CN113444785B - 一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p及其应用 - Google Patents

一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc‑miR‑122‑5p，该ssc‑miR‑122‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了用于检测所述的ssc‑miR‑122‑5p的表达量的特异性引物，其序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了一种通过干扰ssc‑miR‑122‑5p从而提高仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染的方法。本发明首次发现ssc‑miR‑122‑5p在仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻的回肠组织中显著高表达，然后以IPEC‑J2细胞为研究对象，通过过表达和干扰ssc‑miR‑122‑5p研究其对CPB2毒素诱导IPEC‑J2细胞损伤的影响，以期阐明ssc‑miR‑122‑5p参与调控C型产气荚膜梭菌感染致腹泻过程中的作用机制，为仔猪的细菌性腹泻的分子育种提供有力的科研借鉴。

Description

一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR- 122-5p及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p及其应用。
背景技术
目前，C型产气荚膜梭菌已成为现代养殖业中多种畜禽肠道感染的主要原因，尤其对于一周龄以内的仔猪而言，可引起出血性腹泻，随后细菌及毒素又进入全身循环系统，导致多器官衰竭，最终造成机体死亡。据统计C型产气荚膜梭菌引起的仔猪腹泻患病率和病死率均可高达100%。目前已通过抗生素、疫苗等手段降低了仔猪腹泻的发生率，而且随着抗生素的过度使用，不仅改变了仔猪肠道粘膜层结构，损伤肠道屏障，影响了仔猪的正常生长，而且药物残留等降低了猪肉产品的质量，进一步危害了人类健康，同时，耐药菌的出现也加大了防治仔猪腹泻的难度。由此可见，单纯依赖疫苗和抗生素等防治仔猪腹泻是治标不治本的，而且随着养猪产业逐步实施“减抗、禁抗”的政策，使得仔猪腹泻的防治成为一项难度较大的挑战。因此，从遗传本质上提高仔猪对C型产气荚膜梭菌的抵抗力，培育出具有抗腹泻能力的新品系（种），是解决仔猪腹泻的有效途径。因此，分析探讨猪肠上皮细胞在C型产气荚膜梭菌产生的毒素侵染过程的炎症损伤机理，对于寻求控制和减少仔猪腹泻发病率及严重程度的分子靶标具有重要意义。
miRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性单链小分子RNA，不编码蛋白，但可通过其种子序列与靶基因3′-UTR区特异性配对，介导靶基因降解或阻遏翻译，从而调控靶基因表达。据报道，miRNA参与各种细胞生理和病理过程，例如细胞增殖、分化、凋亡以及免疫炎症反应等。王鹏飞等在仔猪感染C型产气荚膜梭菌前后的仔猪回肠组织检测分析到大量的差异表达miRNAs，并且多数miRNAs具有较高的保守性。但目前，关于miRNA在仔猪的细菌性感染性腹泻中的作用机制研究较少。
发明内容
本发明提供一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p及其应用，
在感染C型产气荚膜梭菌过程中可调控猪肠上皮细胞的凋亡和损伤的小分子RNA，将其应用到仔猪抗腹泻育种中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p，所述ssc-miR-122-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本发明用于扩增所述的ssc-miR-122-5p表达量检测的荧光定量特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
还有一方面，本发明提供了一种所述的ssc-miR-122-5p在仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻的抗病育种药物制备中的应用，具体方法如下：通过使用ssc-miR-122-5pinhibitor转染猪肠上皮细胞IPEC-J2，干扰ssc-miR-122-5p的表达，从而抑制CPB2毒素诱导IPEC-J2的细胞活力降低、细胞毒性和炎性因子分泌增加以及细胞通透性增大，缓解CPB2毒素诱导IPEC-J2细胞损伤。
本发明具有的有益效果：
本发明通过检测C型产气荚膜梭菌感染后的仔猪回肠组织及CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中的ssc-miR-122-5p的表达水平，发现ssc-miR-122-5p被大量诱导；本发明以IPEC-J2细胞为研究对象，通过使用ssc-miR-122-5p mimic和ssc-miR-122-5p inhibitor转染IPEC-J2细胞，进而过表达和干扰ssc-miR-122-5p的表达，然后进行CPB2毒素的处理，随后检测发现ssc-miR-122-5p的高表达显著加剧了CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞活力降低、细胞毒性和炎性因子分泌增加，以及细胞通透性的增大，而ssc-miR-122-5p的低表达显著抑制了CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞活力降低、细胞毒性和炎性因子分泌增加，以及细胞通透性的增大，进而说明ssc-miR-122-5p在调控猪肠上皮细胞的炎症损伤过程中发挥了重要作用，可用于仔猪的细菌性腹泻的分子抗病育种，对提高仔猪的成活率及猪产业的健康发展具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中腹泻仔猪回肠组织中ssc-miR-122-5p的荧光定量检测结果；
