 따라 지난 수년간 연구자들에 의해 더 많은 관심을 받았다. 상용 POC는 우수한 특이성(90-95%)을 가지고 있지만 현재의 한계는 검출 한계가 낮고 감도가 낮거나 중간 정도이다.
마이코티올로 공지된 티올 부류는, 감염성 TB 유발 마이코박테리움을 포함한 유기체 부류인 악티노마이세트(actinomycete)에 유일한 것으로 인식되었고(Gerald et al (1996) Journal of Bacteriology 178(7): 1990-1995), 후자는 TB 관련 증상을 유도하는 유일한 악티노마이세트 속이며, 이러한 이유로 이는 TB 환자 객담에서 상기 유기체를 확인하기 위한 특이성이 있다. 이것은, 결국, 생물학적 샘플에서 마이코티올을 검출하는 다수의 면역검정 시스템의 개발을 유도하였다(Unson et al (1998) Journal of Immunological Methods 214: 29-39 and Unson et al (1999) Journal of Clinical Microbiology 37(7): 2153-2157). 이러한 방법은 효소 결합 면역흡착검정(ELISA) 접근을 사용하여 높은 감도가 가능하지만, 이러한 결과를 얻기 위해 장시간의 설정 및 처리 단계(최소 10시간)가 필요하다.
이를 감안할 때, 인간 피험자에서의 마이코박테리움 감염 검출을 위한 신속하고 민감하며 고도의 특이적 검정에 대한 현재의 필요성이 존재한다는 것이 명백하다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 전술된 단점을 극복할 수 있거나 최소 감소시킬 수 있는, 생물학적 샘플에서의 마이코박테리움 특이적 대사산물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
제1 측면에 따르면, 시험관내 생물학적 샘플 중 마이코티올 형태의 마이코박테리움 특이적 대사산물을 검출하는 방법으로서,
- 생물학적 샘플을, 반응 버퍼, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 함유하는 효소 용액과 배합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계;
- 생물학적 샘플 중에 존재하는 경우, 마이코티올 형태의 소정의 마이코박테리움 특이적 대사산물과 FD-MDH의 상호작용에 의해 반응 혼합물 중에서 NAD를 환원시켜 NADH를 발생시키는 단계; 및
- 생물학적 샘플 중 마이코티올의 존재 및 이에 따라 생물학적 샘플의 공급원 중 마이코박테리움 감염을 가리키는, 샘플 내 환원된 NAD(NADH)를 검출하는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
마이코박테리움 감염은 통상, 독점적인 것은 아니지만, 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 감염, 또는 통상 동일한 방식으로 처리된 다른 마이코박테리움 종에 의한 감염이다.
추가로, 본 발명에 따르면, 샘플에서 환원된 NAD(즉, NADH)를 검출하는 단계는, 비색 반응, 효소 검정, 크로마토그래피법, 질량 분광법 및 분광광도법으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 하나 이상의 방법을 통해 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
생물학적 샘플은 순수 대사산물, 세포 추출물, 혈액, 객담, 소변, 뇌척수액, 액체 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
추가로, 본 발명에 따르면, 효소 용액은 염, 알데히드, 아민, 히드록시드, 환원제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 보조제를 포함한다.
바람직하게는, 효소 용액은 염화나트륨, 포름알데히드, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 디티오트레이톨 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
효소 반응은 25-40 섭씨온도의 온도에서 2-840분 동안 수행될 수 있다. 대안적으로, 효소 반응은 2-80분 동안 수행된다. 추가로 대안적으로, 효소 반응은 2-20분 동안 수행될 수 있다.
효소 반응은 큐벳, 투명 다중웰 플레이트 또는 유리 샘플 바이알에서 수행될 수 있고, 개별 반응의 총 부피는 250 uL 하에 있다. 대안적으로, 반응은 종래의 실험 유리제품에서 수행된다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 시험관내 생물학적 샘플에서의 마이코박테리움 특이적 대사산물을 검출하기 위한 키트로서, 반응 버퍼, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 함유하는 효소 용액; 및 생물학적 샘플 및 효소 용액을 수용하여 반응 혼합물을 형성하기에 적당한 용기를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 장점은 본 발명의 상세한 설명 이후에 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 첨부 도면을 참조하여 하기 기술된다:
도 1은 광학 밀도의 증가가 340 nm에서 측정된 NADH에서의 증가와 선형적으로 관련되는 트리스-버퍼 중 MSH 및 MD-FalDH의 효소 반응의 표준화를 도시하는 그래프이다.
