JP2019030287A - 病原体検出方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】マイコバクテリウム感染を診断するための方法の提供。【解決手段】インビトロで生体試料中のマイコチオール形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出する方法であって、反応緩衝液、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＤ−ＭＤＨ）を含有する酵素溶液と、生体試料を混合することにより、反応混合物を調製する工程；生体試料中に存在する場合、所定のマイコチオールの形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物とＦＤ−ＭＤＨの相互作用により、反応混合物中において、ＮＡＤを還元させる工程；および生体試料中のマイコチオールの存在、それ故に生体試料の供給源におけるマイコバクテリウム感染を示す、試料内の還元ＮＡＤを検出する工程を含む、方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の利用分野
本発明は、生体試料中のマイコバクテリウム特異的代謝産物の検出のための方法およびキットに関する。
発明の背景
マイコバクテリア疾患、特に結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）に関連する結核（「TB」）は、年間100万例をゆうに超える死亡の原因であり；死亡は、HIV感染の場合に特に関連している。エアロゾル液滴により伝播され得て、それ故に活動性感染の場合高い感染率を有するため、マイコバクテリウム感染の早期検出および陽性同定は、疾患を処置する重要な要素である。また、正しい一連の処置を受けることを確実にするために迅速な同定を必要とする、Multiple Drug Resistant（MDR）株を含む、結核菌（M・ツベルクローシス）の多剤耐性株が現在知られている。
マイコバクテリウム感染を診断するための通常の方法は、直接の顕微鏡検査および培養による痰中の抗酸菌の検出によるものである。TBの検出のためのZiehl-Neelsen（ZN）染色を用いる顕微鏡検査が速く安価であるが、適切に行われた場合、痰培養と比較して、肺TBの全成人の60〜70％のみを検出する。しかしながら、実際にはこれらの数値ははるかに低い。培養は、現在、TBを診断するための「ゴールドスタンダード」として分類され、現在、すべての発展途上国でその目的のために推奨される。しかしながら、これもまた限界がない訳ではなく；主要なものは、診断に要する時間、すなわち2〜8週間である。痰中の細菌内容物を遺伝子型決定するための分子生物学技術は、マイコバクテリウム遺伝子材料を得るために複雑な痰の微構造およびマイコバクテリウム細胞壁を壊す長い試料調製と、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む。より最近では、PCR技術が、TB診断用途に用いられている。しかしながら、高い費用ならびにハイテク基盤および十分な訓練を受けた人員の必要性を考慮すると、これもまた限界がない訳ではない。実験室の交差汚染による偽陽性結果の高い発生率もまた、現場条件下でのその実施を制限し、塗抹陰性-培養確認試料におけるその感度は、47〜68％間のいずれかであると報告されている。PCRは、高価で高感度で正確な分子生物学的ツールであり、不適切な試料調製からの試料のハンドリングエラーおよび阻害因子が生じやすく、これは、貧しく、無学な地域での使用を排除し、訓練された人員のみを必要とする。これらの欠点は、未処置の感染個体の地域社会への長期曝露をもたらし、TBおよびMDR-TB感染、疾患および死亡率の増加に寄与する主要な要因であると考えられている。
結核の早期検出は、1.その拡散およびMDR-TBの新規株の発生の防止、2.死亡率の低下、および3.より効果的な処置結果をもたらし得る。迅速診断のポイントオブケア（POC）デバイスの開発は、特にナノテクノロジーおよびナノ粒子への関心の増加に伴い、過去数年研究者により注目されている。市販のPOCは、良好な特異性（90〜95％）を有するが、現在の制限は、検出限界が十分でなく、感度が低〜中程度であることである。
マイコチオールとして知られる一群のチオールは、感染性TB原因マイコバクテリアを含む生物群を含むアクチノマイセスに特有であると認識されており（特許文献1）、感染性TB原因マイコバクテリアは、TB関連症状を引き起こすアクチノマイセスの唯一の属であるので、TB患者痰中のこれらの生物体を同定するのに特異的である。これは、今度は、生体試料中のマイコチオールを検出するための多数のイムノアッセイシステムの発達をもたらしている（特許文献2、3）。これらの方法は、酵素結合免疫吸着法（ELISA）アプローチを用いて高感度を可能にするが、これらの結果を達成するために長い設定および処理工程（少なくとも10時間）を必要とする。