图2为本发明实施例1中不同CPB2毒素浓度处理的IPEC-J2细胞中ssc-miR-122-5p的荧光定量检测结果；
图3为本发明实施例1中CPB2毒素处理不同时间的IPEC-J2细胞中ssc-miR-122-5p的荧光定量检测结果；
图4为本发明实施例2中ssc-miR-122-5p的过表达和干扰的效率。*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图5为本发明实施例2中ssc-miR-122-5p的过表达和干扰对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞活力的影响。Control表示空白对照；CPB2表示CPB2毒素处理的阴性对照；mimic NC+CPB2表示转染mimic NC且CPB2毒素处理，ssc-miR-122-5p mimic+CPB2表示转染ssc-miR-122-5p mimic且CPB2毒素处理，inhibitor NC+CPB2表示转染inhibitor NC且CPB2毒素处理，ssc-miR-122-5p inhibitor+CPB2表示转染ssc-miR-122-5p inhibitor且CPB2毒素处理，*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图6为本发明实施例2中ssc-miR-122-5p的过表达和干扰对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞毒性的影响。*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图7为本发明实施例2中ssc-miR-122-5p的过表达和干扰对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞产生炎性因子的影响。*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；
图8为本发明实施例2中ssc-miR-122-5p的过表达和干扰对CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞通透性的影响。*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1， ssc-miR-122-5p的表达检测
1. ssc-miR-122-5p在仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻回肠组织中的表达检测
步骤1、样品采集
选取30头健康7日龄仔猪（长×大），从中随机选取5头作为对照仔猪组（IC），灌服同等剂量未接种菌株的培养液，剩余25头仔猪进行C型产气荚膜梭菌口服攻毒试验，每头仔猪每天灌服C型产气荚膜梭菌C59-2菌株培养液（1×109CFU/mL）1 mL，试验期为5 d。迅速采集回肠组织样品于液氮保存。
步骤2、回肠组织总RNA提取
从液氮中取出组织样品，将其研成粉末，收集于1.5 mL离心管中，加入1 mLTransZol Up，震荡混匀，室温静置5 min，加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置10min，然后4 ℃，12000 r/min离心15 min。离心结束后，小心吸取上层无色水相液于新的1.5mL离心管中，加入预冷的异丙醇500 μL，上下颠倒混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 r/min离心10 min。然后去掉上清，加入1 mL预冷的75%乙醇（DEPC水配制），混匀后，4 ℃，7500r/min离心5 min，再重复1次。弃去上清，待RNA干燥后加入30-50 μL无RNA酶水。利用核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度和纯度，最后置于-80℃保存。
步骤3、qRT-PCR检测
（1）选用miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行miRNA反转录，反应体系（表1）：然后37 ℃，60 min，85 ℃，5 min，结束后加入90 μL无RNA酶水于离心管中，置于-20 ℃保存。
表1 miRNA反转录反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（2）设计miRNA的特异性引物，序列如SEQ ID NO.2所示。将上述获得的cDNA作为模板，使用TB Green™ Premix Ex Taq™ II试剂检测miRNA的表达情况（表2）。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退30 s，72 ℃延伸20 s（40个循环）；72 ℃延伸10min，4 ℃保存。
表2 miRNA的qPCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（3）参照 2-△△Ct方法，U6作为内参基因，以检测miRNA和靶基因表达情况。
结果表明（图1），ssc-miR-122-5p在仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻的回肠组织中的显著高表达（p < 0.01），表明C型产气荚膜梭菌感染激活ssc-miR-122-5p。
2. ssc-miR-122-5p在CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中的表达检测