도 2는 (a) 14h에 걸쳐 트리스-버퍼 중 저농도의 MSH 및 MD-FalDH의 존재 하에 무의미한 사이클을 사용하여 MSH 및 MD-FalDH의 효소 반응의 표준화를 도시하는 그래프이고, (b) 14h에 걸쳐 배양된 세포 용해물에 대한 검정의 응용예이며, 0.05 ug (또는 50 ng) 세포 추출물 등가물에 대한 낮은 검출 한계를 입증하는 확대도에 대한 그래프이다. 광학 밀도의 증가는 340 nm에서 측정된 NADH의 증가와 선형적으로 관련된다.
도 3은 (a) 객담 샘플(배양 양성; 도말 현미경 검사 양성(C+ve; SM+ve); 배양 양성 및 도말 현미경 검사 음성(C+ve; SM-ve)), 및 배양 및 도말을 사용한 TB 음성 객담 샘플(객담-ve)을 사용하여 MSH-MD-FalDH 검정에 대하여 340 nm에서의 광학 밀도의 증가를 나타내는 그래프이고, (b) 감지가능한 신호가 없는 대조군 또는 TB- 샘플(b)과 TB+ 샘플에 대해 발생하는 검출가능한 신호를 나타내는 그래프의 확대 영역이다.
본원에 개시된 청구 대상은 대표 구체예가 제시된 첨부 실시예를 참조하여 이하 더욱 자세하게 기술된다. 하지만, 본원에 개시된 청구 대상은 상이한 형태로 구현될 수 있고 본원에 제시된 구체예로 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 오히려, 이러한 구체예는 본 개시내용이 철저하고 완전하며 구체예의 범위가 당업자에게 충분히 전달되도록 제공된다.
본 발명의 바람직한 구체예의 설명
시험관내 생물학적 샘플 중 마이코티올 형태의 마이코박테리움 특이적 대사산물을 검출하는 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 방법은
- 생물학적 샘플을, 반응 버퍼, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 함유하는 효소 용액과 배합함으로써 반응 혼합물을 제조하는 단계;
- 생물학적 샘플 중에 존재하는 경우, 마이코티올 형태의 소정의 마이코박테리움 특이적 대사산물과 FD-MDH의 상호작용에 의해 반응 혼합물 중에서 NAD를 환원시켜 NADH를 발생시키는 단계; 및
- 생물학적 샘플 중 마이코티올의 존재 및 이에 따라 생물학적 샘플의 공급원 중 마이코박테리움의 감염을 가리키는, 샘플 내 환원된 NAD(NADH)를 검출하는 단계
를 포함한다.
상기 방법은 비제한적으로 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 감염을 포함한 마이코박테리움 감염을 검출하기에 특히 적당하며, 하지만 마이코티올의 분포를 갖는 임의의 악티노마이세트의 존재가 본 발명에 따른 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다는 것이 예견된다. 하지만, 환자 샘플은 감염성 마이코박테리움에 의해 야기된 것과 독점적으로 관련된 증상을 기초로 수집되도록 고려되고, 이는 결핵에 특정하다.
생물학적 샘플은 순수 대사산물, 세포 추출물, 혈액, 객담, 소변, 뇌척수액, 액체 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
샘플에서 환원된 NAD(즉, NADH)를 검출하는 단계는, 비색 반응, 효소 검정, 크로마토그래피법, 질량 분광법 및 분광광도법으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 하나 이상의 방법을 통해 변화를 검출하는 것을 포함한다.
효소 용액은 염 및 버퍼, 특히 알데히드, 아민, 히드록시드, 환원제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 효소 용액은 염화나트륨, 포름알데히드, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 디티오트레이톨의 혼합물을 포함한다.