Gerald et al (1996) Journal of Bacteriology 178(7): 1990-1995 Unson et al (1998) Journal of Immunological Methods 214: 29-39 Unson et al (1999) Journal of Clinical Microbiology 37(7): 2153-2157
上記を考慮すると、ヒト対象体におけるマイコバクテリウム感染の検出のための迅速で高感度で高特異性のアッセイが必要とされていることが明らかである。
発明の目的
したがって、上記欠点が解消されるかまたは少なくとも最小限にすることができる、生体試料中のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出する方法を提供することが本発明の目的である。
発明の概要
本発明の第1態様によれば、インビトロで生体試料中のマイコチオール形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出する方法であって、下記工程：
- 反応緩衝液、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）およびマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FD-MDH）を含有する酵素溶液と、生体試料を混合することにより、反応混合物を調製する工程；
- 生体試料中に存在する場合、所定のマイコチオールの形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物とFD-MDHの相互作用により、反応混合物中において、NADを還元して、NADHを生成させる工程；および
- 生体試料中のマイコチオールの存在、それ故に生体試料の供給源におけるマイコバクテリウム感染を示す、試料内の還元NAD（NADH）を検出する工程
を含む、方法を提供する。
マイコバクテリウム感染は、排他的ではないが典型的には、結核菌の感染、または典型的に同じ方法で処置される他のマイコバクテリウム種の感染である。
また、本発明によれば、試料中の還元NAD（すなわちNADH）を検出する工程は、比色反応、酵素アッセイ、クロマトグラフィー法、質量分析および分光光学法からなる群より選択されるいずれか1つ以上の方法により変化を検出する工程を含む。
生体試料は、純粋代謝産物、細胞抽出物、血液、痰、尿、脳脊髄液、液体培養物およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。
また、本発明によれば、酵素溶液は、塩、アルデヒド、アミン、水酸化物、還元剤およびそれらの組合せからなる群より選択される補助剤を含む。
好ましくは、酵素溶液は、塩化ナトリウム、ホルムアルデヒド、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ジチオトレイトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
酵素反応は、25〜40℃にて2〜840分間実施され得る。別法として、酵素反応は、2〜80分間の時間実施される。更なる別法として、酵素反応は、2〜20分間実施され得る。
酵素反応は、個々の反応の総容量が250μL未満である、キュベット、透明マルチウェルプレートまたはガラスサンプルバイアルにおいて実施され得る。別法として、反応は、従来の実験用ガラス器具において実施される。
本発明の第2態様によれば、インビトロで生体試料中のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出するためのキットであって、反応緩衝液、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）およびマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FD-MDH）を含有する酵素溶液；ならびに生体試料および酵素溶液を受け取り、反応混合物を形成するのに適する容器を含む、キットを提供する。
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の本発明の詳細な説明から当業者には明らかであろう。
図面の簡単な説明
本発明の好ましい実施態様は、図面を参照して以下に説明される：