步骤1、IPEC-J2细胞培养
IPEC-J2细胞获自北京北纳创联生物技术研究院。将IPEC-J2细胞接种到培养瓶中培养，待密度达到70%左右，吸弃培养液，PBS清洗3次，加入适量胰酶消化2～3 min，加入等体积的完全培养基终止消化，然后轻轻吹打培养瓶底部，使细胞脱落，将细胞悬液移至离心管中，1000 r/min，离心3 min，弃去上清液，再加入适量完全培养基重悬细胞，调整细胞密度，将其接种于所需的细胞培养板中，于37℃，5% CO2的培养箱中培养备用。
步骤2、CPB2毒素处理IPEC-J2细胞
首先配制含CPB2毒素（终浓度为10、20、30 μg/mL）的培养液，然后将IPEC-J2细胞接种在所需的培养板中，待贴壁并且细胞密度达70～80%，PBS清洗，然后加入含CPB2毒素（终浓度为20 μg/mL）的培养液培养12、24、36 h。
步骤3、IPEC-J2细胞总RNA提取
吸弃细胞培养液，PBS清洗2次，在培养孔中加入1 mL TransZol Up，反复吹打至细胞脱落裂解，移至1.5 mL离心管中，室温静置5 min。后续步骤同上。
步骤4、qRT-PCR检测
具体步骤同1—步骤3。
结果表明（图2和图3），ssc-miR-122-5p在CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞中显著高表达（p<0.01），且呈浓度和时间依赖性的升高，表明CPB2毒素处理同样诱导ssc-miR-122-5p表达增加。
实施例2， ssc-miR-122-5p的过表达及干扰对CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞炎性损伤的影响
1. ssc-miR-122-5p的过表达及干扰效率检测
步骤1、IPEC-J2细胞培养
步骤同实施例1。
步骤2、化学合成miRNA模拟物、抑制剂
根据miRBase数据库提供的猪ssc-miR-122-5p的序列信息，体外化学合成miRNA模拟物和抑制剂。合成的RNA小片段由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。ssc-miR-122-5pmimic合成序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO. 4所示，ssc-miR-122-5p inhibitor合成序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤3、细胞转染
将IPEC-J2细胞接种于6孔培养板中，待细胞密度达70%，PBS清洗2～3次备用。以ssc-miR-122-5p mimic终浓度50 nM、100 nM、150 nM，ssc-miR-122-5p inhibitor终浓度100 nM、150 nM、200 nM进行细胞转染。将ssc-miR-122-5p mimic/inhibitor和Lipofectamine 2000分别稀释于OPTI-MEM培养基中，室温孵育5 min后，将稀释好的ssc-miR-122-5p mimic/inhibitor与Lipofectamine 2000混在一起，室温孵育25 min。将混合物加到对应的孔中，置于培养箱中孵育4 h后更换培养液，继续培养24 h。
步骤4、qRT-PCR检测
步骤同实施例1。
结果表明（图4），与mimic NC组相比，ssc-miR-122-5p mimic在终浓度为50 nM、100 nM、150 nM组中ssc-miR-122-5p表达量显著增加（p < 0.01）；与inhibitor NC组相比，ssc-miR-122-5p inhibitor在终浓度为150 nM、200 nM组中ssc-miR-122-5p表达量显著降低（p < 0.01），表明ssc-miR-122-5p 的过表达和干扰效率较好，并且选择ssc-miR-122-5pmimic（终浓度50 nM）、ssc-miR-122-5p inhibitor（终浓度150 nM）作为后续试验的最适浓度。
的过表达及干扰对CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞活力的影响
CCK8试剂盒购自碧云天生物技术研究所。将IPEC-J2细胞接种到96孔板中，将mimic NC、ssc-miR-122-5p mimic、inhibitor NC、ssc-miR-122-5p inhibitor分别转染到IPEC-J2细胞中，培养24 h。然后使用CPB2毒素处理24 h。每孔加入10 µL CCK8试剂，培养4h，随后在450 nm处检测吸光度值，计算细胞活力。
CCK8分析证明（图5），ssc-miR-122-5p的过表达显著促进CPB2诱导IPEC-J2细胞活力降低，且在不同时间点上均显著降低了IPEC-J2的存活率（p < 0.01），而抑制ssc-miR-122-5p表达增加了受损IPEC-J2细胞的存活率（p < 0.05）。表明ssc-miR-122-5p mimic抑制CPB2诱导IPEC-J2细胞活力，而ssc-miR-122-5p inhibitor增加CPB2诱导IPEC-J2细胞活力。
3. ssc-miR-122-5p的过表达及干扰对CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞毒性的影响
乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，将IPEC-J2细胞进行转染和CPB2毒素处理后，具体的检测步骤见乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书。