당업자라면 효소 반응의 속도가 생물학적 샘플에서의 마이코박테리움 특이적 대사산물의 출발 농도에 따라 달라지는 것을 알 것이다. 따라서, 반응 동안 NADH의 특정 농도를 발생시키는 데 걸리는 시간은 또한 생물학적 샘플에서의 마이코박테리움 특이적 대사산물의 출발 농도에 따라 달라진다.
효소 반응은 25-40 섭씨 온도의 온도에서 2-840분의 시간 동안 수행된다. 대안적으로, 효소 반응은 2-80분의 시간 동안 수행된다. 추가로 대안적으로, 효소 반응은 2-20분의 시간 동안 수행된다.
당업자라면 효소 반응이 다수의 장치 및 부피로 수행될 수 있다는 것을 알 것이고, 다양한 옵션이 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 발명의 구체예에서, 효소 반응은 큐벳, 투명 다중웰 플레이트 또는 소형 유리 샘플 바이알에서 수행되며, 개별 반응의 총 부피는 250 uL 하에 있다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, 반응은 종래의 실험 유리제품에서 수행된다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 시험관내 생물학적 샘플에서 마이코박테리움 특이적 대사산물을 검출하기 위한 키트로서, 반응 버퍼, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 함유하는 효소 용액; 및 생물학적 샘플과 효소 용액을 수용하여 반응 혼합물을 형성하기에 적당한 용기를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 바람직한 구체예의 비제한적 예는 도 1 내지 3을 참조하여 하기 더욱 상세하게 기술된다.
실시예: 엠. 투베르쿨로시스의 검출을 위한 시각적 검정
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 사용하여 마이코티올(MSH)의 포름알데히드 부가물의 존재 하에 환원된 에너지 담체(NADH)를 발생시켰다. 효소 용액 버퍼는 pH, 온도, 마이코티올 (환원) 함량, 및 포름알데히드 함량에 의존한다.
검정은 반응 부피가 총 200 uL인 고 처리량의 96웰 플레이트 포멧에서 수행될 수 있다. 반응은 30 섭씨 온도에서 2분 내지 14시간이 걸렸다.
효소 검정의 표준화
표준화를 위해, 순수 합성 마이코티올(트리플루오로아세트산 염)이 사용되었다. 이는 추출 없이 10 mM 스톡으로 구성되는데, 그 이유는 트리플루오로아세트산 염이 마이코티올의 자동 산화를 방지하기 때문이다. MD-FalDH 활성 스크린을 96웰 마이크로플레이트에 설치하였다(하기 표 1에서 확인할 수 있는 일반적인 레이아웃). 효소 활성 스크린의 모든 구성요소를 함유하는 예비 혼합물을 제조하였다(Lessmeier et al; 2013). 프리믹스 조성물은 100 mM 트리스(pH 8.25), 500 mM NaCl, 5 mM NAD+, 1 mM DTT, 1-5 mM 포름알데히드, 및 0.001-0.05 mg/mL MD-FalDH로 이루어진다. "샘플"은 사용된 실제 환자 샘플 물질의 컨시스텐스(consistence)를 복제하는 성분의 혼합물을 함유하거나, 또는 검출하고자 하는 감염성 병원체 및/또는 생물학적 화합물(이 경우에는 마이코티올)이 결여된 실제 환자 샘플 매트릭스를 함유한다.
Figure pat00001
인큐베이터 온도가 30 섭씨 온도에서 설정된 BioTEK Synergy UV-Vis 분광계 플레이트 판독기 또는 임의의 유사 모델 기기 상에서 340 nm(NADH)에서의 광학 밀도 증가를 측정하였다. Gen5 소프트웨어 패키지를 사용하여 모든 블랭크 및 파장 보정을 실시하였다. 운동 간격은 샘플의 수에 따라 30-90s 간격으로 판독되었다. 모든 운동 검정의 경우, 순수 MSH는 광학 밀도(340 nm)에서의 증가를 위한 표준물로서 사용된다. 모든 판독은 3회 실시하였다. 모든 목적을 위해, 가능한 경우, MSH는, 병원체 함유 샘플의 것과 동일한 매트릭스, 예컨대 객담 샘플의 경우에 액체 배양 성장 배지 또는 추출 버퍼 중에 용해되는 경우에 표준화된다.