図1は、トリス緩衝液におけるMSHおよびMD-FalDHの酵素反応の標準化を表すグラフであって、光学密度の増加が、340 nmにて測定されたNADHの増加と直線関係にあるグラフである。 図2は、14時間にわたりトリス緩衝液において低濃度のMSHおよびMD-FalDHの存在下で無益回路を使用する、MSHおよびMD-FalDHの酵素反応の標準化を表すグラフであって、(a)は、14時間にわたる培養細胞溶解物へのアッセイの適用であり、(b)は、0.05μg（または50 ng）細胞抽出物相当である、より低い検出限界を示す拡大図である。光学密度の増加は、340 nmにて測定されたNADHの増加と直線関係にある。 図3は、(a)痰試料（培養陽性；塗抹顕微鏡検査陽性（C+ve；SM+ve）；培養陽性および塗抹顕微鏡検査陰性（C+ve；SM-ve））を用いた、ならびに培養および塗抹を用いるTB陰性痰試料（痰-ve）を用いたMSH-MD-FalDHアッセイについての340 nmにおける光学密度の増加、および(b)グラフの拡大であり、TB+試料について生じた検出可能なシグナルと、コントロールまたはTB-試料について検出可能なシグナルがないことを示すグラフである。
本明細書に開示される特許対象を、代表的な実施態様を示す実施例を参照して以下により詳細に説明する。しかしながら、本明細書に開示される特許対象は、異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に示される実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が十分で完全であり、実施態様の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
発明の好ましい実施態様の説明
本発明の好ましい実施態様に従った、インビトロで生体試料中のマイコチオール形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出するための方法は：
- 反応緩衝液、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）およびマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FD-MDH）を含有する酵素溶液と、生体試料を混合することにより、反応混合物を調製する工程；
- 生体試料中に存在する場合、所定のマイコチオールの形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物とFD-MDHの相互作用により、反応混合物中において、NADを還元して、NADHを生成させる工程；および
- 生体試料中のマイコチオールの存在、それ故に生体試料の供給源におけるマイコバクテリウム感染を示す、試料内の還元NAD（NADH）を検出する工程
を含む。
当該方法は、限定されないが特に、結核菌のものを含むマイコバクテリウム感染を検出するのに適するが、マイコチオールが分布している何らかのアクチノマイセスの存在が、本発明による方法を用いて生体試料において検出され得ることが予測される。しかしながら、患者試料が感染性マイコバクテリアにより引き起こされるもののみに関連する症状に基づいて採取されることを考慮すると、結核に特異的であるだろう。
生体試料は、純粋代謝産物、細胞抽出物、血液、痰、尿、脳脊髄液、液体培養物およびそれらの組合せからなる群より選択される。
試料中の還元NAD（すなわちNADH）を検出する工程は、比色反応、酵素アッセイ、クロマトグラフィー法、質量分析および分光光学法からなる群より選択されるいずれか1つ以上の方法により変化を検出することを含む。
酵素溶液は、塩および緩衝液、特に、アルデヒド、アミン、水酸化物、還元剤およびそれらの組合せからなる群より選択される。好ましくは、酵素溶液は、塩化ナトリウム、ホルムアルデヒド、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ジチオトレイトールの混合物を含む。
酵素反応の速度は、生体試料中のマイコバクテリウム特異的代謝産物の開始濃度に依存することは理解されよう。したがって、反応中にNADHの特定の濃度を生じるのに要する時間はまた、生体試料中のマイコバクテリウム特異的代謝産物の開始濃度に依存する。
酵素反応は、25〜40℃にて2〜840分間実施される。別法として、酵素反応は、2〜80分間実施される。更なる別法として、酵素反応は、2〜20分間実施される。
酵素反応は、当業者に周知な様々な選択肢を伴う、多くの装置および容量で実施され得ることが理解されよう。本発明の一実施態様において、酵素反応は、個々の反応の総容量が250μL未満である、キュベット、透明マルチウェルプレートまたは小さいガラスサンプルバイアルにおいて実施される。本発明の別の実施態様において、反応は、従来の実験用ガラス器具において実施される。