结果表明（图6），与mimic NC组相比，ssc-miR-122-5p过表达可显著增加乳酸脱氢酶活性水平（p < 0.05）。与inhibitor NC组相比，抑制ssc-miR-122-5p可降低乳酸脱氢酶活性水平。表明ssc-miR-122-5p mimic可显著加剧CPB2诱导的IPEC-J2细胞毒性效应，而ssc-miR-122-5p inhibitor抑制了CPB2诱导的IPEC-J2细胞毒性效应。
4. ssc-miR-122-5p的过表达及干扰对CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞产生炎性因子的影响
ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
步骤1、首先将IPEC-J2细胞进行转染和CPB2毒素处理，然后收集细胞上清液，将其上清液和标准品稀释液加到酶标板孔底部，加酶标试剂100 µL，随后用封板膜封板，37 ℃孵育30 min。
步骤2、弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30 s弃去，重复洗涤5次，拍干。
步骤3、每孔加入显色剂A 50 µL，再加入显色剂B 50 µL，震荡混匀，37℃避光孵育15 min，显色完毕后，加终止液50 µL。最后使用酶标仪测量450 nm处吸光度值。通过标准曲线计算炎性因子含量。
结果表明（图7），相较于mimic NC组，IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌水平在ssc-miR-122-5p mimic组中显著上升（p < 0.05）；而抑制ssc-miR-122-5p明显降低IL-8和TNF-α的产生（p < 0.05；p < 0.01）。表明ssc-miR-122-5p可显著加剧ssc-miR-122-5p mimic可显著加剧CPB2诱导的IPEC-J2炎性反应，而ssc-miR-122-5p inhibitor抑制了CPB2诱导的IPEC-J2炎性反应。
5. ssc-miR-122-5p的过表达及干扰对CPB2毒素处理的IPEC-J2细胞通透性的影响
异硫氰酸荧光素-葡聚糖4（FITC-Dextran 4，平均分子量4 KDa）购自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。使用FITC-Dextran 4测量细胞单层的旁细胞通透性。将IPEC-J2细胞接种在Transwell板的上腔室中（0.4 μm/孔），待细胞处理12，24和36 h后，将10 μL的10 mg/mL FITC-Dextran 4添加到Transwell的上腔室中。孵育1～2h，从Transwell室的基底外侧收集培养基，并使用酶标仪在485 nm激发波长和520 nm发射波长下测量荧光强度。
FITC-Dextran 4测量细胞单层通透性结果显示（图8），与mimic NC组相比，过表达ssc-miR-122-5p后，检测到的FITC-Dextran 4在CPB2处理后的24和36 h时明显增加（p <0.05），而与inhibitor NC组相比，抑制ssc-miR-122-5p表达导致FITC-Dextran 4明显减少（p < 0.05）。表明ssc-miR-122-5p mimic促进了CPB2诱导的IPEC-J2细胞通透性的增加，加剧单层屏障破坏，而ssc-miR-122-5p inhibitor抑制了CPB2诱导的IPEC-J2细胞通透性的增加，缓解了CPB2诱导的单层屏障破坏。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p及其应用
<160> 5
<170> SIPO Sequence Listing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 猪miRNA
<400> 1
uggaguguga caaugguguu ugu 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggagtgtga caatggtgtt tgtcc 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uggaguguga caaugguguu ugu 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacaccauu gucacacucc auu 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaaacacca uugucacacu cca 23

Claims (2)

1.一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p的抑制剂在仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻的抗病育种药物制备中的应用，其特征在于，所述ssc-miR-122-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，具体方法如下：通过使用ssc-miR-122-5pinhibitor转染猪肠上皮细胞IPEC-J2，干扰ssc-miR-122-5p的表达，从而抑制CPB2毒素诱导IPEC-J2的细胞活力降低、细胞毒性和炎性因子分泌增加以及细胞通透性增大，缓解CPB2毒素诱导IPEC-J2细胞损伤。
CN202110716295.2A 2021-06-28 2021-06-28 一种与仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻相关的ssc-miR-122-5p及其应用 Active CN113444785B (zh)

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