상기 검정의 경우, NaCl 부재 또는 HEPES/MOPS 버퍼로의 트리스 치환은 시간 경과에 따라 340 nm에서의 광학 밀도 증가에 유의적인 효과를 갖지 않는다. 결정 요인은 단지 pH 의존적인 것으로 밝혀졌고, 이 경우 최적의 활성은 문헌에서 Lessmeier 등(2013)에 의해 기술된 것과 상응한다(pH 8.25). 340 nm에서의 광학 밀도의 증가(NADH)는 도 1 및 도 2a에서 확인될 수 있고, 여기서 표준물의 경우에, 광학 밀도의 증가는 앞서 기술된 바와 같이 각각 4h 및 14h에 걸쳐 순수 마이코티올을 함유하는 혼합물의 것이다. 도 1에 생성된 결과에 사용되는 표준물의 조성은, 각각 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM 및 0.06 mM의 MSH 표준물 시리즈에 의해 0.05 mg/mL MD-FalDH를 사용하여 포함되었다. 도 2a에 생성된 결과에 사용되는 표준물의 조성은, 0.032 mM, 0.016 mM 및 0.008 mM의 MSH 표준물 시리즈에 의해 0.002 mg/mL MD-FalDH를 사용하여 포함되었다.
액체 배양된 H37Rv 엠. 투베르쿨로시스 세포 용해물 상에서 실시된 효소 반응으로부터 340 nm에서의 광학 밀도 증가(NADH)는 각각 4h 및 14h 동안 도 1 및 도 2b에서 확인될 수 있고, 0.5, 1 및 5 mg 세포 추출물 등가물로 설명되고 표지되었다. 샘플 대조군은 여기서 마이코티올 또는 효소를 함유하지 않는 샘플과 동일한 제조 단계를 겪는 물/매트릭스 샘플을 지칭한다.
액체 배양된 엠. 투베르쿨로시스로부터의 세포 추출물(용해물)의 경우, 새로운 추출 버퍼가 개발되었다. 버퍼는 다수의 프로토콜, 구체적으로는 식물 물질로부터 게놈 DNA의 단리를 위한 프로토콜을 기초로 따른다. 버퍼는 세포 물질의 존재 하에 있을 때까지 탁백색을 나타내고, 여기서 용액은 선택적으로 투명해진다. 버퍼(pH 8)는 100 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄올설폰산) (HEPES) 버퍼, 500 mM NaCl, 5% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 5% 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)로 이루어진다. 하기는 용해 버퍼를 사용한 일반적인 프로토콜이다:
초과량의 용해 버퍼(100-500 μL)를 액체 배양물에서 단리된 50 mg의 엠. 투베르쿨로시스 펠렛화된 습윤 세포량에 첨가하였다. 세포 펠렛은, 미립자가 가시화될 때까지 동일 바이알에서 반복마이크로피펫팅을 통해 기계적으로 방해하여 샘플은 크림 텍스쳐 및 외관을 가졌다. 그리고나서 세포 펠렛-용해 버퍼 혼합물을 60s 동안 강하게 볼텍싱한 후, 65 섭씨 온도에서 30-45분 동안 또는 90 섭씨 온도에서 20분 동안 가열하였다. 최종 볼텍스 단계는 10s 동안 실시하였다. (4000 g의 상대원심력(RCF)에서) 원심분리를 통해 세포 잔사물을 침강시키고 후속 분석에 상청액을 사용하였다. 대안적으로, (예를 들어, 아이스 상에 배치하거나 냉장고 또는 냉동고에 배치함으로써) 혼합물의 온도를 저하시킴으로써 또는 중력 침강을 통해 샘플을 침강시킨다.
하기 표 2에는 상기 본원에 기술된 용해 버퍼를 사용하는 일반적인 실험 프로토콜을 나타낸다.