本発明の第2態様によれば、インビトロで生体試料中のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出するためのキットであって、反応緩衝液、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）およびマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FD-MDH）を含有する酵素溶液；ならびに生体試料および酵素溶液を受け取り、反応混合物を形成するのに適する容器を含む、キットを提供する。
本発明の好ましい実施態様の非限定的な例を、図1〜3を参照して以下により詳細に説明する。
実施例：結核菌の検出のための視覚的アッセイ
本発明の好ましい実施態様にしたがって、マイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FD-MDH）を、マイコチオール（MSH）のホルムアルデヒド付加物存在下で還元エネルギーキャリア（NADH）を生成させるために用いる。酵素溶液の緩衝液は、pH、温度、マイコチオール（還元された）含有量およびホルムアルデヒド含有量に依存する。
アッセイを、反応物容量が合計200μLであるハイスループット96ウェルプレート形式で行い得る。反応は、30℃にて2分間〜14時間かかる。
酵素アッセイの標準化
標準化のために、純粋な合成マイコチオール（トリフルオロ酢酸塩）を用いる。トリフルオロ酢酸塩がマイコチオールの自己酸化を防止するため、これを抽出せずに10 mMストックとする。MD-FalDH活性スクリーンを96ウェルマイクロプレートにセットする（この一般的なレイアウトは表1において見ることができる）。酵素活性スクリーンのすべての成分を含有するプレ混合物を作製する（Lessmeier et al; 2013）。プレ混合組成物は、100 mMトリス（pH8.25）、500 mM NaCl、5 mM NAD+、1 mM DTT、1〜5 mMホルムアルデヒド、および0.001〜0.05 mg/mL MD-FalDHからなる。「試料」は、用いられる実際の患者試料材料の一貫性を再現するために成分の混合物を含有するか、または感染性病原体および／または検出される生物学的化合物（この場合マイコチオール）を欠く実際の患者試料マトリックスを含有する。
光学密度の増加を、30℃のインキュベーター温度設定でBioTEK Synergy紫外可視分光計プレートリーダー、または任意の同様モデル機器において340 nm（NADH）にて測定する。すべてのブランクおよび波長補正を、Gen5ソフトウェアパッケージを用いて行った。キネティック間隔を、試料数に依存して、30〜90秒間隔で読み取る。すべてのキネティックアッセイについて、純粋なMSHを、光学密度（340 nm）の増加のスタンダードとして用いる。すべての読取を3回繰り返して行う。すべての目的のために、可能であれば、MSHスタンダードは、病原体含有試料のものと同じマトリックス、例えば液体培養増殖培地また痰試料の場合抽出緩衝液に溶解させる。
このアッセイのために、NaClを欠くことまたはトリスをHEPES/MOPS緩衝液と置換することは、経時的な340 nmにおける光学密度の増加に対して顕著な影響を有しない。最適な光学活性が文献中Lessmeierら（2013）により記載されるものに対応する決定因子は、pH依存性のみであると分かった（pH8.25）。スタンダードの場合、光学密度の増加がそれぞれ前記のように4時間および14時間にわたる純粋なマイコチオールを含有する混合物のものである、340 nm（NADH）における光学密度の増加を図1および図2aにおいて見ることができる。図1で生じる結果に用いられるスタンダードの組成物は、それぞれ0.5 mM、0.25 mM、0.125 mMおよび0.06 mMのMSHスタンダード系列を有する0.05 mg/mL MD-FalDHを用いることを含んだ。図2aで生じる結果に用いられるスタンダードの組成物は、0.032 mM、0.016 mM、および0.008 mMのMSHスタンダード系列を有する0.002 mg/mL MD-FalDHを用いることを含んだ。
液体培養H37Rv結核菌細胞溶解物でなされる酵素反応からの340 nm（NADH）における光学密度の増加は、4時間および14時間それぞれについて図1および図2bにおいて見ることができ、0.5、1および5 mg 細胞抽出物相当と表され、ラベルされる。試料コントロールはここでは、マイコチオールまたは酵素を含有しない、試料と同じ調製工程を経た水／マトリックス試料を指す。
液体培養結核菌からの細胞抽出物（溶解物）について、新しい抽出緩衝液を開発した。緩衝液を、多くの手順、特に植物材料からのゲノムDNAの単離のための手順に基づいて作り上げた。緩衝液は、当該溶液が光学的に澄明になる細胞材料が存在するときまで白濁して見える。緩衝液（pH8）は、100 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES）緩衝液、500 mM NaCl、5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、5％臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）からなる。以下、溶解緩衝液を用いるための一般的手順である。
過剰量の溶解緩衝液（100〜500μL）を、液体培養物から単離される結核菌ペレット化湿潤細胞塊50 mgに加える。粒子が見え、試料がクリーム状の質感および外観を有するまで、同じバイアル中における反復マイクロピペット操作により、細胞ペレットを機械的に破壊する。その後、細胞ペレット-溶解緩衝液混合物を60秒間激しくボルテックスし、続いて、65℃にて30〜45分間または90℃にて20分間加熱する。最終ボルテックス工程を10分間行う。細胞残屑を、遠心分離（4000 gの相対遠心力（RCF））により沈降させ、上清をその後の分析に用いる。別法として、試料を、混合物の温度を低下させる（例えば、氷上または冷蔵庫もしくは冷凍庫中に置く）ことによりまたは重力沈降により沈降させる。
表2は、本明細書において上記した溶解緩衝液を使用する典型的な実験手順を示す。
以下の実施例において、検出の下限（すなわち、試料中に存在する必要があるマイコバクテリアの最小数）を決定するために、5 mgの湿潤細胞塊を500μL溶解緩衝液に懸濁させ、上記のように処理した。その後、細胞溶解物を希釈して、5 mg、1 mg、0.05 mg、50μg、5μg、0.5μg、0.05μg、0.005μgの湿潤細胞に相当する希釈系列を作成し、各々の20μLを用いて、表2中試料のカラムに示すように分析用試料を調製した。この実験を3回繰り返し、各試料を3回繰り返して読み取り、各繰返しについて同様の結果を得て、この結果を図1（5 mg、1 mgおよび0.5 mg 細胞塊相当）ならびに図2aおよびb（500μg〜0.005μg（または0.5 ng））に示す。
表3に要約するように、酵素アッセイの推定検出感度は、光学密度の増加が0.05μg（50 ng）相当の細胞溶解物と同じくらい低い量において監察されることを示す（図2b）。
その後、マイコバクテリア含有患者採取診断試料中のマイコチオールの存在を検出する際の酵素アッセイの能力を評価するために、液体培養細胞溶解物についてと同じ抽出手順を、表4に示す例として患者採取痰で実施した。光学密度（340 nm）の増加は、4つすべてのTB+試料（培養陽性；塗抹顕微鏡検査陽性（C+ve；SM+ve）；培養陽性および塗抹顕微鏡検査陰性（C+ve；SM-ve）を含む）ならびにTB陰性痰試料について検出可能なシグナルを示し、コントロールまたは5つのTB-ve試料（培養物および塗抹顕微鏡検査を用いて確認した（痰-ve））については活性を有しない（図3）。図3a中のグラフの特定のエリアの拡大（図3b）は、急速な低下を伴う光学密度の急激な増加を示す。これは、痰試料またはNADHと相互作用する小分子からの残りの酵素活性に起因する可能性がある。試料コントロール（図3a）は、痰試料と全く同じ準備工程を経た。4つのTB(+)試料についての340 nmにおける光学密度の増加は、5つのTB(-)試料および試料コントロールと比較して低いが、依然として検出可能である（図3b）。検出限界をさらに低くする（すなわち、当該方法の感度を増加させる）ために、細胞溶解手順、酵素緩衝液系を最適化するまたは酵素「増強剤」、例えばp-ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットまたはフェナジンメチルスルファート（HinmanおよびBlass、1981）、ならびに蛍光レポーター分子を組み込むことにより、細胞溶解物と同様の結果を生じる試みがなされ得る。
バリデーション中に、痰抽出試料から直接NADHの検出のためのMSH-MD-FalDH酵素アッセイは、すべてのTB+ve（このうち、2つは培養陽性および塗抹陽性であり、2つは培養陽性および塗抹陰性である）および5つのTB-ve試料の良好な識別を示した（図3）。
アッセイの酵素成分がさらなるバリデーションと共に液体培養物および痰試料に用いられ得て、研究および診断に用いられ得ることは容易に理解されよう。