Figure pat00002
하기 실시예에서, 검출 하한(즉, 샘플 중에는 마이코박테리움의 최소 갯수가 존재하는 것이 필요함)을 측정하기 위해, 5 mg의 습윤 세포량을 500 μL 용해 버퍼 중에 현탁시키고 상기 기술된 바와 같이 처리하였다. 그리고나서 세포 용해물을 희석시켜 5 mg, 1 mg, 0.05 mg, 50 μg, 5 μg, 0.5 μg, 0.05 μg, 0.005 μg의 습윤 세포로 희석 시리즈 등가물을 생성하고, 각각 20 μL를 사용하여 상기 표 2에서 샘플 컬럼에 제시된 바와 같이 분석 샘플을 제조하였다. 이러한 실험을 3회 반복하여 각 샘플을 3중 판독하였고, 각 반복 결과는 (5 mg, 1 mg 및 0.5 mg 세포량 등가물에 대한) 도 1 및 도 2a와 2b(500 μg-0.005 μg (또는 0.5 ng))에 제시된 바와 같이 유사한 결과를 얻었다.
Figure pat00003
상기 표 3에 요약된 바와 같이, 효소 검정의 추정된 검출 감도는 0.05 μg(50 ng)의 등가 세포 용해물(도 2b) 정도 낮은 양으로 관찰되는 광학 밀도의 증가로 입증된다.
이어서, 마이코박테리움을 함유하는 환자 수집된 진단 샘플 내 마이코티올의 존재를 검출시 효소 검정의 능력을 평가하기 위해, 하기 표 4에 제시된 예시와 같이 환자 수집된 객담 상에서 액체 배양 세포 용해물과 동일한 추출 프로토콜을 수행하였다. 광학 밀도(340 nm)의 증가는, 4개의 모든 TB+ 샘플(배양 양성; 도말 현미경 검사 양성(C+ve; SM+ve); 배양 양성 및 도말 현미경 검사 음성(C+ve; SM-ve)을 포함함) 및 활동성이 없는 대조군으로서의 TB 음성 객담 샘플, 또는 5개의 TB-ve 샘플(배양 및 도말 현미경 검사를 사용하여 확인됨(객담-ve))에 대한 검출가능한 신호를 나타낸다(도 3). 도 3a(도 3b)의 그래프의 특정 영역의 확대는 빠른 드랍오프(drop-off)로 광학 밀도의 신속한 증가를 나타낸다. 이는 가능하게는 객담 샘플 또는 NADH와 상호작용하는 소형 분자로부터 잔여 효소 활성에 기인하는 것일 수 있다. 샘플 대조군(도 3a)에는 객담 샘플과 정확히 동일한 준비 단계를 실시하였다. 4개의 TB (+) 샘플에 대한 340 nm에서의 광학 밀도 증가는 낮지만 샘플 대조군과 마찬가지로 5개의 TB (-) 샘플과 비교하여 여전히 검출가능하였다(도 3b). 세포 용해 프로토콜, 효소 버퍼 시스템을 최적화함으로써 세포 용해물과 유사하게 결과를 생성하거나, 또는 검출 한계를 추가로 낮추기 위해(즉, 방법 중 감도를 증가시키기 위해), 형광 리포터 분자와 마찬가지로, 효소 "인핸서", 예컨대 p-요오도니트로테트라졸리움 바이올렛 또는 페나진 메토설페이트(Hinman and Blass, 1981)를 혼입시키는 노력을 시도할 수 있다.
Figure pat00004
검증 동안, 객담 추출 샘플로부터 직접 NADH의 검출을 위한 MSH-MD-FalDH 효소 검정은 모든 TB +ve(이 중, 2개는 배양 양성 및 도말 양성이고 2개는 배양 양성 및 도말 음성) 및 5 TB-ve 샘플의 성공적인 구별을 입증하였다(도 3).
당업자라면 검정의 효소 구성요소는 추가 검증으로 객담 샘플과 마찬가지로 액체 배양물에 사용될 수 있고, 진단과 연구에 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기 결과는 본 발명이 10분 인큐베이션 후 1.6 x 107 104 CFU, 및 약 2시간 반 후 1.6 x 104 CFU, 및 대략 6시간 후 1.6 x 103을 검출하기에 충분히 민감하다는 것을 가리킨다. 이러한 감도 및 진단 시간을 고려할 때, 도말 현미경 검사(1 x 104 요구됨)에 대한 대안 방법에 우수한 경우가 된다. 하지만, 실제 환자 수집된 객담에 대해 테스트하였을 때, 이 방법은, 모든 TB 양성 샘플을, 심지어 종래 도말 현미경 검사에 의해 놓친 것도 양성으로 확인할 수 있어서, 도말 현미경 검사보다 더 민감하고, 배양만큼 민감한 후보가 되는 것이며 더 큰 샘플 코호트에서만 확인될 수 있는, 객담 매트릭스 중 마이코박테리움 복합체에 의해 생성된 외인성 마이코티올을 검출할 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따른 방법은, 상기 본원에 기술된 바와 같이, 종래 기술 방법보다 많은 장점들을 갖는다.