本発明が、10分間インキュベーション後に1.6 x 107 104 CFU、および約2時間半後に1.6 x 104 CFU、および約6時間後に1.6 x 103を検出するのに十分な感度であることを結果は示す。この感度および鑑別時間を考慮すると、塗抹顕微鏡検査（1 x 104を必要とする）の代替法として良好なケースとなる。しかしながら、実際の患者採取痰で試験するとき、この方法は、従来の塗抹顕微鏡検査では見逃されていたものでさえ、すべてのTB陽性試料を陽性に同定することができ、塗抹顕微鏡検査より高感度であり、痰マトリックス中のマイコバクテリウム複合体により生成される外因性マイコチオールを検出する可能性が最も高いことが示唆され、これは培養と同じくらい高感度な可能性のある候補となるが、このことはより大きな試料コホートにおいてのみ確認することができる。
本明細書において上記した本発明の好ましい実施態様による方法は、先行技術の方法に対して多くの利点を有する。
第一に、本発明は、実施するのが簡単であり、他の既存の高感度アッセイ方法よりはるかに低コストで商業化し得る。第二に、本明細書において上記した試験は、他の方法より比較的速い；すなわち、同時に複数の試料（96ウェルプレートを用いて行うとき）について完了するまでに最大数時間必要とし、完全に自動化され得る。これは、他の広く基づいたTB診断方法が大部分は時間がかかることを考慮すると現在最も速いPCRに基づく方法（この方法は、増幅工程のみで少なくとも数時間必要とし、事実上完了までに数日かかり、最も速い培養方法が最良で2日（平均2〜8週間）かかる）と比べて遜色がない。本明細書に記載のアッセイと比較したとき、はるかに低い感度を有することとは別に、塗抹顕微鏡検査はまた、大きな労働力を要し、熟練した組織学トレーニングを必要とし、複数のハンドリングエラーおよび確証バイアスを導入し得る視覚的評価が組み込まれる可能性があり、典型的には調製および分析に数時間かかる；そして、いずれにしても、複数の試料調製は、時間的制限因子である。
最後に、本明細書に記載の試験は、代謝マーカーを検出するので、遺伝子材料に依存しない。これは、既存の遺伝子アプローチと比較するとき、残存遺伝子材料が偽陽性結果を生じ得るため、本発明の正確性を向上させる。
さらに、このアッセイは、ポイントオブケア診断デバイスに組み込まれ得る。
特許請求の範囲から逸脱することなく本発明に従った方法で細部の改変が可能であると理解されよう。

Claims (8)

  1. インビトロで生体試料中のマイコチオール形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物を検出する方法であって、下記工程：
    - 反応緩衝液、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）およびマイコチオール依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FD-MDH）を含有する酵素溶液と、生体試料を混合することにより、反応混合物を調製する工程；
    - 生体試料中に存在する場合、所定のマイコチオールの形態のマイコバクテリウム特異的代謝産物とFD-MDHの相互作用により、反応混合物中において、NADを還元して、NADHを生成させる工程；および
    - 生体試料中のマイコチオールの存在、それ故に生体試料の供給源におけるマイコバクテリウム感染を示す、試料内の還元NAD（NADH）を検出する工程
    を含む、方法。
  2. マイコチオールが、結核菌により生成される、請求項1に記載の方法。
  3. 生体試料が、血液、純粋代謝産物、細胞抽出物、痰、尿、脳脊髄液、液体培養物およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
  4. 酵素溶液が、塩、アルデヒド、アミン、水酸化物、還元剤およびそれらの組合せからなる群より選択される補助剤を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 酵素溶液が、塩化ナトリウム、ホルムアルデヒド、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ジチオトレイトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
  6. 反応が、25〜40℃の温度にて2〜840分間の時間実施される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. NADおよび／または還元NAD濃度が、比色分析、酵素アッセイ、クロマトグラフィー分析、質量分析および分光光学的分析、ラテラルフローデバイス、目視検出、尿検査紙およびそれらの組合せを含む群より選択される方法により測定される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 実質的に、明細書に記載および例示される、および／または図面を参照して記載される、請求項1に記載の方法。
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