첫째, 본 발명은 수행하기 간단하고 다른 현존하는 고 감도의 검정 접근법보다 훨씬 낮은 비용으로 상업화될 수 있다. 둘째, 테스트는, 상기 본원에 기술된 바와 같이, 다른 방법보다 비교적 빠른데; 즉 (96웰 플레이트를 사용하여 수행되는 경우) 복수의 샘플을 동시에 완료하는데 최대 수시간이 요구되며, 완전히 자동화될 수 있다. 이는 TB 진단 접근법을 광범위하게 기초로 둔 다른 방법들이 대부분 시기적절한 것을 고려할 때 유리하게 비교되며, 최근 가장 빠른 것은 증폭 단계 단독에 적어도 몇시간이 요구되고 완료하는데 효과적으로 수일이 걸릴 수 있는 PCR 기반 접근법과, 잘해야 2일(평균 2-8주)의 가장 빠른 배양 방법이 있다. 도말 현미경 검사는, 본원에 기술된 검정과 비교하였을 때 훨씬 더 낮은 감도를 갖는 것 이외에, 또한 노동집약적이고, 숙련된 조직학 훈련이 요구되고, 복수의 취급 오류 및 확증 편향을 도입할 수 있는 시각적 평가가 잠재적으로 혼입되고, 제조 및 분석에 통상 수시간이 걸리지만; 복수의 샘플 조제는 시간과 관련하여 제한적 요소이다.
마지막으로, 본원에 기술된 테스트는 대사 마커를 검출하며, 이에 따라 유전 물질에 의존하지 않는다. 이는 현존하는 유전적 접근법과 비교하였을 때 잔류 유전 물질이 위양성 결과를 생성할 수 있기 때문에 본 발명의 정확도를 향상시킨다.
나아가, 이 검정은 현장현시 진단 디바이스에 내장될 수 있다.
당업자라면 첨부된 청구범위의 범위로부터 벗어나는 일 없이 본 발명에 따른 방법에 세부적인 변형이 가능하다는 것일 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 시험관내 생물학적 샘플 중 마이코티올 형태의 마이코박테리움(Mycobacterium) 특이적 대사산물을 검출하는 방법으로서,
    - 생물학적 샘플을, 반응 버퍼, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 포름알데히드 의존성 마이코티올 디히드로게나제(FD-MDH)를 함유하는 효소 용액과 배합함으로써 반응 혼합물을 제조하는 단계;
    - 생물학적 샘플 중에 존재하는 경우, 마이코티올 형태의 소정의 마이코박테리움 특이적 대사산물과 FD-MDH의 상호작용에 의해 반응 혼합물 중에서 NAD를 환원시켜 NADH를 발생시키는 단계; 및
    - 생물학적 샘플 중 마이코티올의 존재 및 이에 따라 생물학적 샘플의 공급원 중 마이코박테리움 감염을 가리키는, 샘플 내 환원된 NAD(NADH)를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 마이코티올은 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 의해 생성되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 순수 대사산물, 세포 추출물, 객담, 소변, 뇌척수액, 액체 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효소 용액은 염, 알데히드, 아민, 히드록시드, 환원제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 보조제를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 효소 용액은 염화나트륨, 포름알데히드, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 디티오트레이톨 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 반응이 25-40 섭씨 온도의 온도에서 2-840분의 시간 동안 수행되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, NAD 및/또는 환원된 NAD의 농도가 비색 검정, 효소 검정, 크로마토그래피 검정, 질량 분광법 및 분광광도 검정, 측류 장치(lateral flow device), 육안 검출, 소변 테스트 스트립 및 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택된 방법에 의해 측정되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 실질적으로 본원에 기술되고 예시된 바와 같고/같거나, 첨부된 도면을 참조하여 기술되는 것인 방법.
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